CN112881510A - 用于富集微生物的混合物、方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于富集微生物的混合物、方法及应用，所述混合物包括至少两种磁性纳米材料，甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料；其中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料分别为单独链接在磁性纳米材料上的，甘露糖凝集素和免疫球蛋白G不共同链接在同一磁性纳米材料上；混合物中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料两者的比例可任意调节。本发明实现复杂体系中微生物的快速、有效富集，提高了使用质谱鉴定微生物的准确性。
Description
技术领域
本发明微生物检测分析领域，特别涉及微生物富集、检测方法。
技术背景
微生物广泛分布于地球表面各处，一些有害微生物正在对人类生活造成危害。例如食品加工和运输过程中的微生物污染，水样中一些肠道致病菌的污染以及临床常见的血流感染，这些微生物的污染都对人类生命健康造成威胁。而对于感染性疾病的诊断一般是通过微生物检测明确病原体，进而通过病原体采取有针对的治疗方案。细菌培养是鉴定细菌的金标准，但是耗时长，阳性率不高，同时容易受到微生物污染。所以需要更加快速和可靠的方法用于微生物鉴定。
近五年基质辅助激光解析飞行时间质谱体系被广泛的应用于临床微生物的鉴定(2014年法国梅埃、德国布鲁克获得临床许可，2018年郑州安图获得CFDA 临床许可，2019年4月珠海美华获得CFDA许可，目前还有多家在临床验证待批)，原因在于相比于传统培养、生化鉴定质谱分析有着巨大的时间和成本优势，快速准确的微生物鉴定(或分型)能及时为医生的临床治疗提供指导。目前，国内三甲医院基本都配备了质辅助激光解析飞行时间质谱的微生物鉴定体系(仪器和数据库)。但质谱仅能针对单一微生物进行鉴定且对微生物的样本量有一定要求。例如针对临床常见的血流感染，由于血液中的微生物含量较低，临床常用血瓶对其培养至报阳，然后再转移到特定的琼脂培养基上再培养12-24小时，以达到纯化和增殖的目的，才能进行微生物的质谱鉴定，如此一来质谱用于微生物鉴定可缩短的时间有限。但是由于样本的复杂性，若不进行微生物的再培养纯化，质谱鉴定的准确性会大大降低。同时对于尿路感染也是如此，在医生进行诊断治疗前，也需对病人尿液中的细菌进行培养增菌，分离出单菌落后再进行质谱鉴定或者染色鉴定等，这一过程需3-5天的时间。因此，在质谱鉴定前引入有效的、可靠的微生物富集方法，不仅可以跳过再培养的过程，而且可以提高质谱鉴定的准确性。这对于微生物感染性疾病而言是是十分重要的，既避免了未得到鉴定结果前的经验性治疗阶段导致抗生素的滥用，也能在最短的时间内给患者确定精准的治疗方案，降低该类感染性疾病的死亡率。
然而目前尚未有特别简单而有效的微生物、特别是细菌的富集、鉴定方法。尤其是在血样、尿液等复杂体系中。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种可利用不同比例磁珠混合富集微生物的混合物及富集、鉴定方法和应用。
为实现上述目的，本发明提供以下方案：用于富集微生物的混合物，包括至少两种磁性纳米材料，甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料；其中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料分别为单独链接在磁性纳米材料上的，甘露糖凝集素和免疫球蛋白G不共同链接在同一磁性纳米材料上；混合物中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料两者的比例可任意调节。
进一步，甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料是将工程化的甘露糖凝集素通过生物素和链霉亲和素的作用链接到四氧化三铁颗粒上。
进一步，甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料中四氧化三铁颗粒是经粒径为 300nm链霉亲和素修饰。
