CN117368171A - 一种检测金黄色葡萄球菌的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，它包括如下部分：1)适配体；所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；2)CRISPR/Cas12a反应体系；所述反应体系中的试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的crRNA、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的ssDNA探针。本发明适配体联合CRISPR系统检测金黄色葡萄球菌可以在保证方法学特异性的基础上实现高灵敏度检测金黄色葡萄球菌，解决了现有金黄色葡萄球菌检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长的问题，具备实际推广应用价值。

Description

一种检测金黄色葡萄球菌的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种检测金黄色葡萄球菌的试剂盒及其应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病微生物，可引起各种组织和器官感染，包括肺炎、脑膜炎、菌血症、尿路感染等。早期检测是诊治相关的细菌性感染疾病的关键。如何实现快速灵敏、可广泛应用于临床的检测技术是目前的一大难题，开发简便快速高效特异的检测方法在公共卫生预防和感染性疾病控制过程中具有重要意义。
目前，传统的金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括微生物培养法、分子生物学检测方法和免疫分析技术。微生物培养法是金标方法，但该法耗时较长，无法满足快速检测的需要。分子生物学检测技术灵敏度较高，但该法需要精密仪器和专业的技术人员。基于抗体技术的免疫学检测具有简便、快速等特点，但该类方法抗体制备成本较高。另外在一些文献中也报道了关于金黄色葡萄球菌检测的最新进展。例如，通过表面增强拉曼光谱检测金黄色葡萄球菌，然而，激发拉曼光谱需要特定的仪器；还有用比色法检测的，比色法灵敏度受限，这限制了其在实际样品检测中的应用。
近年来，基于适配体的生物传感技术得到发展，生物传感器技术依托于自身经济实用、结构小巧、特异性强及高效便捷等优势在致病菌检测方面取得了巨大的进步，已经成为一种备受大众认可的通用分析工具。生物传感器在微生物检测中的应用朝着科技化方向发展，同当下流行的人工智能技术、信息技术良好结合，从而提高检测的精准度、加快检测的速度、进一步提高升检测的准确度。崔妍等在<核酸适配体在金黄色葡萄球菌检测中的应用进展>中公开了基于核酸适配体与金黄色葡萄球菌靶标结合时荧光信号的产生和淬灭完成检测，但其公开的方法中都需要使用到特定的载体或者荧光染料或者能量供体，才能实现准确检测，这增加了成本，延长了检测时间，降低了检测限，因此研究设计出具有高灵敏度与特异性，操作简便，快速的检测金黄色葡萄球菌的新的检测方法是非常有必要的。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，它包括如下部分：
1)适配体；所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
2)CRISPR/Cas12a反应体系；所述反应体系中的试剂包括核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的crRNA、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的ssDNA探针。
进一步地，所述反应体系还包括如下试剂：NEB缓冲液、Cas蛋白、RNA酶抑制剂和水。
本发明还提供了一种前述试剂盒在制备检测体液中金黄色葡萄球菌的试剂盒中的用途。
进一步地，检测体液中金黄色葡萄球菌的试剂盒的使用步骤包括：
a、分别取待测样品、阳性对照品和系列标准曲线溶液，与适配体混合；
b、取CRISPR/Cas12a反应体系中各试剂混合，分别加入步骤a所得混合溶液中孵育，再采用酶标仪检测荧光信号；
所述阳性对照品为pH 7.2-7.4的PBS缓冲液；
