CN202720227U - 链霉素elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型公布一种链霉素ELISA检测试剂盒。该试剂盒组成包括：96孔酶标板、酶标二抗、链霉素抗体工作液、6个浓度的标准品溶液、高浓度标准品、底物液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中含有的链霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗链霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中链霉素药物的含量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在动物源性食品中链霉素药物的含量检测中发挥重要作用。

Description

链霉素ELISA检测试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种检测动物源性食品中链霉素药物的试剂盒。

背景技术

链霉素(Streptomycin，SM)是一种重要的氨基糖苷类抗生素，其作为一种抗生素在治疗家畜感染性疾病中发挥着重要作用，但其耐药性强，毒副作用较大，若动物性食品中有过量的链霉素残留，则可能对人造成严重危害。为了保障动物源性食品的安全，农业部第235号文件《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定链霉素在牛奶中为200μg/L，在肌肉、脂肪、肝中为600μg/kg，在肾中为1000μg/kg。

目前链霉素残留的检测主要有仪器检测方法、微生物学检测法、免疫学法，如高效液相色谱法、荧光检测法、薄层色谱法、质谱法、杯碟法、纸片法、酶联免疫法、光学免疫传感器等，由于仪器较昂贵，操作繁琐、费用高、不适合进行大规模现场检测等，ELISA法具有灵敏度高、耗时少、成本低、大规模检测等优点，目前市场上已有此类检测试剂盒。

实用新型内容

本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的链霉素残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中链霉素残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。

本实用新型的技术方案是：一种检测动物源性食品中链霉素残留量的酶联免疫试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于：采用96孔聚苯乙烯酶标板作为固相载体，酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，在试剂盒酶标板微孔条上预包被链霉素偶联抗原制成检测板，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，以塑料硬膜为盖板膜，将6瓶1ml梯度浓度的标准品溶液、1ml高浓度标准品溶液、12ml酶标二抗、7ml链霉素抗体工作液、7ml底物液A液、7ml底物液B液、7ml终止液、40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质检报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的链霉素将和酶标板微孔条上预包被的链霉素偶联抗原竞争抗链霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含链霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中链霉素含量，其操作简便易行。

经实验表明本试剂盒可以检测链霉素、双氢链霉素、硫酸链霉素，具有很高的灵敏度：肌肉/肝脏样本的最低检测限为2μg/kg、血清样本的最低检测限为10μg/kg；牛奶样本的最低检测限为4μg/kg；奶粉样本的最低检测限为20μg/kg；蜂王浆样本的最低检测限为2μg/kg；蜂蜜样本的最低检测限为0.5μg/kg；肌肉/肝脏样本的回收率为70％±10％；血清样本的回收率为70％±10％；牛奶、奶粉样本的回收率为85％±25％；蜂王浆、蜂蜜样本的回收率为90％±15％；相对于其他链霉素检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、均质器、氮气吹干装置、涡旋仪、离心机、振荡机和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。

本实用新型的有益效果是：能快速、简便、灵敏、准确地用于链霉素残留量的检测。

附图说明

图1为本实用新型酶标板的侧面纵剖面图(长为8.55cm)；

图2为本实用新型酶标板的侧面横剖面图(长为12.8cm)；

图3为本实用新型酶标板的俯视图；

图4为本实用新型盖板膜平面图；

图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；

图6为本实用新型固定泡沫模具俯视图；

图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具侧视图。

参见附图：酶标反应微孔条(2)预包被链霉素偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml底物液A液，红色帽(6)的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml底物液B液，黄色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，红色帽的黄色塑料试剂瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的黄色塑料试剂瓶(8)用于封装7ml链霉素抗体工作液，白色帽的白色塑料试剂瓶(9)用于封装1ml/瓶的标准品溶液及1ml高浓度标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为：40ml浓缩洗涤液瓶位(11)，50ml浓缩复溶液瓶位(18)，7ml底物液A液瓶位(12)，7ml底物液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(14)，7ml链霉素抗体工作液瓶位(15)，12ml酶标二抗瓶位(16)，6种1ml/瓶各种浓度的标准品溶液及1瓶1ml高浓度标准品溶液瓶位(17)，盒体为(19)是硬纸盒。

具体实施方式

一、样本的前处理

1.配液：

配液1：PBST缓冲液(鸡肉、肝脏提取用)

称取5.2g十二水合磷酸氢二钠、0.88g二水合磷酸二氢钠、9g氯化钠和1ml吐温-20加1L去离子水溶解混匀(用于鸡肉、肝脏样本提取用)。

配液2：提取缓冲液(蜂蜜前处理方法一专用)

称取1.5g十二水合磷酸氢二钠和1g庚烷-磺酸钠盐，(大约M＝202.2)加100ml去离子水溶解混匀，加入0.75ml浓磷酸调pH至2.0。

配液3：复溶工作液

用去离子水将10×浓缩复溶液按1∶9体积比进行稀释(1份10×浓缩复溶液+9份去离子水)用于样本的复溶，复溶工作液在4℃环境可保存一个月。

配液4：洗涤工作液

用去离子水将20×浓缩洗涤液按1∶19体积比进行稀释(1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。

