CN113981139A - 一种核酸等温扩增检测试剂、试剂盒、检测系统及方法 - Google Patents

一种核酸等温扩增检测试剂、试剂盒、检测系统及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核酸等温扩增检测试剂、试剂盒、检测系统及方法，该试剂为冻干粉末态，其包括缓冲液、MgCl2、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、UNG酶、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、海藻糖、蔗糖、甘露醇、Tween20、盐酸胍、及待检病毒的LAMP的引物组合物。本发明采用了适合样本直接扩增的体系，能够裂解病原体，释放其基因组核酸，且提供一个耐抑制缓冲体系，达到免核酸提取的效果，同时实现了试剂冻干后常温保存，减少冷链运输弊端，本发明提供的检测系统将该检测试剂与本发明提供的具有反射镜的可视化核酸等温扩增装置检测设备结合，实现了样本进，结果出，快速便捷。

Description

一种核酸等温扩增检测试剂、试剂盒、检测系统及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核酸等温扩增检测试剂、试剂盒、检测系统及方法。
背景技术
环介导等温扩增(LAMP)技术的特点是针对靶基因的特定领域设计特异性引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件下保温几十分钟，即可实现核酸的扩增。LAMP法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，在食品微生物检测及临床医学上传染性疾病、转基因食品和胚胎性别坚定等特性的诊断上都具有独特的应用价值，使得人们对病原体的检测诊断得以快速并高通量的实现。
核酸等温扩增技术在实际应用当中容易遇到抑制现象。采样方法、样本类型、提取试剂、提取方法等均影响得到的DNA或RNA模板的质量，导致不同程度的扩增抑制，且目前多数现有技术采用先提取后反应的两步法，操作不便。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐抑制性好、操作简便的新型核酸等温扩增检测试剂、等温核酸扩增方法及其应用。
为实现本发明的目的，
本发明提供了一种核酸等温扩增检测试剂，所述核酸等温扩增检测试剂为冻干粉末态，其由以下原料冻干制成：
缓冲液、MgCl2、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、UNG酶、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、海藻糖、蔗糖、甘露醇、Tween 20、盐酸胍、及待检病毒的LAMP的引物组合物。
进一步地，所述检测试剂还包括可视化显色剂。
可选地，所述待检病毒为博卡病毒，所述引物组合物包括SEQ ID NO.1-6所示的引物。
可选地，所述待检病毒为呼吸道合胞病毒，所述引物组合物包括SEQ ID NO.7-12所示的引物。
可选地，所述待检病毒为新型冠状病毒，所述引物组合物包括SEQ ID NO.13-24所示的引物
本发明还提供了一种核酸等温扩增检测试剂盒，其含有上述的检测试剂。
本发明还提供了一种核酸等温扩增检测系统，其包括：
预装有核酸等温扩增检测试剂的反应管，所述核酸等温扩增检测试剂为冻干粉末态，其由以下原料冻干制成：缓冲液、MgCl2、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、UNG酶、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、海藻糖、蔗糖、甘露醇、Tween 20、盐酸胍、显色剂、及待检病毒的LAMP的引物组合物；
可视化核酸等温扩增装置，所述装置包括壳体和设置在所述壳体内的加热座，所述加热座内设有由上至下贯穿所述加热座的反应管固定孔，所述反应管固定孔用于放置所述反应管，所述壳体包括相互连接的上盖和下壳体，所述下壳体内装设有反射镜，所述反射镜设置在所述反应管固定孔的下方以供观察反应管内反应溶液的颜色；所述下壳体表面还设有观察窗，所述观察窗设置在所述反射镜的外侧，所述观察窗与所述反射镜之间的夹角为0-90°。
进一步地，所述下壳体的侧壁还设有一散热窗，所述下壳体内部靠近所述散热窗处设有第一散热风扇，所述第一散热风扇用于将热空气吹向所述下壳体外部，所述加热座的一侧底部设有第二散热风扇，所述一侧未设置反应管固定孔，所述第二散热风扇用于将冷空气吹向所述加热座。
进一步地，所述壳体还包括后座壳，所述上盖为透明材料制成，所述上盖与所述后座壳枢接；所述后座壳的表面设有显示窗口和控制键，所述后座壳的内部设有温度控制主板，所述温度控制主板与所述加热座控制连接。
本发明还提供了一种核酸等温扩增检测方法，其包括以下步骤：
S1、将待检样本加入预装有核酸等温扩增检测试剂的反应管中，所述核酸等温扩增检测试剂为冻干粉末态，其由以下原料冻干制成：缓冲液、MgCl2、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、UNG酶、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、海藻糖、蔗糖、甘露醇、Tween 20、盐酸胍及待检病毒的LAMP的引物组合物；
S2、将步骤S1所述的反应管置于LAMP反应装置中，在63℃～68℃反应10-30min。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括以下：
