CN110714049B - 一种检测生物标志物的微生物传感器及检测方法、培养与检测芯片和检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测生物标志物的微生物传感器，由组分A和组分B组成，组分A为磁珠与核酸适配体的偶联物，核酸适配体能够与目标生物标志物特异性结合；组分B为转化荧光蛋白并表达抗性的基因工程菌液，并在基因工程菌株上修饰核酸探针。核酸探针的全部核酸序列与核酸适配体部分序列互补，目标生物标志物与核酸探针竞争结合核酸适配体的结合位点，通过荧光强度来检测目标生物标志物的含量。本发明在建立基因工程微生物表面核酸探针修饰及表征技术、生物标志物与核酸适配体及微生物荧光探针三者竞争反应的基础上，发展了准确灵敏的核酸适配体耦合微生物荧光探针的生物标志物定量检测新技术。

Description

一种检测生物标志物的微生物传感器及检测方法、培养与检 测芯片和检测系统

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种检测生物标志物的微生物传感器及检测方法、培养与检测芯片和检测系统。

背景技术

生物标志物是在疾病发生过程中发生显著改变的分子，可以是核酸、蛋白质、代谢物、同工酶或者是激素，分为诊断性生物标志物、预后性生物标志物和预测性生物标志物。发展准确灵敏的生物标志物定量检测技术不仅对疾病的早期诊断具有重要意义，还能实时监控疾病的进程，以便作出及时治疗。

常用的蛋白类生物标志物的检测方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)、电化学分析法、化学发光免疫分析法和免疫荧光技术等。这些检测方法均有各自的优缺点，值得一提是大多方法是基于抗原抗体之间的免疫反应实现的，而抗体具有稳定性差、修饰难、成本较高等缺点。核酸适配体作为一种新型识别分子，具有易修饰、成本低、化学性质稳定以及配体范围更广等优势，目前在部分研究中替代了抗体进行生物标志物的检测。因此，以核酸适配体为特异性识别分子，发展准确灵敏的生物标志物定量检测新技术，对于疾病的早期诊断具有重要的意义。

微生物荧光探针具有体积小、响应时间短等特点，由微生物作为特异性识别分子，其待测样品一般不需要预处理，同时，微生物的生长起到了一定的信号放大作用。核酸适配体与微生物荧光探针的诸多优点为发展新型准确灵敏的生物标志物定量检技术提供了一种新思路，将二者相结合构建的新型微生物荧光探针能够在高度特异性识别生物标志物的同时，产生效果显著的信号放大作用，极大的提高了检测灵敏度，对生物标志物的痕量检测与疾病的早期诊断有着十分重要的意义。

本发明还将该新型检测技术与微流控芯片相结合，简化检测步骤，减少检测样品的用量，同时还能够实现多种生物标志物的联合检测，为一些引起多生物标志物发生变化的疾病的早期诊断提供更加可靠、准确的检测结果，以便进行针对性的治疗。不仅如此，将基于相关设备的荧光检测系统引入该研究中能够更加方便直观的获得检测结果，最终建立起方便快捷的多种生物标志物同时检测的新型检测方法。

发明内容

为了克服现有技术上的问题，本发明提供一种检测生物标志物的微生物传感器及检测方法、培养与检测芯片和检测系统，在生物标志物与核酸适配体及微生物荧光探针之间竞争反应体系的基础上，建立了生物标志物定量检测技术，减少检测样品的用量，同时还能够实现多种生物标志物的联合检测，为一些引起多生物标志物发生变化的疾病的早期诊断提供更加可靠、准确的检测结果，有利于针对性的治疗。

本发明提供以下技术方案：

一种检测生物标志物的微生物传感器，由组分A和组分B组成，所述组分A为磁珠与核酸适配体的偶联物，所述核酸适配体能够与目标生物标志物特异性结合；所述组分B为转化荧光蛋白并表达抗性的基因工程菌株，并在基因工程菌株上修饰核酸探针。所述核酸探针的核酸序列与所述核酸适配体序列互补，目标生物标志物与所述核酸探针竞争结合核酸适配体的结合位点，通过荧光强度来检测目标生物标志物的含量。

