CN113155942A - 磁性功能化磁性纳米材料的用途及混合微生物鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种磁性功能化磁性纳米材料的用途及混合微生物的鉴定方法,所述捕获材料为甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G同时连接在磁珠表面；所述甘露糖结合凝集素为重组蛋白，免疫球蛋白G为天然蛋白，所述磁性功能化磁性纳米材料用于捕获或鉴定样本中的混合微生物。采用本专利的用途和方法无需长时间的培养即可快速得到样本中混合细菌感染的具体种类。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，且特别涉及一种磁性功能化磁性纳米材料的用途及混合微生物鉴定方法。
背景技术
当下，人类所认知的细菌种类是有限的。细菌作为微生物中的一部分，由细菌引发的公共卫生事件对人类造成的死亡，无异于一场场灾难。对于细菌，人们谈之色变，目前在医药卫生领域中投入了大量的财力和物力，防止病患受到周围环境中细菌特别是耐药性细菌的的侵袭，继而引发二次感染。如何对细菌进行有效的快速鉴定是其技术难点。对于由二混菌引发的泌尿系统感染，如何对尿液中二混菌的直接鉴定具有重要的临床指导和实际意义。
泌尿系统感染常见的是由单一致病菌引起，主要的致病菌为大肠杆菌，其中肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等见于再感染、留置导尿管、有并发症的尿路感染。多种细菌感染常见于留置导尿管、神经源性膀胱、结石、先天性畸形和阴道，肠道、尿道瘘等，主要特征为尿液中细菌数大于105CFU/mL，尿液中主要含有两种混合菌。
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种近年来已成为检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白等高效简便的工具，在20世纪80-90年代发展起来。2002年诺贝尔化学奖授予美国科学家约翰·芬恩、日本科学家田中耕一和瑞士科学家库尔特·维特里希，他们发明了对生物大分子进行识别和结构分析的方法，使得基质辅助激光解吸电离分行时间质谱得到了高速的发展，并广泛应用于生物分析、化学检测及微生物的鉴定等各个重要领域中。
现有的对生物样品特别是尿液中混合菌的检测鉴定方法主要是培养，但是培养耗时长，直接影响医生诊疗和病人康复时间。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱虽然应用于各种微生物鉴定，但是目前也仅用于对单一细菌进行鉴定。申请人之前已经发明一种微生物捕获材料，并尝试捕获鉴定单一细菌，效果较好，也申请了专利。而经过进一步研究，使用该微生物捕获材料对尿液等样品进行混菌检测，具有意想不到的优秀效果。
发明内容
本文为克服现有技术的缺陷，公开了用一种一种基于功能化磁性纳米材料和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的混合微生物快速鉴定方法。通过功能化磁珠对不同种类及不同混合比例下的混合微生物进行快速的捕获富集，运用MALDI-TOFMS对磁珠捕获后的混合菌在一定质荷比范围内(2000-20000Da)进行鉴定分析。实现尿液中混合微生物的快速鉴定。
为了实现上述目的，本发明提供一种磁性功能化磁性纳米材料的用途,所述捕获材料为甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G同时连接在磁珠表面；所述甘露糖结合凝集素为重组蛋白，免疫球蛋白G为天然蛋白，所述磁性功能化磁性纳米材料用于捕获或鉴定样本中的混合微生物。
进一步，所述混合微生物为两种或两种以上混合细菌。
进一步，所述样本为人体尿液样本。
进一步，所述磁珠为羧基修饰的磁珠，将羧基修饰的磁珠进行活化,其具体步骤为:取羧基修饰的磁珠溶液,去除磁珠自身所带的溶剂,加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应后,通过磁性分离得到活化的羧基修饰的磁珠；
将甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G与活化后的磁珠相连接,用甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G的混合溶液将活化好的磁珠重悬,进行偶联反应,将偶联反应后的磁珠从溶液中分离出来,得到具有微生物捕获能力的磁性功能化磁性纳米材料。
本发明还提供一种混合微生物的鉴定方法，将前述的功能化磁性纳米材料加入含混合微生物的生物样品中，加入Tris-HCl(Ca2+)缓冲液；
恒温混匀后，进行磁性分离；加入甲酸后再加入乙腈，进行裂解，收集裂解液；吸取裂解液点靶板，自然干透后在样品靶点处覆盖上CHCA基质溶液，完全干透后，进入基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪舱门内，收集二混菌的质谱图，与基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪的微生物质谱数据库进行比对，即可鉴定样品中的混合微生物。
进一步，质谱图收集时分子量在2000-20000Da，选择线性正离子模式，扫描速度为60/s，进行180次的叠加。
本发明的生物样品可以为血液、尿液、体液等，进一步，所述生物样品为尿液。
进一步，所述混合微生物为两种以上细菌混合。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：采用功能化磁性纳米材料对尿液中的混合微生物进行捕获富集，具有快速、操作简便的优点，在30分钟内即可完成对细菌的富集过程，加入的磁珠量少，总量在微克水平。所得混合微生物总的质谱图通过数据库对比，进行算法转化，即可得到各单一细菌的质谱图，进而区分出混合微生物中微生物的菌种类型。无需长时间的培养即可快速得到人体混合细菌感染的具体种类，可辅助医疗，针对性用药，可有效快速解决问题。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为实施例2中不同体积比下大肠杆菌和肺炎克雷伯菌二混菌在水溶液中富集后的质谱图。
图2为实施例2中不同体积比下大肠杆菌和肺炎克雷伯菌二混菌在尿液中富集后的质谱图。
图3为实施例3中不同体积比下大肠杆菌和铜绿假单胞菌二混菌在水溶液中富集后的质谱图。
图4为实施例3中不同体积比下大肠杆菌和铜绿假单胞菌二混菌在尿液中富集后的质谱图。
图5为实施例4中不同体积比下肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌二混菌在水溶液中富集后的质谱图。
图6为实施例4中不同体积比下肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌二混菌在尿液中富集后的质谱图。
具体实施方式
实施例1对水溶液和尿液中不同体积比下的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌二混菌的富集及其鉴定
细菌样本：大肠杆菌(Ec)ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Sa)ATCC 25923.
