CN111269970A - 一种简单快速的dna现场可视化检测装置和方法 - Google Patents

一种简单快速的dna现场可视化检测装置和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种简单快速的DNA现场可视化检测方法及装置，它将装有核酸荧光染料显色反应体系的核酸扩增反应器皿，在核酸扩增反应结束后，在反应器皿不开盖及核酸扩增反应子和核酸荧光染料显色反应体系其它试剂混合均匀的情况下，将反应器皿置于加热环境中，使得在温度为60至80°C进行孵育，消除荧光染料与引物、引物二聚体或其他非特异性反应生成的短链产物结合产生的背景荧光信号，用肉眼、摄像设备观察反应器皿内是否透出荧光。本发明可以实现快速的DNA可视化检测，根据视觉影像直接判断，结果直观，无需采用昂贵的仪器测定和计算及非视觉影像显示所需进行的专业判断，操作人员培训要求低，能适用于诸如肉类等用途广泛的现场DNA检测。

Description

一种简单快速的DNA现场可视化检测装置和方法
技术领域
本发明属于核酸扩增和检测的领域，其具体内容涉及到一种简单快速的核酸现场可视化检测装置和方法。
背景技术
随着人口的持续增长，人们每年对畜禽肉品的消费量在持续增大，同时人们对肉类的消费从由原来追求量的满足转向现在追求质的保证。由于牛、羊等动物的饲养成本逐渐提高以及肉质更好，牛肉、羊肉等价格在肉品交易市场中逐年攀升。而猪肉、鸡肉等价格每年基本维持在一个恒定的范围内，同时较牛肉、羊肉等价格低。许多不良商家为了获取暴利，不择手段，非法在高价肉中掺杂低价肉，如在牛肉中掺杂猪肉等。这些行为严重侵害了消费者的权益，危害了消费者的健康。不利于社会经济的平稳健康发展。为了实现对肉种类的鉴别，传统的方法主要是根据外观和形态进行判别，这对于外观相近的肉类很难鉴别出来。为此，研究者们建立了许多其他鉴别方法，如红外光谱分析法、质谱分析法、DNA检测法、色谱分析法、免疫分析法等。其中由于DNA分子非常稳定，每种肉类都有其自身独特的DNA，因此通过检测DNA来鉴别肉的种类是目前最为常用的方法之一。
对于检测DNA，一般需要先对DNA进行提取并扩增，再进行检测。因此为了实现对肉类DNA的现场检测，需要在DNA提取、DNA扩增、扩增结果判别等三方面进行一个简化。传统的肉类DNA检测方法在DNA提取与扩增上往往需要消耗2至3小时以上，操作过程较繁琐，操作步骤较多，需要较昂贵的仪器（如PCR扩增仪）等。扩增结果判别一般是利用层析试纸条检测技术或观察荧光扩增曲线来进行判断。前者需要开盖，容易产生假阳性结果；后者需要专业仪器，成本较高。因此，提供一种简单、快速、安全、防污染、低成本的肉类DNA现场可视化检测装置及方法应用于肉类现场鉴别具有重要意义。
SYTO 9、SYBR Green等荧光染料由于能够嵌入DNA中产生绿色荧光，常用于核酸扩增反应来对扩增产物进行检测。传统的检测方法是采用专业的大型荧光检测仪器对其进行检测。也有一些研究者利用特定波长的LED光源或紫外灯对其进行激发，利用肉眼进行判别。由于存在环境光的干扰，往往需要在暗室或黑暗的环境下进行观察，才能对阳性与阴性结果进行有效区分。同时由于荧光染料也能够与引物结合产生荧光信号，所以在室温下阴性样品也会产生一定的绿色荧光，使阳性与阴性结果区分不显著，影响结果判断。
发明内容
本发明首先要解决的技术问题是提供一种能够在普通环境（存在环境光）下的简单快速的DNA现场可视化检测方法。为此，本发明采用以下技术方案：
一种简单快速的DNA现场可视化检测方法，其特征在于，将装有核酸荧光染料显色反应体系的核酸扩增反应器皿，在核酸扩增反应结束后，在反应器皿不开盖及核酸扩增反应子和核酸荧光染料显色反应体系其它试剂混合均匀的情况下，将反应器皿置于加热环境中，使得在温度为60至80°C，优选地，温度为65至80°C，更优选地，温度为65至75°C，更优选地，温度为70至75°C，进行孵育，消除荧光染料与引物、引物二聚体或其他非特异性反应生成的短链产物结合产生的背景荧光信号，用肉眼观察反应器皿内是否透出荧光或通过摄像设备观察反应器皿内是否透出荧光和/或对反应器皿拍摄记录。
本发明再一个要解决的技术问题是提供一种能够在普通环境（存在环境光）下对核酸扩增产物进行可视化检测的装置，能够消除荧光染料与引物结合产生的背景荧光信号影响，并采用常规观察或摄像设备观察和记录。为此，本发明采用以下技术方案：
一种简单快速的DNA现场可视化检测装置，其特征在于包括箱体，所述箱体设置有温度调节区域及遮光观察区域，所述温度调节区域设置有上述反应器皿的支架，所述箱体中还设置有加热装置，使在所述支架上的反应器皿中的反应液能够在60至80°C的温度下进行检测，所述检测装置还设置有反应器皿的照射光源；所述观察区域设置观察孔，以观察处在温度调节区域的反应器皿，在观察孔和反应器皿所处的位置之间还设置有滤光片；或者，所述观察区中设置有摄像设备，在摄像设备的镜头和反应器皿所处的位置之间还设置有滤光片。
所述光源可以为LED光源。
所述加热装置设置在温度调节区域中，采用金属电加热发热体为温度调节区域加热。所述加热装置可配置有温控装置，通过传感器监测温度调节区域的温度或加热装置的发热体或反应器皿的温度或反应器皿周围的温度，并据此控制加热装置的工作。
