CN115851429A - 一种多功能集成分子检测管及其应用 - Google Patents
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Abstract
本方案提供了一种多功能集成分子检测管及其应用,包括形变组件、隔断组件以及反应组件,其中隔断组件置于形变组件和反应组件之间,且隔断组件上设有折断组件,折断组件在外力作用下由封闭状态转变为折断状态,当折断组件处于封闭状态时,所述隔断组件隔断反应组件和形变组件的相通,当折断组件处于折断状态时,折断组件脱离所述隔断组件,且所述隔断组件上形成相通反应组件和形变组件的通道,也可用于CPA、RPA、LAMP、RCA等恒温扩增反应,可实现了全部试剂的一体式预装、样本到结果的全流程一体式检测、灵活多变的样本处理方式,并且具有高生物安全性、产物和样本泄露风险低的特点。
Description
技术领域
本申请涉及分子检测领域,特别是涉及一种多功能集成分子检测管及其应用。
背景技术
核酸检测是分子诊断的重要领域,它是通过特异性扩增检测靶点的核酸片段,实现对病原体或特定基因的检测。当前核酸检测的主流方法是聚合酶链式反应(PCR),聚合酶链式反应的常见检测流程包括:样本处理、核酸提取、PCR扩增、扩增产物的检测数个步骤,这一过程中需要应用多种类型的耗材,并且需要频繁使用移液枪进行液体的转移。因此,核酸检测往往需要专业的实验室,及专业的辅助工具,对操作人员的专业技能亦有较高的要求,这就使得复杂的操作不仅增加了检测的时间及工作量,亦容易引入环境污染,从而导致检测结果的偏差。
近年兴起的即时检测技术(POCT), 是在采样现场即刻进行分析,省去标本在实验室检验时的复杂处理程序,快速得到检验结果的一类新方法。在诸多POCT式分子诊断试剂中,有部分产品利用微流控技术或者整体检测管的设计,其虽然可以实现从样本到结果的整体检测流程整合,但是往往依旧存在结构复杂,工艺成本高的缺陷,使得POCT式分子诊断试剂无法得到市场的推广应用。另外,目前市面上的POCT式检测耗材也难以兼容多种试剂固定方式,这意味着适配于特定的试剂需要特定的POCT式检测耗材,这也在无形中增大了POCT式分子诊断试剂的成本。
发明内容
本申请实施例提供了一种多功能集成分子检测管及其应用,可在同一个检测管中实现样本处理、试剂预装、核酸扩增检测等多功能,且分子检测的操作步骤简单易行,用户可自行居家进行分子检测,也可实现野外移动检测。
第一方面,本申请实施例提供了一种多功能集成分子检测管,包括形变组件、隔断组件以及反应组件,其中隔断组件置于形变组件和反应组件之间,且隔断组件上设有折断组件,折断组件在外力作用下由封闭状态转变为折断状态,当折断组件处于封闭状态时,所述隔断组件隔断反应组件和形变组件的相通,当折断组件处于折断状态时,折断组件脱离所述隔断组件,且所述隔断组件上形成相通反应组件和形变组件的通道。
第二方面,本申请实施例提供了一种多功能集成分子检测体系,包括:多功能集成分子检测管以及配套所述多功能集成分子检测管的孵育器,多功能集成分子检测管在所述孵育器上实现高温加热、震荡、超声、扩增的任一处理。
第三方面, 本申请实施例提供了一种多功能集成分子检测管的检测方法,采用多功能集成分子检测管实现分子检测,包括:在反应组件内预装多用途缓冲液,在所述形变组件内预装反应试剂;将待测样本加入反应组件内实通过所述多用途缓冲液实现所述待测样本的裂解;待裂解完全后,对所述形变组件施加外力以促使所述折断组件切换为折断状态;反复对形变组件施加外力或者倒置检测管以混合反应组件和所述形变组件内的试剂;待试剂充分混合后正置检测管以使得液体全部流动至反应组件的底部,将反应组件置于孵育器内进行加热以及扩增反应。
第四方面,本申请实施例提供了一种多功能集成分子检测管的检测方法,采用所述的多功能集成分子检测管实现分子检测,包括:在反应组件内预装多用途缓冲液,在所述形变组件内预装反应试剂;对所述形变组件施加外力以促使所述折断组件切换为折断状态;反复对形变组件施加外力或者倒置检测管以混合反应组件和所述形变组件内的试剂;待试剂充分混合后正置检测管以使得液体全部流动至反应组件的底部,往反应组件内加入待测物体并将反应组件(30)置于孵育器内进行扩增。
本发明的主要贡献和创新点如下:
本申请实施例提供了一种多功能集成分子检测管及其应用,该多功能集成分子检测管内设有隔断组件以实现反应液和干燥物料的干湿分离,增加该多功能集成分子检测管储存的稳定性和灵活性,且用户可通过简单的操作破坏隔断组件以实现干燥物料和反应液的混合,以实现在同一个检测管内实现样本处理、试剂预装以及核酸扩增检测等多功能,实现痰液、肺泡灌洗液、脓液、血液等复杂样本的一体式检测。在一些实施例中,其内预装有可处理复杂样本的同时用于扩增反应的多用途缓冲液,该多用途缓冲液的使用大大简化了检测管的结构设计,使得检测管内不需要额外地独立设置样本处理缓冲液以及反应缓冲液,极大程度地简化了检测管的结构设计;另外,由于本方案提供的多功能集成分子检测管成本低廉、结构简单、操作简便,使得用户可用该多功能集成分子检测管实现居家检测以及户外移动检测,极大程度地扩展了分子检测的适用场景。
