CN202794175U

CN202794175U - β-兴奋剂类ELISA检测试剂盒

Info

Publication number: CN202794175U
Application number: CN 201220296931
Authority: CN
Inventors: 冯才伟; 万宇平; 罗贵昆; 陈娟; 何方洋; 邢维维; 杨昌松; 顾蓉蓉
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2012-06-19
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2022-06-19

Abstract

本实用新型涉及一种检测组织、肝脏、尿液、血清、饲料、牛奶、奶粉中β-兴奋剂类药物残留量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括：96孔酶标板、浓缩酶结合物、浓缩酶结合物稀释液、7个浓度的标准品溶液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被β-兴奋剂类抗体，样本中残留的β-兴奋剂类药物将和酶标抗原竞争酶标板微孔条上预包被的β-兴奋剂类抗体，用底物液显色，利用样本吸光度值计算出样品中β-兴奋剂类药物的残留量。与仪器分析技术相比具有操作简便、费用低廉、灵敏度高等特点，可在β-兴奋剂类药物的残留量检测中发挥重要作用。

Description

β-兴奋剂类ELISA检测试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种检测β-兴奋剂类药物残留量的试剂盒，特别是检测组织、肝脏、尿液、血清、饲料、牛奶、奶粉中β-兴奋剂类药物残留量的酶联免疫检测（ELISA）试剂盒，ELISA（Enzyme Linked Immunosorbnent Assay）是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种酶免技术。

背景技术

β-兴奋剂（β-agonist）全称β-肾上腺素受体激动剂（β-adrenoceptor agonist），又叫β-激动剂，是一类化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙胺类药物。常见的β-兴奋剂为克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗、马布特罗、非诺特罗、特布他林等。β-兴奋剂能选择性地与细胞膜上的β-肾上腺素受体结合，起到调节交感神经兴奋、松弛气管平滑肌的功能，因此在临床上常用于人和动物哮喘类病症的治疗。20世纪80年代有研究表明，β-兴奋剂影响营养物质在动物体内的流向和重新分配，使体内的脂肪分解代谢增强、蛋白质合成增加，显著提高瘦肉率。β-兴奋剂残留会聚集在动物可食用组织中，由于这类化合物具有口服活性，如果违法超量使用将会对人与动物的肝、肾等内脏器官产生毒副作用。因此世界各国已将这类物质列为禁止用于食品动物的化学物质。

目前国内外关于β-兴奋剂类药物残留的的主要检测方法有色谱法，如气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、气质联用法（GC-MS）、液质联用法（LC-MS）；免疫分析法，如酶联免疫法、胶体金免疫法、时间分辨免疫荧光测定等。色谱方法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用；与之相比，酶联免疫方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点，而且所需设备少，操作简单易学，成本低廉，能够更好地满足我国畜禽养殖户、屠宰场、食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

实用新型内容

本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的β-兴奋剂类药物残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中β-兴奋剂类药物残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型可以检测6种β-兴奋剂类药物。

本实用新型的技术方案是：一种β-兴奋剂类ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于：酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被β-兴奋剂类抗体制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、浓缩酶结合物、浓缩酶结合物稀释液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。

酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装的酶标反应微孔条有8个反应孔，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致，将14瓶试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶盛装并固定在下凹瓶位中，与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。14瓶试剂分别为7瓶1ml梯度浓度的标准品溶液、1.3ml浓缩酶结合物、13ml浓缩酶结合物稀释液、7ml底物液A液、7ml底物液B液、7ml终止液、40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定（包括标准分析孔），既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的残留物（β-兴奋剂类药物）将和酶标抗原竞争酶标板微孔条上预包被的β-兴奋剂类抗体，用底物液显色，样本吸光度值与其所含残留物（β-兴奋剂类药物）的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中β-兴奋剂类药物的含量，其操作简便易行。

经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度：尿液、牛奶样本的最低检测限为0.3μg/L，组织、肝脏样本的最低检测限为0.5μg/kg，血清样本的最低检测限为0.4μg/L，奶粉样本的最低检测限为1μg/kg，饲料样本的最低检测限为5μg/kg。尿液、血清样本的回收率为100%±20%，对组织、肝脏、牛奶、奶粉、饲料样本的回收率为90%±20%。

