CN113702308B - 用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种适配体纳米比色生物传感器及其应用和产品、大肠杆菌的检测方法，涉及生物检测技术领域。本发明提供的适配体纳米比色生物传感器，包括纳米材料和吸附在纳米材料上的适配体，其中纳米材料具有类过氧化物酶活性，适配体为具有特定核苷酸序列的核酸，能够特异性识别并结合大肠杆菌。本发明的适配体纳米比色生物传感器特异性好，灵敏度高，能够应用于大肠杆菌的检测以及制备诊断脓毒症的产品中。本发明提供的大肠杆菌的检测方法，简单方便，能够快速准确的实现对大肠杆菌的定性定量检测，减少大肠杆菌的检测时间，降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器及应用。
背景技术
脓毒症是机体对感染产生的炎症反应失调而引起生理学和器官功能损害的临床综合征，也是危重病患者的首要死因。脓毒症多由细菌感染引起，而腹腔细菌感染尤为常见。在重症加强护理病房(ICU)，腹腔感染导致的脓毒症患者占63％，其中大肠杆菌(E.coli)为主的革兰氏阴性细菌导致的腹膜炎性脓毒症占25-71％。
目前传统的大肠杆菌检测方法过程须经过预增菌、选择性增菌、分离培养、生理生化鉴定及血清型鉴定等步骤，整个过程繁琐耗时(3-7天)。而且在脓毒症的样品中微生物种类相对复杂，致病菌数量可能相对较少，即使经过选择性增菌培养也可能发生漏检现象。上述传统病原菌的分离鉴定较为费时耗力，检测灵敏度差，较低的检测效率将严重地耽误病情并错过最佳治疗期限，虽然如此但其仍是临床医学细菌鉴定的主要途径。一些新型检测方法，如：ELISA法、PCR方法以及生物传感器法对大肠杆菌的检测灵敏度高，然而它们仍需要较长的检测时间、昂贵的仪器以及专业的技术人员，所以只在少数大医院使用。因此，建立灵敏、快速且简便的检测方法对于脓毒症中大肠杆菌的防控显得尤为重要。
适配体纳米比色传感器近年来吸引了研究人员的广泛关注，该技术不仅发挥了比色法简便快速灵敏的优点，还充分利用了适配体针对目标物极高的亲和性和特异性。适配体是一种短的单链核酸序列，能够以类似抗体的方式结合目标分子。到目前为止，已经产生了数以千计的可用于多种靶点的适配体，靶点可以是小金属离子、有机分子、多肽、蛋白质、病毒、细菌、整个细胞，甚至活体动物体内的靶标。与传统的细菌检测方法相比，基于适配体的检测方法具有更高的灵敏性、特异性及快速性。然而，适配体纳米比色传感器还未用于脓毒症中细菌的检测研究中。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种适配体纳米比色生物传感器。
本发明的第二目的在于提供一种适配体纳米比色生物传感器在制备诊断脓毒症的产品中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种诊断脓毒症的产品。
本发明的第四目的在于提供大肠杆菌的检测方法，以解决上述问题的至少一种。
第一方面，本申请提供了一种适配体纳米比色生物传感器，包括适配体和纳米材料；
所述适配体吸附在纳米材料上；
所述适配体包括具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的核酸中的至少一种；
所述纳米材料具有类过氧化物酶活性，适配体吸附在纳米材料上时，类过氧化物酶活性增强。
作为进一步技术方案，所述纳米材料包括蛋白金纳米簇、磁性纳米粒子或石墨烯纳米粒子。
作为进一步技术方案，所述蛋白金纳米簇的制备方法包括如下步骤：
将牛血清白蛋白与氯金酸混合，调节溶液pH至碱性，加热后制备得到蛋白金纳米簇。
作为进一步技术方案，所述加热包括水浴加热；
优选地，所述加热的温度为95～100℃，优选为100℃；
优选地，所述加热的时间为2～4min，优选为3min。
第二方面，本申请提供了一种适配体纳米比色生物传感器在制备诊断脓毒症的产品中的应用。
第三方面，本申请提供了一种诊断脓毒症的产品，包括适配体纳米比色生物传感器。
第四方面，本申请提供了一种大肠杆菌的检测方法，包括如下步骤：
a.将适配体和蛋白金纳米簇混合，进行第一次孵育，然后加入已知浓度的大肠杆菌，进行第二次孵育，再加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行第三次孵育，之后在652nm波长下检测吸光度，得到大肠杆菌浓度与吸光度的关系；
b.将适配体和蛋白金纳米簇混合，进行第一次孵育，然后加入待测样品，进行第二次孵育，再加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行第三次孵育，之后在652nm波长下检测吸光度，根据a步骤中得到的肠杆菌浓度与吸光度的关系计算待测样品中大肠杆菌的浓度；
所述适配体包括具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的核酸中的至少一种。
作为进一步技术方案，所述第一次孵育的溶液中适配体的浓度为1.4～1.6μM，优选为1.5μM；