具体步骤：
1.将冻存于-80℃的菌种分别接种到胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)上并于37℃恒温箱培养12-14个小时。
2.将培养好的菌落划取部分分别溶于装有无菌水的离心管中，将菌液的OD600值调为0.7-0.8。取一定体积置于其它离心管中并进行离心后，加入等体积的尿液，即制备了特定OD600值的单菌尿液。
3.按体积比1：1和2：1比例取单菌液进行两两混合，得总体积分别为200μL和150μL的水和尿液中的二混菌溶液。
4.分别加入浓度为5mg/mL的Fc-MBL@Fe3O4 10μL于二混菌溶液中。
5.加入100μL的0.1mol/L pH为7.4的Tris-HCl(Ca2+)缓冲液。
6.在恒温混匀仪中转速为1000r、37℃下恒温摇晃30min，进行恒温孵育。
7.磁性分离，将磁珠和细菌的偶联物用200μL无菌水洗三次。加入5μL70％甲酸，5min后再加入等体积乙腈，进行裂解，收集裂解液。
8.用移液枪吸取1μL裂解液点靶板，自然干透后加入等体积的CHCA基质，完全干透后，进入基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪舱门内，即可收集二混菌的质谱图。
9.将所获得的混合菌的质谱谱图与数据库中谱图进行比对，进而对二混菌的种类进行分析鉴定。
表一 不同体积比下的二混菌在水溶液和尿液中的各成分得分情况
实施例2对水溶液和尿液中不同体积比下的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌二混菌的富集及其鉴定
细菌样本：大肠杆菌(Ec)ATCC 25922、肺炎克雷伯菌(KP)CICC 21519
具体步骤：
1.将冻存于-80℃的菌种分别接种到胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)上并于37℃恒温箱培养12-14个小时。
2.将培养好的菌落划取部分分别溶于装有无菌水的离心管中，将菌液的OD600值调为0.7-0.8。取一定体积置于其它离心管中并进行离心后，加入等体积的尿液，即制备了特定OD600值的单菌尿液。
3.按体积比1：1和2：1比例取单菌液进行两两混合，得总体积分别为200μL和150μL的水和尿液中的二混菌溶液。
4.分别加入浓度为5mg/mL的Fc-MBL@Fe3O4 10μL于二混菌溶液中。
5.加入100μL的0.1mol/L pH为7.4的Tris-HCl(Ca2+)缓冲液。
6.在恒温混匀仪中转速为1000r、37℃下恒温摇晃30min，进行恒温孵育
7.磁性分离，将磁珠和细菌的偶联物用200μL无菌水洗三次。加入5μL70％甲酸，5min后再加入等体积乙腈，进行裂解，收集裂解液。
8.用移液枪吸取1μL裂解液点靶板，自然干透后加入等体积的CHCA基质，完全干透后，进入基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪舱门内，即可收集二混菌的质谱图。
9.将所获得的混合菌的质谱谱图与数据库中谱图进行比对，进而对二混菌的种类进行分析鉴定。
表二 不同体积比下的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌二混菌在水溶液和尿液中的各成分得分情况
实施例3对水溶液和尿液中不同体积比下的大肠杆菌和铜绿假单胞菌二混菌的富集及其鉴定
细菌样本：大肠杆菌(Ec)ATCC 25922、铜绿假单胞菌菌(PA)CICC 21630具体步骤：
1.将冻存于-80℃的菌种分别接种到胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)上并于37℃恒温箱培养12-14个小时。
2.将培养好的菌落划取部分分别溶于装有无菌水的离心管中，将菌液的OD600值调为0.7-0.8。取一定体积置于其它离心管中并进行离心后，加入等体积的尿液，即制备了特定OD600值的单菌尿液。
3.按体积比1：1和2：1比例取单菌液进行两两混合，得总体积分别为200μL和150μL的水和尿液中的二混菌溶液。
4.分别加入浓度为5mg/mL的Fc-MBL@Fe3O4 10μL于二混菌溶液中。
5.加入100μL的0.1mol/L pH为7.4的Tris-HCl(Ca2+)缓冲液。
6.在恒温混匀仪中转速为1000r、37℃下恒温摇晃30min，进行恒温孵育
7.磁性分离，将磁珠和细菌的偶联物用200μL无菌水洗三次。加入5μL70％甲酸，5min后再加入等体积乙腈，进行裂解，收集裂解液。
8.用移液枪吸取1μL裂解液点靶板，自然干透后加入等体积的CHCA基质，完全干透后，进入基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪舱门内，即可收集二混菌的质谱图。
9.将所获得的混合菌的质谱谱图与数据库中谱图进行比对，进而对二混菌的种类进行分析鉴定。
