JP2023521783A - Ｒｔ－ｐｃｒを用いたウイルス感染の迅速な検出 - Google Patents

Abstract

核酸の調製、保存、増幅および／または検出のワンステップ試薬として用いることができる、１種の非イオン性界面活性剤を含有する溶解緩衝液が提供される。本発明の溶解緩衝液の様々な実施形態は、細胞の溶解、核酸の保存、核酸の増幅、核酸の精製、核酸の検出、および／または核酸の分析のための他の手順に適合するかまたは有用な他の物質を含有する。細胞の迅速な溶解および得られた細胞溶解物のＲＴ－ＰＣＲにおける直接使用のためのものを含む、溶解緩衝液に基づく方法およびキットも提供される。

Description

電子的に提出された配列表の参照

電子的な提出により本出願と共に提供される配列表は明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて生物学的サンプルからウイルスＲＮＡを検出するための改善された方法に関する。

ウイルスＲＮＡを検出するためのいくつかの代表的なＲＴ－ＰＣＲ法では、ＲＮａｓｅを不活性化してＲＮＡを安定化させるために、高度な変性条件下で刺激の強い化学物質を含む溶解緩衝液中で生物学的サンプルを溶解し、続いてカラム精製により、後続のＲＴ－ＰＣＲを妨げる可能性があるこれらの化学物質を溶解緩衝液から除去することでＲＮＡを分離する必要がある。例えば、標準的なＴＲＩｚｏｌ ＲＮＡ調製キットに含まれる溶解緩衝液には、通常、ポリメラーゼ等のタンパク質を分解または変性させ、その後のＰＣＲ反応を阻害するチオシアン酸グアニジニウム、フェノールおよび／またはクロロホルム等の成分が含有されている。

これらの方法のいくつかの欠点は、工程が複数であること、感度が不足していること、時間がかかること、コストがかかること、および結果を得るための試薬が必要であることにある。

この技術的課題に対する解決策が、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態によって提供される。

本願は、細胞および／またはウイルスの溶解および核酸の分析に適した組成物を提供する。

いくつかの実施形態において、本願によれば、１種の非イオン性界面活性剤を含有する溶解緩衝液が提供される。本発明の溶解緩衝液の様々な実施形態は、細胞および／またはウイルスの溶解、核酸の保存、核酸の増幅、核酸の精製、核酸の検出、および／または核酸の分析のための他の手順に適合するかまたは有用である他の物質を含有する。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、核酸の調製、保存、増幅および／または検出のワンステップ試薬と考えることができる。

上記組成物に基づく方法およびキットも提供され、これには細胞の迅速な溶解および得られた細胞溶解物のＲＴ－ＰＣＲにおける直接使用のためのものが包含される。

いくつかの実施形態において、本願によれば、本発明の溶解緩衝液を用いて、少なくとも１つの細胞および／または少なくとも１つのウイルスを溶解する方法が提供される。溶解方法は、一般に、細胞またはウイルスを溶解させるのに十分な時間、少なくとも１つの細胞または少なくとも１つのウイルスを本発明の溶解緩衝液と接触させることを含む。様々な実施形態において、溶解物を用いる前に一定期間溶解物を保存する等の、任意の追加の工程が溶解する方法に含まれる。同様に、他の例示的な追加の工程は、細胞溶解物中の１種以上の核酸を増幅すること、および／または該核酸を検出することを含み得る。

驚くべきことに、本発明の単一の緩衝液が細胞およびウイルスの両方の溶解に適しており、核酸の増幅および検出をもたらす反応の従属構成要素（sub-component）として存在し得ることが見出された。例えば、本発明の緩衝液は、ウイルスに感染したヒト細胞または動物細胞等の細胞を溶解するのに好適であり得る。得られた溶解物は、核酸の増幅、検出および定量につながるその後の反応においてテンプレートとして直接用いることができる。別の実施形態において、本願によれば、１種以上の核酸を増幅する方法が提供される。一つの態様において、この方法は、生物学的サンプルと本発明の溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、および溶解物中の核酸を増幅することを含む。様々な実施形態において、核酸の増幅は、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲまたはＲＴ－ｑＰＣＲ等のＰＣＲ法による。特定の実施形態において、同時に行われている他の増幅反応に対して、または標準増幅曲線に対して、増幅される核酸の量の正規化を可能にするコントロール反応等の、１種以上のコントロール反応が含まれる。

本願によれば、キットも提供される。一般に、キットは本発明の溶解緩衝液を含む。キットは、細胞またはウイルスの溶解、核酸または溶解物の保存に用いることができるか、核酸の増幅、または核酸の検出もしくは定量化中に存在することできる、１種以上の物質、材料、試薬等をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞またはウイルスを溶解するため、核酸を増幅するため、および／または核酸を検出および／または定量するために必要な材料、試薬等の一部またはすべてがキットに含まれる。

サンプルと溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、および溶解物中の少なくとも１種の核酸を増幅することを含む、１種以上の核酸を増幅する方法における溶解緩衝液およびキットの使用も提供される。

サンプルと溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、ＲＮＡウイルス検出の場合には、溶解物中のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得ること、およびＲＮＡウイルスに由来するプライマーセットを用いて溶解物中のＲＮＡウイルスから少なくとも１種の核酸を増幅することを含む、ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスを検出するための方法における溶解緩衝液およびキットの使用も提供される。

一つの態様において、本発明は、少なくとも１つのサンプルと溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、ＲＮＡウイルス検出の場合には、溶解物中のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得ること、およびＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスの核酸配列に由来するプライマーセットを用いて溶解物中のＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスから少なくとも１種の核酸を増幅することを含む、ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスを検出する方法に関する。

特定の実施形態において、溶解緩衝液は、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、グリセロール、および少なくとも１種の塩を含有する。

特定の実施形態において、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤は、親水性ポリエチレンオキシド鎖および芳香族炭化水素の親油性基または疎水性基を有する。

特定の実施形態において、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００である。

特定の実施形態において、溶解緩衝液は、非イオン性界面活性剤を約０．０５％～約２０％の量で含有する。

特定の実施形態において、塩はリン酸二ナトリウムである。

特定の実施形態において、溶解緩衝液は、以下：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＲＮａｓｅ不含有水、ＲＮａｓｅ阻害剤およびそれらの混合物の１種以上をさらに含有する。

特定の実施形態において、溶解緩衝液のｐＨは約７．５～約８．５である。

特定の実施形態において、ＲＮＡウイルスはコロナウイルスである。

特定の実施形態において、コロナウイルスはＳＡＲＳ ＣｏＶ－２である。

特定の実施形態において、コロナウイルスはＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の変異体である。

特定の実施形態において、プライマーセットは、Ｅ遺伝子、Ｎ遺伝子およびＲｄＲＰ遺伝子からなる群から選択されるウイルスＲＮＡ遺伝子に対するものである。

特定の実施形態において、プライマーセットはＥ遺伝子に対するものであり、かつ配列番号８および／または配列番号９、またはその相補体を含むか、またはそれからなる。

特定の実施形態において、プライマーセットはＲｄＲＰ遺伝子に対するものであり、かつ配列番号１１および／または配列番号１２、またはその相補体を含むか、またはそれからなる。

特定の実施形態において、この方法は、ＲＮＡ抽出工程を含まない。

特定の実施形態において、溶解物は逆転写に直接用いられる。

特定の実施形態において、サンプルは生物学的サンプルである。

特定の実施形態において、生物学的サンプルはスワブを用いてて収集される。

特定の実施形態において、生物学的サンプルは鼻スワブである。

特定の実施形態において、少なくとも１つのサンプルは少なくとも１つのヒト細胞を含有する。

特定の実施形態において、サンプルを１００μｌの溶解緩衝液に配置される。

特定の実施形態において、この方法は、溶解緩衝液とサンプルとの混合物を室温で５分間インキュベートして溶解物を生成することをさらに含む。

特定の実施形態において、この方法は、溶解物を遠心分離し、上清を収集することをさらに含む。

特定の実施形態において、溶解物は室温で２分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離される。

さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つのサンプルと溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、および溶解物中の少なくとも１種の核酸を増幅することを含み、溶解緩衝液が少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、グリセロール、および少なくとも１種の塩を含む、１種以上の核酸を増幅する方法に関する。

特定の実施形態において、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤は、親水性ポリエチレンオキシド鎖および芳香族炭化水素の親油性基または疎水性基を有する。

特定の実施形態において、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００である。

特定の実施形態において、溶解緩衝液は、非イオン性界面活性剤を約０．０５％～約２０％の量で含有する。

特定の実施形態において、塩はリン酸二ナトリウムである。

特定の実施形態において、溶解緩衝液は、以下：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＲＮａｓｅ不含有水、ＲＮａｓｅ阻害剤およびそれらの混合物の１種以上をさらに含有する。

特定の実施形態において、少なくとも１つのサンプルは生物学的サンプルである。

特定の実施形態において、生物学的サンプルはスワブを用いて収集される。

特定の実施形態において、生物学的サンプルは鼻スワブである。

特定の実施形態において、サンプルは少なくとも１つのヒト細胞を含有する。

特定の実施形態において、サンプルは１００μｌの溶解緩衝液に配置される。

特定の実施形態において、この方法は、溶解緩衝液とサンプルとの混合物を室温で５分間インキュベートして溶解物を生成することをさらに含む。

特定の実施形態において、この方法は、溶解物を遠心分離し、上清を収集することをさらに含む。

特定の実施形態において、溶解物は室温で２分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離される。

特定の実施形態において、溶解物中の少なくとも１種の核酸を増幅することは、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲまたはＲＴ－ｑＰＣＲによって行われる。

