CN107478832A - 一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料及其应用 - Google Patents

一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物纳米技术检测领域，具体是指基于磁性仿酶纳米材料和一种噬菌体表面展示的靶向多肽配体的病原微生物的磁泳分离比色检测方法。采用生物模板法合成表面氨基化的同时具有优良磁性和仿过氧化物酶活性的四氧化三钴纳米材料。同时采用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与金黄色葡萄球菌特异性结合的噬菌体单克隆，并分离纯化展示有特异性九肽配体AQTFLGEQD的噬菌体主要衣壳蛋白pVIII(pVIII融合蛋白，fusion pVIII)。将fusion pVIII连接到四氧化三钴纳米材料表面从而构建一种多功能生物纳米探针。该探针可实现将靶标微生物从复杂样品中富集和磁性分离，又因其仿酶活性可实现信号放大，从而实现金黄色葡萄球菌的磁泳分离及免疫比色定量检测。该方法操作简单、成本低廉、特异性和灵敏度均较高，为实现致病微生物的富集分离及灵敏检测提供了一条有效途径。

Description

一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料及其 应用
技术领域
本发明属于生物纳米技术检测领域，具体是一种基于磁性仿酶纳米材料和噬菌体表面展示的多肽配体的材料及其对病原微生物在免疫比色检测中的应用。
背景技术
近年来，已经发现有成千上万种致病微生物威胁到食品安全和人类健康、甚至国家安全。过度使用抗生素导致大量耐药致病微生物不断产生，进一步加速了致病微生物的危害。其中，最为常见的危害是由致病微生物感染导致的食源性疾病，严重威胁人类健康且给经济造成重大影响，现已成为目前国际上最突出的公共卫生问题之一。常见的食源性致病菌主要包括大肠埃希式菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、肉毒梭菌等。其中金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，S.aureus)是污染水源和食品的最主要微生物之一，也是全球公共医疗保健体系中最普遍、危害最大的致病菌。因此，研究和发展金黄色葡萄球菌的检测技术，对食源性疾病的治疗和预后有重要意义。
由于污染的食品中致病菌的数量通常较少，加上食品成分复杂，传统方法不能满足快速、特异检测的要求。因此，开发一种低成本、不需要特殊仪器的的可视化方法，使其既能够直接从复杂的食品样品中高效特异地分离出数量极少的食源性致病菌，又能够实现对目标菌高灵敏和高特异的检测，有望实现大规模检测食源性致病菌的目的。
仿酶纳米材料(又称纳米酶)，是一类同时具有纳米材料的独特性能和催化功能的模拟酶。自2007年Fe3O4纳米酶报道以来，纳米酶，特别是金属氧化物纳米酶的研究迅速崛起，研究的涉及面也逐渐广泛，目前已经包括化学、生物、材料科学、物理、医学和环境等不同领域，因而具有潜在而又广泛的应用前景。
作为一种金属氧化酶纳米酶，MnO2具有较好的形貌和优良的仿过氧化酶活性，且对于污染海产品中的致病微生物可实现灵敏、特异检测(申请号201710036540.9，公开号CN106771194A)。然而初被污染的食品中致病微生物数量通常非常少，所以单纯依靠金属氧化物纳米酶的仿酶活性很难实现对食品中痕量致微生物菌高灵敏度、高特异的直接检测。因此，开发一种低成本、不需要特殊仪器的方法，使其既能够直接从复杂的食品样品中高效特异地分离出数量极少的致病微生物并将其浓度进行富集，又能够实现对目标微生物高灵敏和高特异的检测，有望实现及时发现并抑制食品中微生物的污染。合成具有磁性分离效果的纳米酶有望成为实现该目的的方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料及其材料对病原微生物在免疫比色检测中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料，将pVIII融合蛋白(fusion pVIII)组装在四氧化三钴纳米材料的表面，即获得仿酶纳米材料；所述仿酶纳米材料fuison pVIII与四氧化三钴磁性纳米材料的摩尔比例为1000:1。
所述四氧化三钴纳米材料为以牛血清白蛋白(BSA)为模板采用生物模板法合成表面氨基化的四氧化三钴纳米材料Co3O4纳米花(Co3O4NFs)；