表三 不同体积比下的大肠杆菌和铜绿假单胞菌菌二混菌在水溶液和尿液中的各成分得分情况
实施例4对水溶液和尿液中不同体积比下的肺炎克雷伯菌菌和铜绿假单胞菌二混菌的富集及其鉴定
细菌样本：肺炎克雷伯菌(KP)CICC 21519、铜绿假单胞菌菌(PA)CICC21630
具体步骤：
1.将冻存于-80℃的菌种分别接种到胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)上并于37℃恒温箱培养12-14个小时。
2.将培养好的菌落划取部分分别溶于装有无菌水的离心管中，将菌液的OD600值调为0.7-0.8。取一定体积置于其它离心管中并进行离心后，加入等体积的尿液，即制备了特定OD600值的单菌尿液。
3.按体积比1：1和2：1比例取单菌液进行两两混合，得总体积分别为200μL和150μL的水和尿液中的二混菌溶液。
4.分别加入浓度为5mg/mL的Fc-MBL@Fe3O4 10μL于二混菌溶液中。
5.加入100μL的0.1mol/L pH为7.4的Tris-HCl(Ca2+)缓冲液。
6.在恒温混匀仪中转速为1000r、37℃下恒温摇晃30min，进行恒温孵育
7.磁性分离，将磁珠和细菌的偶联物用200μL无菌水洗三次。加入5μL70％甲酸，5min后再加入等体积乙腈，进行裂解，收集裂解液。
8.用移液枪吸取1μL裂解液点靶板，自然干透后加入等体积的CHCA基质，完全干透后，进入基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪舱门内，即可收集二混菌的质谱图。
9.将所获得的混合菌的质谱谱图与数据库中谱图进行比对，进而对二混菌的种类进行分析鉴定。
表四 不同体积比下的肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌菌二混菌在水溶液和尿液中的各成分得分情况
虽然本发明已由较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟知此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所要求保护的范围为准。
Claims (8)
1.磁性功能化磁性纳米材料的用途,所述捕获材料为甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G同时连接在磁珠表面；所述甘露糖结合凝集素为重组蛋白，免疫球蛋白G为天然蛋白，其特征在于:所述磁性功能化磁性纳米材料用于捕获或鉴定样本中的混合微生物。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述混合微生物为两种或两种以上混合细菌。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述样本为人体尿液样本。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述磁珠为羧基修饰的磁珠，将羧基修饰的磁珠进行活化,其具体步骤为:取羧基修饰的磁珠溶液,去除磁珠自身所带的溶剂,加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应后,通过磁性分离得到活化的羧基修饰的磁珠；
将甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G与活化后的磁珠相连接,用甘露糖结合凝集素与免疫球蛋白G的混合溶液将活化好的磁珠重悬,进行偶联反应,将偶联反应后的磁珠从溶液中分离出来,得到具有微生物捕获能力的磁性功能化磁性纳米材料。
5.混合微生物鉴定方法,其特征在于,将权利要求1-4任意一项中所述的功能化磁性纳米材料加入含混合微生物的生物样品中，加入Tris-HCl(Ca2+)缓冲液；恒温混匀后，进行磁性分离；加入甲酸后再加入乙腈，进行裂解，收集裂解液；吸取裂解液点靶板，自然干透后在样品靶点处覆盖上CHCA基质溶液，完全干透后，进入基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪舱门内，收集二混菌的质谱图，与基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪的微生物质谱数据库进行比对，即可鉴定样品中的混合微生物。
6.根据权利要求5所述的混合微生物鉴定方法,其特征在于:质谱图收集时分子量在2000-20000Da，选择线性正离子模式，扫描速度为60/s，进行180次的叠加。
7.根据权利要求5所述的混合微生物鉴定方法,其特征在于:所述生物样品为尿液。
8.根据权利要求5所述的混合微生物鉴定方法,其特征在于:所述混合微生物为两种以上细菌混合。
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