所述加热装置可以采用加热铝块，加热铝块直接可作为反应器皿的支架。
所述箱体可设置遮光盖，在打开时放入反应器皿，关闭后起到遮光作用，可以有效消除环境光的干扰。
所述装置可通过对温度调节区的温度进行调节从而对移至装置内的反应器皿中的扩增反应液再进行加热，使荧光染料与引物、引物二聚体或其他非特异性反应生成的短链产物进行分离达到消除背景荧光信号的效果。调节的温度为60至80°C，更优选地，调节的温度为65至80°C，更优选地，调节的温度为65至75°C，更优选地，调节的温度为70至75°C。孵育的时长为5分钟，更优选地，孵育时长为3分钟，更优选地，孵育时长为2分钟。
在这些优选的调节温度与孵育时间下，在小于等于1分钟即可对肉类DNA扩增产物等DNA扩增产物进行可视化检测。
进一步地，通过温度调节，所述核酸扩增反应也可在对孵育条件下的同一加热环境中进行。本发明的可视化检测装置，能够调节加热温度，因此可将该检测装置与核酸恒温扩增反应（如环介导等温扩增反应）结合在一起，无需另外的控温设备，操作简单方便，检测成本低，这对于DNA现场可视化检测具有十分重要的意义。
所述检测是将核酸恒温扩增反应与可视化检测整合在一个反应器皿中完成，全程无需开盖。利用温控装置调节加热装置的温度，使得在适宜的反应温度下进行核酸恒温扩增反应。反应结束后，再改变加热装置的温度进行孵育以消除荧光染料与引物、引物二聚体或其他非特异性反应生成的短链产物结合产生的背景信号干扰。在结合在一起时，本发明的可视化检测装置中的温度调节区域也是核酸扩增反应的场所，所述支架作为核酸扩增反应时的反应器皿支架，所述加热装置作为核酸扩增反应的加热装置。
在进行检测时，采用特定波长的LED光源或其他光源对扩增反应液进行照射，经过特定波长的滤光片过滤后，进行可视化观察。优选地，激发波长为460至500nm，更优选地，激发波长为470至490nm，更优选地，激发波长为470至480nm；滤光片透过的波长优选地为520至560nm，更优选地为520至540nm，更优选地为520至530nm。
所述可视化检测装置除了能与恒温扩增反应结合外，也可与快速PCR反应（二温区）结合。本发明还提供了用于检测肉类DNA的快速PCR反应扩增体系和扩增程序。扩增体系主要考虑DNA聚合酶浓度、引物浓度及荧光染料浓度；扩增程序主要考虑两个温区各自设定的反应温度以及每个循环所需的时间。
（1）在检测肉类DNA的快速PCR扩增体系中，DNA聚合酶的浓度范围为8U至25U，优选地，DNA聚合酶的浓度范围为10U至20U，更优选地，DNA聚合酶的浓度范围为10U至15U。
（2）在检测肉类DNA的快速PCR扩增体系中，引物的浓度范围为0.4μM至1.6μM，优选地，引物的浓度范围为0.6μM至1.6μM，更优选地，引物的浓度范围为0.8μM至1.6μM。
（3）在检测肉类DNA的快速PCR扩增体系中，荧光染料的浓度范围为0.8μM至8.0μM，优选地，荧光染料的浓度范围为3.2μM至8.0μM，优选地，荧光染料的浓度范围为6.0μM至8.0μM。
（4）在检测肉类DNA的快速PCR扩增程序中，快速PCR反应每个循环只需要两个温度（变性温度与退火延伸温度）即可完成。变性温度的范围为90°C至98°C，优选地，变性的温度范围为92°C至96°C，更优选地，变性的温度范围为92°C至95°C；退火延伸温度的范围为45°C至65°C，优选地，退火延伸温度的范围为50°C至60°C，更优选地，退火延伸温度的范围为50°C至55°C。
（5）在检测肉类DNA的快速PCR扩增程序中，当反应器皿为八联管时，快速PCR反应每个循环时间在少于40s的时间内完成，优选地，每个循环时间在少于30s的时间内完成，更优选地，每个循环时间在少于20s的时间内完成；当反应器皿为毛细管时，快速PCR反应每个循环时间在少于30s的时间内完成，优选地，每个循环时间在少于20s的时间内完成，更优选地，每个循环时间在少于10s的时间内完成。
本发明的另一方面，为了实现肉类DNA的快速提取，本发明还提供了一种简单、无毒、快速、低成本的肉类DNA提取方法。该方法具体操作过程为：称取一定质量的肉末于1.5mL离心管中，随后加入一定体积的裂解液（氯化钠与十二烷基硫酸钠的混合液体）混匀裂解一段时间，然后简单离心取上清，用TE缓冲液（10mM三羟甲基氨基甲烷，1mM乙二胺四乙酸，pH值为8.0）进行一定浓度的稀释，即获得所需的肉类DNA。
（1）在肉类DNA提取过程中，肉末与裂解液的质量体积比在2:2至2:6范围内，优选地，质量体积比在2:3至2:5，更优选地，质量体积比在2:3至2:4。
（2）在肉类DNA提取过程中，使用的裂解液为氯化钠与十二烷基硫酸钠的混合液体，对于氯化钠，优选地，浓度为0.1 M至0.6 M，更优选地，浓度为0.2 M至0.5 M，更优选地，浓度为0.4至0.5 M；对于十二烷基硫酸钠，优选地，质量体积比为0.05 %至1.0 %，更优选地，质量体积比为0.1 %至0.5 %，更优选地，质量体积比为0.3 %至0.5 %。