本申请的一个或多个实施例的细节在以下附图和描述中提出,以使本申请的其他特征、目的和优点更加简明易懂。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解,构成本申请的一部分,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。在附图中:
图1是根据本申请实施例的多功能集成分子检测管的整体示意图;
图2是根据本申请实施例的多功能集成分子检测管的内部结构示意图;
图3是根据本申请实施例的多功能集成分子检测管的折断组件40断开状态的示意图。
图4是根据本申请实施例的多功能集成分子检测管在孵育器上工作状态的示意图。
图中:形变组件10,物料存储区11,第一连接区12,隔断组件20,反应组件30,第二连接区31,反应腔32,折断组件40。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明,其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时,除非另有表示,不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本说明书一个或多个实施例相一致的所有实施方式。相反,它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本说明书一个或多个实施例的一些方面相一致的装置和方法的例子。
需要说明的是:在其他实施例中并不一定按照本说明书示出和描述的顺序来执行相应方法的步骤。在一些其他实施例中,其方法所包括的步骤可以比本说明书所描述的更多或更少。此外,本说明书中所描述的单个步骤,在其他实施例中可能被分解为多个步骤进行描述;而本说明书中所描述的多个步骤,在其他实施例中也可能被合并为单个步骤进行描述。
实施例一
本方案提供了一种多功能集成分子检测管,该多功能集成分子检测管可用于PCR扩增反应、也可用于CPA、RPA、LAMP、RCA等恒温扩增反应,可实现了全部试剂的一体式预装、样本到结果的全流程一体式检测、灵活多变的样本处理方式,并且具有高生物安全性、产物和样本泄露风险低的特点,是一种十分适合由用户在居家环境、基层卫生单位以及野外使用的新型检测装置。
如图1到图3所示,本方案提供的多功能集成分子检测管包括形变组件10、隔断组件20以及反应组件30,其中隔断组件20置于形变组件10和反应组件30之间,且隔断组件20上设有折断组件40,折断组件40在外力作用下由封闭状态转变为折断状态,当折断组件40处于封闭状态时,所述隔断组件20隔断反应组件30和形变组件10的相通,当折断组件40处于折断状态时,折断组件40脱离所述隔断组件20,且所述隔断组件20上形成相通反应组件30和形变组件10的通道。该通道可为预先设置在隔断组件20上,亦可由折断组件40折断时产生。
如图4所示,该多功能集成分子检测管配套孵育器(图中未编号)使用,孵育器上设有容置反应组件30的容置位,反应组件30插置于孵育器上进行高温加热、震荡、超声、扩增的任一处理。换言之,本方案提供的一种多功能集成分子检测体系,该多功能集成分子检测体系包括本方案提供的多功能集成分子检测管以及配套所述多功能集成分子检测管的孵育器,多功能集成分子检测管在所述孵育器上实现高温加热、震荡、超声、扩增的任一处理。
具体的,本方案提供的多功能集成分子检测管的形变组件10内设有物料存储区11,物料存储区11的边侧同隔断组件20贴合以实现物料存储区11内的物料的密封和隔离。也就是说,隔断组件20同形变组件10的外壁包围形成可密封存储物料的物料存储区11。在本方案的实施例中,物料存储区11内预装有液体或固体的反应试剂,液体的反应试剂可以但不限于是:扩增反应缓冲液,样本裂解液,样本稀释液,样本保存液;固体的反应试剂可以但不限于是引物、探针、反应酶、单价离子,二价离子、酸碱缓冲剂等。
需要说明的是,在本方案的一实施例中,形变组件10由软质材料制备得到,软质材料选自PE、PP、ABS等塑料或高分子材质的一种。也就是说,形变组件10由PE、PP、ABS等塑料或高分子材质通过注塑或3D打印的方式制造,具有可挤压、材质软的特点。当形变组件10受到外力挤压时形变组件10发生形变,同时,形变组件10的形变对折断组件40施加外力作用以实现封闭状态和折断状态之间的转换。
在一些实施例中,所述形变组件10为倒置的U型试管状;特别的,所述形变组件10的开口截面自所述物料存储区11向隔断组件20的方向增大,这样的好处在于物料存储区11内预装有液体或固体的反应试剂可更好地聚集在U型形变组件10的一端。