所述展示pVIII融合蛋白的噬菌体为利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与金黄色葡萄球菌特异性结合的噬菌体单克隆，并分离纯化展示有特异性多肽的pVIII融合蛋白。
所述噬菌体表面展示多肽配体以食源性致病菌金黄色葡萄球菌为靶标，利用生物淘选技术从风景噬菌体f8/9文库进行淘选，并通过特异性测试，获得能够特异性识别金黄色葡萄球菌的噬菌体单克隆，进一步的通过饱和酚分离纯化展示有特异性多肽的fusionpVIII。其中，生物淘选技术共经过3轮严格的淘选过程。
所述多功能仿酶纳米材料通过酰胺键将fusion pVIII与四氧化三钴磁性纳米材料表面连接构建得到。
一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料的制备方法：仿酶纳米材料通过酰胺键将fusion pVIII结合到四氧化三钴磁性纳米材料表面。
一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料的应用，所述仿酶纳米材料在磁泳富集分离或免疫比色检测病原微生物中的应用。
所述仿酶纳米材料与含有靶标微生物金黄色葡萄球菌的复杂样品孵育，然后在反应体系底侧部添加磁场，使得游离的仿酶纳米材料、与微生物结合的多功能生物磁性纳米探针均被磁场分离下来，并重悬于50μl缓冲液(10mM，pH 7.4)中，再加入PEG溶液，再利用磁场进行磁泳分离10min，进而磁泳富集分离样品中微生物实现定性检测。
所述磁泳富集分离后溶液中加入显色体系，使其进行免疫反应，进而实现定量的检测。
所述免疫比色法定量检测金黄色葡萄球菌是既磁泳富集分离该微生物之后，在含有磁泳分离得到的移液枪底部的液体中加入显色体系进行反应。
所述多功能生物磁性纳米探针与靶标菌孵育时的添加量与浓度为10μl、0.5mg/ml。
所述多功能生物磁性纳米探针与靶标微生物金黄色葡萄球菌孵育条件为室温条件下轻微地震荡孵育1h。
所述磁泳分离时所用聚乙二醇8000(PEG8000)溶液的浓度为40％(w/t)。
所述免疫比色显色体系及条件为160μl缓冲液(10mM，pH 4)、20μl 10mM H2O2和20μl 6mM 2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)，室温反应30min，最后测定417nm处的吸光度值。
本发明的有益效果为：本发明将具有较高仿过氧化物酶活力和较强磁性的四氧化三钴纳米材料以及采用生物淘选技术从噬菌体文库中淘选得到可特异性识别和结合金黄色葡萄球菌的噬菌体多肽配体进行组装，获得多功能磁性生物纳米探针。该探针中的四氧化三钴纳米结构因其磁性和可催化过氧化物酶底物产生明显的显色反应可分别实现靶标菌的富集分离和检测信号放大；本发明是将噬菌体多肽配体组装在四氧化三钴磁性纳米材料的表面构建得到既可特异性识别、结合、富集、分离金黄色葡萄球菌，又可实现信号放大的多功能磁性纳米探针，实现了金黄色葡萄球菌的灵敏特异检测，具有十分重要的现实意义；具体是：
1、本发明采用生物淘选技术从噬菌体文库中淘选得到金黄色葡萄球菌的高亲和性和高特异性的噬菌体九肽配体AQTFLGEQD。该多肽配体稳定性高、分子量小、特异性高、易合成，将作为昂贵抗体的替代物。
2、本发明采用氨基甲酸叔丁酯(BOC)保护九肽配体的N端、然后将其C端用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化EDC/NHS活化将金黄色葡萄球菌特异性结合的pVIII融合蛋白组装在Co3O4NFs的表面，构建得到一种新颖多功能磁性纳米探针。该探针不仅可以特异性识别、富集分离靶标微生物金黄色葡萄球菌，又可因其仿过氧化酶活性实现信号放大。
3、本发明实现了金黄色葡萄球菌的磁泳分离免疫比色检测方法。该方法检出限为8cfu/mL，低于迄今报道的其他方法的检出限。所提出的方法具有检测范围宽、选择性好、价格低廉，适用于实际复杂样品中靶标菌的定量检测。
附图说明
图1为本发明实施例提供的磁泳分离及免疫比色法检测金黄色葡萄球菌示意图。
图2为本发明实施例提供的三轮生物淘选的回复率。
图3为本发明实施例提供的挑选的两种噬菌体单克隆特异性测试结果。
图4为本发明实施例提供的饱和酚提纯噬菌体pVⅢ-融合蛋白示意图。
图5为本发明实施例提供的透射电镜(TEM)表征，A为金黄色葡萄球菌，B为多功能磁性纳米探针与1000CFU/mL金黄色葡萄球菌孵育。
图6为本发明实施例提供的磁泳分离及免疫比色法检测金黄色葡萄球菌特异性测试结果。
图7为本发明实施例提供的磁泳分离及免疫比色法检测金黄色葡萄球菌工作曲线。
具体实施方式