进一步地，由组分A和组分B组成，所述组分A为磁珠与核酸适配体的偶联物，所述核酸适配体能够与蛋白生物标志物-肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)特异性结合；所述组分B为转化荧光蛋白并表达抗性的基因工程菌液，并在基因工程菌株上修饰核酸探针。所述核酸探针的核酸序列与所述核酸适配体互补，所述核酸适配体的核酸序列为5’-biotin-GGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG，通过荧光强度来检测蛋白生物标志物CK-MB的含量。

进一步地，所述核酸适配体互补核酸探针的核酸序列为5’-HS-CCCAACCCCCTAAAA。

进一步地，所述荧光蛋白为绿色、红色或黄色荧光蛋白中的一种，表达抗性为氯霉素抗性、氨苄霉素抗性或卡那霉素抗性。

进一步地，所述基因工程菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌。

进一步地，在基因工程菌株上修饰核酸探针以双功能蛋白交联试剂SMPB为交联剂。

一种检测生物标志物的微生物传感器的检测方法，包括以下步骤：

步骤1将组分B加入到组分A中进行孵育，磁分离后，收集磁珠；

步骤2将含有目标生物标志物的浓度梯度检测液分别加入磁珠内进行孵育，磁分离，取上清液；

步骤3将上清液分别接种到含有抗性筛选试剂的培养液中，培养所述接种液，测定培养液荧光强度；

步骤4绘制荧光强度与目标生物标志物浓度之间的关系曲线，根据标准曲线计算待测样品中生物标志物的浓度。

进一步地，在步骤1前还包括步骤0将磁珠与等体积的核酸适配体溶液混合混匀，孵育，磁分离后弃上清，制得组分A；

将荧光蛋白并带有抗性的质粒导入感受态工程菌株中，培养菌株挑取单克隆菌落扩大培养，将核酸探针修饰在基因工程菌表面，制得组分B。

进一步地，在步骤0中制得组分A之后还包括如下步骤，将FAM荧光基团修饰的核酸探针与组分A相结合,加入目标生物标志物与核酸探针竞争结合核酸适配体，以验证生物标志物、核酸适配体与核酸探针之间的竞争结合反应。

进一步地，在步骤0中制得组分B之后将FAM荧光基团修饰的核酸适配体与组分B相结合，互补核酸探针修饰在基因工程菌表面，加入目标生物标志物与核酸探针竞争结合核酸适配体，以验证基因工程菌能够适用于所述微生物传感器。

一种应用于检测生物标志物的微生物传感器的检测方法的微流控芯片，所述芯片从上至下设置为四层结构，第一层结构为覆盖层，第二层结构为通道层，通过通道将步骤3中所述的培养液通入培养层的培养区，第三层为培养层，在培养层设有培养区，在培养区进行接种液的培养，第四层为基底层，该芯片为培养与检测芯片。

进一步地，所述芯片各层均采用聚甲基丙烯酸甲酯PMMA材质，热键合而成。

进一步地，所述培养层设有若干培养区，所述通道层设有若干通道，不同的通道与培养区分别对应，用于不同培养液的分区培养。

一种包括培养与检测芯片的检测系统，所述系统包括微控制器、温度控制模块、双光路共焦检测器、培养与检测芯片和蠕动泵，微控制器与蠕动泵互联，由蠕动泵产生负压驱动注入芯片的接种液流动；微控制器与温度控制模块互联，温度控制模块调节培养与检测芯片培养区的温度；微控制器与双光路共焦检测器互联，双光路共焦检测器测定培养区的荧光强度。

进一步地，所述光路双光路共焦检测器包括发出峰值为490nm 3W和585nm 2W的激光LED，四个滤光片，五个会聚透镜，三个长形双色透镜和两个光电传感器。

采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

1、本发明在建立基因工程微生物表面核酸探针修饰及表征技术、生物标志物与核酸适配体及微生物荧光探针三者竞争反应的基础上，发展了准确灵敏的核酸适配体耦合微生物荧光探针的生物标志物定量检测新技术；

