CN115605609A - 使用rt-pcr的病毒感染的快速检测 - Google Patents

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CN115605609A CN202180024785.4A CN202180024785A CN115605609A CN 115605609 A CN115605609 A CN 115605609A CN 202180024785 A CN202180024785 A CN 202180024785A CN 115605609 A CN115605609 A CN 115605609A
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Abstract

本发明提供了一种包含非离子表面活性剂的裂解缓冲液，其可用作制备、储存、扩增和/或检测核酸的一步法试剂。本发明的裂解缓冲液的各种实施方案包括在裂解细胞、储存核酸、扩增核酸、纯化核酸、检测核酸和/或用于分析核酸的其他程序中相容或有用的其他物质。还提供了基于裂解缓冲液的方法和试剂盒，包括用于快速裂解细胞和在RT‑PCR中直接使用所得细胞裂解物的那些方法和试剂盒。

Description

使用RT-PCR的病毒感染的快速检测
对以电子方式提交的序列表的参考
以电子提交方式与本申请一起提供的序列表是说明书的一部分，并且通过引用的方式全文纳入本文。
背景技术
1.领域
本公开内容涉及一种改进的使用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测生物样品中病毒RNA的方法。
一些用于检测病毒RNA的代表性RT-PCR方法需要在高度变性条件下在含有刺激性化学物质的裂解缓冲液中裂解生物样品，以灭活RNA酶并稳定RNA，然后使用柱纯化分离RNA，以从裂解缓冲液中去除这些化学物质(其会干扰后续的RT-PCR)。例如，标准TRIzolRNA制备试剂盒中包含的裂解缓冲液通常含有如硫氰酸胍、苯酚和/或氯仿等组分，它们会使蛋白质(如聚合酶)降解或变性，因此会干扰后续的PCR反应。
这些方法的一些缺点是多个步骤、缺乏灵敏度、时间增加、成本增加以及获得结果所需的试剂。
针对该技术问题的解决方案由权利要求中表征的实施方案提供。
发明内容
本申请提供了适用于裂解细胞和/或病毒和分析核酸的组合物。
在一些实施方案中，本申请提供了包括非离子表面活性剂的裂解缓冲液。本发明的裂解缓冲液的各种实施方案包括在裂解细胞和/或病毒、储存核酸、扩增核酸、纯化核酸、检测核酸和/或用于分析核酸的其他程序中相容或有用的其他物质。在一些实施方案中，裂解缓冲液可以被认为是制备、储存、扩增和/或检测核酸的一步法试剂。
还提供了基于所述组合物的方法和试剂盒，包括用于快速裂解细胞和在RT-PCR中直接使用所得细胞裂解物的方法和试剂盒。
在一些实施方案中，本申请提供了使用本发明的裂解缓冲液裂解至少一种细胞和/或至少一种病毒的方法。裂解方法通常包括使至少一种细胞或至少一种病毒与本发明的裂解缓冲液接触足够的时间量以引起细胞或病毒裂解。在各种实施方案中，裂解方法中包括额外的可选步骤，例如在使用裂解物之前将裂解物储存一段时间。同样，其他示例性额外步骤可以包括扩增细胞裂解物中的一种或多种核酸，和/或检测所述核酸。
出人意料地发现，本发明的单独一种缓冲液可适用于细胞和病毒两者的裂解，并可作为导致核酸扩增和检测的反应的子组分存在。例如，本发明的缓冲液可以适用于裂解被病毒感染的细胞，如人或动物细胞。获得的裂解物可直接用作后续反应的模板，导致核酸的扩增、检测和定量。在另一个实施方案中，本申请提供了一种扩增一种或多种核酸的方法。在一个方面，该方法包括使生物样品与本发明的裂解缓冲液接触以产生裂解物，并扩增裂解物中的核酸。在各种实施方案中，扩增核酸是通过PCR方法，如qPCR、RT-PCR或RT-qPCR。在一些实施方案中，包括一个或多个对照反应，例如一个对照反应，以允许相对于同时进行的其他扩增反应或相对于标准扩增曲线将被扩增的核酸量标准化。
本申请还提供了试剂盒。通常，试剂盒包括本发明的裂解缓冲液。试剂盒还可包括一种或多种物质、材料、试剂等，其可用于细胞或病毒的裂解、核酸或裂解物的储存，在核酸扩增或检测或定量期间存在。在实施方案中，试剂盒中包括裂解细胞或病毒、扩增核酸，和/或检测和/或定量核酸所必需的一些或全部材料、试剂等。
还提供了裂解缓冲液和试剂盒在用于扩增一种或多种核酸的方法中的用途，该方法包括使样品与裂解缓冲液接触以产生裂解物并扩增裂解物中的至少一种核酸。
还提供了裂解缓冲液和试剂盒在检测RNA或DNA病毒的方法中的用途，包括将样品与裂解缓冲液接触以产生裂解物，在RNA病毒检测的情况下，逆转录裂解物中的RNA以获得cDNA，并使用源自RNA病毒的一组引物扩增裂解物中来自RNA病毒的至少一种核酸。
在一个方面，本发明涉及一种检测RNA或DNA病毒的方法，包括将至少一种样品与裂解缓冲液接触以产生裂解物，在RNA病毒检测的情况下，逆转录裂解物中的RNA以获得cDNA，并使用源自RNA或DNA病毒核酸序列的一组引物扩增裂解物中来自RNA或DNA病毒的至少一种核酸。
在具体实施方案中，裂解缓冲液包括至少一种非离子表面活性剂、甘油和至少一种盐。
在具体实施方案中，所述至少一种非离子表面活性剂具有亲水性聚环氧乙烷链(polyethylene oxide chain)和芳族烃亲脂性或疏水性基团。
在具体实施方案中，所述至少一种非离子表面活性剂是Triton X-100。
在具体实施方案中，裂解缓冲液包括约0.05％至约20％的量的非离子表面活性剂。
在具体实施方案中，所述盐是磷酸二钠(disodium phosphate)。
在具体实施方案中，裂解缓冲液还包括以下中的一种或多种：Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、无RNA酶水、RNA酶抑制剂，及其混合物。
在具体实施方案中，裂解缓冲液的pH为约7.5至约8.5。
在具体实施方案中，RNA病毒是冠状病毒。
在具体实施方案中，冠状病毒是SARS CoV-2。
在具体实施方案中，冠状病毒是SARS CoV-2的变体。
在具体实施方案中，该组引物是针对选自E基因、N基因和RdRP基因的病毒RNA基因。
在具体实施方案中，该组引物是针对E基因并且包括SEQ ID NO:8和/或SEQ IDNO:9或其互补序列，或由SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9或其互补序列组成。
在具体实施方案中，该组引物是针对RdRP基因并且包括SEQ ID NO:11和/或SEQID NO:12或其互补序列，或由SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12或其互补序列组成。
在具体实施方案中，该方法不包括RNA提取步骤。
在具体实施方案中，所述裂解物直接用于逆转录。
在具体实施方案中，所述样品是生物样品。
在具体实施方案中，使用拭子收集所述生物样品。
在具体实施方案中，所述生物样品是鼻拭子(nasal swab)。
在具体实施方案中，所述至少一种样品包括至少一种人类细胞。
在具体实施方案中，将样品置于100μl裂解缓冲液中。
在具体实施方案中，该方法进一步包括将裂解缓冲液和样品的混合物在室温下孵育5分钟以产生裂解物。
在具体实施方案中，该方法进一步包括离心裂解物并收集上清液。
在具体实施方案中，将裂解物在室温下以12000rpm离心2分钟。
在另一个方面，本发明涉及扩增一种或多种核酸的方法，包括使至少一种样品与裂解缓冲液接触以产生裂解物，并扩增裂解物中的至少一种核酸，其中裂解缓冲液包括至少一种非离子表面活性剂、甘油和至少一种盐。
在具体实施方案中，所述至少一种非离子表面活性剂具有亲水性聚环氧乙烷链和芳族烃亲脂性或疏水性基团。
在具体实施方案中，所述至少一种非离子表面活性剂是Triton X-100。
在具体实施方案中，裂解缓冲液包括约0.05％至约20％的量的非离子表面活性剂。
在具体实施方案中，所述盐是磷酸二钠。
在具体实施方案中，裂解缓冲液还包括以下中的一种或多种：Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、无RNA酶水、RNA酶抑制剂，及其混合物。
在具体实施方案中，所述至少一种样品是生物样品。
在具体实施方案中，使用拭子收集所述生物样品。
在具体实施方案中，所述生物样品是鼻拭子。
在具体实施方案中，所述样品包括至少一种人类细胞。
在具体实施方案中，将样品置于100μl裂解缓冲液中。
在具体实施方案中，该方法进一步包括将裂解缓冲液和样品的混合物在室温下孵育5分钟以产生裂解物。
在具体实施方案中，该方法进一步包括离心裂解物并收集上清液。
在具体实施方案中，将裂解物在室温下以12000rpm离心2分钟。
在具体实施方案中，扩增裂解物中的至少一种核酸是通过PCR、qPCR、RT-PCR或RT-qPCR进行。
在具体实施方案中，扩增裂解物中的至少一种核酸是通过一步法RT-qPCR进行。
在具体实施方案中，该方法不包括RNA提取步骤。
在具体实施方案中，裂解物直接用于扩增。