优选地，所述第一次孵育的溶液中蛋白金纳米簇的浓度为0.005～0.015mg/mL，优选为0.010mg/mL；
优选地，所述第一次孵育的时间为20～40min，优选为30min。
作为进一步技术方案，所述已知浓度的大肠杆菌或待测样品的加入量与第一次孵育的溶液的体积比为1:1～1:20，优选为1:9；
优选地，所述第二次孵育的时间0.5～2h，优选为1h。
作为进一步技术方案，所述第三次孵育的溶液中过氧化氢的浓度为300～500Mm,优选为400mM；
优选地，所述第三次孵育的溶液中3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为500～600μM，优选为500μM；
优选地，所述第三次孵育的溶液的pH为3～4，优选为4；
优选地，所述第三次孵育的温度为20～40℃，优选为30℃；
优选地，所述第三次孵育的时间为40～50min，优选为40min；
优选地，所述第三次孵育的溶液与所述第二次孵育的溶液的体积比为1:2～2:1，优选为1:1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的适配体纳米比色生物传感器，包括纳米材料和吸附在纳米材料上的适配体，其中纳米材料具有较弱的类过氧化物酶活性，适配体为具有特定核苷酸序列的核酸，能够特异性识别并结合大肠杆菌。当适配体吸附在纳米材料上时，纳米材料的类过氧化物酶活性被促进；当存在大肠杆菌时，适配体展现出对大肠杆菌更高的亲和性，从纳米材料上脱离，纳米材料的类过氧化物酶活性降低至原来水平，本发明的适配体纳米比色生物传感器特异性好，灵敏度高，能够应用于大肠杆菌的检测以及制备诊断脓毒症的产品中。
本发明提供的大肠杆菌的检测方法，简单方便，能够快速准确的实现对大肠杆菌的定性定量检测，减少大肠杆菌的检测时间，降低检测成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为适配体纳米比色生物传感器的原理图；
图2为蛋白金纳米簇的透射电镜图和粒径分析；
图3为蛋白金纳米簇的傅里叶红外光谱；
图4为蛋白金纳米簇的荧光光谱；
图5为pH、温度、孵育时间和TMB浓度对蛋白金纳米簇类过氧化物酶活性的影响；
图6为适配体浓度对蛋白金纳米簇类过氧化物酶活性的影响；
图7为大肠杆菌浓度和吸光度之间的关系。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本申请提供了一种适配体纳米比色生物传感器，包括适配体和纳米材料；
所述适配体吸附在纳米材料上。
所述适配体包括具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的核酸中的至少一种。
需要说明的是，上述适配体均能够与大肠杆菌特性性结合。
所述纳米材料具有类过氧化物酶活性，适配体吸附在纳米材料上时，类过氧化物酶活性增强，可催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)氧化显色，根据颜色的变化实现对大肠杆菌的检测。
SEQ ID NO.1所示的核酸序列如下：
5’-CCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCAGGTGTGACGG-3’(SEQ ID NO.1)。
SEQ ID NO.2所示核酸序列如下：
5’-ATCAAATGTGCAGATATCAAGACGATTTGTACAAGATCCATGCTGAGGTGGTCATAGCTGATCCTACC-3’(SEQ ID NO.2)。
SEQ ID NO.3所示核酸序列如下：
5’-GCAATGGTACGGTACTTCCCCATGAGTGTTGTGAAATGTTGGGACACTAGGTGGCATAGAGCCGCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’(SEQ ID NO.3)。
SEQ ID NO.4所示核酸序列如下：
5’-CCCTCCGGGGGGGTCATCGGGATACCTGGTAAGGATA-3’(SEQ ID NO.4)。
SEQ ID NO.5所示核酸序列如下：
5’-ATCCGTCACACCTGCTCT-3’(SEQ ID NO.5)。
本发明提供的适配体纳米比色生物传感器，包括纳米材料和吸附在纳米材料上的适配体，其中纳米材料具有较弱的类过氧化物酶活性，适配体为具有特定核苷酸序列的核酸，能够特异性识别并结合大肠杆菌。当适配体吸附在纳米材料上时，纳米材料的类过氧化物酶活性被促进；当存在大肠杆菌时，适配体展现出对大肠杆菌更高的亲和性，从纳米材料上脱离，纳米材料的类过氧化物酶活性降低至原始水平，本发明的适配体纳米比色生物传感器特异性好，灵敏度高，能够应用于大肠杆菌的检测以及制备诊断脓毒症的产品中。
在一些优选的实施方式中，所述纳米材料包括但不限于蛋白金纳米簇、磁性纳米粒子或石墨烯纳米粒子。