1、本发明提供的核酸等温扩增检测试剂，采用了适合样本直接扩增的体系(缓冲液、MgCl2、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、UNG酶、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、海藻糖、蔗糖、甘露醇、Tween 20、盐酸胍及待检病毒的LAMP的引物组合物)，能够裂解病原体，释放其基因组核酸，且提供一个耐抑制缓冲体系，达到免核酸提取的效果，同时实现了试剂冻干后常温保存，减少冷链运输弊端，增加应用场景；采用tween20和盐酸胍对病原体核酸进行裂解；海藻糖、蔗糖、甘露醇对反应体系冻干过程进行保护，可实现试剂的冻干粉形态和试剂常温保存；
2、本发明提供的检测系统将本发明提供的检测试剂与本发明提供的具有反射镜的可视化核酸等温扩增装置检测设备结合，可对咽拭子、鼻拭子、唾液等中存在的病原体的核酸(DNA或RNA)进行一步法的检测方法；免去核酸提取这一繁琐步骤，实现核酸扩增(RT-LAMP)及其检测、结果读取一体化，本发明提供的可视化核酸等温扩增装置可直接显示LAMP反应结果，进而形成LAMP全封闭反应和LAMP结果自动判读一体化装置，达到便捷、高效的快速检测，实现样本进，结果出；从而具有丰富的应用场景，可用于海关，边检，诊所，医院门急诊，个人居家自测等；
4、本发明提供的核酸等温扩增检测试剂应用于博卡病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒检测时，检测结果符合企业标准品检测要求，符合方法学对病原体检测的基础性能要求。
附图说明
图1：本发明提供的可视化核酸等温扩增装置一方向的立体示意图；
图2：本发明提供的可视化核酸等温扩增装置另一方向的立体示意图；
图3：本发明提供的可视化核酸等温扩增装置又一方向的立体示意图；
图4：本发明提供的可视化核酸等温扩增装置的分解示意图；
图5：图4中A区域内结构的分解示意图。
图中：
1、壳体，11、上盖，12、后座壳，13、前壳，131、中壳体，1311、开口，132、下壳体，1321、散热窗，1322、观察窗，1323、防护盖，1324、反应管观察孔，133、支撑脚；
2、加热座，21、反应管固定孔；
3、反射镜；
41、第一散热风扇，42、第二散热风扇；
51、温度调节开关，52、电源插座，53、温度控制主板，54、控制键，55、显示窗口。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种耐抑制性好、操作简便的新型核酸等温扩增检测试剂、等温核酸扩增方法及其应用。
为更加清楚的表示，下面结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。若无特别说明，本发明选用的原料、试剂或设备均为市售所得。
本发明提供了一种核酸等温扩增检测试剂，所述核酸等温扩增检测试剂为冻干粉末态，其由以下原料冻干而成：缓冲液(Tris-HCL)、MgCl2、dATP(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)、dGTP(三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸)、dCTP(三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸)、dTTP(三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸)、dUTP(脱氧尿嘧啶核苷三磷酸)、UNG酶(尿嘧啶糖苷酶)、Bst DNA聚合酶(具体可为Bst 3.0DNA Polymerase)、逆转录酶(具体可为Reverse transcriptase)、海藻糖、蔗糖、甘露醇、Tween 20、盐酸胍、及待检病毒的LAMP的引物组合物。
上述冻干粉试剂由于采用了适合样本直接扩增的体系，能够裂解病原体，释放其基因组核酸，且提供一个耐抑制缓冲体系，达到免核酸提取的效果，同时实现了试剂冻干后常温保存，减少冷链运输弊端，增加应用场景。采用tween20和盐酸胍对病原体核酸进行裂解。海藻糖、蔗糖、甘露醇对反应体系冻干过程进行保护，可实现试剂的冻干粉形态和试剂常温保存。冻干后进行测试，性能和液体试剂等效，后续呼吸道合胞病毒、博卡病毒、新冠病毒检测采用冻干形式试剂进行验证。
上述冻干粉试剂还可进一步包含可视化显色剂，例如酸碱指示剂，荧光试剂或者荧光探针，在本发明的具体实施例中，选择以苯酚红作为可视化反应的显色剂，苯酚红为酸碱指示剂，其变色范围pH：6.8(黄)-8.4(红)。在LAMP的反应过程中，DNA聚合酶发挥聚合作用，改变质子数量进而改变pH值，使粉色反应液变成黄色，整个反应过程快速，颜色改变清晰，肉眼可见。该产品可以用于任何LAMP或者RT-LAMP反应，只需要提供样品和加热装置，在短时间内就可以用肉眼读取阳性扩增的结果。
本发明将上述各原料按一定比例混合后，经过冻干机(冻干机型号：LGJ-20F压盖型，冻干机生产厂家为北京松源)的的冻干程序运行后，形成干粉状。冻干程序参数设定见表1。
表1冻干程序参数设定
Figure BDA0003283193660000061
本发明提供的核酸等温扩增检测试剂可以用于在非疾病诊断目的的病原微生物检测，并进一步可制成检测相应的检测试剂盒等。制成试剂盒时，还可进一步包含样本保存液，所述样本保存液可以是生理盐水(0.9％NaCl溶液)。
具体的，本发明中的待检样本可以采用以下方式采集和保存。