2.样本前处理方法

(1)肌肉前处理方法

除去肌肉中的脂肪部分，用均质器均质样本；称取2g±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入8ml PBST缓冲液用振荡器振荡5min，加入正己烷5ml充分上下振荡混合10min后静置1h；3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心15min；移取1ml中间层至5ml聚苯乙烯离心管中，加入1ml正己烷，用振荡器充分振荡5min，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心15min；除去上层，取下层清液用复溶工作液按1∶9体积比进行稀释混匀；取50μl用于分析。

(2)肝脏前处理方法

除去肝脏中的脂肪部分，用均质器均质肝脏样本，称取5.0g±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入20mlPBST缓冲液用振荡器振荡30min；3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心10min；移取2ml上层清液至10ml玻璃离心管中，加入3ml正己烷用振荡器充分振荡5min；3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心10min；除去上层，取下层清液用复溶工作液按1∶9体积比进行稀释混匀；取50μl水相进行分析。

(3)血清前处理方法

用加有肝素钠(20-30单位/ml血)的离心管采集血清样本(建议采血注射器也用肝素钠润洗)，血清样本室温静置1h，待析出血浆后，3000g以上，15℃离心10min；取制备好的血浆样本20μl至5ml聚苯乙烯离心管，用复溶工作液按1∶199体积比进行稀释；取50μl用于分析。

(4)牛奶前处理方法

取20μl牛奶样本，加入780μl复溶工作液，混匀；取50μl用于分析。

(5)奶粉前处理方法

称取1.0g±0.05g奶粉样本；加入5ml去离子水，充分振荡至奶粉全部溶解；取出50μl，加入1950μl复溶工作液，混匀；取50μl用于分析。

(6)蜂蜜前处理方法一

称取1.0g±0.05g蜂蜜样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml提取缓冲液，用振荡器振荡10min至蜂蜜全部溶解，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心10min，直至清亮。用RIDA C18柱(纯化提取物)，用2ml甲醇洗柱子，流速为60d/min；用2ml去离子水洗柱子，流速为60d/min；取2ml样本以流速为15d/min过柱；用3ml去离子水洗柱子，45d/min；用氮气或空气吹干柱子；除去柱中水分，用1ml甲醇洗脱样本，流速为15d/min；在40～50℃，水浴氮气流下完全蒸发溶剂；用2ml复溶工作液溶解干燥的残留物；取50μl进行分析。

蜂蜜前处理方法二

称取1.0g±0.05g蜂蜜样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入5ml复溶工作液，用振荡器振荡10min至蜂蜜全部溶解，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心10min，直至清亮；取200μl清亮上清液，加入600μl复溶工作液中，混匀；取50μl进行分析。

(7)蜂王浆前处理方法

称取1.0g±0.05g蜂王浆样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入4ml去离子水，用振荡器振荡混匀；加入2.0g中性氧化铝，用振荡器充分振荡5min后，3000g以上，室温(20-25℃/68-77°F)离心10min；取100μl清亮上清液，加入900μl复溶工作液，混匀后；取50μl进行分析。

二、使用试剂盒的操作步骤

1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

3、洗涤工作液在使用前也需回温。

4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、加标准品工作液/样本和抗体工作液：加标准品/样本50μl到对应的微孔中，再加入抗体工作液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置于37℃避光环境中反应30min。

6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。

7、加酶标二抗：加入酶标二抗100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤6。

8、显色：加入底物液A液50μl/孔，再加底物液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应15min。

9、测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。

三、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与链霉素含量成负相关。

1、用样本的平均吸光度值与标准品吸光度值比较即可得出其浓度范围(μg/L)。假设样本1的吸光度值为0.152，样本2的吸光度值为0.532，标准液吸光度值分别是：0μg/L为1.552；0.05μg/L为1.281；0.15μg/L为0.901；0.45μg/L为0.511；1.35μg/L为0.25；4.05μg/L为0.111。则样本1的浓度范围是1.35μg/L-4.05μg/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中链霉素残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0.15μg/L-0.45μg/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中链霉素残留的浓度范围。

2、定量分析

(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即

B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀-0μg/L标准溶液的平均吸光度值

(2)标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以链霉素标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中链霉素实际含量。

四、测定前的注意事项

1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温(20-25℃)会导致所有标准的OD值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。

所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、每加一种试剂前需将其摇匀。

4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

6、储存条件

保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、试剂变质的迹象

发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A_450nm＜0.5)时，表示试剂可能变质。

8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色10-15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min(或更长)，但不得超过30min。反之，则减短反应时间。

9、该试剂盒最佳反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

Claims (3)

1.一种链霉素ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于：酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被链霉素偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为6瓶标准品溶液、1瓶高浓度标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。

2.根据权利要求1所述的链霉素ELISA检测试剂盒，其特征在于：盒体是硬纸盒； 96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用白色帽的白色塑料瓶，酶标二抗用红色帽的黄色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的黄色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。

3.根据权利要求1所述的链霉素ELISA检测试剂盒，其特征在于：酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被链霉素偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，1ml/瓶，浓度分别为0μg/L，0.05μg/L，0.15μg/L，0.45μg/L，1.35μg/L，4.05μg/L；高浓度标准品溶液1瓶，1ml；酶标二抗1瓶，12ml；抗体工作液1瓶，7ml；底物液A液1瓶，7ml；底物液B液1瓶，7ml；终止液1瓶，7ml；浓缩洗涤液1瓶，40ml；浓缩复溶液1瓶，50ml。 

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