以蛋白金纳米簇为例进行说明，蛋白金纳米簇具一定强度的类过氧化物酶活性，适配体对大肠杆菌特异亲和性，通过二者间的相互作用，建立一种适配体比色传感器，以实现大肠杆菌的无标记、快速定量检测，如图1所示，当适配体吸附在蛋白-金杂交材料上时，其类过氧化物酶活性被促进，催化H2O2，氧化TMB使之变色。当在体系中加入大肠杆菌时，适配体展现出对大肠杆菌更高的亲和性，从复合物上脱离，此时蛋白金纳米簇的类过氧化物酶活性较低，通过测定吸光度绘制标准曲线，在一定浓度范围内实现检测大肠杆菌的定量检测。
在一些优选的实施方式中，所述蛋白金纳米簇的制备方法包括如下步骤：
将牛血清白蛋白与氯金酸混合，调节溶液pH至碱性，加热后制备得到蛋白金纳米簇。
在一些优选的实施方式中，所述加热包括但不限于水浴加热，或者本领域技术人员所熟知的其他加热方式；
优选地，所述加热的温度为95～100℃，例如可以为，但不限于95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃，优选为100℃；
优选地，所述加热的时间为2～4min，例如可以为，但不限于2min、2.4min、2.8min、3.2min、3.6min或4min，优选为3min。
在本发明中，通过对蛋白金纳米簇的制备方法进一步优化和调整，简单高效的实现对蛋白金纳米簇的制备。
第二方面，本申请提供了一种适配体纳米比色生物传感器在制备诊断脓毒症的产品中的应用。
本发明提供的适配体纳米比色生物传感器，包括纳米材料和吸附在纳米材料上的适配体，当适配体吸附在纳米材料上时，纳米材料的类过氧化物酶活性被促进，可催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺等显色剂的氧化变色；当存在大肠杆菌时，适配体展现出对大肠杆菌更高的亲和性，从纳米材料上脱离，纳米材料的类过氧化物酶活性降低，使显色剂颜色变浅，根据颜色的变化实现对大肠杆菌的检测，能够应用于制备诊断脓毒症的产品中。
第三方面，本申请提供了一种诊断脓毒症的产品，包括适配体纳米比色生物传感器。
第四方面，本申请提供了一种大肠杆菌的检测方法，包括如下步骤：
a.将适配体和蛋白金纳米簇混合，进行第一次孵育，然后加入已知浓度的大肠杆菌，进行第二次孵育，再加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行第三次孵育，之后在652nm波长下检测吸光度，得到大肠杆菌浓度与吸光度的关系；
b.将适配体和蛋白金纳米簇混合，进行第一次孵育，然后加入待测样品，进行第二次孵育，再加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行第三次孵育，之后在652nm波长下检测吸光度，根据a步骤中得到的肠杆菌浓度与吸光度的关系计算待测样品中大肠杆菌的浓度；
所述适配体包括具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的核酸中的至少一种。
本发明提供的大肠杆菌的检测方法，简单方便，能够快速准确的实现对大肠杆菌的定性定量检测，减少大肠杆菌的检测时间，降低检测成本。
在一些优选的实施方式中，所述第一次孵育的溶液中适配体的浓度为1.4～1.6μM，例如可以为，但不限于1.4μM、1.44μM、1.48μM、1.52μM、1.56μM或1.60μM，优选为1.5μM；
优选地，所述第一次孵育的溶液中蛋白金纳米簇的浓度为0.005～0.015mg/mL，例如可以为，但不限于0.005mg/mL、0.007mg/mL、0.009mg/mL、0.011mg/mL、0.013mg/mL或0.015mg/mL，优选为0.010mg/mL；
优选地，所述第一次孵育的时间为20～40min，例如可以为，但不限于20min、24min、28min、32min、36min或40min，优选为30min。
在本发明中，通过对第一次孵育的条件进行进一步优化和调整，使得适配体充分与蛋白金纳米簇结合。
在一些优选的实施方式中，所述已知浓度的大肠杆菌或待测样品的加入量与第一次孵育的溶液的体积比为1:1～1:20，，例如可以为，但不限于1:1、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18或1:20，优选为1:9；
优选地，所述第二次孵育的时间0.5～2h，例如可以为，但不限于0.5h、0.8h、1.1h、1.4h、1.7h或2h，优选为1h。
在本发明中，通过对第二次孵育条件进一步优化和调整，使得适配体充分与大肠杆菌结合，提高准确性。
在一些优选的实施方式中，所述第三次孵育的溶液中过氧化氢的浓度为300～500mM，例如可以为，但不限于300mM、340mM、380mM、420mM、460mM或500mM，优选为400mM；
优选地，所述第三次孵育的溶液中3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为500-600μM，例如可以为，但不限于500μM、520μM、540μM、560μM、580μM或600μM，优选为500μM；