同克仑特罗的交叉反应率为100%、同沙丁胺醇的交叉反应率为106%、同塞布特罗的交叉反应率为99%、同妥布特罗的交叉反应率为95%、同溴布特罗的交叉反应率为69%、同溴氯布特罗的交叉反应率为60%、同特步它林的交叉反应率为22%、同西马特罗的交叉反应率为2.3%、同羟甲基克仑特罗的交叉反应率为2.7%、同莱克多巴胺的交叉反应率＜0.1%。相对于其他β-兴奋剂类药物检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、均质器、涡旋仪、离心机和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。

本实用新型的有益效果是：能快速、简便、灵敏、准确地用于组织、肝脏、尿液、血清、饲料、牛奶、奶粉中β-兴奋剂类药物残留量的检测。

附图说明

图1为本实用新型酶标板的侧面纵剖面图（长为8.55cm）；

图2为本实用新型酶标板的侧面横剖面图（长为12.8cm）；

图3为本实用新型酶标板的俯视图；

图4为本实用新型盖板膜平面图；

图5 5a、5b、5c、5d为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；

图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；

图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。

参见附图：酶标反应微孔条（2）预包被β-兴奋剂类抗体（3）固定于酶标板的外框支撑架（1）上，酶标反应微孔条（2）可随要求拆卸；盖板膜（4）用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条（2），盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明PE塑料试剂瓶（5）用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料试剂瓶（5）用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽的白色PE塑料试剂瓶（6）用于封装7ml底物液A液，红色帽的黑色PE塑料试剂瓶（6）用于封装7ml底物液B液，黄色帽的白色PE塑料试剂瓶（6）用于封装7ml终止液，红色帽的白色PE塑料试剂瓶（7）用于封装1.3ml浓缩酶结合物，绿色帽的白色PE塑料试剂瓶（7）用于封装13ml浓缩酶结合物稀释液，黑色帽的棕色玻璃试剂瓶（8）用于封装1ml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具（10）有15个下凹瓶位，放置位置依次为：40ml浓缩洗涤液瓶位（18），50ml浓缩复溶液瓶位（11），7ml显色液A液瓶位（14），7ml显色液B液瓶位（13)，7ml终止液瓶位（12），1.3ml浓缩酶结合物瓶位（16），13ml浓缩酶结合物稀释液瓶位（15），7个1ml/瓶各种浓度的标准品溶液瓶位（17），盒体（9）是硬纸盒。

具体实施方式

一、样本的前处理

1、配液

配液1：0.5mol/L PB

称取11.0g十二水合磷酸氢二钠，34.2g磷酸二氢钠加入500ml去离子水充分溶解。

配液2：0.2mol/L盐酸溶液

量取8.3ml浓盐酸加入去离子水定容到500ml

配液3：牛羊肉提取液

称取0.44g十二水合磷酸氢二钠，1.37g磷酸二氢钠和0.75g柠檬酸加入500ml去离子水充分溶解。

配液4：1mol/L氢氧化钠溶液

称取4.0g氢氧化钠加入100ml去离子水充分溶解

配液5：复溶工作液

用去离子水将2×浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释（1份2×浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本的复溶。

配液6：洗涤工作液

用去离子水将20×浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。

2、样本处理步骤

（1）尿液（猪尿、牛尿、羊尿）前处理方法

取50μl清亮尿样直接测定（如尿样浑浊必须通过过滤或离心），暂不使用的样本应冷冻保存。

（2）猪肉、猪肝前处理方法

称取2.0g±0.05g匀浆样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入6ml 0.5mol/L PB溶液和2ml 0.2mol/L HCl溶液，用涡旋仪涡动至均匀；3000g以上，室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；肝脏样本：取1ml上清液加入80μl 1mol/L氢氧化钠溶液混匀（混匀以后测定pH值，大约为6.5）；肌肉样本：取1ml上清液加入50μl 1mol/L氢氧化钠溶液混匀（混匀以后测定pH值，大约为6.5）；取50μl用于分析。