在具体实施方案中，所述至少一种核酸来自RNA病毒。
在另一个方面，本发明涉及一种用于鉴定感染SARS CoV-2或SARS CoV-2变体的受试者的方法，包括从获自受试者的生物样品中获得裂解物，逆转录裂解物中的RNA以获得cDNA，并使用源自SARS CoV-2基因组或SARS CoV-2变体基因组的核苷酸序列的一组引物对cDNA进行PCR测定。
在具体实施方案中，裂解物是通过使生物样品与包括至少一种非离子表面活性剂、甘油和至少一种盐的裂解缓冲液接触来获得。
在具体实施方案中，该方法不包括RNA提取步骤。
在具体实施方案中，裂解物直接用于逆转录。
在另一个方面，本发明涉及扩增、鉴定、检测和/或分析靶核酸的方法，包括将样品与裂解缓冲液接触以产生裂解物，逆转录裂解物中的RNA以获得cDNA，并使用一组针对靶核酸的引物对cDNA进行PCR测定。
在具体实施方案中，裂解物是通过使样品与包括至少一种非离子表面活性剂、甘油和至少一种盐的裂解缓冲液接触来获得。
在具体实施方案中，该方法不包括RNA提取步骤。
在具体实施方案中，裂解物直接用于逆转录。
在另一个方面，本发明涉及包含裂解缓冲液的试剂盒，其中裂解缓冲液包括至少一种非离子表面活性剂、甘油和至少一种盐。
在具体实施方案中，试剂盒还包括至少一种用于扩增靶核酸的试剂。
在具体实施方案中，试剂盒包括用于扩增靶核酸的至少一种引物和/或至少一种探针。
在具体实施方案中，试剂盒是用于使用一步法RT qPCR检测RNA的试剂盒。
在具体实施方案中，试剂盒包括以下中的一种或多种：至少一种逆转录酶、至少一种DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、核苷酸、引物、探针、标记物，或其任意组合。
在具体实施方案中，靶核酸来源于RNA病毒。
在具体实施方案中，RNA病毒是冠状病毒。
在具体实施方案中，RNA病毒是SARS CoV-2。
在具体实施方案中，试剂盒包括选自以下的一组引物：SEQ ID NO:8和/或SEQ IDNO:9或其互补序列(complement)，和SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12或其互补序列。
在另一个方面，本发明涉及一种裂解缓冲液，其包括1-5％Triton X-100和一种或多种以下组分：5-20％甘油、0.5-4mM DTT、10-50mM Na2HPO4和10-50mM Tris-HCl。
在具体实施方案中，裂解缓冲液包括约3％Triton X-100和一种或多种以下组分：约10％甘油、约2mM DTT、约25mM Na2HPO4和约25mM Tris-HCl。
在具体实施方案中，裂解缓冲液的pH为约7.5至约8.0。
在具体实施方案中，裂解缓冲液还包括无RNA酶水。
在具体实施方案中，包括约1:15至1:1的量的无RNA酶水(裂解缓冲液:无RNA酶水)。
在具体实施方案中，裂解缓冲液还包括RNA酶抑制剂。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的裂解缓冲液在用于扩增一种或多种核酸的方法中的用途，该方法包括使至少一种样品与裂解缓冲液接触以产生裂解物，并且扩增裂解物中的至少一种核酸。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的裂解缓冲液在检测RNA病毒的方法中的用途，包括使至少一种样品与裂解缓冲液接触以产生裂解物，逆转录裂解物中的RNA以获得cDNA，并使用源自RNA病毒的核酸序列的一组引物扩增裂解物中来自RNA病毒的至少一种核酸。
附图说明
专利或申请文件包括至少一张彩色绘图。在请求和支付必要的费用后专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
为了进一步理解本公开内容的性质、目的和优点，应参考以下详细描述，结合以下附图阅读，其中相同的附图标记表示相同的元素。
图1示出了样品中上皮标志物CLDN1和人管家基因RPL32的RT qPCR的扩增曲线，样品获自10名人类、健康志愿者(S1-S10)的鼻拭子、无样品的拭子(仅拭子，阴性对照)和无模板的样品(NTC，阴性对照)。红色：RPL32；蓝色：CLDN1。每个样品的反应一式四份进行。
图2提供了图1所示数据的总结。1.对于每个样品(S1-S10和阴性对照)，左侧线条(bar)表示CLDN1检测，右侧线条表示RPL32检测。循环阈值(CT)或交叉点(CP)是PCR扩增期间直到测量的荧光达到可以将荧光与背景荧光区分开的值的循环数。
图3示出了举例说明RT qPCR对检测标准RNA提取病毒阳性对照(EAV)的灵敏度的扩增曲线。
图4示出了举例说明RT qPCR对检测SARS CoV-2E-基因的灵敏度的扩增曲线。
图5示出了举例说明RT qPCR对检测SARS CoV-2N-基因的灵敏度的扩增曲线。
图6示出了举例说明RT qPCR对检测SARS CoV-2RdRP基因的灵敏度的扩增曲线。
图7示出了证明可以在来自10名健康人类志愿者(S1-S10)的鼻拭子中检测到SARSCoV-2基因(E-基因和RdRP基因)的扩增曲线，其中添加合成的SARS CoV-2标志物寡核苷酸，检测量小于20个拷贝。每个样品的反应一式四份进行。
图8提供了图7所举例说明的数据的总结。对于每个样品(S1-S10和阴性对照)，左侧线条表示E-基因检测，右侧线条表示RdRP-基因检测。NTC＝无模板的对照；PosControlRNA＝无裂解物的对照。循环阈值(CT)或交叉点(CP)是PCR扩增期间直到测量的荧光达到可以将荧光与背景荧光区分开的值的循环数。
具体实施方式
在一个方面，本公开内容提供了扩增、鉴定、检测、定量和/或分析靶核酸的方法，包括例如：
(a)获得样品，任选地不包括细胞或包括一种或多种细胞，例如上皮细胞，
(b)使样品与本发明的裂解缓冲液接触以产生裂解物，
(c)任选地冷冻裂解物，
(d)必要时解冻裂解物，且必要时离心裂解物，
(e)如果需要离心，收集上清液并将其转移到新的反应容器中，例如反应管或微量滴定板，
(f)任选地冷冻上清液，
(g)必要时解冻上清液，和
(h)通过任何合适的方式扩增、鉴定、检测和/或分析靶核酸。
在一些实施方案中，使用PCR技术进行扩增、鉴定、检测和/或分析靶核酸，例如PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR。PCR方法是公知的，任何合适的方法都可以用于本发明的方法中。
在一个方面，扩增、鉴定、检测、定量和/或分析靶核酸包括，例如：
(1)将PCR MasterMix(例如qPCR MasterMix)添加到裂解物中，该裂解物是通过在qPCR板中裂解来自受试者的至少一种病毒和/或一种或多种细胞(例如上皮细胞)而获得，
(2)用透明的qPCR箔密封qPCR板，
(3)离心qPCR板，
(4)进行PCR，例如qPCR，以及
(5)分析数据。
在一个方面，可以使用任何合适的PCR MasterMix。几种商业化PCR MasterMix制剂(包括qPCR MasterMix制剂)是可获得的并且可以用于本发明。或者，可以通过混合发生PCR反应所必需的组分(例如DNA聚合酶、核苷酸和镁，以及可选的逆转录酶和RNA酶抑制剂)来制造PCR MasterMix。在一些实施方案中，PCR MasterMix和裂解物以5:1的比例添加(PCRMasterMix:裂解物)。
在一个方面，qPCR是使用
Figure GDA0003983622480000081
480QPCR读数器(Roche)的一步法RT-PCR。然而，在本发明的方法中可以使用任何合适的PCR机器。
在一个方面，使用
Figure GDA0003983622480000082
480软件分析数据。然而，可以使用任何合适的软件来分析PCR数据。
在一个方面，本文描述的测定灵敏到足以检测样品中的约20个拷贝或更少、约10个拷贝或更少、约5个拷贝或更少、约4个拷贝或更少、约3个拷贝或更少、或约2个拷贝或更少的靶核酸。
如本文所使用的，“表面活性剂”的含义是本领域普通技术人员容易理解的最广泛定义。也就是说，表面活性剂是降低液体的表面张力和/或降低两种液体之间的界面张力的润湿剂。在水中不带正电荷或负电荷但可溶于水的表面活性剂是“非离子表面活性剂”。两种或更多种非离子表面活性剂的组合包括在术语“非离子表面活性剂”内。
在一个方面，本发明的特征在于一种裂解缓冲液。出人意料地证明了，本发明的裂解缓冲液适用于细胞和病毒的裂解，并且可以被包括作为用于通过PCR方法扩增核酸的反应混合物的组分，例如逆转录酶PCR(RT-PCR)和定量PCR(qPCR)。