另外,为了实现反应试剂的添加,反应组件30和形变组件10可拆卸连接。在一些实施例中,形变组件10靠近反应组件30的一端侧设有第一连接区13,相应的,反应组件30靠近形变组件10的一端侧设有第二连接区31,第一连接区13和第二连接区31相互配合可拆卸连接以实现形变组件10和反应组件30的可拆卸连接。
在一些具体实施例中,形变组件10的第一连接区13为设有螺纹的螺纹区,相应的,反应组件30的第二连接区31为设有对应的螺纹的螺纹区。第一连接区13上的螺纹为内螺纹,对应的,第二连接区31上的螺纹为外螺纹;或者,第一连接区13上的螺纹为外螺纹,对应的,第二连接区31上的螺纹为内螺纹。
在另一些具体实施例中,形变组件10的第一连接区13为卡扣条,反应组件30的第二连接区31为对应卡扣条的卡扣槽;或者,形变组件10的第一连接区13为卡扣槽,第二连接区31为卡扣条。第一连接区13和第二连接区31之间的连接方式不仅包括螺纹连接、卡扣连接,还可以包括磁吸连接等。
本方案提供的隔断组件20组装于所述形变组件10的开口位置以实现物料存储区的密封。在一些实施例中,为了加强隔断组件20同形变组件10的连接以确保形变组件10的密封效果,隔断组件20的侧边边缘设有卡筋,所述卡筋可以是环形突起也可以是其他形态。
在一些实施例中,当形变组件10同所述反应组件30连接时,所述20置于形变组件10和所述反应组件30之间,这样的好处在于可以确保该分子检测管处于相对密封的状态。
在本方案的实施例中,隔断组件20同折断组件40配合以实现反应组件30和形变组件10的相通或者隔断,当折断组件40处于折断状态时,形变组件10和反应组件30之间相通。
具体的,本方案提供两类实施方式:
第一种实施方式:隔断组件20上设有贯通反应组件30和形变组件10的通道,折断组件40设置在通孔所在的位置以封堵所述通道,当折断组件40脱离所述隔断组件20时,所述隔断组件20上的通道被暴露以实现反应组件30和形变组件10的相通。
此时,所述折断组件40的主体置于形变组件10内,主体的端侧封堵隔断组件20的通道;形变组件10相对于隔断组件20发生形变时向折断组件30施加外力,折断组件30在外力作用下脱离隔断组件20以暴露隔断组件20上的通孔。
在一具体实施例中,所述折断组件40的主体部分为硬质材料件,折断组件40同隔断组件20连接的连接部为软质材料件,其中所述软质材料件的材料相较于所述硬质材料件的材料易折断,所述隔断组件20内设有相通于所述形变组件10以及所述反应组件30的通道,当折断组件40处于封闭状态时,所述折断组件40的底部同所述隔断组件20连接以封堵所述隔断组件20内设的通道;当折断组件40受到外力作用时所述连接部同所述隔断组件20脱离,进而暴露所述隔断组件20上的通道。
具体的,所述硬质材料件和所述软质材料件可均为塑料材料,所述软质材料件相较于所述硬质材料件的厚度薄,进而使得软质材料件爱受到外力作用时可被破坏,破坏的形式包括但不限于折断组件40同隔断组件20之间形成孔洞,或者折断组件40同隔断组件20之间彻底分离。为了方便用户对折断组件40折断,所述硬质材料件可设计为置于形变组件10内的棒状体。
另外,需要说明的是,由于形变组件10为软质材料制备得到,故置于形变组件10内的折断组件40可由于形变组件10的形变而从封闭状态切换至折断状态。在一些实施例中,折断所述折断组件40的方式包括但不限于向一侧弯折形变组件,挤压形变组件,扭转形变组件等。当采用折断形变组件的方式折断折断组件40时,所述连接部朝向边侧倾倒以被撕裂进而脱离所述隔断组件20以暴露所述隔断组件20上的通道;当采用挤压形变组件的方式折断折断组件40时,所述连接部由于压力的作用而爆破进而脱离所述隔断组件20;当采用扭转形变组件的方式折断折断组件40时,所述连接部相对于所述隔断组件20发生扭转以破坏所述连接部的结构,进而脱离所述隔断组件20。
第二种实施方式:隔断组件20的材质为易破损材质,折断组件40的材质为刚性材质,折断组件40连接在隔断组件20的顶端,当折断组件40受到外力作用下时,折断组件40从底部折断并在所述隔断组件20上形成通道。
此时,所述折断组件40的主体置于形变组件10内,主体的底部设有刺破件,形变组件10相对于隔断组件20发生形变时向折断组件30施加外力,折断组件30在外力作用下脱离隔断组件20且所述刺破件破坏所述隔断组件20,形成相通于所述形变组件10和所述反应组件30的通道。
在一具体实施例中,所述折断组件40的底部为硬质材料的刺破件,当所述折断组件40处于密封状态时,所述刺破件嵌入所述隔断组件20内,当所述折断组件40处于折断状态时,所述刺破件在外力作用下做行程作用以在所述隔断组件20上形成相通于所述形变组件10和所述反应组件30的通道。此时,所述隔断组件20为易破损的塑料材料,所述刺破件在受到外力作用下而脱离所述隔断组件20的过程中在所述隔断组件20内发生行程变化,进而使得刺破件破坏所述隔断组件20内部的密封结构以形成相通于所述形变组件10和所述反应组件30的通道。