进一步，免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料是将免疫球蛋白G以酸碱缩合的方式链接到四氧化三铁颗粒上而成的。所述四氧化三铁颗粒的粒径也可以为 300nm。
进一步，所述混合物还包括其他细菌亲和剂负载的磁性纳米材料。
进一步，其他细菌亲和剂负载的磁性纳米材料为伴刀豆球蛋白A和万古霉素中的一种或两种。
本发明还提供利用上述混合物对微生物进行富集的方法，将所述用于富集微生物的混合物加入缓冲液体系或复杂体系中，捕获目标微生物，所述复杂体系为血瓶、尿液和污水中的一种或多种。
进一步，捕获目标微生物后，分离微生物后，使用基质辅助激光解析电离质谱对捕获到的微生物进行质谱分析，将获得的微生物的指纹谱图与商用数据库中的标准谱图对比，实现微生物物种水平鉴定。
进一步，使用70％甲酸裂解捕获到的微生物，再加入乙腈进行提取，磁性分离后提取液点于靶板上，待自然晾干后覆盖上一层基质溶液，基质晾干后即进行质谱数据收集。
本发明还提供上述用于富集微生物的混合物在微生物富集、鉴定中的应用。
甘露糖凝集素(MBL)是一种钙依赖性凝集素，能识别不同细菌、真菌和病毒表面的甘露糖、岩藻糖和N-乙酰氨基葡萄糖。而工程化的MBL(Fc-MBL) 是通过基因工程去除天然MBL的促进凝血的结构域，剩余的糖结合结构域与免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段融合获得，其蛋白结构更加稳定。因此Fc-MBL 包裹的磁性纳米材料已经成为一种广谱性的微生物捕获材料，可用于大部分常见细菌的捕获；IgG包裹的磁性纳米材料主要用于细胞表面产生蛋白质A、G、L 的微生物的捕获。伴刀豆球蛋白A是从刀豆中提取的球蛋白，其对富含甘露糖的糖类有高亲和力，因此也可作为一种广谱性的细菌识别蛋白。万古霉素也是一种广谱糖肽类抗生素，由于可以结合大多数革兰氏阳性菌细胞壁中的D-丙氨酰 -D-丙氨酸(D-ala-D-ala)基团，因而成为一种针对革兰氏阳性菌的广谱性富集材料。
本文所公开的一种利用不同比例磁珠混合富集微生物的方法，不仅能同时涵盖甘露糖凝集素和免疫球蛋白G的微生物捕获能力，而且通过调节两种磁珠的比例，实现了血瓶、尿液、污水等复杂体系微生物有效捕获，提高了微生物质谱鉴定的准确性。对于其他复杂体系的微生物富集，我们还可以通过加入其他细菌亲和剂负载的磁性纳米材料，如伴刀豆球蛋白A和万古霉素等，进行两两混合或者三种细菌亲和材料的混合，实现微生物的有效富集。
通过前期的实验证明，在缓冲液体系中工程化的甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的富集效率均大于90％，而免疫球蛋白G 包裹的磁性纳米材料对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的的富集效率也可达80％以上。对于复杂体系通过调节两种磁性纳米材料的比例再进行目标微生物的捕获，这一方法既保证了该方法广谱性的微生物捕获能力，也进一步提高了微生物捕获效果的稳定性和质谱鉴定的准确率。
进一步的，与单一磁珠相比，混合磁珠的使用比例可以人为控制，更加灵活地应用于许多复杂体系中微生物的富集和质谱快速鉴定。这一方法对于微生物感染的早期诊断具有重要意义。
附图表说明
图1为磁性材料对金黄色葡萄球菌的富集效率图，采用工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从缓冲液中捕获细菌。
图2为磁性材料对大肠杆菌的富集效率图，采用工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从缓冲液中捕获细菌。
图3为磁性材料对头葡萄球菌的富集效率图，采用工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从缓冲液中捕获细菌。
图4为磁性材料对肺炎克雷伯菌的富集效率图，采用工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从缓冲液中捕获细菌。
图5为磁性材料对金黄色葡萄球菌的富集效率图，采用不同比例的工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从血瓶中捕获细菌。
图6为磁性材料对大肠杆菌的富集效率图，采用不同比例的工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从血瓶中捕获细菌。