所述系列标准曲线溶液为102-107cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液。
进一步地，步骤a所述待测样品、阳性对照品和系列标准曲线溶液与适配体的体积比为4～20：1～5，优选8:2；所述适配体的浓度为1μM。
进一步地，步骤a所述混合的温度37℃，时间为15min。
进一步地，步骤b所述CRISPR/Cas12a反应体系中各试剂按如下体积比混合：1μL 1×NEB缓冲液：1μL 1μM ssDNA探针：1μL 1μM Cas蛋白：1μL1μM crRNA：0.25μL 20U RNA酶抑制剂：6μL水；
和/或，所述混合的温度37℃，时间为15min。
进一步地，步骤b所述孵育为避光孵育，温度25～45℃，优选40℃，时间为10～50min，优选50min。
进一步地，所述荧光信号的强度用Perkin Elmer多模式荧光微孔板阅读器记录，荧光的测量参数为λex＝495nm，λem＝520nm；所述待测样品的荧光强度小于阳性对照品，判定待测样品存在金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌的浓度根据以系列浓度阳性对照品中金黄色葡萄球菌浓度与荧光强度绘制的标准曲线计算。
进一步地，所述体液包括脑脊液，优选人脑脊液。
目前，RNA引导的CRISPR/Cas基因编辑技术，因其快速、简便和高效地操纵内源性基因而得到广泛应用。最新研究发现，某些CRISPR/Cas核酸酶(Cas12,Cas13,Cas14等)在特异性编辑靶向DNA或RNA的同时，能够激活其自身的非特异性核酸酶，引起连带切割(lateral cleaving)邻近的核酸进而激活荧光基团。在此基础上，通过适配体联合CRISPR系统建立荧光传感器，使得CRISPR系统在病原体检测有更加深入的应用。
本发明通过特定的核酸适配体与金黄色葡萄球菌特异性结合，保证了方法学的特异性，并且在结合后，加入Cas蛋白，产生独特的反式切割活性，切割带有荧光基团的特定的单链DNA，信号得以放大，提高了灵敏度。使用本发明适配体联合CRISPR系统检测金黄色葡萄球菌可以在保证方法学特异性的基础上实现高灵敏度检测金黄色葡萄球菌，解决了现有金黄色葡萄球菌检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长的问题，具备实际推广应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明基于适配体联合CRISPR系统检测脑脊液中金黄色葡萄球菌的的原理示意图。
图2为本发明实施例中检测方法的线性范围与标准曲线。(A)荧光随金黄色葡萄球菌浓度变化图；(B)10cfu/mL至107cfu/mL范围内拟合的线性方程。
图3为本发明实施例中检测方法的实验条件优化结果图。(A)适配体体积的优化；(B)菌液体积的优化；(C)孵育时间的优化；(D)反应温度的优化。
图4为本实验实施例中检测方法的特异性分析结果图。
图5为本实验实施例中检测方法的稳定性分析结果图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的试剂、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1检测金黄色葡萄球菌的试剂盒
一、试剂盒组成(1份)
二、试剂盒的使用
1、溶液制备
待测样品：脑脊液；
阳性对照品溶液：pH 7.2-7.4的PBS缓冲液；
系列标准曲线溶液：取金黄色葡萄球菌标准菌株，用pH 7.2-7.4的PBS缓冲液稀释成浓度102-107cfu/mL的系列菌液；
2、检测金黄色葡萄球菌
a、分别取8μL待测样品、阳性对照品溶液和系列标准曲线溶液，与2μL1μM适配体在37℃混合15min，得待测样品混合溶液，阳性对照混合溶液和系列标准曲线混合溶液；
b、取CRISPR/Cas12a反应体系中各试剂(1μL 1×NEB缓冲液，1μL 1μMssDNA探针，1μL 1μM Cas蛋白，1μL 1μM crRNA，0.25μL 20U RNA酶抑制剂，6μL Hplc-water)在37℃混合15min，得CRISPR/Cas混合液；分别取10μL CRISPR/Cas混合液，加入步骤a所得待测样品混合溶液，阳性对照混合溶液和系列标准曲线混合溶液中，在40℃避光孵育50min，再使用多功能酶标仪对孵育后样本进行检测，FAM荧光团测量参数为λex＝495nm，λem＝520nm，用Perkin Elmer多模式荧光微孔板阅读器记录荧光强度。
