CN106010961B - 高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体装置及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体装置及检测方法，包括有恒温机构（1）、反应板（2）、荧光激发装置（3）、图像摄取机构（4）、便携式计算机（5），其中反应板（2）设置在恒温机构（1）的顶部，荧光激发装置（3）设置在反应板（2）的上方，图像摄取机构（4）设置在荧光激发装置（3）的上方，便携式计算机（5）与图像摄取机构（4）连接。本发明使用廉价的与便携式计算机连接的图像采集设备，通过实时拍摄环介导等温核酸扩增过程中的荧光强度，并通过分析检测食源性致病菌。本发明的高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体装置体积小，用电池供电，在无市电条件下可进行野外作业完成样本的高通量核酸鉴定。本发明的检测方法操作简单，方便实用。
Description
技术领域
本发明是一种高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体装置及检测方法，特别是一种用于在POC条件下完成食源性病原体的快速鉴定的高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体装置及检测方法，属于高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体装置及检测方法的创新技术。
背景技术
在病人身边进行医学诊断或护理，称为医疗照护(POC)，是目前活跃的研究领域，并取得重要进展。近年来多有报道。目前在初级保健和急诊室设有POC测试方法。一些最常见的例子是一次性的妊娠检测和连续血糖监测系统(CGMS)。然而，这些设备还有许多其他更新的应用。例如，基于核酸的方法由于其高特异性和选择性，被认为是检测和鉴定微生物和病毒的金标准。一种能够与诸如聚合酶链反应(PCR)技术进行DNA扩增的POC设备可以显著降低检测成本，减少样品体积，并在各种无法接触到大多数标准实验室设备的环境下缩短出结果的时间。
基于核酸的POC系统目前处于起步阶段前景广阔。在微流体和微/纳米技术领域的最新进展已经能开发小型和灵敏的POC“芯片实验室”诊断仪器，以提供核酸扩增快速分析。便携式诊断设备对POC的DNA的筛查是非常理想的。在例如资源有限的场合，以及家庭检测，包括有限的专业知识和实验设备时为全球卫生所倡议。尤其是当POC设备带有核酸扩增检测(NA-POC检测仪)的功能时，就可以在传染性病原体的准确和快速诊断辅助，在预防感染的传播时起非常重要的作用[4]。
高性价比的POC设备可以以低水平的基础设施需求设立廉价的筛检站，可以发展疾控网络和现场检测感染性病原体。有几种情况证明了NA-POC测试的意义。例如，食品行业花费大量财力(美国农业部专门花费每年1000亿美元，用于控制食源性疾病的病原。POC检测系统将允许所有从事食品生产和商业化的各参与方检测病原体产品，以减少或消除召回和食物有关的疾病。对于POC设备的其他重要的应用包括对患者有害的病毒检测。如果所有机场都有病毒检查设备，2009年H1N1流感大流行应该是可以避免或至少被控制的。检查点配备检查设备，即可以检测到受感染的病人，可预防其传染到其他国家。把发展了40年的半导体技术研究移植到PoC系统是实现成本效益、便携性和快速检测的关键。快速温度循环，是在10分钟或更少时间内进行PCR测定的关键，可以采用半导体作为快速热循环的元件，具有小热质量局部加热器和小体积的特点。半导体还能检测DNA扩增产物，避免使用用昂贵和笨重的光学系统。
其中病原体的核酸扩增检测是鉴定微生物和病毒的重要方法。目前，常规核酸扩增检测是采用光学系统检测荧光或浊度的方法。然而，这种方法需要复杂而昂贵的设备(光纤，LED传感器等)，最低廉的实时PCR分析仪也需要十数万元，会增加成本和增加POC设备的元件的数量。
发明内容
本发明的目的在于考虑上述问题而提供一种价格便宜，体积小，结构更简单的高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体装置。本发明设计合理，方便实用。