图7为磁性材料对头葡萄球菌的富集效率图，采用不同比例的工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从血瓶中捕获细菌。
图8为磁性材料对肺炎克雷伯菌的富集效率图，采用不同比例的工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从血瓶中捕获细菌。
图9为磁性材料对金黄色葡萄球菌的富集效率图，采用不同比例的工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从尿液中捕获细菌。
图10为磁性材料对大肠杆菌的富集效率图，采用不同比例的工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从尿液中捕获细菌。
图11为磁性材料对金黄色葡萄球菌的富集效率图，采用不同比例的工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从污水中捕获细菌。
图12为磁性材料对大肠杆菌的富集效率图，采用不同比例的工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从污水中捕获细菌。
表2为磁性纳米材料对四种细菌富集后的质谱鉴定得分，采用不同比例的工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料从血瓶中捕获细菌。
具体实施方式
下面结合实施例及附图文本对本方法的使用作进一步详细描述。
实施描述：
本发明实施例中，如无特别说明，纳米材料富集到的微生物涂布到胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)固体培养基培养，当然也可以涂布至其他适合的培养基进行培养鉴定。
本发明实施例中采用质谱进行数据收集，以下实施例中使用珠海美华公司 M-Discover 100微生物质谱快速鉴定系统(商用数据库中包括2000多种微生物标准谱图)。
鉴定方法为：在线性正离子模式下收集质荷比为2000-20000道尔顿范围内的质谱信号。将获得的质谱图导入质谱数据处理软件进行基线校准、平滑和归一化后，与数据库中的标准谱图进行匹配，实现目标微生物的鉴定。具体的，将获得的质谱图导入质谱数据处理软件进行基线校准、平滑和归一化后，与商用数据库中的标准谱图进行匹配，得分低于1.7表示鉴定结果不可信，得分在1.7和2.0 之间代表细菌属水平上可信，得分超过2.0表示鉴定结果在细菌物种水平可信。
实施例1混合物及捕获方法在缓冲液体系中对金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希氏菌ATCC 8739、头葡萄球菌CICC 21722和肺炎克雷伯菌CICC 21519 的捕获效率
将100μg工程化的甘露糖凝集素包裹的纳米材料(磁珠Fc-MBL)或免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料(磁珠IgG)分散到15μL缓冲溶液(10mM Ca2+) 中，再加入10μL的金黄色葡萄球菌或者大肠杆菌或者头葡萄球菌或者肺炎克雷伯菌培养液(细菌浓度为～10，～100，～1000CFU/mL)，置于震荡金属浴上，37℃反应20分钟，期间保持磁珠悬浮。磁性分离除去上清液，留下微生物富集后的纳米材料。加入无菌水重悬成10μL，稀释后，在生物安全柜中进行平板涂布。图1-4显示磁珠Fc-MBL对实验所选的四种细菌的富集效率均可达90％以上，磁珠IgG对四种细菌的富集效率虽然略低于磁珠Fc-MBL，但也均>80％。这一结果表明这两种磁珠对细菌有较好的捕获能力。
实施例2该方法在缓冲液体系中对四种所选细菌的质谱鉴定结果
将100μg磁珠Fc-MBL或磁珠IgG分散到100μL缓冲溶液(10mM Ca2+) 中，再分别加入100μL的金黄色葡萄球菌或者大肠杆菌或者头葡萄球菌或者肺炎克雷伯菌培养液(细菌浓度为～10，～100，～1000CFU/mL)，置于震荡金属浴上，37℃反应20分钟，期间保持磁珠悬浮。磁性分离除去上清液，留下微生物富集后的纳米材料。再加入5μL 70％甲酸和5μL乙腈，磁性分离取1μL上清液点在靶板上，待样本室温干燥后，覆盖1μL基质，室温晾干后，放入仪器中进行检测。表1汇总了四种细菌的质谱鉴定结果。结果显示细菌样本采用磁珠 Fc-MBL富集后进行质谱分析，四种细菌与商用数据库匹配得分>2.0，鉴定结果可达细菌物种水平可信；细菌样本采用磁珠IgG富集后进行质谱分析，四种细菌的鉴定结果也可以达到物种水平可信。每一细菌样品在靶板上均平行点五个样本点，质谱鉴定结果具有一定的稳定性和可靠性。