下面通过实施例详述本发明涉及的检测方法，但不构成对本发明的限制。本发明采用生物模板法合成四氧化三钴磁性仿酶纳米材料，同时利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与金黄色葡萄球菌特异性结合的噬菌体单克隆，并分离纯化展示有特异性多肽的噬菌体pVIII融合蛋白。通过将fusion pVIII组装在四氧化三钴纳米材料的表面，从而构建一种多功能生物磁性纳米探针。该探针可实现将靶标微生物从复杂样品中富集和磁性分离，又因其仿酶活性可实现信号放大，从而实现金黄色葡萄球菌的磁泳分离及免疫比色定量检测。
实施例1
噬菌体表面展示多肽配体的制备
以食源性致病菌金黄色葡萄球菌为靶标，利用生物淘选技术从风景噬菌体f8/9文库进行淘选，并通过特异性测试，成功获得能够特异性识别副溶血弧菌的噬菌体单克隆。进一步大量扩增噬菌体并通过饱和酚分离纯化展示有特异性多肽的噬菌体fusion pVIII。
首先，将金黄色葡萄球菌接种到96孔板中，过夜使其干燥。取10μl的f8/9风景噬菌体文库(约1013个/ml)与45μl的文库封闭液混匀，室温静置1h，然后吸除孵育后不能与靶标细胞结合的噬菌体文库。向金黄色葡萄球菌细胞中添加100μl的洗涤缓冲液(含有0.5％BSA、0.1％Tween-20)并室温孵育10min，弃去缓冲液，然后再次洗涤，如此反复洗涤6-8次，以除去细胞表面结合不牢固的噬菌体。吸除洗涤缓冲液，向金黄色葡萄球菌细胞中加入洗脱缓冲液(含有1mg/ml BSA、0.1mg/ml酚红、0.2M甘氨酸)，室温条件下静置10min，洗脱结合于金黄色葡萄球菌细胞表面的噬菌体。将洗脱液转移至含有19μl中和液(含有1M Tris，pH9.1)的1.5ml离心管中，振荡使其混匀，溶液的颜色由黄色迅速变为酒红色，测定所得噬菌体的滴度，标记为金黄色葡萄球菌细胞第一轮淘选输出的噬菌体总量。
然后扩增第一轮得到的噬菌体，纯化后测定滴度，用于下一轮噬菌体淘选。利用噬菌体回复率监控每一轮淘选过程，回复率的计算方法为：回复率＝输入的噬菌体总量/输出的噬菌体总量×100％。三轮淘选回复率如图2所示。
经过三轮生物淘选后，能够与金黄色葡萄球菌细胞结合的噬菌体得到有效的富集，当第三轮噬菌体淘选结束后，输出的噬菌体不再需要扩增，从测定滴度的平板上随机挑取单克隆，进行PCR鉴定，根据鉴定结果将PCR扩增片段送至公司测序并对测序结果进行分析，结果如表1所示。根据分析结果，将对应的展示有完整外源随机九肽的大肠杆菌菌落进行活化、扩增并从中纯化相应的噬菌体，测定纯化后噬菌体浓度，保存于4℃冰箱中备用。
然后进行特异性测试。分别向96孔板的不同小孔内接种实验组金黄色葡萄球菌和对照组爱德华氏菌、大肠杆菌Trans 5α、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血弧菌和鳗弧菌，过夜干燥。次日，向每个孔中加入50μl噬菌体(107TU)，室温静置孵育1h。然后利用同生物淘选过程相似的方法，通过洗涤、洗脱、裂解和滴度测定等步骤，得到每种细胞的细胞表面噬菌体和细胞内噬菌体数量，对每种细胞对应的噬菌体回复率进行计算，根据回复率的高低确定噬菌体对靶标细胞的结合特异性，结果如图3所示。
最后分离和纯化特异性噬菌体的衣壳蛋白。大量扩增靶标特异性噬菌体S1，经纯化后得到滴度约为1013TU/ml的噬菌体溶液。按照图4所示进行噬菌体衣壳蛋白分离纯化，具体为：将噬菌体溶液与饱和酚融合按照1:1体积比混合，振荡8min，以3000g、4℃条件离心10min，溶液分为上层水相和下层有机相，根据衣壳蛋白与核酸的性质不同，疏水的衣壳蛋白溶于下层，亲水的核酸溶于上层。去掉上层含有DNA的水溶液，向剩余有机相中加入等体积的1M Tris(pH 8.0)溶液，再次振荡8min，离心使溶液分层，重复此过程3次，使得其中的核酸物质被完全分离除去。多次抽提后，去掉上清，向含有蛋白的饱和酚溶液中加入2倍体积的甲醇，然后依次置于甲醇：10mM Tris＝1:1的溶液、甲醇：10mM Tris＝1:3的溶液、10mMTris溶液和蒸馏水中透析，透析时间均为12h。然后采用Tricine-SDS-PAGE凝胶进行鉴定。
金黄色葡萄球菌噬菌体表面展示多肽配体序列为AQTFLGEQD，其能够高亲和性和高特异性结合副溶血弧菌。
表1挑选的噬菌体单克隆展示的多肽序列
实施例2
金黄色葡萄球菌磁泳分离及免疫比色法检测方法的构筑和测试
利用Co3O4NFs的磁性和仿过氧化物酶活性以及pVIII融合蛋白对S.aureus的特异性结合的性能，构建基于特异噬菌体pVIII融合蛋白的无标记仿酶纳米材料探针，而后利用探针进行磁泳法快速分离检测S.aureus的方法：
1)无标记仿酶纳米材料探针的制备：