本发明的另一目的在于提供一种操作简单，方便实用的高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体装置的检测方法。
本发明的技术方案是：本发明的高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体装置，包括有恒温机构、反应板、荧光激发装置、图像摄取机构、便携式计算机，其中反应板设置在恒温机构的顶部，荧光激发装置设置在反应板的上方，图像摄取机构设置在荧光激发装置的上方，便携式计算机与图像摄取机构连接。
本发明使用高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体的装置的检测方法，检测操作分为四个阶段：第一步是准备环介导等温扩增试剂和缓冲液、第二步是样品准备、第三步是加样、第四步是实时荧光成像和数据分析，各阶段具体如下：
第一步：准备环介导等温扩增试剂和缓冲液：
对于每个样品，需总体积10-50μL的准备环介导等温扩增试剂和缓冲液溶液制备成分，优选为30μL；
准备环介导等温扩增试剂和缓冲液试剂包括如下组份，如下标示含量为终浓度：甜菜碱500-1500mM，三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)混合物各1.5mM，1×等温缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)20mM，硫酸铵10mM，曲拉通(Triton)X-100 8mM，氯化钾20mM)，硫酸镁5-15mM，引物混合物0.5-3.5μM，嗜热脂肪芽孢杆菌(BST)热启动聚合酶0.4-1单位/μL，荧光染料20μM；
第二步：上述样品准备在无菌操作下取适量的食品、患者分泌物或粪便的临床样本，接种于增菌培养液中，在37℃下恒温培养12-16小时；无菌条件下取需量的培养液，再次接种于同种增菌液中，振荡培养4-6小时；取1-2ml菌液离心，转速为5000rpm，5-6分钟得到菌体沉淀；用双蒸水洗涤菌体2-3遍后，加入100μL无菌双蒸水悬浮，在100℃下煮沸约10-12分钟，离心，转速为12000rpm，3-4分钟得上清液，即为菌粗制DNA。阳性对照标准和阴性对照标准按相同方法处理；
第三步：上述加样按每孔10-30μL体积加入LAMP溶液，再分别加1μL样品，以及对照品，加样完成后每孔再加20μL石蜡油，防止反应液失水；
第四步：上述实时荧光成像采用具备自动快门的相机拍摄照片，每分钟一次记录扩增过程中荧光强度，加上FITC滤镜拍摄荧光图像,图像依次保存后分析。
本发明由于采用将计算机图像方法用于检测扩增产物的结构，核酸扩增会变得更便宜，更小和更简单。本发明利用小型的图像采集装置，对于温度循环和核酸扩增检测是成功的NA-POC检测仪器的基本元件。本发明使用廉价的与便携式计算机连接的图像采集设备，通过实时拍摄环介导等温核酸扩增过程中的荧光强度，并通过软件分析，检测食源性致病菌。本发明体积小，用电池供电，在无市电条件下可进行野外作业完成样本的高通量核酸鉴定。本发明的高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体的装置设计巧妙，性能优良，方便实用。本发明的高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体的检测方法操作简单，方便实用。
附图说明
图1为本发明的原理图；
图2为微孔板上设有的微孔的放大图。
具体实施方式
实施例1：
本发明的原理图如图1所示，本发明高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体的装置，包括有恒温机构1、反应板2、荧光激发装置3、图像摄取机构4、便携式计算机5，其中反应板2设置在恒温机构1的顶部，荧光激发装置3设置在反应板2的上方，图像摄取机构4设置在荧光激发装置3的上方，便携式计算机5与图像摄取机构4通过数据线6连接。
本实施例中，上述恒温机构包括有保温室、电源、加热元件、恒温控制器、温度传感器，加热元件及温度传感器设置在保温室内，电源与加热元件连接，恒温控制器与加热元件连接。