咽拭子样本采集：将拭子(拭子柄材质：ABS塑料，拭子头材质：尼龙植绒材质)从口腔完全插入咽喉中(或者鼻腔中)，越过舌根到咽后壁或悬雍垂的后侧，适当用力擦拭病人咽后壁和两侧扁桃体部位，取出拭子注意避免触及舌部、口腔粘膜和唾液。注明标本留取时间，及时送检。将采集后的拭子插入样本保存液中，紧靠试管内壁旋转约10次，使样本尽可能溶解在滴瓶的保存液中。沿样本保存液管内壁挤压拭子头部，使液体尽可能留在管内，取出拭子，旋紧管盖。该处理后的咽拭子液为待检样本。
鼻拭子样本采集：将拭子(拭子柄材质：ABS塑料，拭子头材质：尼龙植绒材质)从鼻腔完全插入鼻腔中)，到达鼻咽部，适当用力擦拭，取出拭子放入滴瓶中。注明标本留取时间，及时送检。将采集后的拭子插入样本保存液中，紧靠试管内壁旋转约10次，使样本尽可能溶解在滴瓶的保存液中。沿样本保存液管内壁挤压拭子头部，使液体尽可能留在管内，取出拭子，旋紧管盖。该处理后的咽拭子液为待检样本。
唾液样本采集：打开滴瓶盖子，吐1mL左右唾液到滴瓶中，盖好盖子后，轻轻混匀唾液样本。该处理后的咽拭子液为待检样本。
本发明还提供了一种核酸等温扩增检测系统，其包括：预装有核酸等温扩增检测试剂的反应管和可视化核酸等温扩增装置，所述核酸等温扩增检测试剂为上述的冻干粉；所述可视化核酸等温扩增装置可以是市面上常见的可视化LAMP扩增仪(可以是酸碱指示剂变色可视化也可以是荧光可视化)，也可以是本发明提供的新型装置，该新型装置的结构如下：
请参阅图1-图5所示，本发明提供的可视化核酸等温扩增装置，包括壳体1、加热座2及反射镜3，其中加热座2和反射镜3设置在壳体1的内部。
请配合图1、图4及图5所示，壳体1包括相互连接的上盖11、后座壳12及前壳13，前壳13进一步包括中壳体131和下壳体132，中壳体131和下壳体132可以通过卡扣相互连接，上盖11可以为透明材料(例如透明塑料)制成，上盖11的一侧边枢接在后座壳12的顶部以方便开合，上盖11的盖体盖合在前壳13的中壳体131上，后座壳12与前壳13可以是通过螺接或卡接相互连接。壳体1的底部(即后座壳12和下壳体132的底部)还设有支撑脚133，支撑脚133的底部还可进一步设有防滑垫，以增加装置整体的稳固性。
请配合图4和图5所示，加热座2内设有由上至下贯穿所述加热座的反应管固定孔21，反应管固定孔21用于放置反应管。加热座2套接在中壳体131中，具体的，中壳体131的中部开设有开口1311，该开口与加热座2设有反应管固定孔21的部位/区域形状和大小相适应，以使得该部位/区域可以容置在开口1311中且与开口1311的边缘齐平；进而使用者通过透明上盖11即可观察到反应管内的反应情况。下壳体131的侧壁还设有一散热窗1321，下壳体132内部靠近散热窗1321处设有第一散热风扇41，第一散热风扇41用于将热空气吹向下壳体131的外部。
加热座2由导热性良好的金属制成，其外表面贴覆有加热膜(厂家：芝罘区明康五金机电商行，型号：YX89VA28)，通过对所述加热膜加热而使得金属加热座发热。容易理解的，也可以通过其他方式使金属加热座部分加热，例如布设加热丝。请参照图5所示，加热座2的一侧底部设有第二散热风扇42，该一侧未设置反应管固定孔21，从而不会对放置在反应管固定孔21中的反应管底部造成遮挡。第二散热风扇42用于将冷空气吹向加热座2，以使加热座降温。通过在壳体1侧壁和内部分别设置第一散热风扇41和第二散热风扇42，利于反应温度保持恒定，同时也可以在反应结束后给加热座2和可视化等温扩增装置进行降温。
请配合图1、图2、图4及图5所示，反射镜3设置在下壳体1321的下部内，且反射镜3位于反应管固定孔21的下方以供观察反应管内反应溶液的颜色。具体的，下壳体1321的表面开设有观察窗1322，观察窗1322设置在反射镜3的外侧，观察窗1322与反射镜3之间的夹角为0-90°，从而使得使用者可以直接通过观察窗1322看到反射镜3内反射出的反应管底部，进而直接观察到反应管内反应溶液的颜色得出结论。再具体的，下壳体1321的上表面可以设有与反应管固定孔21的大小和形状相适配的反应管观察孔1324，反应管观察孔1324位于反应管固定孔21的正下方，反射镜3位于反应管观察孔1324的下方，反射镜3例如是平面镜。反射镜3的附近还可进一步设置照明装置，例如在反射镜3的边缘设置白色灯带，以更清晰的看清反应管底部。观察窗1322上还可以进一步设有可以盖合该观察窗的防护罩，所述防护罩为透明材料制成，从而可以对观察窗内部进行防护同时不影响观察反射镜3内显示的反应管底部。
请配合图1-图5所示，后座壳12的表面设有显示窗口55和控制键54，显示窗口可以用于显示加热座2的加热目标温度、实际温度、加热时长等信息，控制键用于调节目标温度、加热时间等。后座壳12的内部设有温度控制主板53，温度控制主板53与加热座2控制连接，以采集和控制所述加热座2的加热温度与加热时间，智能控制，窗口显示，便于观察。下壳体132的侧壁上设有电源插座52，电源插座52与温度控制板53、第一散热风扇41及第二散热风扇42电连接以控制其电路的通断。所述中壳体131的侧壁还设有温度调节开关51，所述温度调节开关用于开启加热和散热功能。
本发明提供的新型可视化核酸等温扩增装置的使用过程可以如下：打开上盖，取15μL-30μL待测样本加入反应管中，反应管中预先装有所有检测试剂的冻干粉，盖紧反应管盖子(该反应管可以是市面上核酸扩增通用的离心管)，置于反应管固定孔中；启动加热开关，调整好目标加热温度和时间(升温到在63℃～68℃，最佳为65℃，恒温反应10-30min，最佳为20min)，自动加热进行反应，达到预设反应时间或者反应结束后，启动散热风扇进行散热；通过观察窗观察反射镜中显示的反应管底部的情况(即反应溶液最终的颜色)，得出结论(核酸阴性或阳性)。