在一些实施例中,隔断组件20为塑料材料,折断组件30为使用PE、PP、ABS等塑料或高分子材质通过注塑或3D打印的方式制造,具有一定的刚性的结构。隔断组件20可以是柱形结构,折断组件30可以是柱形结构。
相类似的,在一些实施例中,折断所述折断组件40的方式包括但不限于向一侧弯折形变组件,挤压形变组件,扭转形变组件等。当采用折断形变组件的方式折断折断组件40时,所述刺破件向一侧翻转进而破坏所述隔断组件20的内部结构;当采用挤压形变组件的方式折断折断组件40时,所述刺破件由于压力作用自下而上发生行程变化进而在隔断组件20内形成通道;当采用扭转形变组件的方式折断折断组件40时,所述刺破件发生扭转向上的形成而在隔断组件内形成通道。
本方案提供的反应组件30内设有反应腔32,反应物置于反应腔32内进行反应。为了使得反应组件30更好地同孵育器进行配合,反应组件30的外周侧设有第三连接区33,所述第三连接区同孵育器上的容置位相配合,在一些实施例中,第三连接区33为外螺纹,当然,第三连接区33可以是卡扣或者卡槽。
本方案的反应组件30由使用PE、PP、ABS等塑料或高分子材质通过注塑或3D打印的方式制造,具有一定的刚性,并可承受高温。另外,反应组件30为透光材料制备得到,这样可以确保后续可使用外部的光学探头对其进行荧光或者可见光的检测。当然,反应组件30的材质还可以承受震荡和超声波处理。
本方案提供的多功能集成分子检测管可实现液态的反应液同固态的物料的干湿分离,也可实现两种不同液体的分置存储。在一些实施例中,为了不再独立设置样本处理缓冲液同反应缓冲液,本方案提供了一种多用途缓冲液,该多用途缓冲液既可用于样本的裂解或处理,亦可作为扩增反应体系的缓冲液使用。具体的,所述多用途缓冲液的成分包括:Tris-HCl pH 6-9 、二甲基亚砜、TritonX 100、EDTA二钠、十二烷基-β-D-麦芽糖苷。其中Tris-HCl起到酸碱缓冲液的作用,将体系的pH值稳定在6-9;二甲基亚砜起到样本裂解,及扩增反应辅剂的作用;TritonX 100起到裂解样本蛋白质外壳或磷脂双分子膜的作用;EDTA二钠起到保护核酸样本的作用;十二烷基-β-D-麦芽糖苷可讲解生物磷脂双分子膜,起到裂解样本的作用。
具体的,在一特定实施例中,多用途缓冲液的成分包括5-500nm pH 6-9的Tris-HCl,1%-2%的二甲基亚砜,0.1-10%的TritonX100,0.1-10 mM的EDTA二钠,0.1%-1%的十二烷基-β-D-麦芽糖苷,对应的,本方案在反应组件30内预装多用途缓冲液,在形变组件10内放置反应试剂。
当然,在另一些实施例中,反应组件30内预装样本裂解液,形变组件10内预装液体或固体的反应试剂。且本方案的多用途缓冲液或样本裂解液可通过玻璃化、冻干、挥干等方式制备成干燥的物料,此时,本方案提供的多功能集成分子检测管可实现干湿物料的分隔存储。
实施例二
本方案提供了一种多功能集成分子检测管的检测方法,使用实施例一介绍的多功能集成分子检测管实现分子检测,包括以下步骤:
在反应组件30内预装多用途缓冲液,在所述形变组件10内预装反应试剂;
将待测样本加入反应组件30内实通过所述多用途缓冲液实现所述待测样本的裂解;
待裂解完全后,对所述形变组件10施加外力以促使所述折断组件40切换为折断状态;
反复对形变组件10施加外力或者倒置检测管以混合反应组件30和所述形变组件10内的试剂;
待试剂充分混合后正置检测管以使得液体全部流动至反应组件30的底部,将反应组件30置于孵育器内进行加热以及扩增反应。
在这种方式下用户只需要往反应组件30内添加待测样本即可,无需添加额外的试剂即可实现待测样本的一体化检测。
具体的,用户在使用多功能集成分子检测管进行待测样本的分子检测时,通过旋转打开多功能集成分子检测管,将待测样本加入反应组件中并和多用途缓冲液充分混合,随后重新拧上检测管,使其整体处于密封状态。在样本裂解过程,可以是通过多用途缓冲液中的化学物质和待测样本进行室温下的反应,亦可结合额外的孵育器对反应组件底部施以高温,震荡、超声等处理,从而帮助待测样本的裂解。当待测样本充分裂解后,通过从一个侧面挤压形变组件和折断组件,使折断组件从底部断裂,在隔断组件上形成通道,从而联通检测管上下两个区域。可以通过反复挤压形变组件或者倒置检测管的方式,使形变组件和反应组件内的试剂进行混合。当试剂充分混合后,正置检测管,将液体流动至反应组件的底部,可以辅以挤压形变组件的操作,加速液体的流动。此后使用孵育器对检测管底部进行加热、使试剂进行核酸扩增反应。其扩增反应的结果可以通过荧光信号、可见光信号、比浊、核酸侧向层析等方式进行判读。
实施例三