此外，上述恒温控制器上设有温度设定装置，温度设定装置为温度设定面板或开关。上述温度设定面板主要对恒温室温度设定，温度设定面板可采用触控液晶面板，开关可采用拨动开关设定。并且设定完成后确认进行温控过程；上述保温室构成可根据所使用的DNA扩增酶，设定成适宜温度，恒温温度范围控制在±0.5℃范围内；上述加热元件用电阻片，或电热管，或半导体或低电压加热器，功率为10-100瓦。；上述恒温控制器由单片机控制电路板组成，按设定温度从传感器接收温度信息，控制加热器的开关，完成高精度温度控制；上述温度传感器由加热部位传感器和样品部位传感器组成，加热部位传感器连接简单温度控制电源开关装置，主要防止温度过高造成仪器损坏。
为了确保保温效果，上述恒温室由3层结构组成立方腔体，外层是保护层，由金属或工程塑料压制成型；中间层为保温材料；内层为金属层，恒温室内侧壁靠底部固定加热元件以及温度传感器，加热腔上有液体石蜡或和反应板契合的金属孔板，以进行有效的热传递过程。
本实施例中，上述电源部分包括有小型蓄电池和整流稳压电路、充电电路，并可通过常用交流电进行供电或充电。
本实施例中，上述反应板2的结构为微孔板，微孔板上设有微孔7，微孔7上放置有反应液71，激发光72经过反应液71后反射出反射光73，如图2所示，微孔板的材质为聚乙烯或其他有机聚合材料，应不影响DNA聚合酶反应。
本实施例中，上述荧光激发装置3由能发射激发光的LED或紫外线灯管31和滤光片32组成，LED或紫外线灯管31和滤光片32位于反应板2的上方侧面，固定在恒温室上。上述LED或紫外线灯管31发射的激发光的波长为纳米级，SYBR Green I在低于485nm波长处被激发。
本实施例中，上述图像摄取机构4包括有数码相机41、镜头42、荧光滤光片43、遮光罩44，其中镜头42置于数码相机41的下方，荧光滤光片43置于镜头42的下方，且荧光滤光片43置于遮光罩44的顶部。数码相机41采用能进行荧光拍摄的相机或摄像头，镜头42应满足孔板拍摄时各部位荧光都能拍摄到并且影像无畸变；荧光滤光片43选择仅在DNA染料发射波长，如采用Evagreen时λ＝495nm，SYBR Green I时λ＝520nm的有高通特性的滤光片；遮光罩44可用多层厚的黑布或塑料板制备，防止环境光线干扰荧光拍摄；上述便携式计算机5采用常见的笔记本电脑，安装操作系统如windows，以及图像采集接口，如USB3或IEEE1394以进行高速图像采集。软件部分应有图像采集软件和荧光图像分析软件。
本发明使用高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体的装置的检测方法，检测操作分为四个阶段：第一步是准备环介导等温扩增试剂和缓冲液、第二步是样品准备、第三步是加样、第四步是实时荧光成像和数据分析，各阶段具体如下：
第一步：准备环介导等温扩增试剂和缓冲液：
对于每个样品，需总体积30μL的环介导等温扩增试剂和缓冲液；
LAMP溶液制备成分：
a)甜菜碱1000mM；
b)dNTPs 1.4mM混合物；
c)1×等温缓冲液(Tris-HCl)20mM，硫酸铵10mM，Triton X-100 8mM，氯化钾20mM)；
d)硫酸镁10mM；
e)引物混合物1μM；
f)嗜热脂肪芽孢杆菌(BST)2.0热启动聚合酶0.5单位/μL
g)荧光染料20μM(SYBR Green I)。
第二步是样品准备:在无菌操作下取100μL临床样本，接种于5mL增菌培养液中，在37℃下恒温培养12-16小时；无菌条件下取50μL的培养液，再次接种于同种5mL增菌液中，振荡培养4小时；取1ml菌液离心，转速为5000rpm，5分钟得到菌体沉淀；用双蒸水洗涤菌体3遍后，加入100μL无菌双蒸水悬浮，在100℃下煮沸约10分钟，离心，转速为12000rpm，3分钟得上清液，即为菌粗制DNA。阳性对照标准和阴性对照标准按相同方法处理。
第三步是加样:按每孔30μL体积加入LAMP溶液，再分别加1μL样品，以及对照品。加样完成后每孔再加20μL石蜡油，防止反应液失水。
第四步是实时荧光成像和数据分析:
实时荧光成像采用具备自动快门的相机拍摄照片，每分钟一次记录扩增过程中荧光强度。采用NIS–Elements 3.4相机(尼康仪器公司梅尔维尔，纽约州)，加上FITC滤镜拍摄荧光图像。图像依次保存后分析。
