CN103045469A

CN103045469A - 多通道环介导核酸等温扩增定量检测器

Info

Publication number: CN103045469A
Application number: CN2013100173218A
Authority: CN
Inventors: 鲍军波; 方雪恩; 孔继烈
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2013-04-17

Abstract

本发明属于核酸等温扩增技术领域，具体涉及一种用于多通道环介导核酸等温扩增定量（LAMP）检测器。本发明的检测器以可更换LAMP芯片为核心，由检测器控制主板、与上位机通讯或检测器之间通讯及仪器调试用和检测数据存贮打印用的主板接口、电源、显示屏、操作面板/按键、光源及光电检测器、光纤连接线、检测芯片、反光镜片、加热板、进样池、废液池、泵/阀、液路连接管等组成。使用本检测器可自动化快速定量检测样品中的特征核酸分子，具有灵敏度高、检测速度快、特异性强、操作简单、结果稳定、自动给出测量结果等优点。本发明适用于实验研究、临床检测、食品安全检测、药物筛选等领域中的核酸检测。

Description

多通道环介导核酸等温扩增定量检测器

技术领域

本发明属于核酸等温扩增技术领域，具体涉及一种用于多通道环介导核酸等温扩增定量（LAMP）检测器。

技术背景

常规的病原微生物检测方法是采用体外培养技术，但是，仅有约1%的细菌或病毒可以培养，以及培养过程的复杂性和漫长的培养时间，大大限制了这样技术的普及。以聚合酶链反应（PCR）为代表的基于核酸的检测技术发展迅速，为病原体的精确检测诊断提供了可能。经过几十年的改进，PCR方法已从定性发展为定量，能够在几个小时内，从几个拷贝或单个细胞开始扩增到数十亿特异性的核酸片段，而且特异性也有了极大的提高。然而，从PCR技术的诞生之日起，它始终无法摆脱依赖精良仪器设备的局限，使得以PCR为基础的核酸扩增检测技术无法更广泛地推广和应用。

基于这种强烈的需求，以核酸等温扩增技术为基础的检测技术近年来得到了迅猛的发展。核酸等温扩增技术不需要温度变化的时间过程，摆脱了对精良仪器设备的依赖，使得我们对病原体的检测诊断得以快速并高通量的实现。Notomi 等于2000 年开发的环介导等温扩增法( loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 技术，其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 条特异引物，并利用一种链置换DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等温条件(65 ℃左右) 保温几十分钟，即可高效、快速、高特异地完成靶核酸序列的扩增反应。该技术不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAMP 是一种崭新的DNA 扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点，具有替代PCR 方法的可能性。近年来，国外己将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(2007)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Obuyuki Rayashi等人（2007）针对四种香酒酵母的ITS序列设计了特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。

LAMP法的原理

DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区段的3' 末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补，以3' 末端为起点，通过链置换型DNA聚合酶的作用，一边置换先头FIP引物合成的DNA链。一边合成自身DNA，如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，这条单链在5' 末端存在互补的Flc 和Fl 区段，于是发生自我碱基配对，形成环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以BIP引物的3' 端为起点，合成互补链，在此过程中环状结构被打开。接着，类似于F3，B3引物从BIP引物外侧插入，进行碱基配对，以3' 端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述两过程，形成双链DNA。而被置换的单链DNA两端存在互补序列，自然发生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构。该结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。至此为止的所有过程都是为了形成LAMP法基因扩增循环的起点结构。

在哑铃状结构中，以3' 末端的Fl 区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应。解离由F1区段合成的双链核酸。同样，在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。在环状结构上存在单链形式B2c，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增。经过相同的过程，又形成环状结构。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。

该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，且可在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在15～60 min扩增10⁹～10¹⁰ 倍；特异性高，所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应，用浊度仪检测沉淀浊度来判定的。

(1)荧光定量检测：利用SYBR Green I 荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA双链结合时，发出较原先强800～1000倍的荧光的原理，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。在核酸大量合成时，SYBR Green I 能自动掺入双链DNA，通过检测所产生的荧光强度，获取Ct值，比照标准曲线，可确定模板DNA的起始拷贝数。