C、记录的待测样品的荧光强度小于阳性对照品，判定待测样品存在金黄色葡萄球菌，再以系列标准曲线溶液中金黄色葡萄球菌浓度与荧光强度绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测样品中金黄色葡萄球菌的浓度。
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果
试验例1基于适配体联合CRISPR系统检测脑脊液中金黄色葡萄球菌的方法
1、检测原理及实验用材料和试剂
基于适配体结合CRISPR/Cas12a的荧光生物传感器对金黄色葡萄球菌的超敏检测的工作原理具体为：在体系中加入待测菌液与核酸适配体孵育，当体系中存在S.aureus时，由于氢键、范德华力以及碱基堆积等的特定作用力，使得适配体与S.aureus特异性结合。反之，体系中的适配体单链呈游离状态。同时，将一定量的NEB缓冲液、ssDNA探针、LbCas12a、crRNA、RNA酶抑制剂避光混合孵育，形成CRISPR/Cas混合液体系。在待测菌液与核酸适配体的体系中加入CRISPR/Cas混合液，轻轻混匀后进行孵育，由于crRNA部分序列被设计与适配体序列互补，因此反应体系中剩余的适配体在加入CRISPR/Cas混合液后被crRNA识别，激活Cas蛋白活性，引发ssDNA荧光信号探针的反式切割。当没有靶标菌时，所有适配体都可以被crRNA识别，激活Cas蛋白；有靶标菌时，部分适配体被消耗，所以荧光低于无靶标菌组。
使用多功能酶标仪对孵育后样本进行检测，根据荧光信号的变化来判断待测样品是否存在S.aureus，或与预先标准曲线对比，测定S.aureus的浓度。
方法中所用的S.aureus提取自西南医科大学附属医院医学检验部，所用核酸包括的扩增引物及检测探针，由上海生物工程有限公司合成，各核酸的碱基序列如表1所示，使用的试剂和实验材料如表2～3所示。
表1核酸序列
表2试剂配制
试剂 体积 浓度
CrRNA 1μL 1μM
NEBbuffer 1 μL 1X
Cas蛋白 1μL 1μM
ssDNA Probe 1μL 1μM
Hplc-water 6μL -
RNA酶inhibitor 0.25μL 20U
适配体 2μL 1μM
菌液 8μL
表3实验材料
2、实验过程及结果
2.1具体实验过程如图1所示：
1)核酸适配体与靶标结合：在200μL反应管中，加入8μL含有S.aureus的样本与2μL1μM的S.aureus适配体并轻轻吹打混匀，放置于金属恒温仪中，在37℃的条件下孵育15min。
2)组装CRISPR/Cas：配置CRISPR/Cas混合液(1μL 1×NEB缓冲液，1μL 1μM ssDNA探针，1μL 1μM Cas蛋白，1μL 1μM crRNA，0.25μL 20U RNA酶抑制剂，6μL Hplc-water)，吹打混匀后再室温下孵育15min。
3)激活Cas蛋白：在含有核酸适配体与靶标的反应体系中加入10μLCRISPR/Cas混合液并混匀，在40℃下避光孵育50min，阴性对照和阳性对照也以类似方式制备。本反应适配体在CRISPR/Cas混合液中被crRNA识别，激活Cas蛋白活性，引发ssDNA荧光信号探针的反式切割。
4)检测荧光信号：使用多功能酶标仪对孵育后样本进行检测，设置测量参数：λex＝480nm，λem＝520nm，检测完毕后与预先标准曲线对比，测定S.aureus的浓度，并判断待测样品是否存在S.aureus。
2.2绘制标准曲线，测定检测范围和灵敏度
取-80℃保存的金黄色葡萄球菌标准菌株，待其复苏后，采用四区划线法接种在血平板上，置于细菌孵育箱中37℃下培养24h。于超净工作台中挑取目的菌落使其悬浮在细菌接种液中；采用麦氏比浊法，制备0.5麦氏浊度的均一浑浊的菌液，定为1×108cfu/mL，以此为参照值。取8支无酶EP管，装入900μL PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)，编号为0，1，2，3，4，5，6，7，吸取100μL浓度为108cfu/mL的菌液至编号为7的EP管中，振荡混匀，得到107cfu/mL的菌液。依次类推，得到102-107cfu/mL浓度的菌液。