进行DNA扩增的结果分析原理是荧光染料结合到LAMP产物双链DNA中，DNA拷贝数越多，荧光发射强度就越大。荧光图像用ImageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij/)软件分析，使用原始像素集成密度分析方法\RawIntDen。该方法主要是把图像或选择区域中未经校准像素值取总和，板中的所有位置使用堆栈测量插件(stack-measurement plugin)测量，形成Excel文件，然后将数值导入到matlab进行进一步的分析。
Matlab程序读取ImageJ的所生成的Excel文件，并为每个孔创建一个数列，多个孔荧光强度值形成矩阵。这个矩阵中数值均进行归一化，即采用第一个孔的荧光值(即第一个孔被设置为1)归一化。程序把相对荧光单位(RFU)相对于时间绘制曲线，计算标准误差和阈值的平均值。阈值是由用户在1.2-1.4之间选择一个值，即手动定义为荧光强度的增量比噪声强度高20到40％。本发明在实验中，阈值RFU被设置为1.2(增加20％荧光强度)或1.35(增加35％荧光强度)，用于确定实验的非特异性扩增。
使用荧光强度的导数随着时间变化进行阈值倍数分析。阈值时间定义为达到最大导数的时间。以这种方式，可以看到在阈值倍数的细小差别。
本发明所用缩写：POC医疗照护,LAMP环介导等温扩增,LED发光二极管,PCR聚合酶链式反应,NA核酸,CGMS连续血糖监测系统,DNA脱氧核糖核酸,USB计算机串行总线之一,IEEE 1394计算机高速串行口之一,RT-PCR实时PCR,μL微升,mM毫摩尔/升,μM微摩尔/升,rpm转/分钟,RFU相对荧光单位。
实施例2：
本实施例与实施例1的区别是检测操作的各阶段具体如下：
第一步：准备环介导等温扩增试剂和缓冲液：
对于每个样品，需总体积10μL的准备环介导等温扩增试剂和缓冲液溶液制备成分；
准备环介导等温扩增试剂和缓冲液试剂包括如下组份，如下标示含量为终浓度：甜菜碱500mM，三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)混合物各1.3mM，1×等温缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)20mM，硫酸铵10mM，曲拉通(Triton)X-100 8mM，氯化钾20mM)，硫酸镁5mM，引物混合物0.5μM，嗜热脂肪芽孢杆菌(BST)热启动聚合酶0.4单位/μL，荧光染料20μM；
第二步：上述样品准备在无菌操作下取适量的食品、患者分泌物或粪便的临床样本，接种于增菌培养液中，在37℃下恒温培养12小时；无菌条件下取需量的培养液，再次接种于同种增菌液中，振荡培养5小时；取1.5ml菌液离心，转速为4500rpm，5.5分钟得到菌体沉淀；用双蒸水洗涤菌体2遍后，加入100μL无菌双蒸水悬浮，在100℃下煮沸约11分钟，离心，转速为11500rpm，3.5分钟得上清液，即为菌粗制DNA。阳性对照标准和阴性对照标准按相同方法处理；
第三步：上述加样按每孔10μL体积加入LAMP溶液，再分别加1μL样品，以及对照品，加样完成后每孔再加20μL石蜡油，防止反应液失水；
第四步：上述实时荧光成像采用具备自动快门的相机拍摄照片，每分钟一次记录扩增过程中荧光强度，加上FITC滤镜拍摄荧光图像,图像依次保存后分析。
实施例3：
本实施例与实施例1的区别是检测操作的各阶段具体如下：
第一步：准备环介导等温扩增试剂和缓冲液：
对于每个样品，需总体积50μL的准备环介导等温扩增试剂和缓冲液溶液制备成分；
准备环介导等温扩增试剂和缓冲液试剂包括如下组份，如下标示含量为终浓度：甜菜碱1500mM，三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)混合物1.5mM，1×等温缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)20mM，硫酸铵10mM，曲拉通(Triton)X-100 8mM，氯化钾20mM)，硫酸镁15mM，引物混合物3.5μM，嗜热脂肪芽孢杆菌(BST)热启动聚合酶1单位/μL，荧光染料20μM；