（3）在肉类DNA提取过程中，肉末与裂解液混匀后，裂解时间范围在1 min至10min，优选地，裂解时间范围在2 min至6 min，更优选地，裂解时间在3 min至5 min。
（4）在肉类DNA提取过程中，用TE缓冲液进行一定浓度稀释时，优选地，稀释倍数为20倍至100倍，更优选地，稀释倍数为30至80倍，更优选地，稀释倍数为30倍至50倍。
本发明可以实现快速的DNA可视化检测，根据视觉影像直接判断，结果直观，无需采用昂贵的仪器测定和计算及非视觉影像显示所需进行的专业判断，操作人员培训要求低，能适用于诸如肉类等用途广泛的现场DNA检测。
附图说明
图1为本发明的简单快速肉类DNA现场可视化检测方法原理图。
图2.1.1及2.1.2分别为本发明的针对反应器皿为八联管的现场可视化检测装置示意图。
图2.2.1及2.2.2分别为本发明的针对反应器皿为毛细管的现场可视化检测装置示意图。
图3为实施例1的结果图。其中“1”代表阴性样本，“2”代表阳性样本。
图4为实施例2的结果图。其中“1”代表阴性样本，“2”代表阳性样本。
图5为实施例3的结果图。其中“1”代表阴性样本，“2”代表阳性样本。
图6为实施例4的结果图。其中“1”代表阴性样本，“2”代表阳性样本。
具体实施方式
参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述，但具体实施例并不对本发明作任何限定。
如图2.1.1、2.1.2、2.2.1、2.2.2所示，本发明提供的简单快速的DNA现场可视化检测装置包括箱体4，所述箱体设置有温度调节区域9及遮光观察区域8，所述温度调节区域设置有反应器皿的支架，该支架可由在温度调节区域所设置的加热铝块3的表面形状直接构成。反应器皿可以是八联管7或毛细管10，支架设置相应的支撑结构。
所述加热铝块3设置在温度调节区域中，为温度调节区域提高温度，使温度调节区域能够保持60至80°C的环境温度，核酸扩增反应子和核酸荧光染料显色反应体系其它试剂，在此温度范围内再次进行孵育，消除荧光染料与引物、引物二聚体或其他非特异性反应生成的短链产物结合产生的背景荧光信号。
所述检测装置还设置有反应器皿的照射光源，其可采用LED光源1；所述观察区域设置观察孔6，以观察处在温度调节区域的反应器皿，在观察孔和反应器皿所处的位置之间还设置有滤光片5；或者，所述观察区中设置有摄像设备11比如照相机或摄像机，在摄像设备的镜头和反应器皿所处的位置之间还设置有滤光片5，可在箱体上开窗或透明部位，以可观察到摄像设备11显示器或取景窗的图像。
所述箱体4可设置遮光盖2，在打开时放入反应器皿，关闭后起到遮光作用，可以有效消除环境光的干扰。
实施例1 可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉
猪肉DNA提取条件：称取150mg猪肉肉末于1.5mL离心管中，加入150μL裂解液（0.5M氯化钠，0.5%十二烷基硫酸钠）混匀并静置3分钟，然后10000rpm离心1分钟，吸取上清，用TE缓冲液对其进行50倍稀释，即获得肉类DNA。
快速PCR扩增体系：快速PCR反应在12.5μL体积中进行，该体系包含有8μM SYTO 9，TaKaRa Taq HS聚合酶3.125U，10×PCR Buffer（Mg2+ Plus），dNTP各0.2mM（购买自宝日医生物技术（北京）有限公司），引物浓度为1.6μM（购买自生工生物工程（上海）股份有限公司）。反应器皿为八联管。
快速PCR扩增程序：95 ℃热启动60s，40个循环，每个循环包括95℃反应9s，55℃反应9s，扩增总耗时13 min。
可视化检测：将扩增完的八联管直接放入可视化检测装置中，利用温控装置调节加热铝块3的温度至74.0°C，孵育时间1分钟，然后用波长为470nm的LED光源1照射八联管，透过525nm的滤光片5，利用摄像设备11对反应液进行观察。
使用的引物序列：
F：5’ GAAGGTTCAGGTTTACTCACG 3’
R：5’ TCAGCAAATCAATTTCAATCTGG 3’
扩增的模版序列：
5’GAAGGTTCAGGTTTACTCACGCCACCCAGCGGAAAACGGAAAGCCAAATTACCTGAACTGCTATGTATCTGGGTTCCATCCGCCCCAGATTGAAATTGATTTGCTGA3’（GeneBank:NC_010443.5）
利用可视化检测装置对反应液检测结果见图3；结果显示：猪肉阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例2 可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉
猪肉DNA提取条件：称取150mg猪肉肉末于1.5 mL离心管中，加入150μL裂解液（0.5 M氯化钠，0.5 %十二烷基硫酸钠）混匀并静置3分钟，然后10000 rpm离心1分钟，吸取上清，用TE缓冲液对其进行50倍稀释，即获得猪肉DNA。