2、设计加工制作了以PMMA为主材料的多腔室微流控细菌培养芯片，可用于不同菌液或不同浓度梯度的菌液，在不同的培养区内同时培养。

3、设计搭建了荧光检测装置，该装置小巧便捷、结构简单、成本低廉，对操作人员没有太多专业要求。

附图说明

图1是本发明实施例中的蛋白生物标志物CK-MB与核酸适配体的竞争反应原理示意图。

图2是本发明实施例中的大肠杆菌表面修饰核酸探针原理示意图；

图3是本发明实施例中核酸适配体耦合微生物荧光探针的蛋白生物标志物CK-MB定量检测方法原理示意图

图4是本发明实施例中培养与检测芯片各层的结构示意图；

图5是本发明实施例中双光路共焦检测器的光路原理图；

图6是本发明实施例中检测系统的结构示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明提供了一种检测生物标志物的微生物传感器，由组分A和组分B组成，组分A为磁珠与核酸适配体的偶联物，核酸适配体能够与目标生物标志物特异性结合；组分B为转化荧光蛋白并表达抗性的基因工程菌液，并以SMPB为交联剂，在基因工程菌株上修饰核酸探针。核酸探针的核酸序列与核酸适配体互补，优选地，核酸探针的全部核酸序列与核酸适配体部分序列互补。目标生物标志物与核酸探针竞争结合核酸适配体的结合位点，核酸探针从核酸适配体上脱落下来，通过检测荧光探针的荧光强度，可以用来检测目标生物标志物的含量。

其中，荧光蛋白可以为为绿色、红色或黄色荧光蛋白，并且表达氯霉素抗性。经过对表达这几种颜色荧光蛋白的基因工程菌检测灵敏度和表征效果的对比试验，最终采用表达红色荧光蛋白的工程菌作为后续实验用菌。

应当理解的是，具备以下条件的基因工程宿主菌均可使用在本专利里，1、发酵产品具有高浓度、高转化率和高产率；2、菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵；3、菌株不是致病株，也不产内毒素；4、代谢控制容易进行；5、能进行适当的DNA重组，并且稳定。一般常用大肠杆菌。

实施例2

针对不同的目标生物标志物，本发明优化了互补核酸探针的长度、反应的温度以及核酸适配体与互补核酸探针结合的实验条件，并在CK-MB竞争反应的孵育温度为37℃；核酸适配体与互补探针偶联结束后的洗涤次数为5次；核酸适配体与互补探针的偶联时间为1h；蛋白生物标志物CK-MB与核酸适配体的竞争孵育的时间为1h。在此最佳条件下实现目标生物标志物与核酸适配体及互补核酸探针的竞争结合反应。

本发明提供了一种检测生物标志物的微生物传感器，由组分A和组分B组成，组分A为磁珠与核酸适配体的偶联物，核酸适配体能够与蛋白生物标志物CK-MB特异性结合；组分B为转化荧光蛋白并表达抗性的基因工程菌液，并在基因工程菌株上修饰核酸探针。核酸适配体核酸序列为5’-biotin-GGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG，经过多轮筛选，该核酸适配体可以高效结合CK-MB。当核酸适配体互补探针长度为15bp时，竞争反应上清液的荧光值较高，表明蛋白生物标志物CK-MB与核酸适配体的竞争反应的效果最为明显，故选用该适配体互补核酸探针作为修饰核酸探针，其核酸序列为：5’-HS-CCCAACCCCCTAAAA。

将组分A与成功修饰适配体互补核酸探针的组分B混合孵育，磁分离，取上清液并进行多次洗涤；将一系列浓度梯度的待测生物标志物加入到对应的样品管中孵育，磁分离，取上清液，并接种到含有抗性筛选试剂的培养液中进行培养，记录基因工程菌表达的荧光强度，绘制荧光强度与待测蛋白浓度之间的关系曲线。