表1
实施例3该方法在血瓶体系中对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的捕获效率
将100μg磁珠Fc-MBL、磁珠Fc-MBL：IgG＝4:1、磁珠Fc-MBL：IgG＝1:1、磁珠Fc-MBL：IgG＝1:4或磁珠IgG分散到15μL缓冲溶液(10mM Ca2+)中，再加入10μL的金黄色葡萄球菌阳性血培养液(细菌浓度为～10，～100，～1000 CFU/mL)，置于震荡金属浴上，37℃反应20分钟，期间保持磁珠悬浮。磁性分离除去上清液，留下微生物富集后的纳米材料。加入无菌水重悬成10μL，稀释后，在生物安全柜中进行平板涂布。图5表明随着两种磁珠比例的变化，富集效率也随之变化。使用单一磁珠从血瓶中捕获金黄色葡萄球菌的富集效率均低于 50％，而把比例调节为1：4或者4：1时，富集效率略有增加。两种磁珠的比例为1：1时，细菌的富集效率可达50％以上。
实施例4该方法在血瓶体系中对大肠埃希氏菌ATCC 8739的捕获效率
将100μg磁珠Fc-MBL、磁珠Fc-MBL：IgG＝4:1、磁珠Fc-MBL：IgG＝1:1、磁珠Fc-MBL：IgG＝1:4或磁珠IgG分散到15μL缓冲溶液(10mM Ca2+)中，再加入10μL的大肠杆菌阳性血培养液(细菌浓度为～10，～100，～1000CFU/mL)，置于震荡金属浴上，37℃反应20分钟，期间保持磁珠悬浮。磁性分离除去上清液，留下微生物富集后的纳米材料。加入无菌水重悬成10μL，稀释后，在生物安全柜中进行平板涂布。图6表明随着两种磁珠比例的变化，对大肠杆菌的的捕获效率呈正态分布，在两种磁珠用量相同附近富集效率达到峰值。
实施例5该方法在血瓶体系中对头葡萄球菌CICC 21722的捕获效率
将100μg磁珠Fc-MBL、磁珠Fc-MBL：IgG＝4:1、磁珠Fc-MBL：IgG＝1:1、磁珠Fc-MBL：IgG＝1:4或磁珠IgG分散到15μL缓冲溶液(10mM Ca2+)中，再加入10μL的头葡萄球菌阳性血培养液(细菌浓度为～10，～100，～1000 CFU/mL)，置于震荡金属浴上，37℃反应20分钟，期间保持磁珠悬浮。磁性分离除去上清液，留下微生物富集后的纳米材料。加入无菌水重悬成10μL，稀释后，在生物安全柜中进行平板涂布。图7表明在血瓶中不同比例的磁珠混合对头葡萄球菌的捕获效率也不同。当磁珠Fc-MBL和磁珠IgG等比混合时，细菌的富集效率可达50％以上。
实施例6该方法在血瓶体系中对肺炎克雷伯菌CICC 21519的捕获效率
将100μg磁珠Fc-MBL、磁珠Fc-MBL：IgG＝4:1、磁珠Fc-MBL：IgG＝1:1、磁珠Fc-MBL：IgG＝1:4或磁珠IgG分散到15μL缓冲溶液(10mM Ca2+)中，再加入10μL的肺炎克雷伯菌阳性血培养液(细菌浓度为～10，～100，～1000 CFU/mL)，置于震荡金属浴上，37℃反应20分钟，期间保持磁珠悬浮。磁性分离除去上清液，留下微生物富集后的纳米材料。加入无菌水重悬成10μL，稀释后，在生物安全柜中进行平板涂布。图8表明不同比例的磁珠Fc-MBL和磁珠IgG混合对肺炎克雷伯菌的富集效率结果与上述三种细菌类似，两种磁珠等比混合时效果最好，富集效率大于50％。
实施例7该方法在尿液体系中对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的捕获效率
将100μg磁珠Fc-MBL、磁珠Fc-MBL：IgG＝4:1、磁珠Fc-MBL：IgG＝1:1、磁珠Fc-MBL：IgG＝1:4或磁珠IgG分散到15μL缓冲溶液(10mM Ca2+)中，再加入10μL的金黄色葡萄球菌尿液培养液(细菌浓度为～10，～100，～1000 CFU/mL)，置于震荡金属浴上，37℃反应20分钟，期间保持磁珠悬浮。磁性分离除去上清液，留下微生物富集后的纳米材料。加入无菌水重悬成10μL，稀释后，在生物安全柜中进行平板涂布。图9表明随着磁珠Fc-MBL和磁珠IgG比例的变化，富集效率也随之变化。使用单一磁珠从尿液中捕获金黄色葡萄球菌的富集效率均低于50％，而把比例调节为1：4或者1：1或者4：1时，富集效率均有增加。磁珠比例为1：1或者1：4时，富集效率约为50％。当两种磁珠的比例为4：1时，细菌的富集效率可达50％以上。