优选地，所述第三次孵育的溶液的pH为3～4，例如可以为，但不限于3、3.2、3.4、3.6、3.8或4，优选为4，例如可以向适配体和蛋白金纳米簇混合后的溶液中添加PBS等缓冲液，以维持体系pH的稳定。
优选地，所述第三次孵育的温度为20～40℃，例如可以为，但不限于20℃、24℃、28℃、32℃、36℃或40℃，优选为30℃；
优选地，所述第三次孵育的时间为40～50min，例如可以为，但不限于40min、42min、44min、46min、48min或50min，优选为40min；
优选地，所述第三次孵育的溶液与所述第二次孵育的溶液的体积比为1:2～2:1，优选为1:1。
在本发明中，通过对第三次孵育条件进一步优化和调整，更加准确的实现对大肠杆菌的检测。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
蛋白金纳米簇的制备以及理化表征。
将3mL牛血清白蛋白(BSA)(50mg/mL)与3mL氯金酸(10mM)混合搅拌3分钟，加入NaOH调至pH为14，最后在100℃水浴中加热三分钟制备得到蛋白金纳米簇。
对制备得到的蛋白金纳米簇进行傅里叶检测、透射电镜分析和荧光光谱检测，结过如图2-图4所示。
为了确定蛋白金杂交材料的纳米结构，首先对制备得到的蛋白金纳米簇拍摄了透射电镜(图2)，通过ImageJ进行粒径分析得出所制备的材料直径大多集中在2.50-3.50nm之间。
为了验证蛋白金纳米颗粒中的蛋白——BSA成功的修饰于金纳米颗粒上，进行了傅里叶红外光谱的检测。由于纯金属没有红外特征峰，猜测蛋白金纳米簇的红外特征峰应与蛋白BSA类似，结果如图3所示，蛋白金纳米簇显示了四个与BSA一致的特征峰。图中上面一条线表示BSA，下面一条线表示蛋白金纳米材料。3290.34cm-1处显示了蛋白质的一级胺结构，1522.78cm-1处显示了一级胺的剪切作用，1641.19cm-1处显示了酰胺Ⅰ条带，这是由于高比例的蛋白质α螺旋所致的，2958.19cm-1处对应于C-H键的震荡。
除此之外，为了验证材料的荧光性能，对制备得到的蛋白金纳米簇进行了荧光光谱的扫描，如图4所示。图中左侧线表示激发光谱，图中右侧线表示发射光谱。结果显示，此材料的激发峰值为329nm，发射峰值为656nm(图4)。
实施例2
根据材料的理化性质，调节pH、温度等条件，确定体系最优反应条件。
由于蛋白金纳米簇的类过氧化物酶活性是本检测方法的重要条件之一，为了保证体系的高灵敏性，发明人依次探究了pH、温度、孵育时间以及TMB浓度对蛋白金纳米簇类过氧化物酶活性的影响。结果如图5所示。
取蛋白金纳米簇0.02mL(20mg/mL)加入PBS中，加入过氧化氢(H2O2)使其终浓度为400mM，以及一定量的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，使最终反应体系为4mL，保持孵育的时间、温度一致，改变pH，通过测定溶液在652nm处的吸光度值，推测最佳反应pH。
pH：从图5中我们可以清晰地看出，随着pH的不断增加，吸光度呈现先增高后降低的趋势，并且在pH＝4时，吸光度达到最大值，因此最佳反应pH为4。
取蛋白金纳米簇0.02mL(20mg/mL)加入PBS中，加入过氧化氢(H2O2)使其终浓度为400mM，以及一定量的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，使最终反应体系为4mL，保持孵育的pH、时间一致，改变反应温度，通过测定溶液在652nm处的吸光度值，推测最佳反应温度。
温度：与pH类似的趋势，随着温度的不断增高，吸光度呈现出先上升后下降的趋势，并且在温度为30℃时拥有最大值，最佳反应时间为30℃。
取蛋白金纳米簇0.02mL(20mg/mL)加入PBS中，加入过氧化氢(H2O2)使其终浓度为400mM，以及一定量的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，使最终反应体系为4mL，保持孵育的pH、温度一致，改变反应时间，通过测定溶液在652nm处的吸光度值，推测最佳反应时间。
时间：实验结果表明，随着时间的增加，吸光度逐渐上升，并且在40分钟以后，吸光度趋于稳定，为了更高的检测效率，最佳反应时间应为40min。
取蛋白金纳米簇0.02mL(20mg/mL)加入PBS中，加入过氧化氢(H2O2)使其终浓度为400mM，以及一定量的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，使最终反应体系为4mL，保持孵育的pH、时间、温度一致，改变TMB浓度，使其终浓度依次为200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM以及800μM，通过测定溶液在652nm处的吸光度值，推测最佳反应的TMB浓度。
TMB浓度：从200μM开始，100μM为间隔，随着TMB浓度的增加，吸光度逐渐增大，虽然结果显示，600μM处吸光度有波动，不过趋势表明，从TMB浓度达到500μM时，吸光度已经趋于稳定，因此最优的TMB浓度应为500μM。