特定の実施形態において、溶解物中の少なくとも１種の核酸を増幅することは、ワンステップＲＴ－ｑＰＣＲによって行われる。

特定の実施形態において、この方法は、ＲＮＡ抽出工程を含まない。

特定の実施形態において、溶解物は増幅に直接用いられる。

特定の実施形態において、少なくとも１種の核酸はＲＮＡウイルスに由来する。

さらなる態様において、本発明は、対象から得られた生物学的サンプルから溶解物を得ること、溶解物中のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得ること、およびｃＤＮＡをＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ゲノムのヌクレオチド配列またはＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の変異体のゲノムに由来するプライマーセットを用いたＰＣＲアッセイすることを含むＳＡＲＳ ＣｏＶ－２またはＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の変異体に感染した対象を同定する方法に関する。

特定の実施形態において、溶解物は、生物学的サンプルと少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、グリセロール、および少なくとも１種の塩を含有する溶解緩衝液とを接触させることによって得られる。

特定の実施形態において、この方法は、ＲＮＡ抽出工程を含まない。

特定の実施形態において、溶解物は逆転写に直接用いられる。

さらなる態様において、本発明は、サンプルと溶解緩衝液と接触させて溶解物を生成すること、溶解物中のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得ること、およびｃＤＮＡを標的核酸に対するプライマーセットを用いてＰＣＲアッセイすることを含む、標的核酸を増幅、同定、検出および／または分析する方法に関する。

特定の実施形態において、溶解物は、サンプルと少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、グリセロール、および少なくとも１種の塩を含有する溶解緩衝液とを接触させることによって得られる。

特定の実施形態において、この方法は、ＲＮＡ抽出工程を含まない。

特定の実施形態において、溶解物は逆転写に直接用いられる。

さらなる態様において、本発明は、溶解緩衝液を含むキットに関し、溶解緩衝液は、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、グリセロール、および少なくとも１種の塩を含有する。

特定の実施形態において、キットは、標的核酸の増幅のための少なくとも１種の試薬をさらに含む。

特定の実施形態において、キットは、標的核酸の増幅のための少なくとも１種のプライマーおよび／または少なくとも１種のプローブを含む。

特定の実施形態において、キットは、ワンステップＲＴ－ｑＰＣＲを用いたＲＮＡ検出用のキットである。

特定の実施形態において、キットは、少なくとも１種の逆転写酵素、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ヌクレオチド、プライマー、プローブ、標識の１種以上、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

特定の実施形態において、標的核酸はＲＮＡウイルスに由来する。

特定の実施形態において、ＲＮＡウイルスはコロナウイルスである。

特定の実施形態において、ＲＮＡウイルスはＳＡＲＳ ＣｏＶ－２である。

特定の実施形態において、キットは、配列番号８および／または配列番号９、またはその相補体、ならびに配列番号１１および／または配列番号１２、またはその相補体から選択されるプライマーセットを含む。

さらなる態様において、本発明は、１～５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と、以下の成分：５～２０％のグリセロール、０．５～４ｍＭのＤＴＴ、１０～５０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、および１０～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌの１種以上を含有する溶解緩衝液に関する。

特定の実施形態において、溶解緩衝液は、約３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と、以下の成分：約１０％のグリセロール、約２ｍＭのＤＴＴ、約２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、および約２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌの１種以上を含有する。

特定の実施形態において、溶解緩衝液のｐＨは約７．５～約８．０である。

特定の実施形態において、溶解緩衝液はＲＮａｓｅ不含有水をさらに含有する。

特定の実施形態において、ＲＮａｓｅ不含有水を約１：１５～１：１（溶解緩衝液：ＲＮａｓｅ不含有水）の量で含有する。

特定の実施形態において、溶解緩衝液はＲＮＡｓｅ阻害剤をさらに含有する。

さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つのサンプルと溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、および溶解物中の少なくとも１種の核酸を増幅することを含む、１種以上の核酸を増幅する方法における、本発明の溶解緩衝液の使用に関する。

さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つのサンプルと溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、溶解物中でＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得ること、およびＲＮＡウイルスの核酸配列に由来するプライマーセットを用いて溶解物中のＲＮＡウイルスから少なくとも１種の核酸を増幅することを含む、ＲＮＡウイルスを検出する方法における、本発明の溶解緩衝液の使用に関する。

特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、要求および必要な手数料の支払いに応じて、特許庁により提供される。

本開示の性質、目的および利点をさらに理解するために、以下の詳細な説明を参照し、同様の参照番号が同様の要素を示す以下の図面と併せて読まなければならない。

図１は、１０人のヒトの健康なボランティア（Ｓ１～Ｓ１０）の鼻スワブから得られたサンプル、サンプルなしのスワブ（スワブのみ、ネガティブコントロール）、およびテンプレートなしのサンプル（ＮＴＣ、ネガティブコントロール）における上皮マーカーＣＬＤＮ１およびヒトハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ３２のＲＴ－ｑＰＣＲの増幅曲線を示す。赤：ＲＰＬ３２；青：ＣＬＤＮ１。各サンプルの反応は４連で行った。

図２は、図１に示したデータの要約を提供する。各サンプル（Ｓ１～Ｓ１０およびネガティブコントロール）について、左側のバーはＣＬＤＮ１検出を示し、右側のバーはＲＰＬ３２検出を示す。サイクル閾値（ＣＴ）またはクロッシングポイント（ＣＰ）は、測定された蛍光が、蛍光をバックグラウンド蛍光と区別できる値に達するまでのＰＣＲ増幅中のサイクル数である。

図３は、標準ＲＮＡ抽出ウイルス陽性コントロール（ＥＡＶ）の検出に対するＲＴ－ｑＰＣＲの感度を示す増幅曲線を示す。

図４は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のＥ遺伝子の検出に対するＲＴ－ｑＰＣＲの感度を示す増幅曲線を示す。

図５は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のＮ遺伝子の検出に対するＲＴ－ｑＰＣＲの感度を示す増幅曲線を示す。

図６は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のＲｄＲＰ遺伝子の検出に対するＲＴ－ｑＰＣＲの感度を示す増幅曲線を示す。

図７は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の遺伝子（Ｅ遺伝子およびＲｄＲＰ遺伝子）が、合成ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２マーカーオリゴヌクレオチドでスパイクされた１０人の健康なヒトボランティア（Ｓ１～Ｓ１０）からの鼻スワブにおいて＜２０コピーの検出で検出され得ることを示す増幅曲線を示す。各サンプルの反応は４連で行った。

図８は、図７に示したデータの要約を提供する。各サンプル（Ｓ１～Ｓ１０およびネガティブコントロール）について、左側のバーはＥ遺伝子の検出を示し、右側のバーはＲｄＲＰ遺伝子の検出を示す。ＮＴＣ＝テンプレートなしのコントロール；ＰｏｓＣｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡ＝溶解物なしのコントロール；サイクル閾値（ＣＴ）またはクロッシングポイント（ＣＰ）は、測定された蛍光が、蛍光をバックグラウンド蛍光と区別できる値に達するまでのＰＣＲ増幅中のサイクル数である。

発明の詳細な説明

一つの態様において、本開示は、標的核酸を増幅、同定、検出、定量化および／または分析する方法であって、例えば、
（ａ）任意に細胞を含有しないか、または１種以上の細胞、例えば上皮細胞を含有するサンプルを得ること、
（ｂ）上記サンプルと本発明の溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、
（ｃ）任意に上記溶解物を凍結すること、
（ｄ）任意に上記溶解物を解凍して、任意に該溶解物を遠心分離すること、
（ｅ）遠心分離が必要な場合には、上清を回収して、反応チューブやマイクロタイタープレート等の新しい反応容器に移すこと、
（ｆ）任意に上記上清を凍結すること、
（ｇ）任意に上記上清を解凍すること、および
（ｈ）任意の適切な手段によって標的核酸を増幅、同定、検出および／または分析すること
を含む方法を提供する

いくつかの実施形態において、標的核酸の増幅、同定、検出および／または分析は、例えばＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ等のＰＣＲ技術を用いて行われる。ＰＣＲの方法はよく知られており、本発明の方法においては任意の適切な方法を用いることができる。

一つの態様において、標的核酸を増幅、同定、検出、定量化および／または分析することは、例えば、
（１）ｑＰＣＲプレート中で、ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、例えばｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘを、対象からの少なくとも１つのウイルスおよび／または１つ以上の細胞、例えば上皮細胞を溶解することによって得られた溶解物に添加すること、
（２）ｑＰＣＲ プレートを透明なｑＰＣＲホイルで密封すること、
（３）ｑＰＣＲプレートを遠心分離すること、
（４）ｑＰＣＲ等のＰＣＲを行うこと、および
（５）データを分析すること
を含む。

一つの態様において、任意の適切なＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘを用いることができる。ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ製剤を含むいくつかの市販のＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ製剤が入手可能であり、本発明において用いることができる。あるいは、ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘは、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドおよびマグネシウム等のＰＣＲ反応に必要な成分と、任意に逆転写酵素およびＲＮａｓｅ阻害剤とを混合することによって作成することができる。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘおよび溶解物は、５：１の比率（ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ：溶解物）で添加される。

一つの態様において、ｑＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＱＰＣＲリーダー（Ｒｏｃｈｅ製）を用いたワンステップＲＴ－ＰＣＲである。しかしながら、本発明の方法では、任意の適切なＰＣＲ機を用いることができる。

一つの態様において、データは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ソフトウェアを用いてデータを分析される。しかしながら、ＰＣＲデータを分析するために、任意の適切なソフトウェアを用いることができる。

一つの態様において、本明細書に記載のアッセイは、約２０コピー以下、約１０コピー以下、約５コピー以下、約４コピー以下、約３コピー以下、または約２コピー以下のサンプル内の標的核酸を検出するのに十分な感度を有する。

本明細書で用いられる「界面活性剤」の意味は、当業者によって容易に認識される最も広い定義である。すなわち、界面活性剤は、液体の表面張力を低下させ、かつ／または２つの液体間の界面張力を低下させる湿潤剤である。水中で正電荷も負電荷も有しないが、水に溶解する界面活性剤は「非イオン性界面活性剤」である。２種以上の非イオン性界面活性剤の組み合わせは、「非イオン性界面活性剤」という用語に包含される。