本方案提供了一种多功能集成分子检测管的检测方法,使用实施例一介绍的多功能集成分子检测管实现分子检测,包括以下步骤:
在反应组件30内预装多用途缓冲液,在所述形变组件10内预装反应试剂;
对所述形变组件10施加外力以促使所述折断组件40切换为折断状态;
反复对形变组件10施加外力或者倒置检测管以混合反应组件30和所述形变组件10内的试剂;
待试剂充分混合后正置检测管以使得液体全部流动至反应组件30的底部,往反应组件30内加入待测物体并将反应组件30置于孵育器内进行扩增。
需要补充说明的是:实施例二或实施例三中提到的扩增反应包括PCR扩增反应,也包括CPA、RPA、LAMP、RCA等恒温扩增反应,且本方案提供的多功能集成分子检测管可适用于痰液、脓液、血液的检测。
为了验证本方案提供的多功能集成分子检测管的使用效果,本方案进行了如下的实施例进行验证:
实施例1:采用交叉引物恒温扩增-实时荧光法对人源β-actin 基因及其RNA产物进行检测:
扩增引物探针及扩增体系:
CPA 人源β-actin 基因引物,具体如表一所示:
表一 CPA 人源β-actin 基因引物体系的组成
序列 | |
正向外围引物FB | 5’-AGTACCCCATCGAGCACG-3’ |
反向外围引物RB | 5’-AGCCTGGATAGCAACGTACA-3’ |
正向交叉扩增引物CPF | 5’-GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA-3’ |
反向交叉扩增引物CPR | 5’-CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC-3’ |
增强引物IP1 | 5’-GAGTGTGGGTGTTCCCTTTGTACGGGCCCG-3’ |
检测探针IP2 | 5’-(FAM)-GCGTCGGCCTACCCTCGTCCTAACACGGG AGCCTGCACTGACCCGACGC-(BHQ1)-3’ |
CPA反应体系,具体如表二所示:
表二 CPA反应体系
成分 | 体积 |
β-actin-FB (20µM) | 4µl |
β-actin-RB (20µM) | 4µl |
β-actin-CPF (20µM) | 20µl |
β-actin-CPR (20µM) | 20µl |
β-actin-IP1 (20µM) | 15µl |
β-actin-IP2 (20µM) | 7µl |
样本保护剂 | 10µl |
M-MLV酶 | 1µl |
Bst聚合酶 | 1µl |
将反应所需的酶、引物、探针等按照上述体积配制成预混液之后进行冻干处理,制成冻干球预装于反应组件中;将反应所需的CPAbuffer、ddH2O的反应物料预装于形变组件内,其中CPAbuffer为120µl,ddH2O为193µl。
步骤一:使用无菌拭子采集人咽部口腔上皮细胞;
步骤二:从侧面挤压形变组件和折断组件,使折断组件从底部断裂,并在隔断组件上形成小孔。挤压形变组件,使预装的反应物料充分流至反应组件中和冻干试剂充分混合。
步骤三,从中部旋开检测管,将采集的拭子头部插入液体中进行样本的洗脱,然后将拭子取出,该步骤完成了上皮细胞的洗脱,并且由于样本保护剂的作用检测所需的样本得到了保护。
步骤四,重新旋紧检测管,并至于58度恒温-荧光孵育器上进行核酸扩增和检测20分钟。
步骤五,反应结束后,通过检测反应起始荧光值和终点荧光值的差异,判断检测结果是否为阳性。
检测结果如下表三所示:
表三检测结果
样本 | 荧光差值(>500为阳性) | 检测结果 |
人咽拭子1 | 2045 | 阳性 |
人咽拭子2 | 1952 | 阳性 |
人咽拭子3 | 1780 | 阳性 |
人咽拭子4 | 1965 | 阳性 |
人咽拭子5 | 2135 | 阳性 |
人咽拭子6 | 1795 | 阳性 |
人咽拭子7 | 2039 | 阳性 |
人咽拭子8 | 1896 | 阳性 |
人咽拭子9 | 2257 | 阳性 |
人咽拭子10 | 1893 | 阳性 |
生理盐水拭子1 | 135 | 阴性 |
生理盐水拭子2 | 124 | 阴性 |
生理盐水拭子3 | 118 | 阴性 |
生理盐水拭子4 | 190 | 阴性 |
生理盐水拭子5 | 213 | 阴性 |
生理盐水拭子6 | 156 | 阴性 |
生理盐水拭子7 | 144 | 阴性 |
生理盐水拭子8 | 189 | 阴性 |
生理盐水拭子9 | 172 | 阴性 |
生理盐水拭子10 | 138 | 阴性 |
结论:检测结果和样本的来源全部相符。经过扩增后,所有人源样本的荧光差值在1780到2257之间,均为阳性。所有非人源样本的荧光差值为118-213,均为阴性。该方法可以有效检测人源β-actin基因及其RNA产物。
实施例2使用交叉引物恒温扩增-荧光探针法实现快速分枝杆菌的检测:
试剂预装的方式为:在反应组件预装600μL的样本处理液;形变组件内部预装反应所需的干燥试剂,两者通过隔断组件及折断组件进行分隔,检测试剂采用交叉引物恒温扩增-荧光探针法。
形变组件内的干燥试剂的组成如下表四所示:
表四干燥试剂
成分 | 体积 |
GAPDH-FB | 1.2 pmol |
GAPDH-RB | 1.2 pmol |
GAPDH-CPF | 10pmol |
GAPDH-CPR | 10pmol |
GAPDH-IP1 | 3pmol |
GAPDH-IP2 | 1.2 pmol |
6110-FB | 1.1 pmol |
6110-RB | 1.1 pmol |
6110-CPF | 12pmol |
6110-CPR | 12pmol |
6110-IP1 | 4pmol |
6110-IP2 | 1.2 pmol |
BST聚合酶 | 100U |
MgSO4 | 3 pmol |
NH3SO4 | 10 pmol |
干燥辅剂 | 50 mg |
结核IS6110片段检测系统的引物探针序列如表五所示:
表五引物探针序列
序列 | |
正向外围引物6110-FB | 5’-TCAACCGGGAGCCCAG-3’ |
反向外围引物6110-RB | 5’-TTTGCCGCGGGTGGTC-3’ |
正向交叉扩增引物6110-CPF | 5’-CGTAAACACCGTAGTTGGCGGCGCG CGATGGCGAACTCA-3’ |
反向交叉扩增引物6110-CPR | 5’-GTGCCCGCAAAGTGTGGCTAACAGT TTGGTCATCAGCCGTTC-3’ |
增强引物6110-IP1 | 5’-TGGACGCGGCTGATGTGC-3’ |
检测探针6110-IP2 | 5’-(FAM)-GCGTCGGCCTGAACCGTGAG GGCATCGAGGACCCGACGC-(BHQ1)-3’ |
人源GAPDH基因内标检测系统的引物探针序列如表六所示:
表六引物探针序列
序列 | |
正向外围引物GAPDH-FB | 5’-GGGGAGGCGTGTGTGT-3’ |
反向外围引物GAPDH-RB | 5’-CCCCATACGACTGCAAAGAC-3’ |
正向交叉扩增引物GAPDH-CPF | 5’-TGGTGTCTGAGCGATGTGGCG CCACTAGGCGCTCACT-3’ |
反向交叉扩增引物GAPDH-CPR | 5’-AGGTCGGAGTCAACGGGTGAT CGTAGACGCGGTTCGG-3’ |
增强引物GAPDH-IP1 | 5’-CTGCGCGGAGGGAGAGAA-3’ |
检测探针GAPDH-IP2 | 5’-(cy5)-GCGTCGGCCGCCCTGGGCT GCGACCCCCGACGC-(BHQ2)-3’ |
每升样本处理液的组成如表七所示:
表七样本处理液
成分 | 体积 |
Tris-HCl PH 8.5 | 100 mM |
Triton X100 | 1.5 mM |
EDTA二钠 | 1 mM |
样本裂解剂 | 1% |
无核酸酶水 | 补充至1L体积 |
采集20份健康人的阴性舌拭子,在拭子头部额外加入少量高浓度的结核分枝杆菌复合群菌株(BCG),最终得到的样本浓度如下:10000个菌/拭子5份,1000个菌/拭子5份,100个菌/拭子5份,0个菌/拭子5份。
检测步骤如下:
从中部拧开检测管,将模拟样本拭子插入反应组件中的样本处理液进行洗脱,然后取出拭子丢弃;
将检测管重新拧紧,将检测管硬储存部件朝下插入95度孵育器中10分钟,进行样本的裂解和灭活。
待样本稍稍冷却之后,通过侧向施力,使折断组件从底部断开,从而联通检测管上部和下部的空间。将检测管倒置,按压形变组件数次,使得液体流动至形变组件内部和预装的干燥试剂充分混合。
再次正置检测管,按压形变组件数次,将液体重新流动至反应组件底部。
将检测管以反应组件朝下的方向插入63度孵育器中进行扩增20分钟。通过孵育器上的荧光检测探头检测荧光信号的变化。
反应结束后,通过检测反应起始荧光值和终点荧光值的差异,判断检测结果是否为阳性、阴性或无效,检测结果如表八所示;
表八检测结果
样本 | 浓度 | FAM荧光差值(>500为阳性) | Cy5荧光差值(>500为阳性) | 检测结果 |
模拟样本1 | 10000个菌/拭子 | 2214 | 2305 | 阳性 |
模拟样本2 | 10000个菌/拭子 | 2317 | 1980 | 阳性 |
模拟样本3 | 10000个菌/拭子 | 2098 | 1998 | 阳性 |
模拟样本4 | 10000个菌/拭子 | 2134 | 2175 | 阳性 |
模拟样本5 | 10000个菌/拭子 | 2154 | 2249 | 阳性 |
模拟样本6 | 1000个菌/拭子 | 2013 | 2184 | 阳性 |