裂解缓冲液包括至少一种能够破坏膜(例如细胞膜和病毒膜)的洗涤剂。在一些实施方案中，裂解缓冲液包括至少一种非离子表面活性剂。在一些实施方案中，所述至少一种非离子表面活性剂具有亲水性聚环氧乙烷链和芳族烃亲脂性或疏水性基团。合适的非离子表面活性剂包括但不限于Triton X-100、Igepal CA-630(Nonidet P-40)、Conco NI、Dowfax 9N、Igepal CO、Makon、Neutronyx 600's、Nonipol NO、Plytergent B、Renex 600's、Solar NO、Sterox、Serfonic N、T-DET-N、Tergitol NP、Triton N、BIGCHAP(N,N-双(3-D-葡萄糖酰氨基丙基)乙醇胺)或脱氧-BIGCHAP(N,N-双(3-葡萄糖酰氨基丙基)脱氧乙醇胺)；癸酰基-N-甲基葡糖酰胺；n-癸基α-D-吡喃葡萄糖苷；n-癸基β-D-吡喃葡萄糖苷；n-癸基β-D-吡喃麦芽糖苷；洋地黄皂苷；n-十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷；n-十二烷基α-D-麦芽糖苷；n-十二烷基β-D-麦芽糖苷；庚酰基-N-甲基葡糖酰胺；n-庚基β-D-吡喃葡萄糖苷；N-庚基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷；n-己基β-D-吡喃葡萄糖苷；1-单油酰基-rac-甘油；壬酰基-N-甲基葡糖酰胺；n-壬基α-D-吡喃葡萄糖苷；n-壬基β-D-吡喃葡萄糖苷；辛酰基-N-甲基葡糖酰胺；n-辛基α-D-吡喃葡萄糖苷；n-辛基β-D-吡喃葡萄糖苷；辛基β-D-硫代吡喃半乳糖苷；辛基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷；聚氧乙烯酯(如8-硬脂酸聚氧乙烯酯(Myrj 45)、40-硬脂酸聚氧乙烯酯(Myrj 52)、50-硬脂酸聚氧乙烯酯(Myrj 53)和100-硬脂酸聚氧乙烯酯(Myrj 59))、聚氧乙烯醚(如含有一个或多个乙基、甲基、戊基、鲸蜡基、硬脂基、油基、己基、辛基、癸基、月桂基、肉豆蔻基、庚基、十三烷基、异十六烷基及其组合的那些)；聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(如含有一个或多个单月桂酸酯基、单油酸酯基、单棕榈酸酯基、单硬脂酸酯基、三油酸酯基和三硬脂酸酯基及其组合的那些，包括但不限于“Tween”系列洗涤剂)；脱水山梨糖醇酯(如含有一个或多个单月桂酸酯基、单油酸酯基、单棕榈酸酯基、单硬脂酸酯基、倍半油酸酯基、三油酸酯基、三硬脂酸酯基及其组合的那些)；Tergitol；n-十四烷基β-D-麦芽糖苷；Triton系列洗涤剂，包括但不必须限于Triton X-100(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)及其衍生物、Triton X-114、Triton X-405、Triton X-101、Triton N-42、Triton N-57、Triton N-60、Triton X-15、Triton X-35、Triton X-45、Triton X-102、Triton X-155、Triton X-165、Triton X-207、Triton X-305、Triton X-705-70and Triton B-1956；壬基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40；NP-40、Igepal CA630)；Surfynol表面活性剂的Air Products系列，包括但不必须限于Surfynol 104、Surfynol 420、Surfynol440、Surfynol 465、Surfynol 485、Surfynol 504、Surfynol PSA系列、Surfynol SE系列、Dynol 604、Surfynol DF系列、Surfynol CT系列和Surfynol EP系列，例如Surfynol 104系列(104、104A、104BC、104DPM、104E、104H、104NP、104PA、104PG50、104S)、和Surfynol 2502；Tyloxapol；n-十一烷基β-D-吡喃葡萄糖苷，和任何非离子辛基酚乙氧基化物表面活性剂。其他非限制性实例包括DowChemicals的Dowfax系列非离子表面活性剂，例如N系列和DP系列表面活性剂，包括但不必须限于DOWFAX 63N10、DOWFAX 63N13、DOWFAX 63N30、DOWFAX 63N40、DOWFAX 81N13、DOWFAX81N15、DOWFAX 92N20、DOWFAX 100N15、DOWFAX EM-51、DOWFAX 20A42、DOWFAX 20A64、DOWFAX 20A612、DOWFAX 20B102、DOWFAX DF-101、DOWFAX DF-111、DOWFAX DF-112、DOWFAXDF-113、DOWFAX DF-114、DOWFAX DF-117、DOWFAX WP-310、DOWFAX 50C15、DOWFAX DF-121、DOWFAX DF-122、DOWFAX DF-133、DOWFAX DF-141、DOWFAX DF-142和DOWFAX DF-161。其他额外的非限制性实例包括BASF的pluronic系列表面活性剂，包括但不限于10R5、17R2、17R4、25R2、25R4、31R1、F108系列、F127系列、F38系列、F68系列、F77系列、F87系列、F88系列、F98系列、L10、L101、L121、L31、L34、L43、L44系列、L61、L62系列、L64、L81、L92、N-3、P103、P104、P105、P123、P65、P84、P85和F127。
裂解缓冲液中可以包括任何合适量的洗涤剂和/或非离子表面活性剂。在一些实施方案中，裂解缓冲液包括约0.05％至约20％的量的非离子表面活性剂，例如Triton X-100。在一些实施方案中，裂解缓冲液包括约0.05％至约15％、约0.05％至约10％、约0.05％至约7％、约0.05％至约5％、约0.05％至约4％、约0.05％至约3％、约0.05％至约2％、约0.05％至约1％、或约0.05％至约0.5％。在一些实施方案中，裂解缓冲液包括约0.1％至约15％、约0.1％至约10％、约0.1％至约7％、约0.1％至约5％、约0.1％至约4％、约0.1％至约3％、约0.1％至约2％或约0.1％至约1％。在一些实施方案中，裂解缓冲液包括约0.5％至约15％、约0.5％至约10％、约0.5％至约7％、约0.5％至约5％、约0.5％至约4％、约0.5％至约3％、或约0.5％至约2％。在一些实施方案中，裂解缓冲液包括约1％至约15％、约1％至约10％、约1％至约7％、约1％至约5％、约1％至约4％、约1％至约3％、或约1％至约2％的非离子表面活性剂，如Triton X-100。在一些实施方案中，裂解缓冲液包括约2％至约15％、约2％至约10％、约2％至约7％、约2％至约5％、约2％至约4％，或约2％至约3％的非离子表面活性剂，如Triton X-100。在一些实施方案中，裂解缓冲液包括约3％至约15％、约3％至约10％、约3％至约7％、约3％至约5％、或约3％至约4％的非离子表面活性剂，例如Triton X-100。在一些实施方案中，裂解缓冲液包括约0.05％、约0.1％、约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％或约15％的非离子表面活性剂，例如Triton X100。
尽管裂解缓冲液可以包括一种或多种其他组分，并且这些组分不受本文公开的示例性组分的限制，但是裂解缓冲液通常会包括溶剂(例如水)、有机溶剂(例如甘油)，或两者。尽管优选地使用的溶剂尽可能纯或可行，但可以使用任何纯度的溶剂。因此，当裂解缓冲液中包括水时，其可以是蒸馏水、双蒸水、去离子水、无菌水或它们的任何组合。溶剂，无论是水还是任何其他溶剂或水和任何其他溶剂的组合，都可以在使用前进行处理，以减少或消除一种或多种化学或生化活性，例如但不限于核酸酶(例如，RNA酶、DNA酶)活性。例如，水或任何其他溶剂或水和任何其他溶剂的组合可以是不含RNA酶的。同样，可以用灭菌技术或用化学或生物制品等处理裂解缓冲液，以对组合物进行灭菌或者减少或消除一种或多种不合需要的化学或生化活性(例如，RNA酶、DNA酶等)。例如，裂解缓冲液可含有RNA酶抑制剂。
本发明的裂解缓冲液还可包括一种或多种盐，例如钠盐、钾盐、镁盐、锰盐、锌盐、钴盐，或这些盐中的两种或更多种的组合。具体的示例性盐包括磷酸二钠、氯化钠、氯化镁、氯化锰和氯化钾。盐可以以任何合适的量和出于任何原因添加，包括但不限于作为细胞或病毒裂解的辅助、用于缓和表面活性剂浊点和泡沫水平、以及用于改进参与核酸扩增的试剂的功能。
本发明的裂解缓冲液还可包括一种或多种适用于核酸扩增的缓冲液，例如但不限于Tris-HCl。
本发明的裂解缓冲液还可包括一种或多种还原剂。还原剂有助于破坏使RNA的二级结构松散的键(例如二硫键)，并可以促进逆转录(RT)酶的转录起始。裂解缓冲液中可以包括任何合适的还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)。
不希望囿于理论，本发明的裂解缓冲液可能是裂解感染的细胞(例如上皮细胞)和病毒两者所必需的。可以使用任何合适的裂解缓冲液，只要其不干扰后续的PCR反应，例如RT-PCR。