模拟上述方法的反应过程，将2μL 1μM适配体探针和8μL不同浓度金黄色葡萄球菌菌液混合，37℃孵育15min。在反应体系中加入上述孵育完成的CRISPR/Cas混合液。在40℃的条件下反应50min。在酶标仪中分别测量其荧光值(激发波长480nm，发射波长520nm)，重复三次计算平均值。
通过配制10-107cfu/mL不同浓度目的菌液进行检测，以浓度为10cfu/mL、102cfu/mL、103cfu/mL、104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL的菌液浓度的对数为横坐标，以菌液对应的荧光值FL为纵坐标作图，建立标准曲线(图2)。根据LOD＝3σ/SD公式计算最低检测限，σ为线性斜率，SD是10次空白样本检测值的标准偏差。本发明的最低检测限为39cfu/mL，并且在10-107cfu/mL的浓度范围内有很好的线性关系，标准曲线为y＝-894x+8368。
2.3优化实验参数
为了获得最佳检测效果，对实验条件中的适配体用量、菌液体积、反应时间以及温度进行了优化。
首先，背景荧光会随着适配体的浓度增加而增大，因此为了实现适配体介导的CRISPR/Cas检测体系的良好性能，适配体的取用体积被选择性的优化。分别取浓度为1μM的适配体母液1μL、2μL、3μL、4μL和5μL实验，如图3A所示，当所取适配体的体积大于2μL时，ΔFL(ΔFL＝F0-F，其中F0为不加靶标菌的荧光强度，F为加入靶标后生物传感器的荧光强度)的值随着体积的增加而明显降低，因此2μL 1μM适配体是检测的最佳条件。
其次，靶标菌溶液太少会导致与适配体的不完全结合，而靶标菌溶液太多则会导致反应体系的稀释，这将影响实验结果，因此需对加入菌液的体积进行优化。本发明在4μL-20μL的范围内进行实验，如图3B所示，随着加入菌液体积的增大，体系中荧光强度先升后降，在8μL处达到最大值，因此体系中加入8μL的菌液是检测的最佳条件。
为了缩短检测时间而不影响实验效果，在加入CRISPR/Cas混合液与适配体菌液的最终反应体系中，进一步对孵育时间进行优化，采用20min、30min、40min、50min和60min的孵育时间检测荧光强度。如图3C所示，随着孵育时间的增加，荧光信号增加，并在50min时趋于稳定值，继续延长孵育时间其荧光轻度并没有明显增加。因此，50min被选为实验的最佳孵育时间。
最后，温度会显著影响Cas蛋白的活性和适配体对目标细菌的结合能力，在加入CRISPR/Cas混合液与适配体菌液的最终反应体系中，对反应温度进行优化。如图3D所示，在25℃、30℃、35℃、40℃和45℃条件下，随着孵育温度的升高，荧光值逐步增加，在40℃时达到最大荧光强度。因此，40℃是CRISPR/Cas混合液与适配体菌液体系中反应的最佳温度。
2.5检测特异性
在最佳的实验条件下，利用本发明适配体联合CRISPR系统以临床常见细菌包括粪肠球菌、窄食假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌作为对照进行实验，以金黄色葡萄球菌为实验组进行实验。各组菌液浓度为同一为1×107cfu/mL，分别在酶标仪上检测荧光信号。
由于适配体不与非靶标菌结合或结合较少，其是CRISPR/Cas中crRNA的识别序列，因此被crRNA识别，激活Cas蛋白活性，引发ssDNA荧光信号探针的反式切割。如图4所示，非靶标菌检测荧光强度显著增高，与金黄色葡萄球菌检测荧光强度有显著差别，表明本反应体系对金黄色葡萄球菌具有良好特异性。
2.6实验稳定性
在临床检测中，稳定性高的试剂对成本节约和检测准确性具有关键作用，模拟上述方法的反应过程，配置10cfu/mL和107cfu/mL的标准菌液，对分别存放0周、1周、2周、3周和4周的试剂进行重复性检测，验证其稳定性。如图5所示，每组荧光值无较大差别，表明本反应体系对金黄色葡萄球菌具有良好重复性。
2.7、与现有技术相比
将最佳实验条件下的检测方法与公开报道的其他检测原理下的检测方法进行比较，结果见表3。表3中细菌培养方法参考文献PMID:37367024，PCR方法参考文献PMID：37481551，质谱的方法参考文献PMID:37550758，免疫的方法参考文献PMID:34262744。从表3可见本发明方法检测时间短、成本低、灵敏度高、特异性好。
表3.本发明与现有技术相比具有的优势
检测时间 检测成本 灵敏度 特异性 所需仪器
实施例1方法 min 低 高 高 低
细菌培养 day 低 高 较高 低
PCR方法 hour 低 高 高 高
质谱的方法 min-hour 高 高 高 高