快速PCR扩增体系：快速PCR反应在12.5μL体积中进行，该体系包含有8μM SYTO 9，TaKaRa Taq HS聚合酶3.125U，10×PCR Buffer（Mg2+ Plus），dNTP各0.2mM（购买自宝日医生物技术（北京）有限公司），引物浓度为1.6μM（购买自生工生物工程（上海）股份有限公司）。反应器皿为毛细管。
快速PCR扩增程序：95℃热启动30 s，40个循环，每个循环包括95 ℃反应4 s，55℃反应4 s，扩增总耗时5.9 min。
可视化检测：将扩增完的毛细管直接放入可视化检测装置中，利用温控装置调节加热铝块3的温度至74.0°C，孵育时间1分钟，然后用波长为470nm的LED光源1照射毛细管，透过525nm的滤光片5，利用摄像设备11对反应液进行观察。
使用的引物序列与扩增的模版序列同实施例1。
利用可视化检测装置对反应液检测结果见图4；结果显示：猪肉阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例3 可视化检测装置结合快速PCR反应检测牛肉
牛肉DNA提取条件：称取150 mg牛肉肉末于1.5mL离心管中，加入150μL裂解液（0.5 M氯化钠，0.5 %十二烷基硫酸钠）混匀并静置3分钟，然后10000 rpm离心1分钟，吸取上清，用TE缓冲液对其进行50倍稀释，即获得牛肉DNA。
快速PCR扩增体系同实施例1。反应器皿为八联管。
快速PCR扩增程序：95℃热启动60s，40个循环，每个循环包括95℃反应9s，55 ℃反应9s，扩增总耗时13min。
可视化检测：将扩增完的八联管直接放入可视化检测装置中，利用温控装置调节加热铝块3的温度至74.0°C，孵育时间1分钟，然后用波长为470nm的LED光源1照射八联管，透过525nm的滤光片5，利用摄像设备11对反应液进行观察。
使用的引物序列：
F：5’ CTGCTATGTGTATGGGTTCC 3’
R：5’ GTAGAAAGACCAGTCCTTGC 3’
扩增的模版序列：
5’CTGCTATGTGTATGGGTTCCATCCACCCCAGATTGAAATCGATTTGCTGAAGAATGGGGAGAAGATTAAATCGGAGCAGTCAGACCTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTAC3’（GeneBank:NC_037337.1）
利用可视化检测装置对反应液检测结果见图5；结果显示：牛肉阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；不含牛肉样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例4 可视化检测装置结合快速PCR反应检测牛肉
牛肉DNA提取条件：称取150 mg牛肉肉末于1.5mL离心管中，加入150μL裂解液（0.5 M氯化钠，0.5 %十二烷基硫酸钠）混匀并静置3分钟，然后10000 rpm离心1分钟，吸取上清，用TE缓冲液对其进行50倍稀释，即获得猪肉DNA。
快速PCR扩增体系同实施例1。反应器皿为毛细管。
快速PCR扩增程序：95℃热启动30s，40个循环，每个循环包括95℃反应4s，55℃反应4s，扩增总耗时5.9min。
可视化检测：将扩增完的毛细管直接放入可视化检测装置中，利用温控装置调节加热铝块3的温度至74.0°C，孵育时间1分钟，然后用波长为470nm的LED光源1照射毛细管，透过525nm的滤光片5，利用摄像设备11对反应液进行观察。
使用的引物序列与扩增的模版序列同实施例3。
利用可视化检测装置对反应液检测结果见图6；结果显示：牛肉阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；不含牛肉样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例5 可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，利用可视化检测装置中温度调节区调节加热铝块的温度为60°C，其他工作条件同实施例1/3（反应器皿为八联管）或同实施例2/4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉/牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例6 可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，利用可视化检测装置中温度调节区调节加热铝块的温度为65°C，其他工作条件同实施例1/3（反应器皿为八联管）或同实施例2/4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例7 可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，利用可视化检测装置中温度调节区调节加热铝块的温度为80°C，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例8 