一つの態様において、本発明は、溶解緩衝液を特徴とする。驚くべきことに、本発明の溶解緩衝液は、細胞およびウイルスの溶解に適しており、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）および定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）等のＰＣＲ法による核酸の増幅のための反応混合物の成分として含有され得る。

溶解緩衝液は、細胞膜およびウイルス膜等の膜を破壊することができる少なくとも１種の界面活性剤を含有する。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤を含有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤は、親水性ポリエチレンオキシド鎖および芳香族炭化水素の親油性または疎水性基を有する。適切な非イオン性界面活性剤としては、限定されないが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０）、Ｃｏｎｃｏ ＮＩ、Ｄｏｗｆａｘ ９Ｎ、Ｉｇｅｐａｌ ＣＯ、Ｍａｋｏｎ、Ｎｅｕｔｒｏｎｙｘ ６００’ｓ、Ｎｏｎｉｐｏｌ ＮＯ、Ｐｌｙｔｅｒｇｅｎｔ Ｂ、Ｒｅｎｅｘ ６００’ｓ、Ｓｏｌａｒ ＮＯ、Ｓｔｅｒｏｘ、Ｓｅｒｆｏｎｉｃ Ｎ、Ｔ－ＤＥＴ－Ｎ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ、ＢＩＧＣＨＡＰ（Ｎ，Ｎ－ビス－（３－Ｄ－グルコンアミドプロピル）コールアミド）またはデオキシ－ＢＩＧＣＨＡＰ（Ｎ，Ｎ－ビス（３－グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミド）；デカノイル－Ｎ－メチルグルカミド；ｎ－デシルα－Ｄ－グルコピラノシド；ｎ－デシルβ－Ｄ－グルコピラノシド；ｎ－デシルβ－Ｄ－マルトピラノシド；ジギトニン；ｎ－ドデシルβ－Ｄ－グルコピラノシド；ｎ－ドデシルα－Ｄ－マルトシド；ｎ－ドデシルβ－Ｄ－マルトシド；ヘプタノイル－Ｎ－メチルグルカミド；ｎ－ヘプチルβ－Ｄ－グルコピラノシド；Ｎ－ヘプチルβ－Ｄ－チオグルコピラノシド；ｎ－ヘキシルβ－Ｄ－グルコピラノシド；１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール；ノナノイル－Ｎ－メチルグルカミド；ｎ－ノニルα－Ｄ－グルコピラノシド；ｎ－ノニルβ－Ｄ－グルコピラノシド；オクタノイル－Ｎ－メチルグルカミド；ｎ－オクチルα－Ｄ－グルコピラノシド；ｎ－オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド；オクチルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド；オクチルβ－Ｄ－チオグルコピラノシド；ポリオキシエチレンエステル（８－ステアリン酸ポリオキシエチレンエステル（Ｍｙｒｊ ４５）、４０－ステアリン酸ポリオキシエチレンエステル（Ｍｙｒｊ ５２）、５０－ステアリン酸ポリオキシエチレンエステル（Ｍｙｒｊ ５３）、１００－ステアリン酸ポリオキシエチレンエステル（Ｍｙｒｊ ５９）等））、ポリオキシエチレンエーテル（１つ以上のエチル基、メチル基、ペンチル基、セチル基、ステアリル基、オレイル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ラウリル基、ミリスチル基、ヘプチル基、トリデシル基、イソヘキサデシル基、およびこれらの組み合わせ等）；ポリオキシエチレンソルビタンエステル（１つ以上のモノラウレート基、モノオレエート基、モノパルミテート基、モノステアレート基、トリオレエート基およびトリステアレート基、ならびにそれらの組み合わせを含むもの等であり、限定されないが、「Ｔｗｅｅｎ」シリーズの界面活性剤）；ソルビタンエステル（１つ以上のモノラウレート基、モノオレエート基、モノパルミテート基、モノステアレート基、セスキオレエート基、トリオレエート基、トリステアレート基、およびそれらの組み合わせを含むもの等）；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ；ｎ－テトラデシルβ－Ｄ－マルトシド；限定されないが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）およびその誘導体、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－４０５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１０１、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ－４２、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ－５７、トリトン Ｎ－６０、トリトン Ｘ－１５、トリトン Ｘ－３５、トリトン Ｘ－４５、トリトン Ｘ－１０２、トリトン Ｘ－１５５、トリトン Ｘ－１６５、トリトン Ｘ－２０７、トリトン Ｘ－３０５、トリトン Ｘ－７０５－７０およびトリトン Ｂ－１９５６を含むＴｒｉｔｏｎシリーズの界面活性剤；ノニルフェニルポリエチレングリコール（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０；ＮＰ－４０、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ６３０）；Ｓｕｒｆｙｎｏｌ １０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ ４２０、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ ４４０、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ ４６５、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ ４８５、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ ５０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ ＰＳＡシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ ＳＥシリーズ、Ｄｙｎｏｌ ６０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ ＤＦシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ ＣＴシリーズおよびＳｕｒｆｙｎｏｌ ＥＰシリーズ、例えばＳｕｒｆｙｎｏｌ １０４シリーズ（１０４、１０４Ａ、１０４ＢＣ、１０４ＤＰＭ、１０４Ｅ、１０４Ｈ、１０４ＮＰ、１０４ＰＡ、１０４ＰＧ５０、１０４Ｓ）、およびＳｕｒｆｙｎｏｌ ２５０２を含む、Ａｉｒ ＰｒｏｄｕｃｔｓシリーズのＳｕｒｆｙｎｏｌ界面活性剤；Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ；ｎ－ウンデシルβ－Ｄ－グルコピラノシド、および任意の非イオン性オクチルフェノールエトキシレート界面活性剤が挙げられる。さらなる非限定的な例としては、限定されないが、ＤＯＷＦＡＸ ６３Ｎ１０、ＤＯＷＦＡＸ ６３Ｎ１３、ＤＯＷＦＡＸ ６３Ｎ３０、ＤＯＷＦＡＸ６３Ｎ４０、ＤＯＷＦＡＸ ８１Ｎ１３、ＤＯＷＦＡＸ ８１Ｎ１５、ＤＯＷＦＡＸ ９２Ｎ２０、ＤＯＷＦＡＸ １００Ｎ１５、ＤＯＷＦＡＸ ＥＭ－５１、ＤＯＷＦＡＸ ２０Ａ４２、ＤＯＷＦＡＸ ２０Ａ６４、ＤＯＷＦＡＸ ２０Ａ６１２、ＤＯＷＦＡＸ ２０Ｂ１０２、ＤＯＷＦＡＸ ＤＦ－１０１、ＤＯＷＦＡＸ ＤＦ－１１１、ＤＯＷＦＡＸ－ＤＦ１１２、ＤＯＷＦＡＸ ＤＦ－１１３、ＤＯＷＦＡＸ ＤＦ－１１４、ＤＯＷＦＡＸ ＤＦ－１１７、ＤＯＷＦＡＸ ＷＰ－３１０、ＤＯＷＦＡＸ ５０Ｃ１５、ＤＯＷＦＡＸ ＤＦ－１２１、ＤＯＷＦＡＸ ＤＦ－１２２、ＤＯＷＦＡＸ ＤＦ－１３３、ＤＯＷＦＡＸ ＤＦ－１４１、ＤＯＷＦＡＸ ＤＦ－１４２およびＤＯＷＦＡＸ ＤＦ－１６１を含む、ＮシリーズおよびＤＰシリーズの界面活性剤等のＤｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社のＤｏｗｆａｘシリーズの非イオン性界面活性剤が挙げられる。さらなる他の非限定的な例としては、限定されないが、１０Ｒ５、１７Ｒ２、１７Ｒ４、２５Ｒ２、２５Ｒ４、３１Ｒ１、Ｆ１０８シリーズ、Ｆ１２７シリーズ、Ｆ３８シリーズ、Ｆ６８シリーズ、Ｆ７７シリーズ、Ｆ８７シリーズ、Ｆ８８シリーズ、Ｆ９８シリーズ、Ｌ１０、Ｌ１０１、Ｌ１２１、Ｌ３１、Ｌ３４、Ｌ４３、Ｌ４４シリーズ、Ｌ６１、Ｌ６２シリーズ、Ｌ６４、Ｌ８１、Ｌ９２、Ｎ－３、Ｐ１０３、Ｐ１０４、Ｐ１０５、Ｐ１２３、Ｐ６５、Ｐ８４、Ｐ８５およびＦ１２７を含む、ＢＡＳＦ社のＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの界面活性剤が挙げられる。

任意の適切な量の界面活性剤および／または非イオン性界面活性剤を溶解緩衝液に含有させることができる。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００等の非イオン性界面活性剤を、約０．０５％～約２０％の量で含有する。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、約０．０５％～約１５％、約０．０５％～約１０％、約０．０５％～約７％、約０．０５％～約５％、約０．０５％～約５％、約０．０５～約４％、約０．０５％～約３％、約０．０５％～約２％、約０．０５％～約１％、または約０．０５％～約０．５％含有する。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、約０．１％～約１５％、約０．１％～約１０％、約０．１％～約７％、約０．１％～約５％、約０．１％～約５％、約０．１～約４％、約０．１％～約３％、約０．１％～約２％、または約０．１％～約１％含有する。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、約０．５％～約１５％、約０．５％～約１０％、約０．５％～約７％、約０．５％～約５％、約０．５％～約１０％、約０．５～約４％、約０．５％～約３％、または約０．５％～約２％が丹生する。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００等の非イオン性界面活性剤を、約１％～約１５％、約１％～約１０％、約１％～約７％、約１％～約５％、約１％～約４％、約１％～約３％、または約１％～約２％含有する。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００等の非イオン性界面活性剤を、約２％～約１５％、約２％～約１０％、約２％～約７％、約２％～約５％、約２％～約４％、または約２％～約３％含有する。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００等の非イオン性界面活性剤を、約３％～約１５％、約３％～約１０％、約３％～約７％、約３％～約５％、または約３％～約４％を含有する。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００等の非イオン性界面活性剤を、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、または約１５％含有する。