裂解缓冲液的pH可以是任何合适的pH。在一些实施方案中，裂解缓冲液的pH为约6.5至约8.5或约7.0至约8.5。例如，裂解缓冲液的pH可以为约7.5至约8.5或约7.5至约8.0。在一些实施方案中，裂解缓冲液的pH为约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4或约8.5。
本发明的裂解缓冲液可以作为浓缩储液提供。例如，浓缩储液可以配制成100X储液、50X储液、20X储液、10X储液、5X储液或2X储液。
本发明的裂解缓冲液可以预先制备，并在使用前任选地稀释。裂解缓冲液可以在不干扰后续RT-PCR的任何合适的稀释剂中稀释。在一些实施方案中，裂解缓冲液在使用前用水稀释。在其他实施方案中，裂解缓冲液用介质稀释，例如运输/储存介质。裂解缓冲液可以以任何合适的比例稀释。例如，裂解缓冲液可以按100:1、50:1、25:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:40、1:50或1:100(裂解缓冲液：稀释剂)。
在一个方面，本发明的裂解缓冲液可以是包括1-5％Triton X-100和一种或多种以下组分的浓缩储液：5-20％甘油、0.5-4mM DTT、10-50mM Na2HPO4和10-50mM Tris-HCl。在一些实施方案中，本发明的裂解缓冲液可以是包括约3％Triton X-100和一种或多种以下组分的浓缩储液：约10％甘油、约2mM DTT、约25mM Na2HPO4和约25mM Tris-HCl。浓缩储液的pH可为约7.5至约8.0，优选地约7.8。
浓缩储液可以在使用前用稀释剂(例如无RNA酶水)稀释。在一些实施方案中，浓缩储液可以在使用前用无RNA酶水从1:15稀释至1:1。在一些实施方案中，浓缩储液可以在使用前用无RNA酶水稀释至1:6。
在一些方面，在使用前将RNA酶抑制剂添加到裂解缓冲液中。在一些实施方案中，在使用前将RNA酶抑制剂以约1:100至约1:10000的量添加到裂解缓冲液中。在一些实施方案中，在使用前将RNA酶抑制剂以约1:1000的量添加到裂解缓冲液中。
方法
在一个方面，本发明提供了一种使用本发明的裂解缓冲液裂解至少一种细胞或病毒的方法。该方法包括使至少一种细胞或病毒与本发明的组合物接触足够长的时间以引起细胞或病毒裂解。
细胞可以是任何真核细胞。细胞可以是任何目的细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖动物细胞、爬行动物细胞和昆虫细胞。例如，细胞可以是人细胞、猴细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、狗细胞、猫细胞、猪细胞、马细胞、仓鼠细胞、兔细胞、青蛙细胞、昆虫细胞等。在一些实施方案中，细胞是上皮细胞。
“至少一个细胞”不仅指单独一个细胞，还指单独一种细胞类型。因此，两个或更多个细胞不仅可以指相同细胞类型的两个或更多个细胞，还指两种不同细胞类型的一个或多个细胞。除非另有特别说明，是否存在单一细胞类型的群体或存在两种或更多种细胞类型的群体是无关紧要的。无论如何，本发明的方法(包括下文讨论的那些)将提供所述效果。
此外，除非另有说明，术语“至少一个细胞”和“一个细胞”在本文中可互换使用以定义单个细胞、单一类型细胞的集合或多种类型细胞的集合，存在每种类型的至少一个细胞。
类似地，除非另有说明，术语“至少一种病毒”和“一种病毒”在本文中可互换使用以定义单个病毒、单一类型病毒的集合或多种类型病毒的集合，存在每种类型的至少一种病毒。
在一些实施方案中，至少一种细胞或至少一种病毒存在于生物样品中。
在一些方面，使用拭子收集生物样品。例如，该拭子可用于从任何粘膜(如鼻子、脸颊、咽或口腔)中收集生物样品。在一个方面，拭子可用于从目的细胞(例如上皮细胞)所在的任何位置收集样品。在一个具体实施方案中，生物样品是鼻拭子。在另一个实施方案中，生物样品是体液(鼻咽抽吸物、痰、唾液、尿液、血液等)、排泄物、灌洗液等。
生物样品可以来自任何动物，优选哺乳动物，更优选人类。
其他类型的样品，例如液体样品和来自表面的涂片，也可以用于本发明的方法中。
在裂解之前，样品可以任选地通过任何合适的方式储存。储存方式可能因样品类型和储存时间长短而变化。例如，生物样品可以在室温(例如，22-25℃)下储存、置于冰上、或冷藏(例如，4℃)用于短期储存，或者可以冷冻用于长期储存。冷冻的生物样品可以储存在例如-20℃、-80℃或液氮中。
在一些实施方案中，将样品(例如生物样品)置于运输或储存介质中以在任何合适的温度下储存任何合适的时间。
任选地包括至少一种细胞的样品与本发明的裂解缓冲液接触的时间量可以变化并且可以由本领域技术人员确定。在一些实施方案中，样品与本发明的裂解缓冲液接触的时间量是足以导致至少一种细胞或病毒裂解的时间量。由于裂解反应的化学性质，可以想到时间可以非常短，例如1秒或更短。然而，时间不必如此受限。实际上，因为在随后的核酸储存和/或扩增过程中可以存在裂解缓冲液，所以裂解时间可能相对较长。合适的时间范围可以从1秒或更短至几分钟、几小时或几天。示例性的接触时间包括但不限于10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分钟、90秒、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟或更长。
在各种实施方案中，裂解方法中包括额外的可选步骤。已经证明，通过使用本发明的裂解缓冲液，无需额外步骤即可发生细胞或病毒裂解。然而，为了加速裂解，可以将细胞和/或病毒暴露于一种或多种机械破碎技术。可以使用任何已知的机械破碎技术，包括但不限于涡旋、重复移液、倒置、振荡和搅拌。因此，可以至少部分地通过匀浆来完成裂解。根据裂解物的最终用途，在使用机械技术时，可以温和地应用以最小化核酸上的剪切应力。在一些实施方案中，可以至少部分地通过生物或生化物质的作用来完成裂解。例如，裂解可以在蛋白酶如蛋白酶K的存在下完成。
在本发明的方法中可以使用任何合适体积的裂解缓冲液并且可以根据样品而变化。在一些实施方案中，使用约50μl、约100μl、约200μl或更多体积的裂解缓冲液。在一些实施方案中，使用体积为100μl的裂解缓冲液。
裂解物的冷冻可以改善细胞和/或病毒的裂解。因此，在一些实施方案中，裂解物可任选地在分析之前冷冻。裂解物可以冷冻一次或多次。换言之，可以对裂解物进行一次或多次冻融循环。可以使用任何合适的条件来冷冻裂解物。应当理解，温度和持续时间可以根据各种因素进行优化，例如样品的大小和类型以及裂解物的量。在一些实施方案中，裂解物在分析前在-20℃或更低的温度下孵育。例如，裂解物可在分析前在选自但不限于约-20℃、约-80℃或约-120℃的温度下孵育。在一些实施方案中，在分析之前将裂解物置于干冰上。可以如上所述将裂解物孵育任何合适的时间。在一些实施方案中，裂解物可以在-20℃或更低的温度下孵育至少约10分钟。例如，裂解物可以在-20℃或更低的温度下孵育约10分钟、约30分钟、约1小时、或约24小时或更长。在一些实施方案中，裂解物在分析前在-80℃的温度下孵育10分钟。
裂解方法中的另一个可选步骤是在使用前将裂解物储存一段时间。在这样的实施方案中，裂解物可以在任何温度下储存。例如，其可以储存在相对较高的温度下(例如，37℃)、室温下(例如，22℃-25℃)、冰箱中(例如，4℃)、冷冻(例如，-20℃)或深度冷冻(例如，-80℃或更低)。
裂解方法还可以包括导致细胞和/或病毒组分与其他细胞和/或病毒组分分离的一个或多个步骤。因此，例如，该方法可以包括离心裂解物以从核酸中去除未裂解的细胞和/或病毒、细胞和/或病毒膜和蛋白质。虽然不是优选的，但还可以包括从其他组分中沉淀出一种或多种细胞或病毒组分，例如，通过添加一种或多种盐、有机溶剂(例如，酒精)，或通过热处理和随后的离心。用于将细胞和/或病毒组分彼此分离的其他技术是本领域技术人员已知的，并且可以使用任何合适的技术，每种技术都基于期望的结果进行选择。适当技术的选择和执行完全在本领域技术人员的技能水平内。
裂解方法还可以包括对一种或多种裂解组分的操作。因此，该方法可以包括从裂解物中纯化一种或多种核酸和/或从裂解物中扩增一种或多种核酸。裂解方法的各种实施方案包括已知用于裂解物的任何和所有程序。
在一个实施方案中，裂解至少一种细胞和/或至少一种病毒的方法包括将本发明的裂解缓冲液加入到至少一种细胞和/或至少一种病毒中。在一些实施方案中，该方法进一步包括将裂解缓冲液与至少一种细胞和/或至少一种病毒的混合物在室温下孵育5分钟。
在另一个实施方案中，提供了一种裂解样品的方法，该方法包括将样品与本发明的裂解缓冲液混合。在一些实施方案中，样品是生物样品。在一些实施方案中，生物样品是拭子，例如鼻拭子。在一些实施方案中，生物样品包括至少一种细胞，例如上皮细胞和/或至少一种病毒，例如冠状病毒。在一些实施方案中，将鼻拭子置于100μl本发明的裂解缓冲液中。在一些实施方案中，该方法还包括挤压鼻拭子以将样品释放到裂解缓冲液中。在一些实施方案中，该方法还包括将裂解缓冲液和生物样品的混合物在室温下孵育5分钟以产生裂解物。在一些实施方案中，该方法进一步包括将裂解物离心，例如在室温下以12000rpm离心2分钟，并收集上清液。
本发明还提供了一种扩增一种或多种核酸的方法。通常，该方法包括使样品与本发明的裂解缓冲液接触以产生如上所述的裂解物并扩增裂解物中的至少一种核酸。