实施例8该方法在尿液体系中对大肠埃希氏菌ATCC 8739的捕获效率
将100μg磁珠Fc-MBL、磁珠Fc-MBL:IgG＝4:1、磁珠Fc-MBL:IgG＝1:1、磁珠Fc-MBL:IgG＝1:4或磁珠IgG分散到15μL缓冲溶液(10mM Ca2+)中，再加入10μL的大肠杆菌尿液培养液(细菌浓度为～10，～100，～1000CFU/mL)，置于震荡金属浴上，37℃反应20分钟，期间保持磁珠悬浮。磁性分离除去上清液，留下微生物富集后的纳米材料。加入无菌水重悬成10μL，稀释后，在生物安全柜中进行平板涂布。图10表明随着两种磁珠比例的变化，对大肠杆菌的的捕获效率也有所变化。单一磁珠对细菌的捕获效率均低于50％，磁珠比例为磁珠 Fc-MBL:IgG＝1：1或者1：4时，效果略有增加，但仍小于50％。当磁珠比列调节为4:1时，富集效率最好(>50％)。
实施例9该方法在污水体系中对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的捕获效率
将100μg磁珠Fc-MBL、磁珠Fc-MBL:IgG＝4:1、磁珠Fc-MBL:IgG＝1:1、磁珠Fc-MBL:IgG＝1:4或磁珠IgG分散到15μL缓冲溶液(10mM Ca2+)中，再加入10μL的金黄色葡萄球菌污水培养液(细菌浓度为～10，～100，～1000CFU/mL)，置于震荡金属浴上，37℃反应20分钟，期间保持磁珠悬浮。磁性分离除去上清液，留下微生物富集后的纳米材料。加入无菌水重悬成10μL，稀释后，在生物安全柜中进行平板涂布。图11表明随着两种磁珠比例的变化，富集效率也随之变化。使用单一磁珠从污水中捕获金黄色葡萄球菌的富集效率均低于50％，而把比例调节为磁珠Fc-MBL:IgG为1：4或者1：1或者4：1时，富集效率略有增加，均大于50％。
实施例10该方法在污水体系中对大肠埃希氏菌ATCC 8739的捕获效率
将100μg磁珠Fc-MBL、磁珠Fc-MBL:IgG＝4:1、磁珠Fc-MBL:IgG＝1:1、磁珠Fc-MBL:IgG＝1:4或磁珠IgG分散到15μL缓冲溶液(10mM Ca2+)中，再加入10μL的大肠杆菌污水培养液(细菌浓度为～10，～100，～1000CFU/mL)，置于震荡金属浴上，37℃反应20分钟，期间保持磁珠悬浮。磁性分离除去上清液，留下微生物富集后的纳米材料。加入无菌水重悬成10μL，稀释后，在生物安全柜中进行平板涂布。图12表明随着两种磁珠比例的变化，对大肠杆菌的的捕获效率也不同。单一磁珠和磁珠比例为1：4时的捕获效率均小于50％。当把两种磁珠比例调节为1：4或者1：1时，混合磁珠对大肠杆菌的富集效率变化不大，均大于50％。
实施例11该方法在血瓶体系中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、头葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的质谱鉴定结果
将100μg磁珠Fc-MBL、磁珠IgG或磁珠Fc-MBL:IgG＝1:1分散到100μL 缓冲溶液中，再分别加入100μL的金黄色葡萄球菌或者大肠杆菌或者头葡萄球菌或者肺炎克雷伯菌阳性培养液，细菌培养液首先在10000rpm下离心2min，重悬到缓冲液(10mM Ca2+)中，细菌浓度约为～108CFU/mL，置于震荡金属浴上，37℃反应20分钟，期间保持磁珠悬浮。磁性分离除去上清液，留下微生物富集后的纳米材料。再加入5μL 70％甲酸和5μL乙腈，磁性分离取1μL上清液点在靶板上，待样本室温干燥后，覆盖1μL基质，室温晾干后，放入仪器中进行检测。每个样品平行点5个靶点。表2的第一列和第二列显示，采用磁珠 Fc-MBL富集后的四种所选的细菌样本进行质谱分析，除肺炎克雷伯菌外，鉴定评分均低于1.7，结果不可信。但是肺炎克雷伯菌的鉴定结果也未达到物种水平可信。对于革兰氏阴性菌，大肠杆菌和肺炎克雷伯菌均能匹配到数据库中对应的细菌物种。采用磁珠IgG包裹的磁性纳米材料富集后的细菌样本进行质谱分析，除头葡萄球菌外，鉴定评分也低于1.7，但是头葡萄球菌的鉴定结果也是物种水平不可信的。对于革兰氏阳性菌，金黄色葡萄球菌和头葡萄球菌均能匹配到数据库中对应的细菌物种。采用等比混合的两种磁性纳米材料对样本进行富集后，通过数据库匹配得分大于2.0，表明细菌物种水平是可信的。