溶解緩衝液は、１種以上の他の成分を含有してもよく、それらの成分は、本明細書に開示される例示的な成分によって限定されず、溶解緩衝液は、典型的には、水等の溶媒、グリセロール等の有機溶媒、またはそれらの両方を含有する。用いられる溶媒は可能な限り純粋であることが好ましいが、任意の純度の溶媒を用いることができる。したがって、溶解緩衝液に水が含有される場合、該水は蒸留水、再蒸留水、脱イオン水、滅菌水、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。水または任意の他の溶媒または水と任意の他の溶媒の組み合わせである溶媒は、その使用前に、限定されないが、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ）活性等の、１種以上の化学的活性または生物学的活性が低減されるか、または失われるように処理されてもよい。例えば、水または任意の他の溶媒、または水と任意の他の溶媒との組み合わせは、ＲＮａｓｅ不含有であり得る。同様に、溶解緩衝液は、組成物を滅菌するか、または１種以上の望ましくない化学的活性または生化学的活性（例えば、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ等）を低減させるか、または失わせるために、滅菌技術または化学薬品または生物学的製剤等で処理することができる。例えば、溶解緩衝液はＲＮａｓｅ阻害剤を含有し得る。

本発明の溶解緩衝液はまた、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、またはこれらの塩の２種以上の組み合わせ等の１つ以上の塩を含有してもよい。具体的な塩の例としては、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガンおよび塩化カリウムが挙げられる。塩は、限定されないが、細胞またはウイルスの溶解を補助するために、界面活性剤の曇り点および泡レベルを緩和するため、ならびに核酸の増幅に関与する試薬の機能を改善するためを含み、任意の適切な量および任意の理由で添加することができる。

本発明の溶解緩衝液はまた、限定されないが、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ等の、核酸増幅に含めるのに適した１種以上の緩衝液を含有してもよい。

本発明の溶解緩衝液はまた、１種以上の還元剤を含有してもよい。還元剤は、結合（ジスルフィド結合等）を切断するのに役立ち、ＲＮＡの二次構造を緩め、転写の逆転写酵素（ＲＴ）酵素開始を促進する。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の任意の適切な還元剤を溶解緩衝液に含有させることができる。

理論に拘束されることを望むものではないが、本発明の溶解緩衝液は、感染細胞（上皮細胞等）およびウイルスの両方の溶解におそらく必要である。ＲＴ－ＰＣＲ等の後続のＰＣＲ反応を妨げない限り、任意の適切な溶解緩衝液を用いることができる。

溶解緩衝液のｐＨは、任意の適切なｐＨであり得る。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液のｐＨは、約６．５～約８．５、または約７．０～約８．５である。例えば、溶解緩衝液のｐＨは、約７．５～約８．５まで、または約７．５～約８．０までであり得る。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液のｐＨは、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、または約８．５である。

本発明の溶解緩衝液は、濃縮ストック溶液として提供され得る。例えば、濃縮原液は、１００×原液、５０×原液、２０×原液、１０×原液、５×原液、または２×原液として処方することができる。

本発明の溶解緩衝液は、予め作製されてもよく、任意に使用前に希釈されてもよい。溶解緩衝液は、その後のＲＴ－ＰＣＲを妨げない任意の適切な希釈剤で希釈することができる。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液は、使用前に水で希釈される。他の実施形態において、溶解緩衝液は、例えば輸送／保存媒体等の媒体で希釈される。溶解緩衝液は、任意の適切な比率で希釈することができる。例えば、溶解緩衝液は、１００：１、５０：１、２５：１、２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：４０、１：５０、または１：１００（溶解緩衝液：希釈液）で希釈することができる。

一つの態様において、本発明の溶解緩衝液は、１～５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と、以下の成分：５～２０％のグリセロール、０．５～４ｍＭのＤＴＴ、１０～５０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、および１０～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌの１種以上とを含有する濃縮ストックであってもよい。いくつかの実施形態において、本発明の溶解緩衝液は、約３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と、以下の成分：約１０％のグリセロール、約２ｍＭのＤＴＴ、約２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、および約２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌの１種以上とを含有する濃縮ストックであってもよい。濃縮ストックのｐＨは、約７．５～約８．０であり得、好ましくは約７．８であり得る。

濃縮ストックは、使用前にＲＮａｓｅ不含有水等の希釈剤で希釈することができる。いくつかの実施形態において、濃縮ストックは、使用前にＲＮａｓｅ不含有水で１：１５～１：１に希釈することができる。いくつかの実施形態において、濃縮ストックは、使用前にＲＮａｓｅ不含有水で１：６に希釈することができる。

いくつかの態様において、ＲＮａｓｅ阻害剤は、使用前に溶解緩衝液に添加される。いくつかの実施形態において、ＲＮａｓｅ阻害剤は、使用前に約１：１００～約１：１００００の量で溶解緩衝液に添加される。いくつかの実施形態において、ＲＮａｓｅ阻害剤は、使用前に約１：１０００の量で溶解緩衝液に添加される。

方法

一つの態様において、本発明によれば、本発明の溶解緩衝液を用いて少なくとも１つの細胞またはウイルスを溶解する方法が提供される。この方法は、少なくとも１つの細胞またはウイルスと本発明の組成物とを、該細胞またはウイルスを溶解させるのに十分な時間接触させることを含む。

細胞は、任意の真核細胞であり得る。細胞は、限定されないが、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、爬虫類細胞および昆虫細胞を含む任意の目的の細胞であり得る。例えば、細胞は、ヒト細胞、サル細胞、ラット細胞、マウス細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、カエル細胞、昆虫細胞等であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は上皮細胞である。

「少なくとも１つの細胞」とは、単一の細胞だけでなく、単一のタイプの細胞も意味する。したがって、２つ以上の細胞は、同じタイプの細胞の２つ以上の細胞だけでなく、２つの異なるタイプの細胞の１つ以上の細胞を意味し得る。別段の明記がない限り、単一のタイプの細胞の集団が存在するか、２つ以上のタイプの細胞の集団が存在するかは関係ない。それにもかかわらず、本発明の方法（以下に論じるものを含む）は、記載された効果を提供する。

さらに、「少なくとも１つの細胞」および「細胞」という用語は、別段の記載がない限り、本明細書においては、単一の細胞、単一のタイプの細胞の集合、または各細胞のタイプの細胞が少なくとも１つ存在する複数のタイプの細胞の集合を定義するために互換的に用いられる。

同様に、「少なくとも１つのウイルス」および「ウイルス」という用語は、別段の記載がない限り、本明細書においては、単一のウイルス、単一のタイプのウイルスの集合、または各タイプのウイルスが少なくとも１つ存在する複数のタイプのウイルスの集合を定義するために互換的に用いられる。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞または少なくとも１つのウイルスが生物学的サンプル中に存在する。

いくつかの態様において、生物学的サンプルはスワブを用いて収集される。例えば、スワブを用いて、鼻、頬、咽頭または口等の任意の粘膜から生物学的サンプルを収集することができる。一つの態様において、スワブを用いて、目的の細胞、例えば上皮細胞が位置する任意の場所からサンプルを収集することができる。特定の実施形態において、生物学的サンプルは鼻スワブである。別の実施形態において、生物学的サンプルは、体液（鼻咽頭吸引液、痰、唾液、尿、血液等）、排泄物、洗浄液等である。

生物学的サンプルは、任意の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに由来するものであり得る。

例えば、液体サンプルおよび表面からのスミア等の他のタイプのサンプルも、本発明の方法で用いることができる。

サンプルは、溶解前に任意の適切な手段によって保存することができる。保存方法は、サンプルの種類および保存期間によって異なり得る。例えば、生物学的サンプルは、室温（例えば、２２～２５℃）で保存するか、氷上に静置するか、または短期保存のために冷蔵（例えば、４℃）することができ、長期保存のために冷凍することができる。凍結生体サンプルは、－２０℃、－８０℃、または液体窒素等で保存することができる。

いくつかの実施形態において、生物学的サンプル等のサンプルは、任意の適切な温度で任意の適切な時間保存するために輸送媒体または保存媒体に入れられる。

任意に少なくとも１つの細胞を含有するサンプルと本発明の溶解緩衝液とを接触させる時間は変動し得、当業者によって決定され得る。いくつかの実施形態において、サンプルと本発明の溶解緩衝液とを接触させる時間は、少なくとも１つの細胞またはウイルスが溶解するのに十分な時間である。溶解反応の化学的性質により、時間が、１秒以下のように非常に短くなることが想定される。しかしながら、時間はそれほど制限される必要はない。実際、溶解緩衝液はその後の核酸の保存および／または増幅中に存在する可能性があるため、溶解時間は比較的長くなり得る。適切な時間は、１秒以下から、数分、数時間、または数日の範囲である。接触時間の例としては、限定されないが、１０秒、１５秒、２０秒、２５秒、３０秒、３５秒、４０秒、４５秒、５０秒、５５秒、１分、９０秒、２分、５分、１０分、２０分、３０分、またはそれ以上が挙げられる。

様々な実施形態において、任意の追加の工程が溶解方法に含まれる。本発明の溶解緩衝液を用いることにより、追加の工程なしで細胞またはウイルスの溶解が起こることが示された。しかしながら、溶解を促進するために、細胞および／またはウイルスを１種以上の機械的破壊手法にかけてもよい。限定されないが、ボルテックス、反復ピペッティング、反転、振とうおよび撹拌を含む任意の既知の機械的破壊手法を用いることができる。したがって、溶解は、少なくとも部分的にホモジナイズすることによって達成することができる。溶解物の最終的な用途に応じて、機械的手法が用いられる場合は、核酸に対するせん断応力を最小限に抑えるために穏やかに適用され得る。いくつかの実施形態において、溶解は、少なくとも部分的に、生物学的または生化学的物質の作用によって達成することができる。例えば、溶解は、プロテイナーゼＫ等のプロテイナーゼの存在下で行うことができる。