本发明提供的反应试剂配合本发明的新型装置，可免去核酸提取这一繁琐步骤，装置可直接显示LAMP反应结果，进而形成LAMP全封闭反应和LAMP结果自动判读一体化系统。利用本发明中免核酸提取的可视化逆转录等温扩增(RT-LAMP)可简化核酸扩增和检测的操作步骤，达到便捷、高效的快速检测，实现样本进，结果出。由于该新型装置的结构简单、紧凑，所以整体的大小和尺寸可以根据需要制定，所以可以制成小型便携款，进一步增加实用性。
本发明中的检测系统具有丰富的应用场景，可用于家庭核酸自测，诊所核酸检测，海关，边检，医院门诊和急诊的检测、儿科急诊、宠物医院等。
以下通过具体应用实施例对本发明进行更详细的说明。
实施例1：
本实施例提供了利用本发明的检测试剂、检测系统和检测方法应用于非疾病诊断目的的博卡病毒(简称BK)检测上。
应用于博卡病毒检测的核酸检测试剂原料(反应体系原料)见表2。
表2博卡病毒核酸检测试剂配方(RT-LAMP法)
Figure BDA0003283193660000101
Figure BDA0003283193660000111
注：表2中，mM，μM，M中的M为mol/L的简写。
上述检测试剂原料(反应体系)中，引物组合物包括BK-F3、BK-R3、BK-FIP、BK-BIP、BK-LF、BK-LB共6条引物，其中BK为博卡病毒的简称，F3、R3、FIP、BIP、LF、LB为引物名称。这些引物通过引物设计软件(例如NEB网站https://lamp.neb.com/#！/)设计得出并由具有合成引物能力的公司进行合成。本发明根据NCBI网站下载的博卡病毒的基因组核酸序列，进行引物设计。本实施例最终设计筛选得到RT-LAMP引物组合的引物序列见表3。
表3实施例1中用于检测博卡病毒的引物序列表
Figure BDA0003283193660000121
本实施例将待检样本并置于样本保存液中保存后，将表2中的反应试剂原料冻干后置于按照本发明提供的检测装置中，对博卡病毒的企业参考品进行了以下方面的检测考察。所述企业参考品采用的人工合成的博卡假病毒和博卡病毒阳性的样本组成。所述假病毒由生工生物工程(上海)有限公司提供，实验测试前稀释到工作浓度。
01、检测限实验：
检测表4中2种检测限参考品：
表4实施例1检测限参考品信息
参考品编号 浓度 详细信息
BK L1 200copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
BK L2 1000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
检测限实验为每种检测限参考品重复检测20次，
本发明提供的检测系统对2种检测限参考品，在20次重复检测中，均100％检出阳性，证明了本发明检测系统的敏感性。
02、阴阳性参考品符合率实验：
检测表5中的BK P1阳性参考品3次，检测结果均为博卡阳性。检测BK N1阴性参考品3次，检测结果均为博卡阴性。
表5实施例1阴阳性参考品信息
参考品编号 浓度 详细信息
BK P1 2000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
BK N1 / 正常人咽拭子液(博卡病毒阴性)
03、特异性实验
检测表6中的特异性参考品各3次，均为阳性。
表6实施例1特异性实验参考品信息
参考品编号 浓度
BK T1 1000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
BK T2 2000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
BK T3 10000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
BK T4 100000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
04、精密度实验
检测表7中的精密度参考品：
表7实施例1精密度实验参考品信息
参考品编号 浓度 基因型
BK T1 2000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
BK T2 5000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
BK T3 / 正常人咽拭子液(博卡病毒阴性)
检测精密度参考品BK T1，BK T2,每种精密度参考品重复检测10次，均检测为阳性。检测精密度参考品BK T3 10次，均检测为阴性。
05、免提取测试
检测表8中的免提取测试参考品：
表8实施例1免提取测试实验参考品信息
参考品编号 浓度 基因型
BK M1 2000copy/mL 人工合成假病毒
BK M2 5000copy/mL 博卡病毒阳性咽拭子样本
BK M3 / 正常人咽拭子液(博卡病毒阴性)
检测免提取参考品BK M1，BK M2,每种精密度参考品重复检测3次，均检测为阳性。检测免提取参考品BK M3 3次，均为阴性。
06、抗干扰能力实验
经测试，样本中浓度含量为2g/L的血红蛋白和20mg/mL的粘蛋白对检测无影响。样本中含有表9所列浓度药物对检测结果无影响。
表9实施例1抗干扰能力实验中对检测结果无影响的药物及浓度信息
α-干扰素 扎那米韦 利巴韦林 奥司他韦 帕拉米韦 盐酸组胺 利托那韦 阿比多尔
1000万U/mL 50mg/mL 2g/mL 200mg/mL 1g/mL 5mg/mL 250mg/mL 1g/mL
左氧氟沙星 阿奇霉素 头孢曲松 莫米松 氟替卡松 苯福林 羟甲唑啉 倍氯美松
500mg/mL 1g/mL 2g/mL 1mg/mL 10mg/mL 50mg/mL 0.5mg/mL 2mg/mL
07、临床样本检测
