CN105779291B - 高通量同时同步实时监测细胞增殖及活性的装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于图像分析的细胞增殖及活性监测的高通量同时同步检测装置及方法，该装置包括：电源适配器、广角镜头、智能移动设备、暗室、底座、细胞培养板、培养板装载台、冷光片、单片机、加热器和温度传感器。该方法首先进行细胞培养；接种不同密度的细胞，并加入商用细胞增殖及活性检测试剂盒溶液；放入装置进行长时监测，采用连续采集图像分析，计算细胞活性指数CVI；通过遍历及最小二乘法拟合出检测细胞密度的最佳标定曲线；通过分析待测样品溶液的CVI曲线，获取最佳检测时间点的CVI值，带入标定曲线，计算出待测样品的细胞密度。本发明实现了细胞增殖及活性的长时监测，具有高通量、同时同步、长时监测、操作简便和成本低廉等优点。

Description

高通量同时同步实时监测细胞增殖及活性的装置及方法

技术领域

本发明涉及一种高通量同时同步实时监测细胞增殖及活性的装置及技术，尤其涉及基于图像分析的细胞增殖及活性监测的高通量同时同步检测装置及方法。

背景技术

细胞增殖及活性检测常用于药物筛选、药物发现及生物毒素等测定，与目前常用方法小鼠生物检测法相比，具有重现性高等特点。目前检测细胞活性的方法是使用酶标仪与细胞增殖、细胞活性试剂盒进行检测。试剂盒检测原理居于酶促反应，酶促反应随着孵化时间的不同存在差异，而酶标仪只能够进行单时间点检测，并且采用机械移动装置进行异步高通量检测，会造成每个样品在检测时间上的不同步而造成误差。细胞增殖及活性表征了细胞数量、细胞生长及细胞凋亡等状态，细胞状态的改变与时间具有相关性，因此，药物发现、筛选及生物毒素检测等使用到细胞增殖及活性检测的领域迫切需要一种能够高通量、同时同步、操作简便、检测成本低廉并且能够实时监测细胞增殖及活性的装置及方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于图像分析的细胞增殖及活性监测的高通量同时同步检测装置及方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于图像分析的细胞增殖及活性监测的高通量同时同步检测装置，该装置包括：电源适配器、广角镜头、智能移动设备、暗室、底座、96孔细胞培养板、96孔细胞培养板装载台、冷光片、单片机、加热器和温度传感器；其中，暗室与底座通过隔板分离；单片机和电源适配器固定在底座内；暗室中具有可抽拉的96孔检测板装载台，96孔细胞培养板通过卡槽固定在96孔细胞培养板装载台顶部，冷光片通过卡槽固定在96孔细胞培养板装载台底部；电源适配器、加热器、温度传感器和冷光片均与单片机连接，由单片机控制冷光片发光及暗室内的温度；在暗室的顶部开有圆孔，广角镜头固定暗室顶部的圆孔正下方；智能移动设备通过卡槽固定在暗室顶部外侧，且其摄像头可通过暗室的圆孔透过广角镜头，对暗室内的96孔细胞培养板进行图像采集。

一种基于图像分析的细胞增殖及活性监测的高通量同时同步检测的方法，该方法包括以下步骤：

(1)细胞培养：选用某种细胞系细胞进行培养。采用与该细胞系对应的DMEM培养基进行培养。上述培养基中均添加了体积分数为1％的青霉素-链霉素溶液。所有的细胞于37℃，体积分数为5％CO₂的饱和湿度培养箱中培养。待细胞融合度达到80-90％时，使用含体积分数为0.02％的胰酶将其消化下来，将细胞接种在96孔细胞培养板的培养孔内；

(2)加入显色剂：在96孔细胞培养板的培养孔内接种不同密度的细胞。培养24小时后，选用细胞毒性低的商用细胞增殖及活性检测试剂盒作为显色剂，按照说明书，将其混合进新鲜培养基中，然后将混合了试剂盒溶液的新鲜培养基加入培养孔中；

(3)对细胞增殖及活性进行长时监测：将96孔细胞培养板固定在96孔细胞培养板装载台上。单片机控制冷光片发光，并根据温度传感器反馈的温度信息采用PID控制算法控制加热器对暗室的室内空间加热，实现37℃环境温度的恒温控制。

(4)确定检测细胞数量的最佳标定曲线：通过智能移动设备连续采集96孔细胞培养板的图像。每一次采集到图像后，对采集的图像进行处理，然后再进行下一次采集。其中，对图像的处理过程包括以下子步骤：

(4.1)切割出96孔检测板上的微孔所对应的子图像，子图像的孔内像素范围为10×10；

(4.2)将子图像转换至颜色孔间RGB，提取子图像中每个像素的B分量，并计算子图像像素B分量平均值；

(4.3)计算细胞活性指数CVI，根据公式CVI＝255–C，其中，C为步骤(4.2)中所计算的子图像像素B分量平均值；

基于上述处理过程，每次采集得到的图像对应单个时间点的检测，将每个时间点计算得到的不同细胞密度的细胞活性指数CVI连接，绘出细胞活性指数CVI对时间的连续图谱。然后，遍历所有时间点，根据最小二乘法拟合曲线算法，拟合出每个时间点的细胞活性指数CVI，关于已知密度的细胞浓度以10为底的对数的标定曲线。从所有的拟合标定曲线中，选出拟合优度最大的标定曲线，即检测细胞数量的最佳标定曲线；