用于扩增核酸的多种技术在本领域中是已知的并且广泛使用，并且这些技术中的任何一种均可用于根据本发明的方法。本领域技术人员可以基于任何数量的考虑因素来选择扩增方法，包括但不限于速度、灵敏度、在扩增特定类型的核酸(例如，RNA对比DNA)中的有用性和可靠性。
尽管该方法可以包括核酸的分离或纯化(至少在一定程度上)，但出人意料地发现，靶核酸的扩增可以在没有预先纯化核酸的情况下完成。因此，本发明的裂解物适用于直接核酸扩增。在一些实施方案中，扩增是通过PCR技术进行的。在某些实施方案中，PCR技术是qPCR或RT-PCR(包括RT-qPCR)。
当一种或多种RNA是目的核酸时，该方法可以包括在扩增之前或扩增时进行cDNA合成。许多cDNA合成方案是本领域中已知的，并且可以使用任何合适的方案。例如，Quantabio的qScript XLT逆转录酶可用于从RNA模板制备cDNA。
已经证明，本发明的方法特别适用于检测哺乳动物生物样品(例如鼻拭子)或非生物样品中的病毒RNA或DNA。
本发明的方法提供了优于常规病毒RNA或DNA检测测定的几个优点。例如，本发明的方法避免了对RNA提取步骤的需求，从而减少了工作并使本发明的方法更快速。RNA提取试剂盒，例如美国疾病控制和预防中心(CDC)目前要求用于COVID-19检测的
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DSP Viral RNA Mini试剂盒(Qiagen)，通常包括用于从组分(其可能干扰扩增方法)中分离和纯化核酸的柱子。因此，由于不需要柱子，RNA提取步骤的消除也减少了材料消耗。此外，RNA提取所需的试剂并非总是很容易获得，因此，消除这些试剂会增加测定的可用性。这在流行病期间尤其重要，例如，当需要分析大量测试样品并获得快速结果时。提供一种既精确又灵敏的高通量、快速的检测病毒RNA的方法是一个显著的优势。
本发明的方法优选地包括将生物或非生物样品(例如鼻拭子)与裂解缓冲液一起孵育，并将裂解物直接用于RT-PCR(例如一步法RT-qPCR)。本发明的方法优选地在没有RNA或DNA提取步骤的情况下进行。
在一些实施方案中，包括一种或多种对照反应，例如一种对照反应，以相对于同时进行的其他扩增反应或相对于标准扩增曲线，使被扩增的核酸量标准化。此类对照反应可包括将一种或多种外源核酸添加至反应并对该核酸进行扩增。对照反应可替代地包括扩增目的细胞或生物样品中天然存在的核酸中存在的序列，其中此类序列具有已知的拷贝数和扩增效率。在其他实施方案中，已知序列的对照反应是在与其中正在进行目的扩增的反应容器分开的反应容器中进行。各种其他对照反应是已知的并且广泛用于扩增反应，并且这些对照反应中的任何一种都可以包括在本发明的方法中以确定扩增过程中一个或多个步骤的成功和效率。
在一些实施方案中，对照反应是内部对照，其允许从业者评估存在于特定细胞裂解物样品中的细胞数量，并因此在需要时标准化。通过这种方式，可以得出关于样品中靶核酸(例如，特定的病毒RNA或DNA基因)的量的结论。更具体而言，当比较两个不同样品的扩增结果时，通常不能以高度的准确性确定原始样品中的细胞或病毒数量、成功裂解的细胞或病毒的数量或从每个样品中释放的核酸总量。因此，不可能准确比较不同样品中靶核酸的总量。目前，管家基因或rRNA类型被用作标志物来标准化(standardize或normalize)来自不同细胞或组织的样品。然而，据报道，目前使用的内部标准不一致，因此不能提供内部控制所需的准确性和可重复性。
因此，在不同样品和细胞类型之间标准化的内部对照是PCR方案的合乎需要的特征。在某些实施方案中，本发明通过在组合物、方法和试剂盒中包括特异性针对给定细胞或病毒的一条或多条染色体上的独特序列的引物来涵盖此类内部对照。因为这些独特的基因组序列在每个单倍体基因组中仅存在一个拷贝(即每个细胞两个拷贝)，它们可用于为特定的扩增程序准备标准曲线。在测试样品的扩增反应中包含引物(在同一反应容器中或在包括相同组分的第二反应容器中)获得所述独特基因组序列的扩增曲线。这些曲线可以与每个引物组的标准曲线进行比较，可以计算出核酸的量，从而计算出原始样品中的细胞或病毒数量。有了这些知识，就可以确定许多不同样品中靶核酸的量，并与其他样品进行准确的比较。
在一些实施方案中，本发明的方法可用于使用本文所述的裂解缓冲液检测RNA或DNA病毒。例如，本发明的方法可用于检测RNA或DNA病毒，例如但不限于披膜病毒、冠状病毒、逆转录病毒、微小核糖核酸病毒、萼状病毒、呼肠孤病毒、正粘液病毒、副粘液病毒、弹状病毒、布尼亚病毒(buynavvirus)、沙粒病毒或纤维病毒(fibovirus)。在一些实施方案中，RNA病毒是冠状病毒，例如但不限于冠状SARS病毒，例如SARS CoV或SARS CoV-2或这些病毒的变体。在一个具体实施方案中，本发明的方法可用于检测SARS CoV-2。
因此，本发明还涉及一种用于鉴定感染SARS CoV-2的受试者的方法，该方法包括从获自受试者的生物样品中获得裂解物，逆转录裂解物中的RNA以获得cDNA，以及使用源自SARS CoV-2基因组核苷酸序列的一组引物对cDNA进行PCR测定。
引物
在本发明的方法中可以使用任何合适的引物。本领域技术人员可以根据待鉴定的目的靶核酸容易地鉴定合适的引物。可用于鉴定常见目的核酸的几种引物是可商购的并且可用于本发明的方法中。
在一些实施方案中，引物是针对RNA病毒基因组，例如SARS CoV-2基因组或SARSCoV-2变体的基因组。完整的SARS CoV-2基因组序列可在GenBank登录号MN908947.3中找到。用于检测SARS CoV的含有引物的试剂盒可从各个供应商处购买。应想到此类引物可用于本发明的方法中。在一些实施方案中，引物是针对E基因、N基因或RdRP基因。在一些实施方案中，引物是针对E基因并且包括SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9或其互补序列，或由SEQID NO:8和/或SEQ ID NO:9或其互补序列组成。在一些实施方案中，引物是针对RdRP基因并且包括SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12或其互补序列，或由SEQ ID NO:11和/或SEQ IDNO:12或其互补序列组成。
探针
在本发明的方法中可以使用任何合适的核酸探针。本领域技术人员可以根据待鉴定的目的靶核酸容易地鉴定合适的核酸探针。可用于鉴定常见目的核酸的几种探针是可商购的并且可用于本发明的方法中。
在一些实施方案中，核酸探针是针对RNA或DNA病毒基因组，例如SARS CoV-2基因组、SARS CoV-2变体的基因组。用于检测SARS CoV的含有核酸探针的试剂盒可从各个供应商处购得。应想到此类探针可用于本发明的方法中。在一些实施方案中，核酸探针是针对E基因、N基因或RdRP基因。在一些实施方案中，核酸探针是针对E基因并且包括SEQ ID NO:7或其互补序列，或SEQ ID NO:7或其互补序列其组成。在一些实施方案中，核酸探针是针对RdRP基因并且包括SEQ ID NO:10或其互补序列，或由SEQ ID NO:10或其互补序列组成。
在一些实施方案中，探针可以在5'和/或3'末端标记，例如用荧光团和/或猝灭剂。标签可以是任何合适的标签，例如HEX标签或BHQ1标签。
本文描述的RT-qPCR方案是基于标准的基于TaqMan的CoV-2诊断RT-qPCR方法。原则上，该方案可以变化，例如，可以测量其他病毒基因，可以使用不同的引物和探针序列、不同的主混合物、猝灭剂、荧光团、装置等。其他RT-qPCR方法(例如基于sybr green的方法)也可以用于本发明的方法中。
还提供了试剂盒。通常，试剂盒包含本发明的裂解缓冲液。试剂盒还可以包括一种或多种物质、材料、试剂等，这些物质、材料、试剂等可用于细胞或病毒的裂解、核酸或细胞裂解物的储存、或核酸的操作或分析，例如核酸的扩增。在一些实施方案中，试剂盒中包括裂解细胞或病毒、扩增核酸和/或纯化核酸所必需的一些或全部材料、试剂等。
例如，试剂盒可以包含容纳本发明的裂解缓冲液的容器，并且在同一或单独的容器中，包含至少一种用于扩增靶核酸的试剂。因此，其可以包括用于扩增靶核酸的至少一种引物(例如两种引物)。其还可以包括用于扩增靶核酸的至少一种其他引物，该靶核酸可以是但不必须是与试剂盒中的一种或多种其他引物的靶标相同的核酸(甚至相同核酸内的相同序列)。在一些实施方案中，试剂盒包括用于扩增一种或多种独特基因组序列的两种或多种引物。
本发明的试剂盒可以是用于分析核酸的试剂盒，还包括本发明的裂解缓冲液。例如，其可以是使用一步法RT-qPCR检测RNA的试剂盒，还包括至少一个含有本发明裂解缓冲液的容器。这样的试剂盒可以以包装组合形式包括至少一种逆转录酶、至少一种DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pfx DNA聚合酶、Tli DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶和klenow)、一种RNA酶抑制剂、核苷酸(例如，四种常见脱氧核苷酸中的任何一种或全部)、引物、探针或标记物(例如，SYBR green)，或这些中的两种或更多种的任何组合。或者，其可以是可用于使用两步RT-qPCR检测RNA的试剂盒。或者，该试剂盒可以是一种可用于使用PCR技术(例如qPCR)检测DNA的试剂盒。此外，该试剂盒可以是用于检测短干扰RNA(siRNA)的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括转染或转化试剂。