模拟样本7 | 1000个菌/拭子 | 1981 | 1923 | 阳性 |
模拟样本8 | 1000个菌/拭子 | 1906 | 1884 | 阳性 |
模拟样本9 | 1000个菌/拭子 | 2003 | 2011 | 阳性 |
模拟样本10 | 1000个菌/拭子 | 1998 | 2184 | 阳性 |
模拟样本11 | 100个菌/拭子 | 1897 | 2305 | 阳性 |
模拟样本12 | 100个菌/拭子 | 1906 | 2293 | 阳性 |
模拟样本13 | 100个菌/拭子 | 1920 | 2174 | 阳性 |
模拟样本14 | 100个菌/拭子 | 1902 | 2141 | 阳性 |
模拟样本15 | 100个菌/拭子 | 211 | 2075 | 阳性 |
模拟样本16 | 0个菌/拭子 | 186 | 2203 | 阴性 |
模拟样本17 | 0个菌/拭子 | 175 | 2198 | 阴性 |
模拟样本18 | 0个菌/拭子 | 164 | 2245 | 阴性 |
模拟样本19 | 0个菌/拭子 | 153 | 2174 | 阴性 |
模拟样本20 | 0个菌/拭子 | 138 | 2305 | 阴性 |
检测结果显示,所有阳性样本均能检出,该方法对结核分枝杆菌复合群模拟样本的检测灵敏度可以达到100个菌/拭子。
实施例三使用交叉引物恒温扩增搭配核酸层析试纸条的方法检测新冠核酸特异性片段:扩增引物探针及扩增体系:
新冠检测系统基因引物具体如表九所示:
表九 新冠检测系统基因引物的组成
序列 | |
正向外围引物FB | 5’-TTCTTAGGAATCATCACAACTG-3’ |
反向外围引物RB | 5’-ATATCGATGTACTGAATGGGT-3’ |
正向交叉扩增引物CPF | 5’-GACACGGGTCATCAACTACATATGCACCAAGAATGTAGTTTACAGTC-3’ |
反向交叉扩增引物CPR | 5’-GAGTAGGAGCTAGAAAATCAGCACGATTTAGAACCAGCCTCATCC-3’ |
检测探针IP1 | 5’-(FITC)-GACACGGGTCATCAACTACATATG-3’ |
检测探针IP2 | 5’-(BIOTIN)-GAGTAGGAGCTAGAAAATCAGCAC-3’ |
恒温扩增反应体系具体如表十所示:
表十恒温扩增反应体系
成分 | 体积 |
FB(100μM) | 0.2µl |
RB (100μM) | 0.2µl |
CPF (100μM) | 1µl |
CPR (100μM) | 1.5µl |
IP1 (100μM) | 0.3µl |
IP2(100μM) | 0.3µl |
样本保护剂 | 1µl |
M-MLV酶 | 0.1µl |
Bst聚合酶 | 0.1µl |
将反应所需的酶、引物、探针等按照上述体积配制成预混液之后进行冻干处理,制成冻干球预装于反应组件中;将反应所需的CPAbuffer、ddH2O的反应物料预装于形变组件内,其中CPAbuffer为4µl,ddH2O为40µl。反应过程中通过DNA聚合酶将两条分别含有FITC和BIOTIN基团的探针引物连接在扩增产物中。核酸侧向层析试纸条的T线特异性捕获同时含有FITC和BIOTIN基团的产物,并且在结合垫中添加质控物质,该物质可以在C线被捕获。
步骤一,从侧面挤压形变组件和折断组件,使折断组件从底部断裂,并在隔断组件上形成小孔。挤压形变组件,使预装的液体充分流至反应组件中和冻干试剂充分混合。
步骤二,从中部旋开检测管,加入含有检测片段的新冠病毒假病毒。
步骤三,重新旋紧检测管,并至于58度恒温-荧光孵育器上进行核酸扩增和检测20分钟。
步骤四,反应结束后,将检测管插入含有尖锐和核酸免疫层析试纸条的检测卡盒。通过刀片将检测管底部割开,使其反应产物流动至试纸条上,从而获得最终的结果,检测结果如表十一所示:
表十一检测结果
样本 | T线 | C线 | 结果 |
1000拷贝/反应 | +++ | ++ | 阳性 |
1000拷贝/反应 | +++ | +++ | 阳性 |
1000拷贝/反应 | ++ | ++ | 阳性 |
300拷贝/反应 | +++ | +++ | 阳性 |
300拷贝/反应 | ++ | +++ | 阳性 |
300拷贝/反应 | ++ | +++ | 阳性 |
100拷贝/反应 | ++ | +++ | 阳性 |
100拷贝/反应 | + | ++ | 阳性 |
100拷贝/反应 | ++ | ++ | 阳性 |
0拷贝/反应 | - | +++ | 阴性 |
0拷贝/反应 | - | +++ | 阴性 |
0拷贝/反应 | - | +++ | 阴性 |
注:不同数量的“+”由少至多表示条带的强度由弱到强,“-”表示无条带。