可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，可视化检测装置中加热铝块对扩增完样品的孵育时间为5分钟，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例9 可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，可视化检测装置中加热铝块对扩增完样品的孵育时间为3分钟，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例10 可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，可视化检测装置中加热铝块对扩增完样品的孵育时间为2分钟，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例11可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，可视化检测装置中LED光源的波长为490 nm，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例12可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，可视化检测装置中LED光源的波长为460 nm，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例13可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，可视化检测装置中LED光源的波长为490 nm，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例14可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，可视化检测装置中LED光源的波长为500 nm，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例15可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，可视化检测装置中滤光片的波长为530 nm，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例16可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，可视化检测装置中滤光片的波长为540 nm，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例17可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，可视化检测装置中滤光片的波长为560 nm，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例18可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中酶的浓度为25 U，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例19可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中酶的浓度为20 U，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例20可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中酶的浓度为15 U，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例21可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中酶的浓度为15 U，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例22可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中引物浓度各为0.4μM，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例23可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中引物浓度各为0.6μM，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例24可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中引物浓度各为0.8μM，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例25可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中荧光染料浓度为0.8μM，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例26可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中荧光染料浓度为3.2μM，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例27可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中荧光染料浓度为6.0μM，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例28可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中变性温度为98 °C，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例29可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中变性温度为96 °C，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例30可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中变性温度为92°C，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例31可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中退火延伸温度为45°C，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例32可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，快速PCR反应体系中退火延伸温度为60 °C，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例33可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，当反应器皿为八联管时，快速PCR反应体系中每个循环包括95 °C反应20s，55 °C反应20 s，其他工作条件同实施例1或3；当反应器皿为毛细管时，快速PCR反应体系中每个循环包括95 °C反应15 s，55 °C反应15 s，其他工作条件同实施例2或3。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例34可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，当反应器皿为八联管时，快速PCR反应体系中每个循环包括95 °C反应15s，55 °C反应15 s，其他工作条件同实施例1或3；当反应器皿为毛细管时，快速PCR反应体系中每个循环包括95 °C反应10 s，55 °C反应10 s，其他工作条件同实施例2或4。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例35可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，当反应器皿为八联管时，快速PCR反应体系中每个循环包括95 °C反应10s，55 °C反应10s，其他工作条件同实施例1或3；当反应器皿为毛细管时，快速PCR反应体系中每个循环包括95 °C反应5s，55 °C反应5s，其他工作条件同实施例2或4。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例36可视化检测装置结合环介导等温扩增反应检测猪肉
猪肉环介导等温扩增体系：该体系在15μL体系中进行，该体系包含有0.4μM SYTO9，BstDNA聚合酶（大片段）9.6U，10xThermoPol Reaction，Betaine（甜菜碱）0.8 M，MgCl2 2mM，dNTP各0.35mM，引物F3/B3浓度各为0.2μM，引物FIP/BIP浓度各为1.6mM，引物LF/LB浓度各为0.4μM（购买自生工生物工程（上海）股份有限公司）。
猪肉环介导等温扩增程序：63 ℃恒温加热20分钟。
使用的引物序列：
F3：5’ AGACTATGAAGACCTCACCTT 3’
B3：5’ AGTGCTGACTAGCTTCTCA 3’
FIP：5’ AGGGATGGGACGGCTCATGACAATCGAGTTGTTCTACCA 3’
BIP：5’ ACAGATGCTATCCCAGGACGATCTGAGCACTGTCCGTAA 3’
LF：5’ GCAGTACGTCTTCAGAGGATAC 3’
LB：5’ CTCTAATATCCACACGACCTGG 3’
扩增的模版序列：