实施例3
适配体浓度的优化。
取蛋白金纳米簇0.02mL(2mg/mL)，加入不同含量适配体)，使其终浓度分别为0、0.5μM、1.0μM、1.5μM和2.0μM，以PBS为溶剂配成2.0mL溶液体系，置于室温下，孵育30min。
按照最优反应条件，加入过氧化氢(H2O2)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，以PBS为溶剂配成4mL体系，调节pH为4，置于40℃下，共孵育40min。
利用紫外分光光度计，测定652nm处oxTMB(氧化TMB)的吸光度，确定适配体与蛋白金纳米簇之间的最佳用量比例。结果如图6所示。
适配体可以通过与蛋白金纳米材料结合而促进其类过氧化物酶活性。因此发明人改变适配体的浓度，以求达到最大的促进效果。试验结果如图6所示，随着适配体浓度的增加，材料的酶活性逐渐增强，吸光度也逐渐升高，当适配体浓度达到1.5μM时，吸光度达到最高值。因此选取1.5μM为适配体浓度来进行检测大肠杆菌的实验。
实施例4
大肠杆菌的定性定量检测。
取适配体0.12mL(25μM)、蛋白金纳米簇0.02mL(2mg/mL)，以PBS为溶剂配成1.8mL溶液体系，置于室温下，孵育30min。
孵育结束后，加入不同数量大肠杆菌0.2mL(大肠杆菌的数量分别为101、102、103、104和105)，孵育1小时。
按照最优反应条件，加入过氧化氢(H2O2)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，以PBS为溶剂配成4mL体系，调节pH为4，置于40℃下，共孵育40min。
利用紫外分光光度计，测定652nm处oxTMB(氧化TMB)的吸光度，建立大肠杆菌浓度和吸光度之间的线性回归方程，结果如图7所示。
如我们预期所想，随着大肠杆菌数量的增加，体系的吸光度逐渐降低，充分证明了我们实验设计的可行性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (31)
1.一种用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器，其特征在于，包括适配体和纳米材料；
所述适配体吸附在纳米材料上；
所述适配体包括具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQID NO.5所示核苷酸序列的核酸中的至少一种；
所述纳米材料具有类过氧化物酶活性，适配体吸附在纳米材料上时，类过氧化物酶活性增强；
所述纳米材料包括蛋白金纳米簇；所述蛋白金纳米簇的制备方法包括如下步骤：
将牛血清白蛋白与氯金酸混合，调节溶液pH至碱性，加热后制备得到蛋白金纳米簇。
2.根据权利要求1所述的用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器，其特征在于，所述加热包括水浴加热。
3.根据权利要求1所述的用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器，其特征在于，所述加热的温度为95~100℃。
4.根据权利要求1所述的用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器，其特征在于，所述加热温度为100℃。
5.根据权利要求1所述的用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器，其特征在于，所述加热的时间为2~4 min。
6.根据权利要求1所述的用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器，其特征在于，所述加热时间为3 min。
7.权利要求1-6任一项所述的用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器在制备诊断脓毒症的产品中的应用。
8.一种诊断脓毒症的产品，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器。
9.一种大肠杆菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
a. 将适配体和蛋白金纳米簇混合，进行第一次孵育，然后加入已知浓度的大肠杆菌，进行第二次孵育，再加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行第三次孵育，之后在652 nm波长下检测吸光度，得到大肠杆菌浓度与吸光度的关系；
b. 将适配体和蛋白金纳米簇混合，进行第一次孵育，然后加入待测样品，进行第二次孵育，再加入过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，进行第三次孵育，之后在652 nm波长下检测吸光度，根据a步骤中得到的肠杆菌浓度与吸光度的关系计算待测样品中大肠杆菌的浓度；
