CN201233399Y - 阿维菌素类药物elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种检测动物源性食品中阿维菌素类药物残留的ELISA检测试剂盒。该试剂盒组成包括：96孔酶标板、酶标二抗、阿维菌素类药物抗体工作液、伊维菌素6个浓度标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、高浓度标准品、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的阿维菌素类药物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗阿维菌素类药物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，利用样本吸光度值及交叉反应率计算出样本中含有的阿维菌素类药物的残留量。与仪器分析技术相比具有操作简便、费用低廉、灵敏度高等特点。

Description

阿维菌素类药物ELISA检测试剂盒

(一)技术领域：本实用新型涉及动物源性食品中药物残留量的检测试剂盒，特别是检测动物源性食品中阿维菌素类药物残留量的试剂盒。

(二)背景技术：阿维菌素类药物属大环内酯类抗生素，商品化的阿维菌素为八个化学结构十分相近的化合物种活性最强的两个同体系得混合物，阿维菌素的二氢还原产物为伊维菌素，为另一种重要的抗寄生虫药。阿维菌素对绝大多数由重要经济价值的寄生线虫和节肢动物均有很强的抑杀作用，其杀虫活性和杀虫谱都堪称划时代的，且作用机制独特，使用方便，被誉为近十几年来抗寄生虫药物研究的重大突破。目前，阿维菌素类药物开始大规模的生产和推广应用。

但阿维菌素类药物的过量使用使其在动物源性食品中高残留，使人体产生抗药性，给人体造成一定的危害，因此我国已限量使用。2002年12月我国农业部公告第235号文规定在所用食品牛的脂肪、肝中的最高残留量为100μg/kg，肾的最高残留量为50μg/kg；所用食品羊的肌肉、肝的最高残留限量为25μg/kg，脂肪的最高残留限量为50μg/kg，肾的最高残留限量为20μg/kg，并将检测兽药中阿维菌素类药物的残留量列为残留监控重点。

目前，检测阿维菌素类药物残留量的方法主要有薄层色谱法(TLC)，气相色谱法(GC)，高效液相色谱法(HPLC)，气—质联机(GC/MS)，液—质联机(HPLC/MS)，毛细管电泳(CE)等。用上述方法检测存在着仪器设备复杂、样本前处理和测定操作烦琐的缺陷，不适合现场监控和大量样本筛查，而且费用高昂，使其推广使用受到限制。

(三)实用新型内容：本实用新型目的是提供一种小巧轻便的阿维菌素类药物残留检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中阿维菌素类药物含量的测定，减少了检验样本所需要的时间。

本实用新型的技术方案是：一种检测动物源性食品中阿维菌素类药物的ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于：采用96孔聚苯乙烯试剂板作为固相载体，酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，在试剂盒酶标板微孔条上预包被阿维菌素偶联抗原制成检测板，放入真空铝铂袋中，盒体为硬纸盒，以塑料硬膜为盖板膜，将40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液、12ml酶标二抗、10ml阿维菌素类药物抗体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液和6瓶1ml梯度浓度的标准品溶液和1瓶1ml高浓度标准品溶液，试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在具有15个下凹瓶位的泡沫塑料模具中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质检报告一同封装在盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。检测时，样本中的残留物(伊维菌素)将和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗阿维菌素类药物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与样本中所含残留物(伊维菌素)的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中伊维菌素的残留量，再根据伊维菌素的残留量，利用交叉反应率计算样本中含有的其它阿维菌素类药物的残留量。其操作简便易行。

经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度：牛肉牛肝的最低检测限为10μg/kg、方法b处理的组织/水产的最低检测限为1μg/kg、方法c处理的组织/水产的最低检测限为4μg/kg、方法d处理的组织/水产的最低检测限为4μg/kg、处理的蔬菜的最低检测限为3μg/kg；组织样本的回收率为70％±10％、蔬菜的回收率为70％±30％、水产的回收率为70％±10％；同伊维菌素的交叉反应率为33％，同爱普瑞菌素的交叉反应率为145％。相对于其他阿维菌素残留检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、匀质器、振荡机和微量加样器，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。