检测80份阳性博卡病毒阳性咽拭子样本均为阳性，检测210份正常人咽拭子样本均为阴性；检测57份阳性博卡病毒鼻拭子样本均为阳性，检测88份正常人鼻拭子样本均为阴性；检测97份阳性呼吸道合胞病毒唾液样本均为阳性，检测256份正常人唾液样本均为阴性。
本检测试剂可以应用于咽拭子，鼻拭子，唾液样本中的博卡病毒核酸检测。通过以上检测结果对比，得出结论，本发明提供的检测试剂、试剂盒、系统及方法应用于人类博卡病毒检测得到的检测结果符合企业标准品检测要求，符合该方法学对博卡病毒检测的基础性能要求。
实施例2
本实施例提供了利用本发明的检测试剂、检测系统和检测方法应用于非疾病诊断目的的呼吸道合胞病毒病毒(简称RSV)检测上。
应用于呼吸道合胞病毒检测的核酸检测试剂(反应体系)原料见表10。
表10呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配方(RT-LAMP法)
Figure BDA0003283193660000141
Figure BDA0003283193660000151
注：表10中，mM，μM，M中的M为mol/L的简写。
上述检测试剂原料(反应体系)中，引物组合物包括RSV-F3、RSV-R3、RSV-FIP、RSV-BIP、RSV-LF、RSV-LB共6条引物，其中RSV为呼吸道合胞病毒的简称，F3、R3、FIP、BIP、LF、LB为引物名称。这些引物通过引物设计软件(例如NEB网站https://lamp.neb.com/#！/)设计得出并由具有合成引物能力的公司进行合成。本发明根据NCBI网站下载的呼吸道合胞病毒的基因组核酸序列，进行引物设计。本实施例最终设计筛选得到RT-LAMP引物组合的引物序列见表11。
表11实施例2中用于检测呼吸道合胞病毒的引物序列表
Figure BDA0003283193660000161
本实施例将待检样本并置于样本保存液中保存后，将表10中的反应试剂原料冻干后置于按照本发明提供的检测装置中，对呼吸道合胞病毒的企业参考品进行了以下方面的检测考察。所述企业参考品采用的人工合成的呼吸道合胞假病毒。所述假病毒由生工生物工程(上海)有限公司提供，实验测试前稀释到工作浓度。
01、检测限实验：
检测表12中2种检测限参考品：
表12实施例2检测限参考品信息
参考品编号 浓度 详细信息
RSV L1 200copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
RSV L2 1000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
检测限实验为每种检测限参考品重复检测20次，
本发明提供的检测系统对2种检测限参考品，在20次重复检测中，均100％检出阳性，证明了本发明检测系统的敏感性。
02、阴阳性参考品符合率实验：
检测表13中的RSV P1阳性参考品3次，检测结果均为呼吸道合胞病毒阳性。检测RSV N1阴性参考品3次，检测结果均为呼吸道合胞病毒阴性。
表13实施例2阴阳性参考品信息
参考品编号 浓度 详细信息
RSV P1 2000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
RSV N1 / 正常人咽拭子液(呼吸道合胞病毒阴性)
03、特异性实验
检测表14中的特异性参考品各3次，均为阳性。
表14实施例2特异性实验参考品信息
参考品编号 浓度 详细信息
RSV T1 1000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
RSV T2 2000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
RSV T3 10000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
RSV T4 100000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
04、精密度实验
检测表15中的精密度参考品：
表15实施例2精密度实验参考品信息
参考品编号 浓度 详细信息
RSV T1 2000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
RSV T2 5000copy/mL 生工生物工程(上海)有限公司提供的假病毒
RSV T3 / 正常人咽拭子液(呼吸道合胞病毒阴性)
检测精密度参考品RSV T1，RSV T2,每种精密度参考品重复检测10次，均检测为阳性。检测精密度参考品RSV T3 10次，均检测为阴性。
05、免提取测试
检测表16中的免提取测试参考品：
表16实施例2免提取测试实验参考品信息
参考品编号 浓度 详细信息
RSV M1 2000copy/mL 人工合成假病毒
RSV M2 5000copy/mL 呼吸道合胞病毒阳性咽拭子样本
RSV M3 / 正常人咽拭子液(呼吸道合胞病毒阴性)
检测以上免提取参考品RSV M1，RSV M2，每种参考品重复检测3次，均检测为阳性。检测免提取参考品RSV M3 3次，均检测为阴性。
06、抗干扰能力实验
经测试，样本中浓度含量为2g/L的血红蛋白和20mg/mL的粘蛋白对检测无影响。样本中含有表17所列浓度药物对检测结果无影响。
表17实施例2抗干扰能力实验中对检测结果无影响的药物及浓度信息
α-干扰素 扎那米韦 利巴韦林 奥司他韦 帕拉米韦 盐酸组胺 利托那韦 阿比多尔
1000万U/mL 50mg/mL 2g/mL 200mg/mL 1g/mL 5mg/mL 250mg/mL 1g/mL
左氧氟沙星 阿奇霉素 头孢曲松 莫米松 氟替卡松 苯福林 羟甲唑啉 倍氯美松