首先以BSA为模板合成BSA-Co3O4NFs，具体步骤为：将15mg的BSA加入含有1mMCoCl2水溶液中，同时加入10mM的NaBH4，过夜反应后磁力回收样品并同进行冷冻干燥最终得到BSA-Co3O4粉末。
然后利用BOC保护从f8/9噬菌体文库中筛选并提纯得到的九肽配体AQTFLGEQD展示的pVIII蛋白(fusion pVIII)中具有与S.aureus结合活性的N端，然后将其C端用EDC/NHS进行活化，按照fusion pVIII/Co3O4NFs＝1000(摩尔比例)进行组装(4℃静置过夜)，此时fusion pVIII通过酰胺键组装在Co3O4NFs的表面。然后通过加入三氟乙酸将fusion pVIII去BOC保护，使得其-NH2端恢复与S.aureus特异性结合的活性，从而可得到Co3O4@fusionpVIII功能仿酶纳米探针。
2)利用探针进行磁泳法快速分离检测S.aureus的过程：
将10μl、0.5mg/ml的Co3O4@fusion pVIII-S1多功能生物磁性纳米探针与0-104cfu/ml的靶标微生物金黄色葡萄球菌室温震荡孵育1h，磁场分离游离的多功能生物磁性纳米探针、与微生物结合的多功能生物磁性纳米探针，将其重悬于50μl缓冲液中并吸入200μl的移液枪头中，然后吸入150μl 40％(w/t)PEG8000溶液。利用PEG可以改变反应体系的粘度而非密度的特性，对游离的及与微生物结合的功能磁球通过磁泳法分离开来，由于与微生物结合的多功能生物磁性纳米探针的密度较大，故其率先迁移至移液枪的底部。对该移液枪底部的液体进行TEM观察，结果如图5所示，证明该多功能生物磁性纳米探针确实能够与金黄色葡萄球菌结合。随后依次加入160μl缓冲液(10mM，pH 4)、20μl 10mM H2O2和20μl 6mM ABTS，室温反应30min。最后记录416nm处的吸光度值。随着靶标微生物浓度的增大，与其结合的多功能生物磁性纳米探针也增大，进而最终反应吸光值也会随之增大。
依据本发明建立的方法可实现副溶血弧菌的灵敏特异检测(图5)，其检测范围为0-104cfu/ml，检出限为8cfu/mL，如图6所示，低于迄今报道的其他方法的检出限。
综上所述，本发明通过采用生物模板法合成表面氨基化的同时具有优良磁性和仿过氧化物酶活性的四氧化三钴纳米材料。同时通过生物淘选技术获得金黄色葡萄球菌的特异性噬菌体多肽配体，并将其组装在四氧化三钴磁性纳米材料的表面，从而构建得到一种新颖多功能生物磁性纳米探针。利用该探针开发了检测金黄色葡萄的磁泳分离及免疫比色方法，检出限低至8cfu/mL，低于迄今报道的其他方法的检出限。该方法操作简单、成本低廉、特异性和灵敏度均较高，为实现致病微生物的富集分离及灵敏检测提供了一条有效途径。
上面结合附图对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细的说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，也不限于纳米仿酶和生物酶(如辣根过氧化物酶等)，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料，其特征在于：将pVIII融合蛋白(fusion pVIII)组装在四氧化三钴纳米材料的表面，即获得仿酶纳米材料；所述fusion pVIII与四氧化三钴磁性纳米材料的摩尔比为1000:1。
2.按权利要求1所述的基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料，其特征在于：所述四氧化三钴纳米材料为以牛血清白蛋白(BSA)为模板采用生物模板法合成的四氧化三钴纳米材料Co3O4纳米花(Co3O4 NFs)；
所述fusion pVIII为利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与金黄色葡萄球菌特异性结合的噬菌体单克隆，并分离纯化展示有特异性九肽配体AQTFLGEQD的噬菌体主要衣壳蛋白pVIII(pVIII融合蛋白，fusion pVIII)。
3.按权利要求1或2所述的基于噬菌体表面展示靶向多肽配体和磁性仿酶纳米材料，其特征在于：所述噬菌体表面展示多肽配体以食源性致病菌金黄色葡萄球菌为靶标，利用生物淘选技术从风景噬菌体f8/9文库进行淘选，并通过特异性测试，获得能够特异性识别金黄色葡萄球菌的噬菌体单克隆，进一步通过饱和酚分离纯化展示有特异性多肽的噬菌体fusion pVIII。
4.一种权利要求1所述的基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料的应用，其特征在于：所述仿酶纳米材料在磁泳富集分离或免疫比色检测病原微生物中的应用。