第二步：上述样品准备在无菌操作下取适量的食品、患者分泌物或粪便的临床样本，接种于增菌培养液中，在37℃下恒温培养16小时；无菌条件下取需量的培养液，再次接种于同种增菌液中，振荡培养6小时；取2ml菌液离心，转速为5500rpm，6分钟得到菌体沉淀；用双蒸水洗涤菌体3遍后，加入100μL无菌双蒸水悬浮，在100℃下煮沸约12分钟，离心，转速为12500rpm，4分钟得上清液，即为菌粗制DNA。阳性对照标准和阴性对照标准按相同方法处理；
第三步：上述加样按每孔20μL体积加入LAMP溶液，再分别加1μL样品，以及对照品，加样完成后每孔再加20μL石蜡油，防止反应液失水；第四步：上述实时荧光成像采用具备自动快门的相机拍摄照片，每分钟一次记录扩增过程中荧光强度，加上FITC滤镜拍摄荧光图像,图像依次保存后分析。
Claims (1)
1.一种使用高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体的装置的检测方法，高通量环介导等温扩增鉴定食源性病原体的装置包括有恒温机构(1)、反应板(2)、荧光激发装置(3)、图像摄取机构(4)、便携式计算机(5)，其中反应板(2)设置在恒温机构(1)的顶部，荧光激发装置(3)设置在反应板(2)的上方，图像摄取机构(4)设置在荧光激发装置(3)的上方，便携式计算机(5)与图像摄取机构(4)连接，其特征在于检测方法是非诊断目的，其检测操作分为四个阶段：第一步是准备环介导等温扩增试剂和缓冲液、第二步是样品准备、第三步是加样、第四步是实时荧光成像和数据分析，各阶段具体如下：
第一步：准备环介导等温扩增试剂和缓冲液：
对于每个样品，需总体积10-50μL的准备环介导等温扩增试剂和缓冲液溶液制备成分；
准备环介导等温扩增试剂和缓冲液试剂包括如下组份，如下标示含量为终浓度：甜菜碱500-1500mM，三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)混合物各1.5mM，1×等温缓冲液，硫酸镁5-15mM，引物混合物0.5-3.5μM，嗜热脂肪芽孢杆菌(BST)热启动聚合酶0.4-1单位/μL，荧光染料20μM，上述缓冲液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)20mM，硫酸铵10mM，曲拉通(Triton)X-100 8mM，氯化钾20mM组成；
第二步：上述样品准备在无菌操作下取适量的食品、患者分泌物或粪便的临床样本，接种于增菌培养液中，在37℃下恒温培养12-16小时；无菌条件下取需量的培养液，再次接种于同种增菌液中，振荡培养4-6小时；取1-2ml菌液离心，转速为5000rpm，5-6分钟得到菌体沉淀；用双蒸水洗涤菌体2-3遍后，加入100μL无菌双蒸水悬浮，在100℃下煮沸10-12分钟，离心，转速为12000rpm，3-4分钟得上清液，即为菌粗制DNA；阳性对照标准和阴性对照标准按相同方法处理；
第三步：上述加样按每孔10-30μL体积加入LAMP溶液，再分别加1μL样品，以及对照品，加样完成后每孔再加20μL石蜡油，防止反应液失水；
第四步：上述实时荧光成像采用具备自动快门的相机拍摄照片，每分钟一次记录扩增过程中荧光强度，加上FITC滤镜拍摄荧光图像,图像依次保存后分析；
进行DNA扩增的结果分析原理是荧光染料结合到LAMP产物双链DNA中，DNA拷贝数越多，荧光发射强度就越大；荧光图像用ImageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij/)软件分析，使用原始像素集成密度分析方法\RawIntDen；该方法是把图像或选择区域中未经校准像素值取总和，板中的所有位置使用堆栈测量插件测量，形成Excel文件，然后将数值导入到matlab进行进一步的分析；
Matlab程序读取ImageJ的所生成的Excel文件，并为每个孔创建一个数列，多个孔荧光强度值形成矩阵，这个矩阵中数值均进行归一化，即采用第一个孔的荧光值归一化，第一个孔被设置为1，程序把相对荧光单位(RFU)相对于时间绘制曲线，计算标准误差和阈值的平均值，阈值是由用户在1.2-1.4之间选择一个值，即手动定义为荧光强度的增量比噪声强度高20到40％，用于确定实验的非特异性扩增；
使用荧光强度的导数随着时间变化进行阈值倍数分析，阈值时间定义为达到最大导数的时间，以这种方式，可以看到在阈值倍数的细小差别。
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