试剂盒可以在单个包装中或在同一试剂盒内的多于一个包装中包括组分。当一个试剂盒中包括一个以上的包装时，每个包装可以独立地包含单独一种组分或以任何合适组合方式的多个组分。如本文所使用的，单个试剂盒中的两个或更多个包装或容器的组合称为“包装组合”。试剂盒和试剂盒内的容器可以用任何已知材料制造。例如，试剂盒本身可以由塑料材料或纸板制成。容纳组分的容器可以是例如塑料材料或玻璃。一个试剂盒中的不同容器可以由不同的材料制成。在实施方案中，试剂盒可以在其中包含另一试剂盒。例如，本发明的试剂盒可以包括用于纯化核酸的试剂盒。
本发明的试剂盒可以包括可用于扩增靶序列的一种或多种组分。在实施方案中，进行PCR所必需的试剂和供应品(supply)中的一些或全部都包括在试剂盒中。在一些实施方案中，用于进行qPCR的试剂和供应品中的一些或全部都包括在试剂盒中。在其他实施方案中，用于进行RT-PCR的试剂和供应品中的一些或全部都包括在试剂盒中。试剂的非限制性示例是缓冲液(例如，含有Tris、HEPES等的缓冲液)、盐和模板依赖性核酸延伸酶(例如热稳定酶，例如Taq聚合酶)、适合酶活性的缓冲液、以及酶所需的额外试剂，例如dNTP、dUTP和/或UDG酶。供应品的非限制性示例是反应容器(例如，微量离心管(microfuge tube))。
试剂盒可以包括至少一种用于检测核酸的染料，包括但不限于dsDNA。在实施方案中，试剂盒包括检测dsDNA的序列非特异性染料，例如
Figure GDA0003983622480000211
Green染料(MolexularProbes,Eugene,OR)。染料优选地被单独包含在容器中。在实施方案中，染料作为浓缩储液提供，例如作为50X溶液。在实施方案中，试剂盒包括被动参考染料。在这些实施方案中，被动参考染料可以单独包括在试剂盒中的单独容器中。被动参考染料可以作为浓缩储液提供，例如作为1mM储液。非排他示例性被动参考染料是ROX染料。在实施方案中，试剂盒包含DNA检测染料或被动参考染料。在其他实施方案中，试剂盒同时包含DNA检测染料和被动参考染料。
通常，本发明适用于研究和诊断。也就是说，本发明的组合物和方法可用于鉴定各种核酸或表达基因的目的，或用于其他研究目的。同样，组合物和方法可用于诊断人和动物的多种疾病或病症。此外，它们还可用于鉴定患病或受污染的食品(例如，被一种或多种病原微生物感染的食品)，或样品中有毒物质或产毒微生物的存在。因此，该组合物和方法具有人类健康和兽医应用，以及食品检测和国土安全应用。
通过参考以下实施例可以更好地理解本发明，这些实施例并不意欲限制权利要求的范围。
实施例
材料和方法
使用手工艺棉头拭子(craft cotton swab，货号87104**260；Tamiya)收集鼻拭子，并转移至含有100μl裂解缓冲液的1.5ml反应管或深孔微量滴定板(3％Triton X-100、10％甘油、2mM DTT、25mM Na2HPO4、25mM TRIS HCL；pH 7,8)。裂解缓冲液在室温下储存，并在使用前用无RNA酶水(Invitrogen，无DNA酶/RNA酶的超纯蒸馏水，10977-035)按1:6稀释。使用当天：每100μl样品裂解体积加入0.1μl RNA酶抑制剂(NEB,M0314L,40U/μl)。
将拭子放入裂解缓冲液中后，压缩拭子以将样品释放到裂解缓冲液中并孵育5分钟。然后将样品保存在冰上以供直接使用或在-20℃(短期)或-80℃(长期储存)下冷冻。
使用前，将样品解冻(如有必要)并在室温下以12000rpm离心2分钟。离心后，将上清液转移到新的反应管或深孔微量滴定板中。在进行实时一步法RT-PCR之前，可以任选地在此阶段冷冻样品。
对于实时一步法RT-PCR测定，使用10μl多通道移液器或自动移液系统(例如CybiWell Vario,Analytik Jena)将2μl裂解物转移到384孔QPCR微孔板(
Figure GDA0003983622480000221
480Multiwell Plate 384white,4barcodes No.:05217555001)中。使用100μl多通道移液器或分液器添加8μl PCR MasterMix(Quantabio,UltraPlexTM 1-step
Figure GDA0003983622480000222
No.:95166-01K)。然后使用透明qPCR箔(MicroAmpTM Optical Adhesive Film,ThermoScientific,4311971)手动或使用热封机密封微孔板，并以1500rpm离心3分钟。使用LC480(Roche，384孔)进行一步法RT-PCR，并使用LC480软件分析数据。计算每个反应的循环阈值(CP或Cp)，其代表PCR扩增期间直到测量的荧光达到可以将荧光与背景荧光区分开的值的循环数。
探针/引物
CLDN1(基因ID:9076；claudin 1，人上皮细胞标志物)
CLDN1_探针：
5’_HEX-CAGGCTCTCTTCACTGGCTGGGC-BHQ1_3’(SEQ ID NO:1)
CLDN1_F1(正向引物)：5’-CCAGTCAATGCCAGGTACGA-3’(SEQ ID NO:2)
CLDN1_R1(反向引物)：5’-GAAGGCAGAGAGAAGCAGCA-3’(SEQ ID NO:3)
RPL32(基因ID：6161；核糖体蛋白L32；人管家基因)
RPL32_探针：
5’_HEX-AATTAAGCGTAACTGGCGGAAACCC-BHQ1_3’(SEQ ID NO:4)
RPL32_F1(正向引物)：5’-GCACCAGTCAGACCGATATGT-3’(SEQ ID NO:5)
RPL32_R1(反向引物)：5’-ACCCTGTTGTCAATGCCTCT-3’(SEQ ID NO:6)
E基因Sarbeco(E基因，SARS CoV2基因)
E_Gene Sarbeco_P1(探针)：
5'-Hex-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ-1-3‘(SEQ ID NO:7)
E_Gene Sarbeco_F1(正向引物)：
5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3‘(SEQ ID NO:8)
E_Gene Sarbeco_R2(反向引物)：
5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3‘(SEQ ID NO:9)
RdRP_SARSr(RdRP SARS CoV2基因；特异性针对SARS CoV2，不会检测SARS CoV)
RdRP_SARSr-P2(探针)：
5'-Hex-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-BHQ-1-3‘(SEQ ID NO:10)
RdRP_SARSr-F2(正向引物)：
5'-GTGARATGGTCATGTGTGGCGG-3'(SEQ ID NO:11)
RdRP_SARSr-R1(反向引物)：
5’-CARATGTTAAASACACTATTAGCATA-3‘(SEQ ID NO:12)
实施例1——上皮细胞的检测
用于上皮标志物CLDN1和人管家基因RPL32的RT qPCR是根据所描述的方案进行。简而言之，按照材料和方法中所述，收集来自十名健康人类志愿者的鼻拭子并进行裂解。裂解物直接用于RT qPCR而无需冷冻。对照样品仅包括拭子(不含样品的拭子)和NTC(无模板对照)。
包括CLDN1和RPL32探针和引物，使得反应中每个寡核苷酸的最终浓度为333nM。
PCR反应设置：2.5μl UltraPlex 1-step tough mix(4X)、2.5μl引物/探针混合物、2.0μl裂解的鼻样品等分试样、3.0μl无RNA酶水。
PCR方案：逆转录是在50℃下进行10分钟，然后在95℃下变性5分钟。45个循环：1分钟95℃+30秒60℃(或更优选地，15秒95℃)+1分钟60℃。循环后，在40℃下冷却30秒。
来自每个样品的扩增曲线在图1中提供并总结于图2中。这些数据举例说明，在不包括RNA提取步骤的情况下，可以从制备的鼻拭子样品中可靠地检测到基因。检测水平的变异性可归因于个体采样。
实施例2——通过RT qPCR检测病毒基因的灵敏度
使用的RT-qPCR方案如TIB MOLBIOL/Roche试剂盒手册中所述，但存在以下例外：使用了8分钟的RT步骤。任选地，使用UltraPlexTM 1-step
Figure GDA0003983622480000241
代替Roche RNAVirus Master Mix。该方案在下表1中提供。
表1.