5.按权利要求4所述的基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料的应用，其特征在于：所述仿酶纳米材料与含有靶标微生物金黄色葡萄球菌的复杂样品孵育，然后在反应体系底侧部添加磁场，使得游离的仿酶纳米材料、与微生物结合的多功能生物磁性纳米探针均被磁场分离下来，并重悬于50μl缓冲液(10mM，pH 7.4)中，再加入PEG溶液，再利用磁场进行磁泳分离10min，进而磁泳富集分离样品中微生物实现定性检测。
6.按权利要求5所述的基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料的应用，其特征在于：所述磁泳富集分离后溶液中加入显色体系，使其进行免疫反应，进而实现定量的检测。
7.按权利要求6所述的基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料的应用，其特征在于：所述免疫比色显色体系及条件为160μl缓冲液(10mM，pH 4)、20μl 10mM H2O2和20μl 6mM 2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)，室温反应30min，最后测定417nm处的吸光度值。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112881510A (zh) * 2021-01-15 2021-06-01 传鸣(宁波)化学科技有限公司 用于富集微生物的混合物、方法及应用
CN113702308A (zh) * 2021-08-25 2021-11-26 青岛大学 适配体纳米比色生物传感器及其应用和产品、大肠杆菌的检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104568934A (zh) * 2015-01-05 2015-04-29 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 纳米四氧化三钴作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢的应用
CN106111140A (zh) * 2016-06-13 2016-11-16 齐鲁工业大学 具有高类过氧化物酶活性及稳定性的四氧化三钴微米带及其制备方法
CN106397539A (zh) * 2016-05-12 2017-02-15 青岛大学 含有与前列腺抗原特异性结合短肽的噬菌体及其应用
CN106771194A (zh) * 2017-01-18 2017-05-31 青岛大学 一种检测病原微生物的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104568934A (zh) * 2015-01-05 2015-04-29 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 纳米四氧化三钴作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢的应用
CN106397539A (zh) * 2016-05-12 2017-02-15 青岛大学 含有与前列腺抗原特异性结合短肽的噬菌体及其应用
CN106111140A (zh) * 2016-06-13 2016-11-16 齐鲁工业大学 具有高类过氧化物酶活性及稳定性的四氧化三钴微米带及其制备方法
CN106771194A (zh) * 2017-01-18 2017-05-31 青岛大学 一种检测病原微生物的方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112881510A (zh) * 2021-01-15 2021-06-01 传鸣(宁波)化学科技有限公司 用于富集微生物的混合物、方法及应用
CN113702308A (zh) * 2021-08-25 2021-11-26 青岛大学 适配体纳米比色生物传感器及其应用和产品、大肠杆菌的检测方法
CN113702308B (zh) * 2021-08-25 2024-01-30 青岛大学 用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器及应用

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