实施例3

如图3所示，本发明提供了一种的微生物传感器检测生物标志物的方法，包括以下步骤：

步骤0将磁珠与等体积的核酸适配体溶液混合混匀，孵育后，磁分离后弃上清，制得组分A；

将荧光蛋白并带有抗性的质粒导入感受态工程菌株中，培养菌株挑取单克隆菌落扩大培养，将核酸探针修饰在基因工程菌表面，制得组分B。

步骤1将组分B加入到组分A中进行孵育，磁分离，收集磁珠；

磁珠结合核酸适配体后进行多次洗涤，结束后加入已经修饰了核酸适配体互补核酸探针的基因工程菌液，混匀37℃，140r/min摇床孵育一段时间，磁分离，弃上清，进行多次洗涤。

步骤2将含有目标生物标志物的浓度梯度检测液分别加入磁珠内进行孵育，磁分离，取上清液。

步骤3将上清液分别接种到含有抗性筛选试剂的培养液中，培养接种液，测定培养液荧光强度；

步骤4绘制荧光强度与目标生物标志物浓度之间的关系曲线，根据标准曲线计算待测样品中生物标志物的浓度。

如图1所示，在步骤0中制得组分A之后还包括如下步骤，将FAM荧光基团修饰的核酸探针与组分A相结合，加入目标生物标志物与核酸探针竞争结合核酸适配体，以验证生物标志物、核酸适配体与核酸探针之间的竞争结合反应。

如图2所示，在步骤0中制得组分B之后将FAM荧光基团修饰的核酸适配体与组分B相结合，互补核酸探针修饰在基因工程菌表面，加入目标生物标志物与核酸探针竞争结合核酸适配体，以验证基因工程菌能够适用于微生物传感器。

实施例4

如图4所示，一种用于检测生物标志物的微生物传感器的检测方法的培养与检测芯片，芯片从上至下设置为四层结构，第一层结构为覆盖层，第二层结构为通道层，通过通道将步骤3中的培养液通入培养层的培养区，第三层为培养层，在培养层设有培养区，在培养区进行接种液的培养，第四层为基底层，该芯片为培养与检测芯片。芯片各层均采用PMMA材质，热键合而成，这种材料具有良好的生物相容性，经过简单的灭菌处理即可用于大肠杆菌的培养及其荧光蛋白的表达。

培养层设有若干培养区，通道层设有若干通道，不同的通道与培养区分别对应，可用于不同菌液的分区培养，或者相同菌液的不同浓度梯度的分区培养。

培养与检测芯片采用四层结构的设计及加工制作，第一层覆盖层利用激光雕刻机雕刻出进样口与出样口；第二层通道层利用激光雕刻机雕刻出样品流动通道；第三层培养层利用激光雕刻机雕刻出培养区；第四层基底层，不需要进行雕刻。可以培养区设计的是半径为4mm的圆形，共有六个，可实现不同浓度菌液的同时培养，亦可实现多种菌液的同时培养。培养腔室的厚度为第二层芯片与第三层芯片的叠加高度，为3mm，培养腔室的设计体积约为150.72μL。

实施例5

如图5、6所示，本发明提供了一种包括培养与检测芯片的检测系统，系统包括微控制器、温度控制模块、双光路共焦检测器、培养与检测芯片和蠕动泵。微控制器与蠕动泵互联，由蠕动泵产生负压驱动注入芯片的接种液流动；微控制器与温度控制模块互联，调节培养与检测芯片培养区的温度；微控制器与双光路共焦检测器互联，双光路共焦检测器测定培养液的荧光强度。

其中，光路双光路共焦检测器包括两个LED，四个滤光片，五个会聚透镜，三个长形双色透镜和两个光电传感器，其中大部分部件用螺纹接口连接起来。

电源为每个功率单元提供额定电压，由3D打印机打印的结构用于固定各个组件。微控制器负责控制各个组件的工作，将信息传递给串口，处理检测数据。串行屏幕负责显示测试结果，并提供人机交互平台。培养与检测芯片作为整个反应的平台。温度控制模块和蠕动泵辅助培养与检测芯片实现其功能，共聚焦使用光路检测来检测荧光强度。