500mg/mL 1g/mL 2g/mL 1mg/mL 10mg/mL 50mg/mL 0.5mg/mL 2mg/mL
07、临床样本检测
检测112份阳性呼吸道合胞病毒咽拭子样本均为阳性，检测300份正常人咽拭子样本均为阴性；检测60份阳性呼吸道合胞病毒鼻拭子样本均为阳性，检测100份正常人鼻拭子样本均为阴性；检测127份阳性呼吸道合胞病毒唾液样本均为阳性，检测223份正常人唾液样本均为阴性。
本检测试剂可以应用于咽拭子，鼻拭子，唾液样本中的呼吸道合胞病毒核酸检测。通过以上检测结果对比，得出结论，本发明提供的检测试剂、试剂盒、系统及方法应用于人类呼吸道合胞病毒检测得到的检测结果符合企业标准品检测要求，符合该方法学对呼吸道合胞病毒检测的基础性能要求。
实施例3
本实施例提供了利用本发明的检测试剂、检测系统和检测方法应用于非疾病诊断目的的新型冠状病毒(简称SARS-COV-2)检测上。
应用于新型冠状病毒检测的核酸检测试剂(反应体系)原料见表10。
表18新型冠状病毒核酸检测试剂配方(RT-LAMP法)
原料及其浓度 使用量(体积，μL)
Tris-HCL(500mM) 1.500-2.000
MgCl<sub>2</sub>(25mM) 1.000-1.500
dATP(100mM) 0.020-0.050
dGTP(100mM) 0.020-0.050
dCTP(100mM) 0.020-0.050
dTTP(100mM) 0.020-0.050
dUTP(100mM) 0.020-0.050
UNG(1U/μL) 0.020-0.050
Bst 3.0 DNA Polymerase(8,000U/mL) 0.300-0.500
Reverse transcriptase(15,000units/mL) 0.300-0.500
lab-F3(100μM) 0.030-0.050
lab-R3(100μM) 0.030-0.050
lab-FIP(100μM) 0.800-1.300
lab-BIP(100μM) 0.800-1.300
lab-LF(100μM) 0.050-0.080
lab-LB(100μM) 0.050-0.080
N-F3(100μM) 0.050～0.080
N-B3(100μM) 0.050～0.080
N-FIP(100μM) 0.800～1.200
N-BIP(100μM) 0.800～1.200
N-LF(100μM) 0.050～0.080
N-LB(100μM) 0.050～0.080
海藻糖(3M) 0.100-0.200
蔗糖(5M) 0.050-0.100
甘露醇(2M) 2.000-6.000
苯酚红(900μM) 1.000-1.500
Tween 20(v/v 10％) 0.0500-0.0800
盐酸胍(3M) 0.050-0.0800
注：表18中，mM，μM，M中的M为mol/L的简写。
上述检测试剂原料(反应体系)中，引物组合物包括lab-F3、lab-R3、lab-FIP、lab-BIP、lab-LF、lab-LB；N-F3、N-R3、N-FIP、N-BIP、N-LF、N-LB共12条引物，其中lab、N为新型冠状病毒不同保守区域的简称，F3、R3、FIP、BIP、LF、LB为引物名称。这些引物通过引物设计软件(例如NEB网站https://lamp.neb.com/#！/)设计得出并由具有合成引物能力的公司进行合成。本发明根据新冠病毒的保守区域，选择1ab和N区域进行引物设计，以防漏检。本实施例最终设计筛选得到RT-LAMP引物组合的引物序列见表19-20。
表19实施例3中用于检测新型冠状病毒lab区域的引物序列表
Figure BDA0003283193660000201
表20实施例3中用于检测新型冠状病毒N区域的引物序列表
Figure BDA0003283193660000202
Figure BDA0003283193660000211
本实施例将待检样本并置于样本保存液中保存后，将表10中的反应试剂原料冻干后置于按照本发明提供的检测装置中，对新型冠状病毒的企业参考品进行了以下方面的检测考察。所述企业参考品采用的国家标标准物质(NCRM)，标准物质编号：GBW€091089,该标准物质由中国计量研究院研制，实验测试前稀释到工作浓度。
01、检测限实验：
检测表21中2种检测限参考品：
表21实施例3检测限参考品信息
参考品编号 浓度 详细信息
COV L1 200copy/mL 新型冠状病毒核酸标准物质，中国计量研究院，GBW€091089
COV L2 1000copy/mL 新型冠状病毒核酸标准物质，中国计量研究院，GBW€091089
检测限实验为每种检测限参考品重复检测20次，
本发明提供的检测系统对2种检测限参考品，在20次重复检测中，均100％检出阳性，证明了本发明检测系统的敏感性。
02、阴阳性参考品符合率实验：
检测表22中的COV P1阳性参考品3次，检测结果均为新型冠状病毒阳性。检测COVN1阴性参考品3次，检测结果均为新型冠状病毒阴性。
表22实施例3阴阳性参考品信息
参考品编号 浓度 详细信息
COV P1 2000copy/mL 新型冠状病毒核酸标准物质，中国计量研究院，GBW€091089
COV N1 / 正常人咽拭子液(新型冠状病毒阴性)
03、特异性实验
检测表23中的特异性参考品各3次，均为阳性。
表23实施例3特异性实验参考品信息
参考品编号 浓度 详细信息
COV T1 1000copy/mL 新型冠状病毒核酸标准物质，中国计量研究院，GBW€091089
COV T2 2000copy/mL 新型冠状病毒核酸标准物质，中国计量研究院，GBW€091089