Figure GDA0003983622480000242
测试了RT qPCR检测病毒RNA提取试剂盒(
Figure GDA0003983622480000243
Modular EAV RNAExtraction Control，TIB MOLBIOL Cat.No.58-0909-96)中常用的病毒阳性对照的灵敏度。这是一个典型的RT qPCR反应，其中病毒模板RNA以各种稀释度(无稀释、1:10、1:100、1:1000)添加到PCR混合物中。没有使用裂解物。测试了RT qPCR对该基因的灵敏度。扩增曲线如图3所示且数据在下表2中提供。
表2.
Pos Cp 浓度 平均CP ΔCP
I3 24,94 1x储液 25,01
I4 25,08 1x储液
I5 28,22 1/10 28,27 3,26
I6 28,32 1/10
I7 31,78 1/100 31,38 3,56
I8 31,88 1/100
I9 34,73 1/1000 34,84 3,01
I10 34,95 1/1000
I11 H<sub>2</sub>O
I12 H<sub>2</sub>O
RT qPCR检测三个CoV-2基因的灵敏度：E基因(TIB MOLBIOL货号53-0776-96)、N基因(TIB MOLBIOL货号53-0775-96)和RdRP-基因(TIB MOLBIOL货号53-0777-96)是使用与上述用于检测EAV阳性对照的相同方案进行。每个基因的各种浓度都包括在PCR混合物(2x储液、1x储液、1:10稀释、1:100稀释)中，对应于测试的约1000拷贝(2x)、500拷贝(1x)、50拷贝(1:10)和5拷贝(1:100)。
E基因检测的扩增曲线如图4所示且数据在下表3中提供。
表3.
Pos Cp 浓度 拷贝数 平均CP ΔCP
I3 28,69 2x储液 1000 28,87
I4 29,05 2x储液 1000
I5 30,29 1x储液 500 30,39 1,52
I6 30,49 1x储液 500
I7 33,46 1/10 50 33,30 2,91
I8 33,14 1/10 50
I9 35,16 1/100 5 37,04 3,74
I10 38,91 1/100 5
I11 H<sub>2</sub>O 0
I12 H<sub>2</sub>O 0
N基因检测的扩增曲线如图5所示且数据在下表4中提供。
表4.
Figure GDA0003983622480000251
Figure GDA0003983622480000261
检测专用于检测SARS CoV-2的RdRP-基因的扩增曲线如图6所示且数据在下表5中提供。
表5.
Pos Cp 浓度 拷贝数 平均CP ΔCP
I3 25,65 2x储液 1000 25,63
I4 25,61 2x储液 1000
I5 27,66 1x储液 500 27,34 1,71
I6 27,01 1x储液 500
I7 31,37 1/10 50 31,32 3,99
I8 31,27 1/10 50
I9 34,39 1/100 5 34,56 3,24
I10 34,73 1/100 5
I11 H<sub>2</sub>O 0
I12 H<sub>2</sub>O 0
实施例3——检测鼻拭子裂解物中的CoV-2基因
根据所述方案进行对实施例2中测试的两种病毒基因(E基因和RdRP基因)的RTqPCR。简而言之，按照材料和方法中所述，收集来自10名健康人类志愿者(S1-S10)的鼻拭子并进行裂解，向其中添加CoV-2RNA模板(TibMolBiol)(添加)。裂解物直接用于RT qPCR而无需冷冻。
对于每个样品S1-S10，进行了以下反应：1)E-基因_样品(未添加CoV-2 RNA模板；包括E-基因探针/引物)；2)E-基因_SpikeRNA(添加CoV-2 RNA模板；包括E基因探针/引物)；3)E-基因_PosCntlRNA(仅CoV-2 RNA模板；包括E基因探针/引物)；4)NTC_E-基因(无模板阴性对照)；5)RdRP-基因(未添加CoV-2 RNA模板；包括RdRP探针/引物)；6)RdRP-基因_SpikeRNA(添加CoV-2 RNA模板；包括RdRP-基因探针/引物)；7)RdRP-基因_PosCntlRNA(仅CoV-2 RNA模板；包括RdRP基因探针/引物)；和8)NTC_RdRP-基因(无模板阴性对照)。每个反应一式四份进行。
包括的E-基因探针和引物的最终浓度如下：E_基因Sarbeco_P1探针400nM，E_基因Sarbeco_F1正向引物400nM，E_基因Sarbeco_R2反向引物200nM，或更优选地，E_基因Sarbeco_P1探针200nM，E_基因Sarbeco_F1正向引物400nM，E_基因Sarbeco_R2反向引物400nM。
包括的RdRP探针和引物的最终浓度如下：RdRP_SARSr-P2探针600nM，RdRP_SARSr-F2正向引物800nM，RdRP_SARSrR1反向引物100nM，或更优选地，RdRP_SARSr-P2探针100nM，RdRP_SARSr-F2正向引物600nM，RdRP_SARSr-R1反向引物800nM。
PCR反应设置：2.5μl UltraPlex 1-step tough mix(4X)、2.5μl引物/探针混合物(4x)、0.25μl LightMix试剂盒的阳性对照RNA、2.0μl裂解的鼻样品等分试样、2.75μl无RNA酶水。在样品1)和5)中，未添加阳性对照RNA，而是添加了3.0μl无RNA酶水。
PCR方案：逆转录在50℃下进行10分钟，然后在95℃下变性5分钟。45个循环：1分钟95℃+30秒60℃(或更优选地，15秒95℃)+60秒60℃。循环后，在40℃下冷却30秒。
每个样品的扩增曲线在图7中提供并总结于图8中。数据在下表6中示出。
表6.