(2)焦磷酸镁副产物的浊度检测：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺ 结合，产生焦磷酸镁副产物沉淀。反应方程式如下：

(DNA)_n-1 +dNTP=(DNA)_n+P₂O₇ ^4-

P₂O₇ ^4- +2Mg²⁺=Mg₂P₂O₇(沉淀)

此反应具有极高的特异性，在400nm光下，检测沉淀浊度就能够判断扩增与否。

LAMP还可以检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病、巨细胞病毒、埃博拉病毒、慢性伯基特淋巴瘤病毒、虹彩病毒，人类疤疹病毒、造血组织坏死病毒、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒、口蹄疫病毒等的检测。

但是LAMP反应的“等温模式”和其复杂的核酸探针使其不能实现一个样品中多种目标物的同时检测，即多重检测。微流控芯片技术的发展为我们提供了一个十分有效的解决方案。利用微流控芯片相关技术解决了LAMP检测的多重性难题，克服了上述缺陷。本发明为LAMP芯片提供一种多通道的LAMP检测仪，其检测原理为光电比色法，其分析对象为各类核酸分子，例如病原微生物及其他生物样品。

本发明的检测器以LAMP芯片核心，由检测器控制主板1、与上位机通讯或检测器之间通讯及仪器调试或数据存贮打印用的主板接口2、电源3、显示屏4、操作面板/按键5、光源及光电检测器6、光纤连接线7、检测芯片8、反光镜片9、加热板10、进样池11、废液池12、泵/阀13、液路连接管14等组成。检测方法包括进样、温控和检测等。

发明内容

本发明的目的是提供一种可更换芯片的多重LAMP检测器，一个芯片可以同时检测一个样品中多种目标物，更换不同芯片，可以实现多种病原体或其他核酸检测

本发明提供的多通道核酸等温扩增定量检测器，采用于环介导等温扩增及微流控芯片技术，快速检测病原微生物。

本发明的检测器由电路、LAMP芯片、液路和光路四个部分构成。电路部分控制液路和光路，并采集处理光路中的光电信号，控制液路中的泵阀开启停止或关闭，LAMP芯片通过光纤和液体管路与光路及液路连接。

电路部分由电源3、主板1、显示屏4、键盘/操作面板5及主板接口2构成。电源3可采用市电供电或12V电池供电，主板1采用MCU作为控制器及数据采集芯片，如C8051F340或STM32F106等，采用片上集成A/D或前置信号放大器转换为数字信号后输入到MCU。主板接口2的功能是与上位机通讯或检测器之间通讯及仪器调试或数据存贮和打印使用，如USB接口、RS232、SF卡接口、网络接口、无线通讯接口等。

液路部分由进样池11、废液池12、泵/阀13和连接管道14构成；样品及检测试剂均由进样池11注入。

LAMP芯片具有光纤和液路管道接口，内有扩增池，扩增池内包被针对目标物的特异性探针，通过可更换LAMP芯片与被测液体进行接触，保证了仪器主体部分并不与被测液体进行接触，从而避免了被测液体和化学试剂对检测器主体的腐蚀，也使得被测液体与电气单元完全地隔离起来，提高了安全性，还具有抗干扰性。

光路部分由检测用光源与光电检测器6、连接光纤7及光反射镜8构成。连接光纤7由3根以上的多模光纤组成，具有传导光源光和芯片光的双重作用，检测光源采用激光器组件，包含波长为650nm的红色可见二极管激光器；电源3经过控制主板1与检测光源的激光二极管相连；光电检测器的光信号通过光电池检测。

多重LAMP检测器所采用的可更换LAMP芯片接口，且接口具有可扩展性，可以根据实际需求更换不同数量检测通道的芯片，芯片内的检测通道数决定了光纤接口的数量，如三重、五重或十重通道分别外接3个、5个、10个检测光纤，实现任意多重的LAMP有效扩增及多重LAMP检测信号的有效区分，为临床多种病原体快速诊断提供一种有效手段。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1）本发明的检测器可以更换各种类型的多通道芯片，以实现多重LAMP信号的有效区分，结果直观检测并显示存贮到SD卡中，检测器便携，功耗低，可用电池驱动，有利于LAMP方法的推广和应用。