COV T3 10000copy/mL 新型冠状病毒核酸标准物质，中国计量研究院，GBW€091089
COV T4 100000copy/mL 新型冠状病毒核酸标准物质，中国计量研究院，GBW€091089
04、精密度实验
检测表24中的精密度参考品：
表24实施例3精密度实验参考品信息
参考品编号 浓度 详细信息
COV T1 2000copy/mL 新型冠状病毒核酸标准物质，中国计量研究院，GBW€091089
COV T2 5000copy/mL 新型冠状病毒核酸标准物质，中国计量研究院，GBW€091089
COV T3 / 正常人咽拭子液(新型冠状病毒阴性)
检测精密度参考品COV T1，COV T2，每种精密度参考品重复检测10次，均检测为阳性。检测精密度参考品COV T3 10次，均检测为阴性。
05、免提取测试
检测表25中的免提取测试参考品：
表25实施例3免提取测试实验参考品信息
Figure BDA0003283193660000221
检测以上免提取参考品COV M1，COV M2，每种参考品重复检测3次，均检测为阳性。检测免提取参考品COV M3 3次，均检测为阴性。
06、抗干扰能力实验
经测试，样本中浓度含量为2g/L的血红蛋白和20mg/mL的粘蛋白对检测无影响。样本中含有表26所列浓度药物对检测结果无影响。
表26实施例2抗干扰能力实验中对检测结果无影响的药物及浓度信息
Figure BDA0003283193660000222
Figure BDA0003283193660000231
07、临床样本检测
检测40份阳性新冠病毒咽拭子样本均为阳性，检测300份正常人咽拭子样本均为阴性；检测20份新冠病毒阳性鼻拭子样本均为阳性，检测100份正常人鼻拭子样本均为阴性；检测15份新冠病毒阳性唾液样本均为阳性，检测223份正常人唾液样本均为阴性。
通过以上检测结果对比，得出结论，本发明提供的检测试剂、试剂盒、系统及方法应用于新型冠状病毒检测得到的检测结果符合企业标准品检测要求，符合该方法学对呼吸道合胞病毒检测的基础性能要求。
以上实施例仅用以解释说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管上述实施例对本发明进行了具体的说明，相关技术人员应当理解，依然可对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改和等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之中。
序列表
<110> 厦门健康工程与创新研究院
<120> 一种核酸等温扩增检测试剂、试剂盒、检测系统及方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agatgtattt catcttacag caa 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaccacgtcc tccatagg 18
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcccgttaat aagagtgtga gagtatgatg tttgtacttc tcctgac 47
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gccgcttcca gaacattaca ccattgtttg aggccctg 38
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggttcatttt agctgaaa 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaaaaaacta ccacgcaacc c 21
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caattcagcc gacccaac 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcatagttga ccaggaatgt 20
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgacaatggt ctcatgtctg tgagacacaa cacacaatga ca 42
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctaaccagag acatcataac acacatggcc tgtctttcat caa 43
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctaaatacaa aaaatatact ga 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
attggcatta agcctacaaa gc 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
actgacttaa caaagcctta c 21
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caccatcaac aaatattttt ctcac 25
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggtggtatgt ctgatcccaa tatttgggat ttgttaaaat atgacttcac 50