5’AGACTATGAAGACCTCACCTTTGACTCATATATAATCCCCACATCAGATCTTAAACCTGGAGAAATACGACTACTAGAAGTAGACAATCGAGTTGTTCTGCCAATAGAAATAACAATCCGAATATTAGTGTCCTCTGAAGACGTACTACACTCATGAGCTGTCCCATCCCTCGGTTTAAAAACAGATGCTATCCCAGGACGACTAAACCAAACAACTCTAATATCCACACGACCTGGCCTTTATTACGGACAGTGCTCAGAAATCTGTGGATCAAACCACAGCTTCATGCCCATTGTACTTGAACTTGTCCCATTAAAGTACTTCGAAAAATGGTCAACATCAATATTAACAGGTTCATTGAGAAGCTAGTCAGCACT3’（GeneBank:KC469586.1）
此实施例中，环介导等温扩增反应在可视化检测装置中进行，将加热铝块3的温度调至63℃，加热反应20分钟，然后利用温控装置将加热铝块3的温度调至74℃孵育1分钟，然后用波长为470nm的LED光源1照射反应液，透过525nm的滤光片5，利用摄像设备11对反应液进行观察。猪肉DNA提取条件同实施例1。
结果显示：猪肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉样本无绿色荧光。
实施例37可视化检测装置结合环介导等温扩增反应检测牛肉
牛肉环介导等温扩增体系：该体系在15μL体系中进行，该体系包含有0.4μM SYTO9，BstDNA聚合酶（大片段）9.6 U，10xThermoPol Reaction，Betaine（甜菜碱）0.8 M，MgCl2 2mM，dNTP各0.35mM，引物F3/B3浓度各为0.2μM，引物FIP/BIP浓度各为1.6mM，引物LF/LB浓度各为0.4μM（购买自生工生物工程（上海）股份有限公司）。
牛肉环介导等温扩增程序：63 ℃恒温加热20分钟。
使用的引物序列：
F：5’ CTGCTATGTGTATGGGTTCC 3’
R：5’ GTAGAAAGACCAGTCCTTGC 3’
扩增的模版序列：
5’CTGCTATGTGTATGGGTTCCATCCACCCCAGATTGAAATCGATTTGCTGAAGAATGGGGAGAAGATTAAATCGGAGCAGTCAGACCTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTAC3’（GeneBank:NC_037337.1）
此实施例中，环介导等温扩增反应在可视化检测装置中进行，将加热铝块3的温度调至63℃，加热反应20分钟，然后利用温控装置将加热铝块3的温度调至74℃孵育1分钟，然后用波长为470nm的LED光源1照射反应液，透过525nm的滤光片5，利用摄像设备11对反应液进行观察。牛肉DNA提取条件同实施例3。
结果显示：牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含牛肉样本无绿色荧光。
实施例38可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，肉末与裂解液的质量体积比为2:6，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例39可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，肉末与裂解液的质量体积比为2:5，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例40可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，肉末与裂解液的质量体积比为2:4，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例41可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，裂解液中氯化钠使用的浓度为0.1 M，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例42可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，裂解液中氯化钠使用的浓度为0.2 M，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例43可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，裂解液中氯化钠使用的浓度为0.4 M，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例44可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，裂解液中十二烷基硫酸钠使用的质量体积比为0.05 %，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例45可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，裂解液中十二烷基硫酸钠使用的质量体积比为0.1 %，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例46可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，裂解液中十二烷基硫酸钠使用的质量体积比为0.3 %，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例47可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，裂解时间为1分钟，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例48可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，裂解时间为2分钟，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例50可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，裂解时间为5分钟，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例51可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，用TE缓冲液稀释20倍，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例52可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，用TE缓冲液稀释30倍，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。
实施例53可视化检测装置结合快速PCR反应检测猪肉或牛肉
此实施例中，猪肉或牛肉DNA提取过程中，用TE缓冲液稀释80倍，其他工作条件同实施例1或3（反应器皿为八联管）或同实施例2或4（反应器皿为毛细管）。结果显示：猪肉或牛肉阳性样本产生强绿色荧光，呈阳性结果；不含猪肉或牛肉样本无绿色荧光。

Claims (9)

1.一种简单快速的DNA现场可视化检测方法，其特征在于，将装有核酸荧光染料显色反应体系的核酸扩增反应器皿，在核酸扩增反应结束后，在反应器皿不开盖及核酸扩增反应子和核酸荧光染料显色反应体系其它试剂混合均匀的情况下，使反应器皿处于加热环境中，使得反应器皿中的反应液体在温度为60至80°C，优选地，温度为65至80°C，更优选地，温度为65至75°C，更优选地，温度为70至75°C，进行孵育，消除荧光染料与引物、引物二聚体或其他非特异性反应生成的短链产物结合产生的背景荧光信号，用肉眼观察反应器皿内是否透出荧光或通过摄像设备观察反应器皿内是否透出荧光和/或对反应器皿拍摄记录。
2.如权利要求1所述的一种简单快速的DNA现场可视化检测方法，其特征在于在遮光条件下用肉眼观察反应器皿内是否透出荧光或通过摄像设备观察反应器皿内是否透出荧光和/或对反应器皿拍摄记录。
3.如权利要求1所述的一种简单快速的DNA现场可视化检测方法，其特征在于所述孵育反应的时间为5分钟，更优选地，反应时长为3分钟，更优选地，反应时长为2分钟。
4.如权利要求1所述的一种简单快速的DNA现场可视化检测方法，其特征在于在进行孵育之前，所述核酸扩增反应也在同一加热环境中进行。
5.一种简单快速的DNA现场可视化检测装置，其特征在于包括箱体，所述箱体设置有温度调节区域及遮光观察区域，所述温度调节区域设置有权利要求1所述反应器皿的支架，所述箱体中还设置有加热装置，使在所述支架上的反应器皿中的反应液能够在60至80°C的温度下进行检测，所述检测装置还设置有反应器皿的照射光源；所述观察区域设置观察孔，以观察处在温度调节区域的反应器皿，在观察孔和反应器皿所处的位置之间还设置有滤光片；或者，所述观察区中设置有摄像设备，在摄像设备的镜头和反应器皿所处的位置之间还设置有滤光片。
6.如权利要求5所述的一种简单快速的DNA现场可视化检测装置，其特征在于所述光源为LED光源。
7.如权利要求5所述的一种简单快速的DNA现场可视化检测装置，其特征在于所述加热装置设置在温度调节区域中，采用金属电加热发热体为温度调节区域提高温度。
8.如权利要求5所述的一种简单快速的DNA现场可视化检测装置，其特征在于所述加热装置连接有温控装置。
9.如权利要求8所述的一种简单快速的DNA现场可视化检测装置，其特征在于可视化检测装置中的温度调节区域也是核酸扩增反应的场所，所述支架作为核酸扩增反应时的反应器皿支架，所述加热装置作为核酸扩增反应的加热装置。
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