表2
因此，经过初步研究显示，使用单一磁珠不能从血瓶、尿液、污水等复杂体系中中有效地捕获细菌，富集效率均低于50％，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，并且血瓶微生物的质谱鉴定结果也未达到细菌物种可信水平。因而采用不同比例的两种磁珠从复杂体系中富集微生物，富集结果表明不同比例的磁珠混合，对所选细菌的富集能力也不同。同时对于不同的复杂体系，达到最佳富集效果时，所用磁珠的比例也不同。对于血瓶体系，当混合磁珠的比例为1：1时，实验所选细菌的富集效率均可达50％以上。并且质谱鉴定结果显示所选的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均可达到物种水平可信。对于尿液体系，当混合磁珠的比例为4： 1时，实验所选细菌的富集效率均可达50％以上。对于污水体系，当混合磁珠的比例为4：1或者1：1或者1：4时，对金黄色葡萄球菌的富集效率相差不大，均可达50％以上；当混合磁珠的比例为4：1或者1：1时，对大肠杆菌菌的富集效率相差不大，可达50％以上。
Claims (10)
1.用于富集微生物的混合物，其特征在于，所述混合物包括至少两种磁性纳米材料，甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料；其中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料分别为单独链接在磁性纳米材料上的，甘露糖凝集素和免疫球蛋白G不共同链接在同一磁性纳米材料上；混合物中甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料和免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料两者的比例可任意调节。
2.根据权利要求1所述的用于富集微生物的混合物，其特征在于，甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料是将工程化的甘露糖凝集素通过生物素和链霉亲和素的作用链接到四氧化三铁颗粒上。
3.根据权利要求2所述的用于富集微生物的混合物，其特征在于，甘露糖凝集素包裹的磁性纳米材料中四氧化三铁颗粒是经粒径为300nm链霉亲和素修饰。
4.根据权利要求1所述的用于富集微生物的混合物，其特征在于，免疫球蛋白G包裹的磁性纳米材料是将免疫球蛋白G以酸碱缩合的方式链接到四氧化三铁颗粒上而成的。
5.根据权利要求1所述的用于富集微生物的混合物，其特征在于，所述混合物还包括其他细菌亲和剂负载的磁性纳米材料。
6.根据权利要求5所述的用于富集微生物的混合物，其特征在于，其他细菌亲和剂负载的磁性纳米材料为伴刀豆球蛋白A和万古霉素中的一种或两种。
7.利用权利要求1-6任意一下所述的用于富集微生物的混合物富集微生物的方法，其特征在于，将所述用于富集微生物的混合物加入缓冲液体系或复杂体系中，捕获目标微生物，所述复杂体系为血瓶、尿液和污水中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的用于富集微生物的混合物富集微生物的方法，其特征在于，捕获目标微生物后，分离微生物后，使用基质辅助激光解析电离质谱对捕获到的微生物进行质谱分析，将获得的微生物的指纹谱图与商用数据库中的标准谱图对比，实现微生物物种水平鉴定。
9.根据权利要求8所述的用于富集微生物的混合物富集微生物的方法，其特征在于，使用70％甲酸裂解捕获到的微生物，再加入乙腈进行提取，磁性分离后提取液点于靶板上，待自然晾干后覆盖上一层基质溶液，基质晾干后即进行质谱数据收集。
10.如权利要求1-6任意一项用于富集微生物的混合物在微生物富集、鉴定中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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