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tgtgttaact gtttggatga cagagtaggt gggaacactg tag 43
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggtcaaagag ttttaacctc tcttc 25
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tgcattctgc attgtgcaa 19
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gtcattttgc tgaataagca tat 23
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcagcactgc tcatggat 18
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
agtttcatca gccttcttct ttttgacgca tacaaaacat tccca 45
<210> 22
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cttaccgcag agacagaaga aacatgttgc aattgtttgg agaa 44
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggtcaaagag ttttaacctc tcttc 25
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tgcattctgc attgtgcaa 19

Claims (10)

1.一种核酸等温扩增检测试剂，其特征在于：所述核酸等温扩增检测试剂为冻干粉末态，其由以下原料冻干制成：
缓冲液、MgCl2、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、UNG酶、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、海藻糖、蔗糖、甘露醇、Tween 20、盐酸胍、及待检病毒的LAMP的引物组合物。
2.如权利要求1所述的核酸等温扩增检测试剂，其特征在于：所述检测试剂还包括可视化显色剂。
3.如权利要求1所述的核酸等温扩增检测试剂，其特征在于：所述待检病毒为博卡病毒，所述引物组合物包括SEQ ID NO.1-6所示的引物。
4.如权利要求1所述的核酸等温扩增检测试剂，其特征在于：所述待检病毒为呼吸道合胞病毒，所述引物组合物包括SEQ ID NO.7-12所示的引物。
5.如权利要求1所述的核酸等温扩增检测试剂，其特征在于：所述待检病毒为新型冠状病毒，所述引物组合物包括SEQ ID NO.13-24所示的引物。
6.一种核酸等温扩增检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1-5任一项所述的检测试剂。
7.一种核酸等温扩增检测系统，其特征在于：包括：
预装有核酸等温扩增检测试剂的反应管，所述核酸等温扩增检测试剂为冻干粉末态，其由以下原料冻干制成：缓冲液、MgCl2、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、UNG酶、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、海藻糖、蔗糖、甘露醇、Tween 20、盐酸胍、显色剂及待检病毒的LAMP的引物组合物；
可视化核酸等温扩增装置，所述装置包括壳体和设置在所述壳体内的加热座，所述加热座内设有由上至下贯穿所述加热座的反应管固定孔，所述反应管固定孔用于放置所述反应管，所述壳体包括相互连接的上盖和下壳体，所述下壳体内装设有反射镜，所述反射镜设置在所述反应管固定孔的下方以供观察反应管内反应溶液的颜色；所述下壳体表面还设有观察窗，所述观察窗设置在所述反射镜的外侧，所述观察窗与所述反射镜之间的夹角为0-90°。
8.如权利要求7所述的核酸等温扩增检测系统，其特征在于：所述下壳体的侧壁还设有一散热窗，所述下壳体内部靠近所述散热窗处设有第一散热风扇，所述第一散热风扇用于将热空气吹向所述下壳体外部，所述加热座的一侧底部设有第二散热风扇，所述一侧未设置反应管固定孔，所述第二散热风扇用于将冷空气吹向所述加热座。
9.如权利要求7所述的核酸等温扩增检测系统，其特征在于：所述壳体还包括后座壳，所述上盖为透明材料制成，所述上盖与所述后座壳枢接；所述后座壳的表面设有显示窗口和控制键，所述后座壳的内部设有温度控制主板，所述温度控制主板与所述加热座控制连接。
10.一种核酸等温扩增检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将待检样本加入预装有核酸等温扩增检测试剂的反应管中，所述核酸等温扩增检测试剂为冻干粉末态，其由以下原料冻干制成：缓冲液、MgCl2、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、UNG酶、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、海藻糖、蔗糖、甘露醇、Tween 20、盐酸胍、及待检病毒的LAMP的引物组合物；
S2、将步骤S1所述的反应管置于LAMP反应装置中，在63℃～68℃反应10-30min。
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