本発明の方法において、任意の適切な量の溶解緩衝液を用いることができ、サンプルに応じて変えることができる。いくつかの実施形態において、約５０μｌ、約１００μｌ、約２００μｌまたはそれ以上の量の溶解緩衝液が用いられる。いくつかの実施形態において、１００μｌの量の溶解緩衝液が用いられる。

溶解物を凍結することにより、細胞および／またはウイルスの溶解を改善することができる。したがって、いくつかの実施形態において、溶解物は、分析前に任意に凍結することができる。溶解物は１回または複数回凍結され得る。換言すれば、溶解物は、１回または複数回の凍結融解サイクルに供され得る。溶解物を凍結するために、任意の適切な条件を用いることができる。温度および持続時間は、サンプルのサイズおよびタイプ、ならびに溶解物の量等の様々な要因に応じて最適化できることが理解される。いくつかの実施形態において、溶解物は、分析前に－２０℃以下の温度でインキュベートされる。例えば、溶解物は、限定されないが、分析前に約－２０℃、約－８０℃または約－１２０℃から選択される温度でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態において、溶解物は分析前にドライアイス上に静置される。溶解物は、任意の適切な時間、上記のようにインキュベートすることができる。いくつかの実施形態において、溶解物は、－２０℃以下の温度で少なくとも約１０分間インキュベートすることができる。例えば、溶解物は、－２０℃以下の温度で、約１０分、約３０分、約１時間もしくは約２４時間、またはそれ以上インキュベートすることができる。いくつかの実施形態において、溶解物は、分析前に－８０℃の温度で１０分間インキュベートされる。

溶解方法のもう１つの任意の工程は、使用前に一定期間溶解物を保存することである。そのような実施形態において、溶解物は、任意の温度で保存することができる。例えば、溶解物は、比較的高温（例えば、３７℃）、室温（例えば、２２℃～２５℃）、冷蔵庫内（例えば、４℃）、冷凍庫内（例えば、－２０℃）または深冷凍庫（例えば、－８０℃以下）で保存することができる。

溶解方法はまた、細胞および／またはウイルス成分を他の細胞および／またはウイルス成分から分離する１種以上の工程を含んでもよい。したがって、例えば、この方法は、溶解物を遠心分離して、溶解していない細胞および／またはウイルス、細胞および／またはウイルスの膜およびタンパク質を核酸から除去することを含み得る。好ましくはないが、例えば、１種以上の塩、有機溶媒（例えば、アルコール）の添加、または熱処理およびその後の遠心分離による、１種以上の細胞成分またはウイルス成分の他のものからの沈殿も含み得る。細胞および／またはウイルス成分を互いに分離するための他の技術は当業者に知られており、任意の適切な技術を用いることができ、それぞれが所望の結果に基づいて選択される。適切な技術の選択および実行は、十分に当業者の技術レベルの範囲内である。

溶解方法はまた、１種以上の溶解物成分の操作を含んでもよい。したがって、この方法は、溶解物からの１種以上の核酸の精製および／または溶解物からの１種以上の核酸の増幅を含み得る。溶解方法の様々な実施形態には、溶解物において用いられることが知られているあらゆる手順が含まれる。

一つの実施形態において、少なくとも１つの細胞および／または少なくとも１つのウイルスを溶解する方法は、本発明の溶解緩衝液を該少なくとも１つの細胞および／または少なくとも１つのウイルスに添加することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、溶解緩衝液と少なくとも１つの細胞および／または少なくとも１つのウイルスとの混合物を室温で５分間インキュベートすることをさらに含む。

別の実施形態において、サンプルを溶解する方法が提供され、この方法は、サンプルと本発明の溶解緩衝液とを混合することを含む。いくつかの実施形態において、サンプルは生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、鼻スワブ等のスワブである。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、上皮細胞等の少なくとも１つの細胞および／またはコロナウイルス等の少なくとも１つのウイルスを含有する。いくつかの実施形態において、鼻スワブは、本発明の溶解緩衝液１００μｌに配置される。いくつかの実施形態において、この方法は、鼻スワブを絞ってサンプルを溶解緩衝液中に放出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、溶解緩衝液と生物学的サンプルとの混合物を室温で５分間インキュベートして溶解物を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、溶解物を、例えば室温で２分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を収集することをさらに含む。

本発明によれば、１種以上の核酸を増幅する方法も提供される。一般に、この方法は、サンプルと本発明の溶解緩衝液とを接触させて上述した溶解物を生成すること、該溶解物中の少なくとも１種の核酸を増幅することを含む。

核酸の増幅のための多数の技術が知られており、当技術分野で広く行われており、これらの技術のいずれも本発明の方法に従って適用可能である。当業者であれば、限定されないが、特定のタイプの核酸（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ）の増幅における速度、感度、有用性、および信頼性を含む任意の数の考慮事項に基づいて増幅方法を選択し得る。

この方法は、核酸の単離または（少なくともある程度までの）精製を含み得るが、驚くべきことに、標的核酸の増幅は、核酸を予め精製することなく達成され得ることが発見された。したがって、本発明の溶解物は、直接核酸増幅するのに適している。いくつかの実施形態において、増幅はＰＣＲ技術による。特定の実施形態において、ＰＣＲ技術は、ｑＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲを含む）である。

目的の核酸が１種以上のＲＮＡがである場合、この方法は、増幅前または増幅時のｃＤＮＡ合成を含んでもよい。多数のｃＤＮＡ合成プロトコルが当技術分野で知られており、任意の適切なプロトコルを用いることができる。例えば、ＱｕａｎｔａｂｉｏのｑＳｃｒｉｐｔ ＸＬＴ逆転写酵素を用いて、ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを調製することができる。

本発明の方法は、鼻スワブ等の哺乳動物の生物学的サンプルまたは非生物学的サンプル中のウイルスＲＮＡまたはＤＮＡを検出するために用いるのに特に適していることが示されている。

本発明の方法は、従来のウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ検出アッセイよりも優れたいくつかの利点を提供する。例えば、本発明の方法は、ＲＮＡ抽出工程の必要性を回避し、それによって労力を削減し、本発明の方法はより速くなる。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＳＰ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）等のＲＮＡ抽出キットは、現在、米国疾病予防管理センター（ＣＤＣ）がＣＯＶＩＤ－１９の検査のために必要としており、通常、増幅方法を妨げる可能性のあるコンポーネントから核酸を分離および精製するためのカラムが含まれている。したがって、ＲＮＡ抽出工程が不要になると、カラムが不要になるため、材料の消費量も少なくなる。さらに、ＲＮＡ抽出に必要な試薬は常に容易に入手できるとは限らないため、これらの試薬を用いないことでアッセイの可用性が向上する。これは、例えば、大量の検査サンプルを分析して迅速な結果を得る必要がある場合等、パンデミック時に特に重要になる可能性がある。正確かつ高感度なウイルスＲＮＡを検出するためのハイスループットで迅速な方法の提供は、大きな利点である。

本発明の方法は、好ましくは、生物学的サンプルまたは非生物学的サンプル（例えば、鼻スワブ）を溶解緩衝液と共にインキュベートすること、溶解物を直接ＲＴ－ＰＣＲ（例えば、ワンステップＲＴ－ｑＰＣＲ）に用いることを含む。本発明の方法は、好ましくは、ＲＮＡ抽出工程またはＤＮＡ抽出工程なしで行われる。

いくつかの実施形態において、同時に行われる他の増幅反応に対して、または標準増幅曲線に対して、増幅される核酸の量の正規化を可能にするコントロール反応（control reaction）等の、１つ以上のコントロール反応が含まれる。そのようなコントロール反応は、１つ以上の外因性核酸を反応物に転嫁すること、およびその核酸に対して増幅を行うことを含み得る。あるいは、コントロール反応は、目的の細胞または生物学的サンプルに天然に存在する核酸に存在する配列を増幅することを含み得、そのような配列は既知のコピー数および増幅効率を有する。他の実施形態において、既知の配列のコントロール反応は、目的の増幅が行われている反応容器とは別の反応容器で行われる。他の様々なコントロール反応が知られており、増幅反応に広く用いられており、これらのコントロール反応のいずれかを本発明の方法に含めて、増幅プロセスの１つ以上の工程の成功および効率を決定することができる。

いくつかの実施形態において、コントロール反応は、実施者が特定の細胞溶解物サンプル中に存在する細胞の数を評価し、したがって必要に応じて正規化することを可能にする内部コントロールである。このようにして、サンプル中の標的核酸（例えば、特定のウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ遺伝子）の量についての結論を得ることができる。より具体的には、２種の異なるサンプルの増幅結果を比較する場合、多くの場合、元のサンプルに含有される細胞またはウイルスの数、溶解に成功した細胞またはウイルスの数、または各サンプルから遊離した核酸の総量を、高い精度で決定することはできない。したがって、異なるサンプル中の標的核酸の総量を正確に比較することはできない。現在、ハウスキーピング遺伝子またはｒＲＮＡ種は、様々な細胞または組織に由来するサンプルを標準化または正規化するためのマーカーとして用いられている。しかしながら、現在用いられている内部標準は一貫性がなく、そのため内部コントロール（internal control）に必要な精度と再現性を得ることができないと報告されている。

したがって、異なるサンプルおよび細胞タイプ間で標準化された内部コントロールは、ＰＣＲプロトコルの望ましい特徴である。特定の実施形態において、本発明は、組成物、方法およびキットの中に、所定の細胞またはウイルスの１つ以上の染色体上の固有の配列に特異的なプライマーを含めることによって、そのような内部コントロールを包含する。これらの固有のゲノム配列は、一倍体ゲノムあたり１コピー（すなわち、細胞あたり２コピー）しか存在しないため、特定の増幅手順の検量線を作成するために用いることができる。試験サンプルの増幅反応（同じ反応容器または同じ成分を含む第２の反応容器のいずれか）にプライマーを含めることにより、固有のゲノム配列の増幅曲線を得ることができる。これらの曲線は、各プライマーセットの標準曲線と比較することができ、核酸の量、したがって元のサンプル中の細胞またはウイルスの数を計算することができる。この知見により、多数の異なるサンプル中の標的核酸の量を決定し、他のサンプルと正確に比較することができる。