本实用新型的有益效果是：能快速、简便、灵敏、准确地用于动物源性食品中阿维菌素残留的检测。

(四)附图说明：

图1为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12.8cm)；

图2为本实用新型酶联板的俯视图；

图3为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8.55cm)；

图4为本实用新型盖板膜平面图；

图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；

图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图。

参见附图：酶标反应微孔条(2)预包被阿维菌素偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)；透明帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽(6)的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，绿色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装7ml阿维菌素类药物抗体，红色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用于封装1ml/瓶的标准品溶液液及1ml高浓度标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为：40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液(11)，7ml显色液A液瓶位(14)，7ml显色液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)、10ml阿维菌素类药物抗体瓶位(16)，12ml酶标二抗瓶位(15)，6种1ml/瓶各种浓度的标准品溶液及1瓶1ml高浓度标准品溶液瓶位(17)。

本实用新型的实施例：

一、样本的前处理

1.配液：

配液1：复溶工作液

用去离子水将2×浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释(1份2×浓缩复溶液+1份去离子水)用于样本的复溶

配液2：乙腈-水溶液

量取20ml乙腈加入1ml去离子水中混匀

配液3：洗涤工作液

用去离子水将20×浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释(或按需量稀释)(1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤

2.动物组织样本前处理：

(a)牛肉、牛肝前处理方法

用均质器均质样本；称取5.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml无水甲醇，用涡旋仪涡动1min再用振荡器振荡10min，1000g以上，15℃离心10min；移取上清液20μl至2ml聚苯乙烯离心管中，加入复溶工作液按1:9体积比进行稀释(20μl样本+180μl复溶工作液)；取20μl用于分析。

(b)高脂肪样品，如鳗鱼、肌肉前处理方法

用均质器均质组织样本；称取3±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入9ml乙腈、3ml正己烷，用振荡器上下振荡10min，再加入3g无水硫酸钠，用振荡器振荡10min，3000g以上，15℃离心10min；去除上层正己烷，取下层4ml提取液备用；取碱性氧化铝sep-pak vac12cc(2g)柱，称取3g无水硫酸钠平铺在滤板上，加入10ml乙腈洗柱，再加入4ml提取液，开始收集滤液，待提取液流干后，再加入4ml乙腈清洗柱子，合并洗液和滤液至50ml鸡心瓶中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；取1ml复溶工作液至2ml聚苯乙烯离心管中，溶解干燥的残留物，用涡旋仪涡动1min，超声波溶解10min，再用涡旋仪涡动1min，取出100μl溶解后的样品液至2ml聚苯乙烯离心管中，加入100μl复溶工作液用涡旋仪涡动30s充分混合；取20μl用于分析。

(c)低脂肪样本，如虾、肌肉前处理方法

用均质器均质组织样本；称取3±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入9ml乙腈、3ml正己烷，用振荡器振荡10min，3000g以上，15℃离心5min，直接吸取下层液1ml至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干，取1ml复溶工作液至2ml聚苯乙烯离心管中，溶解干燥的残留物，用涡旋仪涡动1min，超声波溶解10min，再用涡旋仪涡动1min；取出100μl溶解后的样品液，加入100μl复溶工作液用涡旋仪涡动30s混合；取20μl用于分析。

(d)高脂肪样本，如鳗鱼前处理方法

用均质器均质组织样本；称取3±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入9ml乙腈-水溶液，10ml正已烷，用振荡器振荡20min，3000g以上，15℃离心5min；除去上层，取下层清液于另一洁净离心管，加3g无水硫酸钠，加3g碱性氧化铝(100～200目)，用振荡器振荡2min，3000g以上，15℃离心5min；取上清液1ml至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；取1ml复溶工作液至2ml聚苯乙烯离心管中溶解干燥的残留物，用涡旋仪涡动1min，超声波溶解10min，再用涡旋仪涡动1min；取出100μl溶解后的样品液至2ml聚苯乙烯离心管，加入100μl复溶工作液用涡旋仪涡动30s混合；取20μl用于分析。