所述适配体包括具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQID NO.5所示核苷酸序列的核酸中的至少一种；
所述蛋白金纳米簇的制备方法包括如下步骤：
将牛血清白蛋白与氯金酸混合，调节溶液pH至碱性，加热后制备得到蛋白金纳米簇。
10.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第一次孵育的溶液中适配体的浓度为1.4~1.6 μM。
11.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第一次孵育的溶液中适配体的浓度为1.5 μM。
12.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第一次孵育的溶液中蛋白金纳米簇的浓度为0.005~0.015 mg/mL。
13.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第一次孵育的溶液中蛋白金纳米簇的浓度为0.010 mg/mL。
14.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第一次孵育的时间为20~40 min。
15.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第一次孵育的时间为为30 min。
16.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述已知浓度的大肠杆菌或待测样品的加入量与第一次孵育的溶液的体积比为1:1~1:20。
17.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述已知浓度的大肠杆菌或待测样品的加入量与第一次孵育的溶液的体积比为1:9。
18.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第二次孵育的时间为0.5~2 h。
19.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第二次孵育的时间为1 h。
20.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第三次孵育的溶液中过氧化氢的浓度为300~500 mM。
21.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第三次孵育的溶液中过氧化氢的浓度为400 mM。
22.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第三次孵育的溶液中3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为500-600 μM。
23.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第三次孵育的溶液中3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为500 μM。
24.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第三次孵育的溶液的pH为3~4。
25.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第三次孵育的溶液的pH为4。
26.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第三次孵育的温度为20~40℃。
27.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第三次孵育的温度为30℃。
28.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第三次孵育的时间为40~50 min。
29.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第三次孵育的时间为40 min。
30.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第三次孵育的溶液与所述第二次孵育的溶液的体积比为1:2~2:1。
31.根据权利要求9所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，所述第三次孵育的溶液与所述第二次孵育的溶液的体积比为1:1。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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