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、本明細書に記載の溶解緩衝液を用いたＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスの検出に用いることができる。例えば、本発明の方法は、限定されないが、トガウイルス、コロナウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、カリシウイルス、レオウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、バイナウイルス、アレナウイルスまたはフィボウイルス等のＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスの検出に用いることができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡウイルスは、限定されないが、ＳＡＲＳ ＣｏＶまたはＳＡＲＳ ＣｏＶ－２等のコロナＳＡＲＳウイルスまたはそれらのウイルスの変異体等のコロナウイルスである。特定の実施形態において、本発明の方法は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の検出に用いることができる。

したがって、本発明はまた、対象から得られる生物学的サンプルから溶解物を得ること、該溶解物中のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得ること、および該ｃＤＮＡをＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ゲノムのヌクレオチド配列に由来するプライマーセットを用いたＰＣＲアッセイすることを含む、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２に感染した対象を同定するための方法に関する。

プライマー

本発明の方法においては、任意の適切なプライマーを用いることができる。適切なプライマーは、同定される目的の標的核酸に応じて、当業者によって容易に同定され得る。目的の一般的な核酸を同定するのに有用ないくつかのプライマーが市販されており、本発明の方法で用いることができる。

いくつかの実施形態において、プライマーは、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ゲノムまたはＳＡＲＳ ＣｏＶ－２変異体ゲノム等のＲＮＡウイルスゲノムに対するものである。完全なＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＭＮ９０８９４７．３に記載されている。プライマーを含むＳＡＲＳ ＣｏＶ検出用キットは、様々な販売業者により市販されている。このようなプライマーは、本発明の方法で用いることができると考えられる。いくつかの実施形態において、プライマーは、Ｅ遺伝子、Ｎ遺伝子またはＲｄＲＰ遺伝子を対象とするものである。いくつかの実施形態において、プライマーは、Ｅ遺伝子を対象とするものであり、配列番号８および／または配列番号９、またはその相補体を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、プライマーは、ＲｄＲＰ遺伝子を対象とするものであり、配列番号１１および／または配列番号１２、またはその相補体を含むか、またはそれらからなる。

プローブ

本発明の方法においては、任意の適切な核酸プローブを用いることができる。適切な核酸プローブは、同定される目的の標的核酸に応じて、当業者によって容易に同定され得る。目的の一般的な核酸を同定するのに有用ないくつかのプローブが市販されており、本発明の方法で用いることができる。

いくつかの実施形態において、核酸プローブは、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ゲノム、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２変異体のゲノム等のＲＮＡウイルスゲノムまたはＤＮＡウイルスゲノムに対するものである。核酸プローブを含むＳＡＲＳ ＣｏＶの検出用キットは、様々な販売業者により市販されている。このようなプローブは、本発明の方法で用いることができると考えられる。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、Ｅ遺伝子、Ｎ遺伝子またはＲｄＲＰ遺伝子を対象とするものである。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、Ｅ遺伝子を対象とするものであり、配列番号７またはその相補体を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、ＲｄＲＰ遺伝子を対象とするものであり、配列番号１０またはその相補体を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態において、プローブは、例えばフルオロフォアおよび／またはクエンチャーと共に５’末端および／または３’末端にタグ付けすることができる。タグは、ＨＥＸタグやＢＨＱ１タグ等の任意の適切なタグであり得る。

本明細書で説明するＲＴ－ｑＰＣＲプロトコルは、ＣｏＶ－２の標準的な診断用ＴａｑＭａｎベースのＲＴ－ｑＰＣＲ法に基づいている。原則として、例えば、他のウイルス遺伝子を測定することができ、異なるプライマーおよびプローブ配列、異なるマスターミックス、クエンチャー、フルオロフォア、装置等を用いることができる等、プロトコルを変更することができる。Ｓｙｂｒｇｒｅｅｎベースの方法等の他のＲＴ－ｑＰＣＲ方法も、本発明の方法で用いることができる。

また、キットも提供される。一般に、キットは、本発明の溶解緩衝液を含む。キットは、細胞またはウイルスの溶解、核酸または細胞溶解物の保存、または核酸の増幅等の核酸の操作または分析に用いることができる１種以上の物質、材料、試薬等をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、細胞またはウイルスを溶解し、核酸を増幅し、かつ／または核酸を精製するために必要な材料、試薬等の一部またはすべてがキットに含まれる。

例えば、キットは、本発明の溶解緩衝液を保持する容器、および同じまたは別個の容器内に、標的核酸の増幅のための少なくとも１種の試薬を含み得る。したがって、キットは、標的核酸の増幅のために、少なくとも１種のプライマー、例えば２種のプライマーを含むことができる。また、キットは、必ずしもそうである必要はないが、キット中の１種以上の他のプライマーの標的である同一の核酸（および同じ核酸中の同じ配列でさえある）であり得る、標的核酸の増幅のための少なくとも１種の他のプライマーを含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、１種以上の固有のゲノム配列を増幅するための２種以上のプライマーを含む。

本発明のキットは、本発明の溶解緩衝液をさらに含む、核酸の分析のためのキットであり得る。例えば、キットは、本発明の溶解緩衝液を含む少なくとも１つの容器をさらに含む、ワンステップＲＴ－ｑＰＣＲを用いるＲＮＡ検出用のキットであり得る。そのようなキットは、パッケージ化された組み合わせで、少なくとも１種の逆転写酵素、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼおよびＫｌｅｎｏｗ等の少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ヌクレオチド（例えば、４種の一般的なデオキシヌクレオチドのいずれかまたはすべて）、プライマー、プローブ、または標識（例えば、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ等）、またはこれらの２種以上の任意の組み合わせを含み得る。あるいは、キットは、ツーステップＲＴ－ｑＰＣＲを用いたＲＮＡ検出用キットであり得る。あるいは、キットは、ｑＰＣＲ等のＰＣＲ技術を用いたＤＮＡ検出用であり得る。さらに、キットは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）検出用であり得る。いくつかの実施形態において、キットは、トランスフェクションまたは形質転換試薬を含む。

キットは、構成要素を単一パッケージまたは同一キット内の複数のパッケージに含めることができる。キット内に複数のパッケージが含まれる場合、各パッケージには、単一の構成要素または複数の構成要素を任意の適切な組み合わせで個別に含めることができる。本明細書で用いられる場合、単一のキット内の２つ以上のパッケージまたは容器の組み合わせは、「パッケージ化された組み合わせ」と呼ばれる。キットおよびキット内の容器は、既知の材料で製造することができる。例えば、キット自体はプラスチック素材または厚紙で作製することができる。構成要素を保持する容器は、例えば、プラスチック素材またはガラスであり得る。１つのキット内の異なる容器は、異なる材料で作製することができる。いくつかの実施形態において、キットは、その中に別のキットを含むことができる。例えば、本発明のキットは、核酸を精製するためのキットを含むことができる。

本発明のキットは、標的配列を増幅するのに有用な１種以上の成分を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＰＣＲを行うために必要な試薬および供給品の一部または全部がキットに含まれる。いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲを行うための試薬および供給品の一部または全部がキットに含まれる。他の実施形態において、ＲＴ－ＰＣＲを行うための試薬および供給品の一部または全部がキットに含まれる。試薬の非限定的な例は、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ等を含む緩衝液）、塩およびテンプレート依存性核酸伸長酵素（Ｔａｑポリメラーゼ等の熱安定性酵素等）、酵素の活性に適した緩衝液、およびｄＮＴＰｓ、ｄＵＴＰおよび／またはＵＤＧ酵素等の酵素によって必要とされる追加の試薬である。供給品の非限定的な例は、反応容器（例えば、微量遠心管）である。

キットは、限定されないが、ｄｓＤＮＡを含む核酸を検出するための少なくとも１種の色素を含んでもよい。いくつかの実施形態において、キットは、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ社、ＯＲ）等の、ｄｓＤＮＡを検出する配列非特異的色素を含む。色素は単独で容器に収容されることが好ましい。いくつかの実施形態において、色素は、濃縮原液として、例えば５０×溶液として提供される。実施形態において、キットは、不活性参照色素（passive reference dye）を含む。これらの実施形態において、不活性参照色素は、別個の容器内で単独でキットに含めることができる。不活性参照色素は、濃縮ストック溶液として、例えば１ｍＭストック溶液として提供することができる。非排他的で例示的な不活性参照色素は、ＲＯＸ色素である。いくつかの実施形態において、キットは、ＤＮＡ検出色素または不活性参照色素のいずれかを含む。他の実施形態において、キットは、ＤＮＡ検出色素および不活性参照色素の両方を含む。

本発明は、一般に、研究および診断の両方における使用に適している。すなわち、本発明の組成物および方法は、様々な核酸または発現遺伝子を同定する目的、または他の研究目的のために用いることができる。同様に、組成物および方法は、ヒトおよび動物の多数の疾患または障害を診断するために用いることができる。さらに、組成物および方法は、異常な食品やその他の汚染された食品（例えば、１種以上の病原性生物に感染している食品）、またはサンプル中の有毒物質または毒素産生生物の存在を同定するために用いることができる。したがって、組成物および方法は、ヒトの健康および獣医学的用途、ならびに食品検査および国土安全保障用途を有する。

本発明は、特許請求の範囲を限定することを意図しない以下の実施例を参照することにより、よりよく理解され得る。

材料および方法

クラフト綿棒（カタログ番号８７１０４^＊＊２６０；Ｔａｍｉｙａ社）を用いて鼻スワブを収集し、１００μｌの溶解緩衝液（３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０％のグリセリン、２ｍＭのＤＴＴ、２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ；ｐＨ７．８）を含む１．５ｍｌ反応チューブまたはディープウェルマイクロタイタープレートに移した。溶解緩衝液を室温で保存し、使用前にＲＮａｓｅ不含有水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ蒸留水 Ｄｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅ不含有、１０９７７－０３５）で１：６に希釈した。使用当日：１００μｌのサンプル溶解物あたり０．１μｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（ＮＥＢ、Ｍ０３１４Ｌ、４０Ｕ／μｌ）。