Figure GDA0003983622480000271
Figure GDA0003983622480000281
这些数据举例说明，可以可靠地检测到鼻拭子样品中的SARS CoV-2基因而不包括RNA提取步骤。将进行进一步的研究以证明存在于CoV-2感染患者的鼻拭子中存在的病毒RNA可以通过所述方法测量。
本说明书中引用的所有参考文献均通过引用的方式纳入本文，如同每个参考文献都具体地且单独地表明以引用的方式纳入本文一样。任何参考文献的引用是针对其在申请日之前的公开内容，不应被解释为承认本公开内容无权因在先发明而早于此类参考文献。
应当理解，上述每个元素或两个或多个元素一起也可以在不同于上述类型的其他类型的方法中找到有用的应用。无需进一步分析，前述内容将如此充分地揭示本公开内容的要点，以至于其他人可以通过应用现有知识，容易地将其适用于各种应用，而不会省略从现有技术的角度而言，完全构成在所附权利要求书中阐述的本公开内容的一般或特定方面的必要特征的特征。上述实施方案仅通过示例方式给出；本公开内容的范围仅由以下权利要求所限制。
序列表
<110> Bayer AG
<120> 使用RT-PCR的病毒感染的快速检测
<130> BHC201020
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CLDN1探针
<400> 1
caggctctct tcactggctg ggc 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CLDN1正向引物
<400> 2
ccagtcaatg ccaggtacga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CLDN1反向引物
<400> 3
gaaggcagag agaagcagca 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPL32探针
<400> 4
aattaagcgt aactggcgga aaccc 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPL32正向引物
<400> 5
gcaccagtca gaccgatatg t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPL32反向引物
<400> 6
accctgttgt caatgcctct 20
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E基因Sarbeco探针
<400> 7
acactagcca tccttactgc gcttcg 26
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E基因Sarbeco正向引物
<400> 8
acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E基因Sarbeco反向引物
<400> 9
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP SARS CoV2探针
<400> 10
caggtggaac ctcatcagga gatgc 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP SARS CoV2正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> R = G或A
<400> 11
gtgaratggt catgtgtggc gg 22
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RdRP SARS CoV2反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> R = G或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> S = G或C
<400> 12
caratgttaa asacactatt agcata 26

Claims (68)

1.一种检测RNA或DNA病毒的方法，包括将至少一种样品与裂解缓冲液接触以产生裂解物，在RNA病毒检测的情况下，逆转录裂解物中的RNA以获得cDNA，并使用源自RNA或DNA病毒核酸序列的一组引物扩增裂解物中来自RNA或DNA病毒的至少一种核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解缓冲液包括至少一种非离子表面活性剂、甘油和至少一种盐。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一种非离子表面活性剂具有亲水性聚环氧乙烷链和芳族烃亲脂性或疏水性基团。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述至少一种非离子表面活性剂是Triton X-100。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述裂解缓冲液包括约0.05％至约20％的量的非离子表面活性剂。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述盐是磷酸二钠。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述裂解缓冲液还包括以下中的一种或多种：Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、无RNA酶水、RNA酶抑制剂，及其混合物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述裂解缓冲液的pH为约7.5至约8.5。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述RNA病毒是冠状病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS CoV-2。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS CoV-2的变体。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该组引物是针对选自E基因、N基因和RdRP基因的病毒RNA基因。
13.根据权利要求12所述的方法，其中该组引物是针对E基因并且包括SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9或其互补序列，或由SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9或其互补序列组成。
14.根据权利要求13所述的方法，其中该组引物是针对RdRP基因并且包括SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12或其互补序列，或由SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12或其互补序列组成。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述方法不包括RNA提取步骤。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述裂解物直接用于逆转录。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述样品是生物样品。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述生物样品是使用拭子收集。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述生物样品是鼻拭子。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述至少一种样品包括至少一种人类细胞。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中将所述样品置于100μl裂解缓冲液中。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，进一步包括将所述裂解缓冲液和样品的混合物在室温下孵育5分钟以产生裂解物。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，进一步包括离心所述裂解物并收集上清液。
24.根据权利要求23所述的方法，其中将所述裂解物在室温下以12000rpm离心2分钟。
25.一种扩增一种或多种核酸的方法，包括使至少一种样品与裂解缓冲液接触以产生裂解物，并扩增裂解物中的至少一种核酸，其中所述裂解缓冲液包括至少一种非离子表面活性剂、甘油和至少一种盐。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一种非离子表面活性剂具有亲水性聚环氧乙烷链和芳族烃亲脂性或疏水性基团。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述至少一种非离子表面活性剂是TritonX-100。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述裂解缓冲液包括约0.05％至约20％的量的非离子表面活性剂。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中所述盐是磷酸二钠。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的方法，其中所述裂解缓冲液还包括以下中的一种或多种：Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)、无RNA酶水、RNA酶抑制剂，及其混合物。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的方法，其中所述至少一种样品是生物样品。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述生物样品是使用拭子收集。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述生物样品是鼻拭子样品。
34.根据权利要求25-33中任一项所述的方法，其中所述样品包括至少一种人类细胞。
35.根据权利要求25-34中任一项所述的方法，其中将所述样品置于100μl裂解缓冲液中。
36.根据权利要求25-35中任一项所述的方法，进一步包括将所述裂解缓冲液和样品的混合物在室温下孵育5分钟以产生裂解物。
37.根据权利要求25-36中任一项所述的方法，进一步包括离心所述裂解物并收集上清液。
38.根据权利要求37所述的方法，其中将所述裂解物在室温下以12000rpm离心2分钟。
39.根据权利要求25-38中任一项所述的方法，其中所述扩增裂解物中的至少一种核酸是通过PCR、qPCR、RT-PCR或RT-qPCR进行。
40.根据权利要求25-39中任一项所述的方法，其中所述扩增裂解物中的至少一种核酸是通过一步法RT-qPCR进行。
41.根据权利要求25-40中任一项所述的方法，其中所述方法不包括RNA提取步骤。
42.根据权利要求25-41中任一项所述的方法，其中所述裂解物直接用于扩增。
43.根据权利要求25-42中任一项所述的方法，其中所述至少一种核酸来自RNA病毒。
44.一种用于鉴定感染SARS CoV-2或SARS CoV-2变体的受试者的方法，包括从获自受试者的生物样品获得裂解物，逆转录裂解物中的RNA以获得cDNA，并使用源自SARS CoV-2基因组或SARS CoV-2变体基因组的核苷酸序列的一组引物对cDNA进行PCR测定。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述裂解物是通过使生物样品与包括至少一种非离子表面活性剂、甘油和至少一种盐的裂解缓冲液接触而获得。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述方法不包括RNA提取步骤。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的方法，其中所述裂解物直接用于逆转录。
48.一种扩增、鉴定、检测和/或分析靶核酸的方法，包括将样品与裂解缓冲液接触以产生裂解物，逆转录裂解物中的RNA以获得cDNA，并使用针对靶核酸的一组引物对cDNA进行PCR测定。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述裂解物是通过使样品与包含至少一种非离子表面活性剂、甘油和至少一种盐的裂解缓冲液接触而获得。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述方法不包括RNA提取步骤。
51.根据权利要求48-50中任一项所述的方法，其中所述裂解物直接用于逆转录。
52.一种包括裂解缓冲液的试剂盒，其中所述裂解缓冲液包括至少一种非离子表面活性剂、甘油和至少一种盐。
53.根据权利要求52所述的试剂盒，还包括至少一种用于扩增靶核酸的试剂。
54.根据权利要求52或53所述的试剂盒，包括用于扩增靶核酸的至少一种引物和/或至少一种探针。
55.根据权利要求52-54中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是用于使用一步法RT-qPCR检测RNA的试剂盒。
56.根据权利要求55所述的方法，包括至少一种逆转录酶、至少一种DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、核苷酸、引物、探针、标记物，或其任意组合中的一种或多种。
57.根据权利要求52-56中任一项所述的试剂盒，其中所述靶核酸来源于RNA病毒。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述RNA病毒是冠状病毒。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述RNA病毒是SARS CoV-2。
60.根据权利要求59所述的试剂盒，包括一组选自SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9或其互补序列、和SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12或其互补序列的引物。
61.一种裂解缓冲液，其包括1-5％Triton X-100和一种或多种以下组分：5-20％甘油、0.5-4mM DTT、10-50mM Na2HPO4和10-50mM Tris-HCl。
62.根据权利要求61所述的裂解缓冲液，其包括约3％Triton X-100和一种或多种以下组分：约10％甘油、约2mM DTT、约25mM Na2HPO4和约25mM Tris-HCl。
63.根据权利要求61或62所述的裂解缓冲液，其中所述裂解缓冲液的pH为约7.5至约8.0。
64.根据权利要求61-63中任一项所述的裂解缓冲液，还包括无RNA酶水。
65.根据权利要求64所述的裂解缓冲液，其中包括约1:15至1:1的量的无RNA酶水(裂解缓冲液:无RNA酶水)。
66.根据权利要求61-65中任一项所述的裂解缓冲液，还包括RNA酶抑制剂。
67.根据权利要求61-66中任一项所述的裂解缓冲液在用于扩增一种或多种核酸的方法中的用途，包括使至少一种样品与裂解缓冲液接触以产生裂解物，并扩增裂解物中的至少一种核酸。
68.根据权利要求61-66中任一项所述的裂解缓冲液在检测RNA病毒的方法中的用途，包括使至少一种样品与裂解缓冲液接触以产生裂解物，逆转录裂解物中的RNA以获得cDNA，并使用源自RNA病毒的核酸序列的一组引物扩增裂解物中来自RNA病毒的至少一种核酸。
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