(5)检测未知密度的细胞溶液的细胞数量：将未知密度的待测样品溶液加入到96孔细胞培养板的培养孔中，重复步骤(1)-步骤(4.3)，得到该待测样品溶液的细胞活性指数CVI，然后根据步骤(4)确定的最佳标定曲线的时间点，获得待测样品溶液在该时间点的细胞活性指数CVI，带入步骤(4)得到的检测细胞数量的最佳标定曲线，计算出待测样品溶液的细胞数量。

本发明的有益效果是：本发明实现了细胞增殖及活性的实时监测，具有高通量、同时同步、长时监测、操作简便和成本低廉等优点。本发明较现有的细胞增殖及活性检测方法上，具有操作步骤简单，成本低廉，高通量同时同步，长时监测细胞增殖及活性等优点，克服现有方法无法同时同步地长时监测的缺点。根据以上优点，本发明的装置及方法可广泛用于药物筛选、药物发现及生物毒素检测等相关领域。

附图说明

图1是本发明细胞增殖及活性监测的高通量同时同步检测装置整体结构图；

图2是本发明所使用的96孔细胞培养板结构图；

图3是本发明监测细胞增殖及活性算法流程图；

图4是本发明监测不同密度的细胞溶液的细胞活性指数CVI谱线图；

图5是本发明确定的检测细胞数量的最佳标定曲线的结果图；

图中，电源适配器1、广角镜头2、智能移动设备3、暗室4、底座5、96孔细胞培养板6、96孔细胞培养板装载台7、冷光片8、单片机9、加热器10和温度传感器11。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但并不是限制本发明。

如图1、2所示，本发明基于图像分析的贝类腹泻性毒素的高通量检测装置，包括：电源适配器1、广角镜头2、智能移动设备3、暗室4、底座5、96孔细胞培养板6、96孔细胞培养板装载台7、冷光片8、单片机9、加热器10和温度传感器11；其中，暗室4与底座5通过隔板分离；单片机9和电源适配器1固定在底座5内；暗室4中具有可抽拉的96孔检测板装载台7，96孔细胞培养板6通过卡槽固定在96孔细胞培养板装载台7顶部，冷光片8通过卡槽固定在96孔细胞培养板装载台7底部；电源适配器1、加热器10、温度传感器11和冷光片8均与单片机9连接，由单片机9控制冷光片8发光及暗室4内的温度；在暗室4的顶部开有圆孔，广角镜头2固定暗室4顶部的圆孔正下方；智能移动设备3通过卡槽固定在暗室4顶部外侧，且其摄像头可通过暗室4的圆孔透过广角镜头2，对暗室4内的96孔细胞培养板6进行图像采集。

一种应用上述装置长时监测细胞增殖及活性的方法，包括以下步骤：

(1)细胞培养：选用肝癌细胞HepG2进行培养。HepG2的培养基为含有体积分数为10％FBS的DMEM培养基。上述培养基中均添加了体积分数为1％的青霉素-链霉素溶液。所有的细胞于37℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度培养箱中培养。待细胞融合度达到80-90％时，使用含体积分数为0.02％的胰酶将其消化下来，将HepG2细胞接种在96孔细胞培养板6的培养孔内。

(2)加入显色剂：在96孔细胞培养板6的培养孔内接种0、5000、10000、20000、30000、40000、50000和60000个/孔不同密度的细胞。培养24小时后，选用细胞增殖及细胞活性检测试剂盒CCK-8作为显色剂，按照说明书，将其混合进新鲜培养基中，配制成含有体积分数为10％CCK-8试剂的新鲜培养基。然后，将混合了试剂盒溶液的新鲜培养基加入培养孔中；

(3)对细胞增殖及活性进行长时监测：将96孔细胞培养板6固定在96孔细胞培养板装载台7上。单片机9控制冷光片8发光，并根据温度传感器11反馈的温度信息采用PID控制算法控制加热器10对暗室4的室内空间加热，实现37℃环境温度的恒温控制。

(4)确定检测细胞数量的最佳标定曲线：通过智能移动设备3连续采集96孔细胞培养板6的图像；每一次采集到图像后，对采集的图像进行处理，然后再进行下一次采集。其中，对图像的处理过程包括以下子步骤：

(4.1)切割出96孔检测板上的微孔所对应的子图像，子图像的孔内像素范围为10×10；

(4.2)将子图像转换至颜色孔间RGB，提取子图像中每个像素的B分量，并计算子图像像素B分量平均值；

(4.3)计算细胞活性指数CVI，根据公式CVI＝255–C，其中，C为步骤(4.2)中所计算的子图像像素B分量平均值；

基于上述处理过程，每次采集得到的图像对应单个时间点的检测，将每个时间点计算得到的不同细胞密度的细胞活性指数CVI连接，绘出细胞活性指数CVI对时间的连续图谱。然后，遍历所有时间点，根据最小二乘法拟合曲线算法，拟合出每个时间点的细胞活性指数CVI，关于已知密度的细胞浓度以10为底的对数的标定曲线。从所有的拟合标定曲线中，选出拟合优度最大的标定曲线，即检测细胞数量的最佳标定曲线；