スワブを溶解緩衝液に入れた後、スワブを圧縮してサンプルを溶解緩衝液に放出し、５分間インキュベートした。次いで、サンプルを直接用いるために氷上に静置するか、または－２０℃（短期）もしくは－８０℃（長期保存）で凍結した。

使用前に、サンプルを解凍し（必要な場合）、室温で２分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、上清を新しい反応チューブまたはディープウェルマイクロタイタープレートに移した。サンプルは、リアルタイムワンステップＲＴ－ＰＣＲに進む前に、この段階で必要に応じて凍結することができる。
リアルタイムワンステップＲＴ－ＰＣＲアッセイでは、１０μｌマルチピペットまたは自動ピペッティングシステム（例えば、Ｃｙｂｉ Ｗｅｌｌ Ｖａｒｉｏ、Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ）を用いて、２μｌ溶解物を３８４ウェルＱＰＣＲマイクロプレート（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０マルチウェルプレート３８４ホワイト、４バーコード Ｎｏ．：０５２１７５５５００１）に移した。１００μｌのマルチピペットまたはディスペンサーを用いて、８μｌのＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ、ＵｌｔｒａＰｌｅｘ（商標）１－ｓｔｅｐ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｎｏ．：９５１６６－０１Ｋ）を添加した。次いで、マイクロプレートを透明なｑＰＣＲホイル（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｆｉｌｍ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４３１１９７１）を用いて手動またはヒートシーラーで密閉し、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。ワンステップＲＴ－ＰＣＲをＬＣ４８０（Ｒｏｃｈｅ、３８４ウェル）を用いて行い、データをＬＣ４８０ソフトウェアで分析した。サイクル閾値（ＣＰまたはＣｐ）を各反応について計算し、測定された蛍光が蛍光をバックグラウンド蛍光と区別できる値に達するまでのＰＣＲ増幅中のサイクル数を表示した。

プローブ／プライマー：

ＣＬＤＮ１（遺伝子ＩＤ：９０７６；ｃｌａｕｄｉｎ１、ヒト上皮細胞マーカー）
ＣＬＤＮ１＿プローブ：５’＿ＨＥＸ－ＣＡＧＧＣＴＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣ－ＢＨＱ１＿３’（配列番号：１）
ＣＬＤＮ１＿Ｆ１（フォワードプライマー）：５’－ＣＣＡＧＴＣＡＡＴＧＣＣＡＧＧＴＡＣＧＡ－３’（配列番号：２）
ＣＬＤＮ１＿Ｒ１（リバースプライマー）：５’－ＧＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡ－３’（配列番号：３）
ＲＰＬ３２（遺伝子ＩＤ：６１６１；リボソームタンパク質Ｌ３２；ヒトハウスキーピング遺伝子）
ＲＰＬ３２＿プローブ：５’＿ＨＥＸ－ＡＡＴＴＡＡＧＣＧＴＡＡＣＴＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣＣ－ＢＨＱ１＿３’（配列番号：４）
ＲＰＬ３２＿Ｆ１（フォワードプライマー）：５’－ＧＣＡＣＣＡＧＴＣＡＧＡＣＣＧＡＴＡＴＧＴ－３’（配列番号：５）
ＲＰＬ３２＿Ｒ１（リバースプライマー）：５’－ＡＣＣＣＴＧＴＴＧＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴ－３’（配列番号：６）
Ｅ＿ｇｅｎｅ Ｓａｒｂｅｃｏ（Ｅ遺伝子、ＳＡＲＳ ＣｏＶ２遺伝子）
Ｅ＿ｇｅｎｅ Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｐ１（プローブ）：５’－Ｈｅｘ－ＡＣＡＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧ－ＢＨＱ－１－３’（配列番号：７）
Ｅ＿ｇｅｎｅ Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｆ１（フォワードプライマー）：５’－ＡＣＡＧＧＴＡＣＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴ－３’（配列番号８）
Ｅ＿ｇｅｎｅ Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｒ２（リバースプライマー）：５’－ＡＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡ－３’（配列番号９）
ＲｄＲＰ＿ＳＡＲＳｒ（ＲｄＲＰ ＳＡＲＳ ＣｏＶ２遺伝子；ＳＡＲＳ ＣｏＶ２に特異的で、ＳＡＲＳ ＣｏＶを検出しない）
ＲｄＲＰ＿ＳＡＲＳｒ－Ｐ２（プローブ）：５’－Ｈｅｘ－ＣＡＧＧＴＧＧＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＧＡＧＡＴＧＣ－ＢＨＱ－１－３’（配列番号１０）
ＲｄＲＰ＿ＳＡＲＳｒ－Ｆ２（フォワードプライマー）：５’－ＧＴＧＡＲＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＧＴＧＧＣＧＧ－３’（配列番号：１１）
ＲｄＲＰ＿ＳＡＲＳｒ－Ｒ１（逆プライマー）：５’－ＣＡＲＡＴＴＧＴＴＡＡＡＳＡＣＡＣＴＡＴＴＡＧＣＡＴＡ－３’（配列番号１２）

実施例１－上皮細胞の検出
上皮マーカーＣＬＤＮ１およびヒトのハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ３２のＲＴ－ｑＰＣＲを、記載されているプロトコルに従って行った。端的には、材料および方法に記載されているように、１０人の健康なヒトボランティアから鼻スワブを収集して溶解した。溶解物は、凍結せずにＲＴ－ｑＰＣＲに直接用いた。コントロールサンプルには、スワブのみ（サンプルなしのスワブ）およびＮＴＣ（テンプレートコントロールなし）が含まれていた。

ＣＬＤＮ１プローブおよびＲＰＬ３２プローブならびにプライマーを、反応液中の各オリゴの最終濃度が３３３ｎＭになるように含有させた。

ＰＣＲ反応の準備：２．５μｌのＵｌｔｒａＰｌｅｘ １－ｓｔｅｐ ｔｏｕｇｈ ｍｉｘ（４×）、２．５μｌのプライマー／プローブミックス、２．０μｌの溶解鼻サンプルアリコート、３．０μｌのＲＮａｓｅ不含有水。

ＰＣＲプロトコル：逆転写を５０℃で１０分間行い、続いて９５℃、４５サイクル：９５℃で１分＋６０℃で３０秒、またはより好ましくは９５℃で１５秒＋６０℃で１分で５分間変性させた。サイクル終了後、４０℃で３０秒間冷却した。

各サンプルの増幅曲線を図１に示し、図２に要約する。これらのデータから、ＲＮＡ抽出工程を含めずに調製した鼻スワブサンプルから遺伝子を確実に検出できることが示された。検出レベルのばらつきは、個々のサンプリングに起因する可能性がある。

実施例２－ＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルス遺伝子検出の感度
用いられたＲＴ－ｑＰＣＲプロトコルは、ＴＩＢ ＭＯＬＢＩＯＬ／Ｒｏｃｈｅ Ｋｉｔマニュアルに記載されているとおりであったが、下記の例外を含んでいた。８分間のＲＴ工程を用いた。必要に応じてＲｏｃｈｅ社のＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘの代わりにＵｌｔｒａＰｌｅｘ（商標）１－ｓｔｅｐ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）を用いました。プロトコルを以下の表１に示す。

ウイルスＲＮＡ抽出キット（ＬｉｇｈｔＭｉｘ（登録商標）Ｍｏｄｕｌａｒ ＥＡＶ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＴＩＢ ＭＯＬＢＩＯＬ カタログ番号５８－０９０９－９６）において一般的に用いられるウイルス陽性コントロールの検出に対するＲＴ－ｑＰＣＲの感度を試験した。これは、ウイルスのテンプレートＲＮＡを様々な希釈率（希釈なし、１：１０、１：１００、１：１０００）でＰＣＲミックスに添加した典型的なＲＴ－ｑＰＣＲ反応であった。溶解物は用いなかった。この遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲの感度を試験した。増幅曲線を図３に示し、データを以下の表２に示す。

３種のＣｏＶ－２遺伝子の検出に対するＲＴ－ｑＰＣＲの感度：Ｅ遺伝子（ＬｉｇｈｔＭｉｘ（登録商標）Ｍｏｄｕｌａｒ ＳＡＲＳ ａｎｄ Ｗｕｈａｎ ＣｏＶ Ｅ－ｇｅｎｅ、ＴＩＢ ＭＯＬＢＩＯＬ カタログ番号５３－０７７６－９６）、Ｎ遺伝子（ＬｉｇｈｔＭｉｘ（登録商標）Ｍｏｄｕｌａｒ ＳＡＲＳ ａｎｄ Ｗｕｈａｎ ＣｏＶ Ｎ－ｇｅｎｅ、ＴＩＢ ＭＯＬＢＩＯＬ カタログ番号５３－０７７５－９６）、およびＲｄＲＰ遺伝子（ＬｉｇｈｔＭｉｘ（登録商標）Ｍｏｄｕｌａｒ Ｗｕｈａｎ ＣｏＶ ＲｄＲＰ－ｇｅｎｅ、ＴＩＢ ＭＯＬＢＩＯＬ カタログ番号５３－０７７７－９６）を、ＥＡＶポジティブコントロールの検出について上述したのと同じプロトコルを用いて行った。様々な濃度の各遺伝子がＰＣＲミックスに含まれており（２×ストック、１×ストック、１：１０希釈、１：１００希釈）、それぞれ試験された約１０００コピー（２×）、約５００コピー（１×）、約５０コピー（１：１０）および約５コピー（１：１００）に対応していた。

Ｅ遺伝子の検出のための増幅曲線を図４に示し、データを以下の表３に示す。

Ｎ遺伝子の検出のための増幅曲線を図５に示し、データを以下の表４に示す。

ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の検出に特異的なＲｄＲＰ遺伝子の検出のための増幅曲線を図６に示し、データを以下の表５に示す。