2）可以根据实际需求更换任意多重的LAMP有效扩增芯片8，从而满足临床任意多种病原体的有效快速诊断。

3）从加样到结果检测全部自动化操作，简单方便，非专业人员通过检测器上带有的例程即可成功操作。

4）使用本检测器可自动化快速定量检测样品中的特征病原体，具有灵敏度高、检测速度快、特异性强、操作简单、结果稳定、自动给出测量结果、便携等优点。本检测器与芯片相连接的探头部分采用光纤及全防腐材料制成，且主体部分并不与被测液体进行接触，从而避免了被测液体和化学试剂对检测器主体的腐蚀，具有耐腐蚀性，也使得被测液体与电气单元完全地隔离起来，提高了安全性。芯片更换操作简单，清洗方便，且对被测液体的取样量需求很少，避免了样品及检测试剂的浪费，还把污染等风险降低到最小。

本发明的检测体系在自动控温的条件下，快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测各种病原微生物及其他生物样品，为临床、医学研究、环境、食品安全等领域的应用提供了新的技术平台，能较好满足现场检测的迫切需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。适合从事分子生物学、临床医学、药学、环境科学等学科的科研工作者使用。

附图说明

图1多重LAMP检测器原理图。

图2多重LAMP检测器原理框图。

图3多重LAMP检测器芯片结构图。

图中标号： 1. 检测器主板；2. 接口，与上位机通讯或检测器之间通讯及仪器调试用；3. 电源；4. 显示屏；5. 操作面板/按键；6. 光源及光电检测器；7. 光纤连接线；8. 检测芯片；9. 反光镜片；10. 加热板；11. 进样池；12. 废液池；13. 泵/阀；14. 液路连接管。

具体实施方式

（1）仪器基本结构

本发明的多重LAMP微流控芯片检测器在结构上主要包括电路、LAMP芯片、液路和光路四个部分（附图1）：电路部分是由电源3、主板1、显示屏4、键盘/操作面板5及主板接口2等部分构成。电源3可采用市电供电或12V电池供电，主板1采用51系列（如C8051F340）或ARM系列（如STM32F106）MCU作为控制及数据采集芯片，采用片上集成A/D或前置信号放大器并转换为数字信号后输入到MCU，如采用CS5532模块或ADS1230模块。主板接口2的功能是与上位机通讯或检测器之间通讯及仪器调试或数据存贮使用；液路部分是由进样池11、废液池12、泵/阀13和连接管道14构成；LAMP芯片（可按现有技术制备）具有光纤和液路管道接口，内有扩增池，扩增池内包被针对目标物的特异性探针，芯片内的检测通道数决定了光纤接口的数量，如三重、五重或十重通道分别外接3个、5个、10个检测光纤。光路部分是由光源与光电检测器6、连接光纤7及光反射镜构成。连接光纤7是由3根以上的多模光纤组成，具有传导光源光和芯片光的双重作用。附图3示出了本发明的芯片与光纤及液体管路的连接方式。

检测器供电可使用市电或电池供电，实现便携及现场检测。

（2）仪器操作流程

开机 → 自检 → 泵阀复位 → 光源开启及加热器开启并检测至稳定 → 显示正常并等待键盘命令，如果检测到上位机，则将控制权交由上位机。

（3）样品测试流程

安装芯片8 → 进样泵/阀开启 → 排液阀打开 → 进样泵启动→ 检测光信号并显示，如果有上位机，则向上位机传送数据。

上述的箭头→ 表示流程的行进次序。

（4）操作实例

下面结合具体实例对本发明做进一步描述，但具体实例并不对本发明做任何限定。

实施例1 甲型流感病毒 (Flu A virus), 季节性甲型流感病毒 (Seasonal flu A virus)和2009年猪源性甲型流感病毒(Pandemic flu A virus)快速分型检测。

将包被有三种流感病毒的特异性LAMP探针的芯片安装到芯片架上，开机。注入4 μL三种病毒标准品液和临床参考品，然后注入46 μL LAMP扩增液，关闭进样阀，反应1小时。结果显示三种标准品及相应的扩增池中出现LAMP信号, 阴性对照通道中不出现信号。