结果显示,该方法检测新冠假病毒样本的灵敏度可以达到100拷贝/反应,且无非特异扩增导致的假阳。
本领域的技术人员应该明白,以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本申请范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。因此,本申请的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种多功能集成分子检测管,其特征在于,包括形变组件(10)、隔断组件(20)以及反应组件(30),其中隔断组件(20)置于形变组件(10)和反应组件(30)之间,且隔断组件(20)上设有折断组件(40),折断组件(40)在外力作用下由封闭状态转变为折断状态,当折断组件(40)处于封闭状态时,所述隔断组件(20)隔断反应组件(30)和形变组件(10)的相通,当折断组件(40)处于折断状态时,折断组件(40)脱离所述隔断组件(20),且所述隔断组件(20)上形成相通反应组件(30)和形变组件(10)的通道。
2.根据权利要求1所述的多功能集成分子检测管,其特征在于,形变组件(10)靠近反应组件(20)的一端侧设有第一连接区(13),相应的,反应组件(30)靠近形变组件(10)的一端侧设有第二连接区(31),第一连接区(13)和第二连接区(31)相互配合以实现形变组件(10)和反应组件(30)的可拆卸连接。
3.根据权利要求1所述的多功能集成分子检测管,其特征在于,断组件(20)上设有贯通反应组件(30)和形变组件(10)的通道,折断组件(40)设置在通道所在的位置以封堵所述通道,当折断组件(40)脱离所述隔断组件(20)时,所述隔断组件(20)上的通道被暴露。
4.根据权利要求3所述的多功能集成分子检测管,其特征在于,所述折断组件(40)的主体部分为硬质材料件,折断组件(40)同隔断组件(20)连接的连接部为软质材料件,其中所述软质材料件的材料相较于所述硬质材料件的材料易折断,折断所述折断组件(40)的方式为向一侧弯折形变组件,挤压形变组件,扭转形变组件的一种。
5.根据权利要求1所述的多功能集成分子检测管,其特征在于,隔断组件(20)的材质为易破损材质,折断组件(40)的材质为刚性材质,折断组件(40)连接在隔断组件20的顶端,当折断组件(40)受到外力作用下时,折断组件(40)从底部折断并在所述隔断组件(20)上形成通孔。
6.根据权利要求5所述的多功能集成分子检测管,其特征在于,所述折断组件(40)的底部为硬质材料的刺破件,当所述折断组件(40)处于密封状态时,所述刺破件嵌入所述隔断组件(20)内,当所述折断组件(40)处于折断状态时,所述刺破件在外力作用下做行程作用以在所述隔断组件(20)上形成相通于所述形变组件(10)和所述反应组件(10)的通道。
7.根据权利要求1所述的多功能集成分子检测管,其特征在于,反应组件(30)内预装多用途缓冲液,形变组件(10)内放置反应试剂,所述多用途缓冲液的成分包括:Tris-HCl pH6-9 、二甲基亚砜、TritonX 100、EDTA二钠、十二烷基-β-D-麦芽糖苷。
8.一种多功能集成分子检测体系,其特征在于,包括:
权利要求1到7任一所述的多功能集成分子检测管以及配套所述多功能集成分子检测管的孵育器,多功能集成分子检测管在所述孵育器上实现高温加热、震荡、超声、扩增的任一处理。
9.一种多功能集成分子检测管的检测方法,采用权利要求1到7任一所述的多功能集成分子检测管实现分子检测,其特征在于,包括:
在反应组件(30)内预装多用途缓冲液,在所述形变组件(10)内预装反应试剂;
将待测样本加入反应组件(30)内实通过所述多用途缓冲液实现所述待测样本的裂解;
待裂解完全后,对所述形变组件(10)施加外力以促使所述折断组件(40)切换为折断状态;
反复对形变组件(10)施加外力或者倒置检测管以混合反应组件(30)和所述形变组件(10)内的试剂;
待试剂充分混合后正置检测管以使得液体全部流动至反应组件(30)的底部,将反应组件(30)置于孵育器内进行加热以及扩增反应。
10.一种多功能集成分子检测管的检测方法,采用权利要求1到7任一所述的多功能集成分子检测管实现分子检测,其特征在于,包括:
在反应组件(30)内预装多用途缓冲液,在所述形变组件(10)内预装反应试剂;
对所述形变组件(10)施加外力以促使所述折断组件(40)切换为折断状态;
反复对形变组件(10)施加外力或者倒置检测管以混合反应组件(30)和所述形变组件(10)内的试剂;
待试剂充分混合后正置检测管以使得液体全部流动至反应组件(30)的底部,往反应组件(30)内加入待测物体并将反应组件(30)置于孵育器内进行扩增。
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