（3）鸡肉、牛肉、羊肉前处理方法

称取2.0g±0.05g匀浆样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入8ml 牛羊肉提取液（称取0.44g十二水合磷酸氢二钠，1.37g磷酸二氢钠和0.75g柠檬酸加入500ml去离子水充分溶解。），用涡旋仪涡动至均匀；3000g以上，室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；取1ml上清液加入20μl 1mol/L氢氧化钠溶液混匀（混匀以后测定pH值为6.5-7）；取50μl用于分析。

（4）饲料（原料、浓缩料、配合料）前处理方法

称取1.0g±0.05g样本至50ml 聚苯乙烯离心管中，加入10ml甲醇，振荡1min；3000g以上，室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；移取1ml上层有机相至10ml干净玻璃试管中，于50-60℃水浴氮气/空气流下吹干；加入1ml正已烷，涡动1min，再加入1ml复溶工作液（用去离子水将浓缩复溶液按1:1体积比进行稀释），涡动30s；3000g以上，室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；去除上层有机相，取100μl下层水相，加400μl复溶工作液混匀；取50μl用于分析。

（5）血清（猪血清、牛血清）前处理方法

取200μl血清样本于2ml聚苯乙烯离心管中，再加入600μl复溶工作液，充分混匀；取50μl用于分析。

（6）牛奶（原奶、成品奶）前处理方法

取50μl牛奶样本直接测定，暂不使用的样本应冷藏保存。

（7）奶粉前处理方法

称取0.5g±0.05g奶粉样本于10ml聚苯乙烯离心管中，加入4ml去离子水充分振荡混匀；取50μl用于分析。

二、使用试剂盒的操作步骤

1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20~25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放回铝箔袋，封口，保存于2~8℃。

3、洗涤工作液在使用前也需回温。

4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、酶结合物工作液配制：根据需要量用浓缩酶结合物稀释液将浓缩酶结合物按1:10的比例稀释成酶结合物工作液（即1份浓缩酶结合物加入到10份浓缩酶结合物稀释液中）。

6、加标准品/样本及酶结合物工作液：加入标准品/样本50μl到对应的微孔中，然后加入配制好的酶结合物工作液100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应40min。

7、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

8、显色：加入底物液A液50μl/孔，再加底物液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15min。

9、测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。（若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定）。

三、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与β-兴奋剂类的含量成负相关。

1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围（μg/L）。例如样本1的吸光度值为0.501，样本2的吸光度值为0.912，标准品吸光度值分别是：0μg/L为1.952；0.1μg/L为1.580；0.4μg/L为1.080；1.6μg/L为0.603；6.4μg/L为0.286；25.6μg/L为0.102。则样本1的浓度范围是1.6~6.4μg/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中β-兴奋剂类残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0.4~1.6μg/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中β-兴奋剂类残留的浓度范围。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

B——标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀——0μg/L标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以克仑特罗标准品浓度（μg/L）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数，即为样本中β-兴奋剂类药物的实际浓度。

四、测定前的注意事项

1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20~25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性、重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、每加一种试剂前需要将其摇匀。

4、反应终止液为2mol/L硫酸，避免接触皮肤。

5、不要使用过了有效期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

6、储存条件：保存试剂盒于2~8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、试剂变质的迹象：发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A_450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。

8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min（或更长），但不得超过30min。反之，则缩短反应时间。

9、该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

Claims

1.一种β-兴奋剂类ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于：酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被β-兴奋剂类抗体制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、浓缩酶结合物、浓缩酶结合物稀释液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液用黑色帽的棕色玻璃瓶，浓缩酶结合物用红色帽的白色PE塑料瓶，浓缩酶结合物稀释液用绿色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，1ml/瓶；浓缩酶结合物1瓶，1.3ml；浓缩酶结合物稀释液1瓶，13ml；底物液A液1瓶，7ml；底物液B液1瓶，7ml；终止液1瓶，7ml；浓缩洗涤液1瓶，40ml；浓缩复溶液1瓶，50ml。