(5)检测未知密度的细胞溶液的细胞数量：将未知的待测样品溶液加入到96孔细胞培养板的培养孔中，重复步骤(1)-步骤(4.3)，得到该待测样品溶液的细胞活性指数CVI，然后根据步骤(4)确定的最佳标定曲线的时间点，获得待测样品溶液在该时间点的细胞活性指数CVI，带入步骤(4)得到的检测细胞数量的最佳标定曲线，计算出待测样品溶液的细胞数量。

图4为本发明监测不同密度的细胞溶液的细胞活性指数CVI谱线图，从图中可以看出，不同密度细胞的细胞活性随时间的变化情况，证明了本发明方法能够长时监测细胞活性变化。图5为本发明确定的检测细胞数量的最佳标定曲线的结果图，从图中可以看出，本发明方法的得出的最佳标定曲线公式为CVI＝169.4lg[C]-575.5，CVI为细胞活性指数，C为待测样品细胞密度。实验结果证明本发明方法能够准确检测待测样品细胞密度。

Claims (1)

1.一种基于图像分析的细胞增殖及活性监测的高通量同时同步检测的方法，该方法在高通量同时同步检测装置上实现，所述高通量同时同步检测装置包括：电源适配器、广角镜头、智能移动设备、暗室、底座、96孔细胞培养板、96孔细胞培养板装载台、冷光片、单片机、加热器和温度传感器；其中，暗室与底座通过隔板分离；单片机和电源适配器固定在底座内；暗室中具有可抽拉的96孔检测板装载台，96孔细胞培养板通过卡槽固定在96孔细胞培养板装载台顶部，冷光片通过卡槽固定在96孔细胞培养板装载台底部；电源适配器、加热器、温度传感器和冷光片均与单片机连接，由单片机控制冷光片发光及暗室内的温度；在暗室的顶部开有圆孔，广角镜头固定暗室顶部的圆孔正下方；智能移动设备通过卡槽固定在暗室顶部外侧，且其摄像头可通过暗室的圆孔透过广角镜头，对暗室内的96孔细胞培养板进行图像采集；其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)细胞培养：选用某种细胞系细胞进行培养；采用与该细胞系对应的DMEM培养基进行培养；上述培养基中均添加了体积分数为1％的青霉素-链霉素溶液；所有的细胞于37℃，体积分数为5％CO₂的饱和湿度培养箱中培养；待细胞融合度达到80-90％时，使用含体积分数为0.02％的胰酶将其消化下来，将细胞接种在96孔细胞培养板的培养孔内；

(2)加入显色剂：在96孔细胞培养板的培养孔内接种不同密度的细胞；培养24小时后，选用细胞增殖及细胞活性检测试剂盒CCK-8作为显色剂，按照说明书，将其混合进新鲜培养基中，然后将混合了试剂盒溶液的新鲜培养基加入培养孔中；

(3)对细胞增殖及活性进行长时监测：将96孔细胞培养板固定在96孔细胞培养板装载台上；单片机控制冷光片发光，并根据温度传感器反馈的温度信息采用PID控制算法控制加热器对暗室的室内空间加热，实现37℃环境温度的恒温控制；

(4)确定检测细胞数量的最佳标定曲线：通过智能移动设备连续采集96孔细胞培养板的图像；每一次采集到图像后，对采集的图像进行处理，然后再进行下一次采集；其中，对图像的处理过程包括以下子步骤：

(4.1)切割出96孔检测板上的微孔所对应的子图像，子图像的孔内像素范围为10×10；

(4.2)将子图像转换至颜色孔间RGB，提取子图像中每个像素的B分量，并计算子图像像素B分量平均值；

(4.3)计算细胞活性指数CVI，根据公式CVI＝255–C，其中，C为步骤(4.2)中所计算的子图像像素B分量平均值；

基于上述处理过程，每次采集得到的图像对应单个时间点的检测，将每个时间点计算得到的不同细胞密度的细胞活性指数CVI连接，绘出细胞活性指数CVI对时间的连续图谱；然后，遍历所有时间点，根据最小二乘法拟合曲线算法，拟合出每个时间点的细胞活性指数CVI，关于已知密度的细胞浓度以10为底的对数的标定曲线；从所有的拟合标定曲线中，选出拟合优度最大的标定曲线，即检测细胞数量的最佳标定曲线；

(5)检测未知密度的细胞溶液的细胞数量：将未知密度的待测样品溶液加入到96孔细胞培养板的培养孔中，重复步骤(1)-步骤(4.3)，得到该待测样品溶液的细胞活性指数CVI，然后根据步骤(4)确定的最佳标定曲线的时间点，获得待测样品溶液在该时间点的细胞活性指数CVI，带入步骤(4)得到的检测细胞数量的最佳标定曲线，计算出待测样品溶液的细胞数量。