免疫的方法 min 高 低 较高 低
综上所述，本发明开发了一种基于适配体联合CRISPR系统检测金黄色葡萄球菌的的超敏检测技术和试剂盒。当体系中存在S.aureus时，由于氢键、范德华力以及碱基堆积等的特定作用力，使得适配体与S.aureus特异性结合，体系中游离少量的适配体。剩余的适配体在加入CRISPR/Cas混合液后被crRNA识别，激活Cas蛋白活性，引发ssDNA信号探针的反式切割，产生荧光信号。
与其他病原体传感器发明相比，本发明具有以下显著的优点：此发明引入了CRISPR系统，增加了体系灵敏度，信号输出是利用荧光传感器，结果以荧光强度表示，容易判读。本发明采用可特异性识别金黄色葡萄球菌的核酸适配体应用于荧光传感器，大大提高了检测的特异性，降低了检测成本和检测方案的复杂性，是一种检测快速，检测成本低，检测灵敏性高，操作简单的检测技术。

Claims (10)

1.一种检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于：它包括如下部分：
1)适配体；所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
2)CRISPR/Cas12a反应体系；所述反应体系中的试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的crRNA、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的ssDNA探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述反应体系还包括如下试剂：NEB缓冲液、Cas蛋白、RNA酶抑制剂和水。
3.权利要求1或2所述试剂盒在制备检测体液中金黄色葡萄球菌的试剂盒中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：检测体液中金黄色葡萄球菌的试剂盒的使用步骤包括：
a、分别取待测样品、阳性对照品和系列标准曲线溶液，与适配体混合；
b、取CRISPR/Cas12a反应体系中各试剂混合，分别加入步骤a所得混合溶液中孵育，再采用酶标仪检测荧光信号；
所述阳性对照品为pH 7.2-7.4的PBS缓冲液；
所述系列标准曲线溶液为102-107cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液。
5.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：步骤a所述待测样品、阳性对照品和系列标准曲线溶液与适配体的体积比为4～20：1～5，优选8:2；所述适配体的浓度为1μM。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于：步骤a所述混合的温度37℃，时间为15min。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：步骤b所述CRISPR/Cas12a反应体系中各试剂按如下体积比混合：1μL 1×NEB缓冲液：1μL 1μM ssDNA探针：1μL 1μM Cas蛋白：1μL 1μMcrRNA：0.25μL 20U RNA酶抑制剂：6μL水；
和/或，所述混合的温度37℃，时间为15min。
8.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：步骤b所述孵育为避光孵育，温度25～45℃，优选40℃，时间为10～50min，优选50min。
9.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述荧光信号的强度用Perkin Elmer多模式荧光微孔板阅读器记录，荧光的测量参数为λex＝495nm，λem＝520nm；所述待测样品的荧光强度小于阳性对照品，判定待测样品存在金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌的浓度根据以系列浓度阳性对照品中金黄色葡萄球菌浓度与荧光强度绘制的标准曲线计算。
10.根据权利要求3和4所述的用途，其特征在于：所述体液包括脑脊液，优选人脑脊液。
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