先以荧光素钠溶液代替菌液，对芯片及荧光检测系统的功能进行验证。将配制好的不同比例的荧光素钠溶液分别加入到培养与检测芯片中，对照组选用的是磷酸盐缓冲液(PBS溶液)。

加样完成后的培养与检测芯片放置在芯片装载卡条内，芯片装载卡条连同培养与检测芯片放置在仪器内部固定位置，利用配套设备进行操作，控制打开光源开关与温控开关，并进行检测成像。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 北京理工大学

<120> 一种检测生物标志物的微生物传感器及检测方法、培养与检测芯片和检测系统

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 核酸适配体序列(人工序列)

<400> 1

ggggggtggg tgggggatct cggaggatgc ttttaggggg ttggg 45

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 核酸探针(人工序列)

<400> 2

cccaaccccc taaaa 15

Claims (8)

1.一种检测生物标志物的微生物传感器，其特征在于，由组分A和组分B组成，所述组分A为磁珠与核酸适配体的偶联物，所述核酸适配体能够与蛋白生物标志物肌酸激酶同工酶CK-MB特异性结合；所述组分B为转化荧光蛋白并表达抗性的基因工程菌液，在基因工程菌株上修饰核酸探针，所述核酸探针的核酸序列为5’-HS-CCCAACCCCCTAAAA-3’，所述核酸探针的核酸序列与所述核酸适配体互补，所述核酸适配体的核酸序列为5’-biotin-GGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG-3’， 所述CK-MB与所述核酸探针竞争结合核酸适配体的结合位点，通过荧光强度来检测蛋白生物标志物CK-MB的含量。

2.根据权利要求1所述的检测生物标志物的微生物传感器，其特征在于，所述荧光蛋白为绿色、红色或黄色荧光蛋白中的一种，表达抗性为氯霉素抗性、氨苄霉素抗性或卡那霉素抗性。

3.根据权利要求1所述的检测生物标志物的微生物传感器，其特征在于，所述基因工程菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌。

4.根据权利要求1所述的检测生物标志物的微生物传感器，其特征在于，在基因工程菌株上修饰核酸探针以双功能蛋白交联试剂SMPB为交联剂。

5.一种包含权利要求1所述检测生物标志物的微生物传感器的培养与检测芯片，其特征在于，所述芯片从上至下设置为四层结构，第一层结构为覆盖层，第二层结构为通道层，所述通道层设有若干通道，第三层为培养层，在培养层设有若干培养区，不同的通道与培养区分别对应，用于不同培养液的分区培养，第四层为基底层，所述组分A与组分B孵育后再添加含有CK-MB的检测液，接种到含有抗性筛选试剂的培养液中形成接种液，通过通道将接种液通入培养层的培养区，在培养区进行接种液的培养。

6.根据权利要求5所述的培养与检测芯片，其特征在于，所述芯片各层均采用聚甲基丙烯酸甲酯PMMA材质，热键合而成。

7.一种包括权利要求5-6任一项所述培养与检测芯片的检测系统，其特征在于，所述系统包括微控制器、温度控制模块、双光路共焦检测器、培养与检测芯片和蠕动泵，微控制器与蠕动泵互联，由蠕动泵产生负压驱动注入芯片的接种液流动；微控制器与温度控制模块互联，温度控制模块调节培养与检测芯片培养区的温度；微控制器与双光路共焦检测器互联，双光路共焦检测器测定培养区的荧光强度。

8.根据权利要求7所述的培养与检测芯片的检测系统，其特征在于，所述光路双光路共焦检测器包括发出峰值为490 nm 3W和585 nm 2W的激光LED，四个滤光片，五个会聚透镜，三个长形双色透镜和两个光电传感器。

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