3.蔬菜样本前处理方法：

(a)新鲜蔬菜，如白菜、胡萝卜、生姜等前处理方法

用均质器均质蔬菜样本；称取1±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml正己烷，用振荡器振荡10min，3000g以上，15℃离心10min；取上层澄清液1ml至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml复溶工作液溶解干燥的残留物，用涡旋仪涡动30s以上，超声10min，再用涡旋仪涡动30s；取20μl用于分析。

(b)干菜和高淀粉含量样品(干洋葱、番茄酱、土豆等)前处理方法

用均质器均质蔬菜样本；称取1.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml去离子水，充分混匀，再加入5ml正己烷，用振荡器振荡10min，3000g以上，15℃离心10min；取上层澄清液1ml至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml复溶工作液，必须用涡旋仪涡动30s以上，超声10min，再用涡旋仪涡动30s；取20μl用于分析。

二、使用试剂盒的操作步骤：

1、从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、洗涤工作液在使用前也需回温。

4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、加标准品/样本：加标准品/样本20μl/孔到各自的微孔中，再加入抗体工作液80μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。

6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10秒，用吸水纸拍干。(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。

7、加酶标二抗：加入酶标二抗100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。取出重复洗板步骤6。

8、显色：加入底物液A液50μl/孔，再加底物液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中避光反应15min(见注意事项8)。

9、测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。

三、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含伊维菌素成负相关。

1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(μg/L)。假设样本1的吸光度值为0.601，样本2的吸光度值为1.002，标准液吸光度值分别是：0μg/L为2.043；0.5μg/L为1.562；1.5μg/L为0.997；4.5μg/L为0.513；13.5μg/L为0.246；40.5μg/L为0.115。则样本1的浓度范围是1.5μg/L-4.5u???g/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中伊维菌素残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0.5μg/L-1.5μg/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中伊维菌素残留的浓度范围。再根据伊维菌素的残留量，利用交叉反应率计算样本中含有的其它阿维菌素类药物的残留量。

2、定量分析

(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样品的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即

百分吸光度值(％)＝B/B₀×100％

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0μg/L标准溶液的平均吸光度值

(2)标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以伊维菌素标准品浓度(μg/L)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中伊维菌素的实际残留量，再根据伊维菌素的残留量，利用交叉反应率计算样本中含有的其它阿维菌素类药物的残留量。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

四、测定前的注意事项：

1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温(20-25℃)会导致所有标准的OD值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、每加一种试剂前需将其摇匀。

4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

6、储存条件

保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻；将不用的酶标板微孔条放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、试剂变质的迹象

发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A_450nm<0.5)时，表示试剂可能变质。

8、在加入底物液A和底物液B液后，一般显色时间为10-15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min(或更长)，但不得超过30min。反之，则减短反应时间。

9、该试剂盒最佳反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

Claims (3)

1.一种检测动物源性食品中阿维菌素类药物的ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于：酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被阿维菌素偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为浓缩洗涤液、浓缩复溶液、酶标二抗、阿维菌素类药物抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、6瓶标准品溶液、1瓶高浓度标准品溶液、试剂用不同大小，不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在具有15个下凹瓶位的泡沫塑料模具中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质检报告一同封装在盒内。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝铂袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用白色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，阿维菌素类药物抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶；下凹瓶位由塑料泡沫制成。

3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被阿维菌素偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，1ml/瓶，浓度分别为0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L，40.5μg/L；高浓度标准品溶液1瓶，1ml；酶标二抗1瓶，12ml，阿维菌素类药物抗体工作液1瓶，10ml；显色液A液1瓶，7ml；显色液B液1瓶，7ml；终止液1瓶，7ml；浓缩洗涤液1瓶，40ml；浓缩复溶液1瓶，50ml。

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