实施例2 八种重要猪病病毒的分型检测。

将包被有猪口蹄疫病毒（FMDV），猪瘟病毒 (CSFV)，猪蓝耳病病毒 (PRRSV)，猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)，猪伪狂犬病毒 (PRV)，猪细小病毒 (PPV)，猪圆环病毒 (PCV)，猪流感病毒 (SIV)八种重要猪病病毒的LAMP特异核酸探针的功能分型芯片安装到芯片架上，开机。待光路与温度稳定后，注入样品1(FMDV），样品2(CSFV）, 样品3（PRRSV）,样品4 (TGEV), 样品5(PRV), 样品6(PPV), 样品7(PCV）, 样品8（SIV）,样品9（FMDV，CSFV），样品10（FMDV，CSFV，PRRSV），样品11（FMDV，CSFV，PRRSV，TGEV），样品12（FMDV，CSFV，PRRSV，TGEV，PRV），样品13（FMDV，CSFV，PRRSV，TGEV，PRV，PPV），样品14（FMDV，CSFV，PRRSV，TGEV，PRV，PPV，PCV），样品15（FMDV，CSFV，PRRSV，TGEV，PRV，PPV，PCV，SIV），然后注入LAMP扩增液，封闭芯片，反应1小时，检测、显示并存贮结果，排出废液。实验结果能很好地区分八种猪病病毒，也可以判定出样品中目标病原体的类型。

Claims

1. 一种多重LAMP检测器，其特征在于：该检测器由电路、LAMP芯片、液路和光路四个部分构成；所述的电路部分控制液路和光路，并采集处理光路中的光电信号，控制液路中的泵阀开启停止或关闭，所述的LAMP芯片通过光纤和液体管路与光路及液路连接。

2. 如权利要求1所述的多重LAMP检测器，其特征在于电路部分由电源（3）、主板（1）、显示屏（4）、键盘/操作面板（5）及主板接口（2）构成；主板（1）采用51系列或ARM系列MCU作为控制及数据采集芯片，采用片上集成A/D或采用前置信号放大器并转换为数字信号后输入到MCU；主板接口（2）的功能是与上位机通讯或检测器之间通讯及仪器调试或数据存贮、打印使用。

3. 如权利要求1所述的多重LAMP检测器，其特征在于液路部分由进样池（11）、废液池（12）、泵/阀（13）和连接管道（14）构成；样品及检测试剂均由进样池（11）注入。

4. 如权利要求1所述的多重LAMP检测器，其特征在于LAMP芯片具有光纤和液路管道接口，内有扩增池，扩增池内包被针对目标物的特异性探针，通过可更换LAMP芯片与被测液体进行接触，保证仪器主体部分并不与被测液体进行接触。

5. 如权利要求1所述的多重LAMP检测器，其特征在于光路部分由检测用光源与光电检测器（6）、连接光纤（7）及光反射镜（8）构成；连接光纤（7）由3根以上的多模光纤组成，具有传导光源光和芯片光的双重作用，检测光源采用激光器组件，包含波长为650nm的红色可见二极管激光器；电源（3）经过控制主板（1）与检测光源的激光二极管相连；光电检测器的光信号通过光电池检测。

6. 如权利要求1所述的多重LAMP检测器，其特征在于所采用可更换LAMP芯片接口，且接口具有可扩展性，可以根据实际需求更换不同数量检测通道的芯片，芯片内的检测通道数决定了光纤接口的数量，实现任意多重的LAMP有效扩增及多重LAMP检测信号的有效区分，为临床多种病原体快速诊断提供一种有效手段。

7. 如权利要求1所述的多重LAMP检测器，其特征在于基本操作与测试流程：开机 → 自检 → 泵阀复位 → 光源开启及加热器开启并检测至稳定 → 显示正常并等待键盘命令，如果检测到上位机，则将控制权交由上位机。

8.如权利要求1所述的多重LAMP检测器，其特征在于基本测试流程：

安装芯片（8）→ 进样泵/阀开启 → 排液阀打开 → 进样泵启动→ 检测光信号并显示并存贮打印，如果有上位机，则向上位机传送数据。