実施例３－鼻スワブ溶解液中のＣｏＶ－２遺伝子の検出
実施例２で試験した２つのウイルス遺伝子（Ｅ遺伝子およびＲｄＲＰ遺伝子）についてのＲＴ－ｑＰＣＲを、記載されたプロトコルに従って行った。端的には、材料および方法に記載されているように、１０人の健康なヒトボランティア（Ｓ１～Ｓ１０）から鼻スワブを収集して溶解し、ＣｏＶ－２ ＲＮＡテンプレート（ＴｉｂＭｏｌＢｉｏｌ社）を添加（スパイク）した。溶解物は、凍結せずにＲＴ－ｑＰＣＲに直接用いた。

各サンプルＳ１～Ｓ１０について、次の反応が行った：１）Ｅ－Ｇｅｎｅ＿Ｓａｍｐｌｅ（ＣｏＶ－２ ＲＮＡテンプレートを添加せず；Ｅ遺伝子プローブ／プライマーを含む）；２）Ｅ－Ｇｅｎｅ＿ＳｐｉｋｅＲＮＡ（ＣｏＶ－２ ＲＮＡテンプレートを添加；Ｅ遺伝子プローブ／プライマーを含む）；３）Ｅ－Ｇｅｎｅ＿ＰｏｓＣｎｔｌＲＮＡ（ＣｏＶ－２ ＲＮＡテンプレートのみ；Ｅ遺伝子プローブ／プライマーを含む）；４）ＮＴＣ＿Ｅ－Ｇｅｎｅ（テンプレートなしのネガティブコントロール）；５）ＲｄＲＰ－Ｇｅｎｅ（ＣｏＶ－２ ＲＮＡテンプレートを添加せず、ＲｄＲＰプローブ／プライマーを含む）；６）ＲｄＲＰ－Ｇｅｎｅ＿ＳｐｉｋｅＲＮＡ（ＣｏＶ－２ ＲＮＡテンプレートを添加；ＲｄＲＰ遺伝子プローブ／プライマーを含む）；７）ＲｄＲＰ－Ｇｅｎｅ＿ＰｏｓＣｎｔｌＲＮＡ（ＣｏＶ－２ ＲＮＡテンプレートのみ；ＲｄＲＰ－Ｇｅｎｅプローブ／プライマーを含む）；および８）ＮＴＣ＿ＲｄＲＰ－Ｇｅｎｅ（テンプレートなしのネガティブコントロール）。各反応は４連で行った。

Ｅ遺伝子のプローブおよびプライマーは、以下の最終濃度で含有されていた：Ｅ＿Ｇｅｎｅ Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｐ１プローブ４００ｎＭ、Ｅ＿Ｇｅｎｅ Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｆ１フォワードプライマー４００ｎＭ、Ｅ＿Ｇｅｎｅ Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｒ２リバースプライマー２００ｎＭまたはそれ以上、好ましくはＥ＿Ｇｅｎｅ Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｐ１プローブ２００ｎＭ、Ｅ＿Ｇｅｎｅ Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｆ１フォワードプライマー４００ｎＭ、Ｅ＿Ｇｅｎｅ Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｒ２リバースプライマー４００ｎＭ。

ＲｄＲＰのプローブおよびプライマーは、以下の最終濃度で含有されていた：ＲｄＲＰ＿ＳＡＲＳｒ－Ｐ２プローブ６００ｎＭ、ＲｄＲＰ＿ＳＡＲＳｒ－Ｆ２フォワードプライマー８００ｎＭ、ＲｄＲＰ＿ＳＡＲＳｒ－Ｒ１リバースプライマー１００ｎＭまたはそれ以上、好ましくはＲｄＲＰ＿ＳＡＲＳｒ－Ｐ２プローブ１００ｎＭ、ＲｄＲＰ＿ＳＡＲＳｒ－Ｆ２フォワードプライマー６００ｎＭ、ＲｄＲＰ＿ＳＡＲＳｒ－Ｒ１リバースプライマー８００ｎＭ。

ＰＣＲ反応の準備：２．５μｌのＵｌｔｒａＰｌｅｘ １－ｓｔｅｐ ｔｏｕｇｈ ｍｉｘ（４×）、２．５μｌのプライマー／プローブミックス（４×）、０．２５μｌのＬｉｇｈｔＭｉｘキットからのポジティブコントロールＲＮＡ、２．０μｌの溶解鼻サンプルアリコート、２．７５μｌのＲＮａｓｅ不含有水。サンプル１）および５）においては、ポジティブコントロールＲＮＡを添加せず、３．０μｌのＲＮａｓｅ不含有水を添加した。

ＰＣＲプロトコル：逆転写を５０℃で１０分間行い、続いて９５℃、４５サイクル：９５℃で１分＋６０℃で３０秒、またはより好ましくは９５℃で１５秒＋６０℃で６０秒で５分間変性させた。サイクル終了後、４０℃で３０秒間冷却した。

各サンプルの増幅曲線を図７に示し、図８に要約する。データを下記の表６に示す。

これらのデータから、ＲＮＡ抽出工程を含めずに調製した鼻スワブサンプルからＳＡＲＳ ＣｏＶ－２遺伝子を確実に検出できることが示された。ＣｏＶ－２感染患者の鼻スワブに存在するウイルスＲＮＡが、記載されている方法で測定できることを実証するために、さらなる研究が行われる。

本明細書で引用されるすべての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているように、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる参考文献の引用も、出願日以前の開示のためのものであり、本開示が先行発明のおかげでそのような参考文献に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。

上記の要素のそれぞれ、または２つ以上を一緒にすると、上記のタイプとは異なる他のタイプの方法においても有用な用途が見出され得ることが理解されるであろう。さらなる分析をしなくても、上記は本開示の要旨を完全に明らかにするので、他の人は、現在の知識を適用することにより、従来技術の観点から、添付の特許請求の範囲に記載される一連の開示の一般的または特定の態様の必須の特徴を適正に構成する特徴を省略することなく、本開示を様々な用途に容易に適応させるであろう。上述した実施形態は、例示することのみを目的として示されるものであり；本開示の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。

Claims (68)

1. ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスを検出する方法であって、
   少なくとも１つのサンプルと溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、
   ＲＮＡウイルス検出の場合には、前記溶解物中のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得ること、および
   前記ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスの核酸配列に由来するプライマーセットを用いて前記溶解物中のＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスから少なくとも１種の核酸を増幅すること
   を含む、前記方法。
2. 前記溶解緩衝液が、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、グリセロール、および少なくとも１種の塩を含有する、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも１種の前記非イオン性界面活性剤が、親水性のポリエチレンオキシド鎖および芳香族炭化水素の親油性基または疎水性基を有する、請求項２に記載の方法。
4. 少なくとも１種の前記非イオン性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００である、請求項２または３に記載の方法。
5. 前記溶解緩衝液が、非イオン性界面活性剤を約０．０５％～約２０％の量で含有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記塩がリン酸二ナトリウムである、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記溶解緩衝液が、以下：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＲＮａｓｅ不含有水、ＲＮａｓｅ阻害剤およびそれらの混合物の１種以上をさらに含有する、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記溶解緩衝液のｐＨが約７．５～約８．５である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ＲＮＡウイルスがコロナウイルスである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記コロナウイルスがＳＡＲＳ ＣｏＶ－２である、請求項９に記載の方法。
11. 前記コロナウイルスがＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の変異体である、請求項９に記載の方法。
12. 前記プライマーセットが、Ｅ遺伝子、Ｎ遺伝子およびＲｄＲＰ遺伝子からなる群から選択されるウイルスＲＮＡ遺伝子に対するものである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記プライマーセットがＥ遺伝子に対するものであり、かつ配列番号８および／または配列番号９、またはその相補体を含むか、またはそれからなる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記プライマーセットがＲｄＲＰ遺伝子に対するものであり、かつ配列番号１１および／または配列番号１２、またはその相補体を含むか、またはそれからなる、請求項１３に記載の方法。
15. ＲＮＡ抽出工程を含まない、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記溶解物が前記逆転写に直接用いられる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記生物学的サンプルがスワブを用いて収集される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記生物学的サンプルが鼻スワブである、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 少なくとも１つの前記サンプルが少なくとも１つのヒト細胞を含有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記サンプルが１００μｌの前記溶解緩衝液に配置される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記溶解緩衝液と前記サンプルとの混合物を室温で５分間インキュベートして溶解物を生成することをさらに含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記溶解物を遠心分離し、上清を収集することをさらに含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記溶解物が室温で２分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離される、請求項２３に記載の方法。
25. １種以上の核酸を増幅する方法であって、
    少なくとも１つのサンプルと溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、および
    前記溶解物中の少なくとも１種の核酸を増幅すること
    を含み、前記溶解緩衝液が少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、グリセロール、および少なくとも１種の塩を含有する、前記方法。
26. 少なくとも１種の前記非イオン性界面活性剤が、親水性のポリエチレンオキシド鎖および芳香族炭化水素の親油性基または疎水性基を有する、請求項２５に記載の方法。
27. 少なくとも１種の前記非イオン性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００である、請求項２５または２６に記載の方法。
28. 前記溶解緩衝液が、非イオン性界面活性剤を約０．０５％～約２０％の量で含有する、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記塩がリン酸二ナトリウムである、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記溶解緩衝液が、以下：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＲＮａｓｅ不含有水、ＲＮａｓｅ阻害剤およびそれらの混合物の１種以上をさらに含有する、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 少なくとも１つの前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記生物学的サンプルがスワブを用いて収集される、請求項３１に記載の方法。
33. 前記生物学的サンプルが鼻スワブである、請求項３１または３２に記載の方法。
34. 前記サンプルが少なくとも１つのヒト細胞を含有する、請求項２５～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記サンプルが１００μｌの前記溶解緩衝液に配置される、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記溶解緩衝液と前記サンプルとの混合物を室温で５分間インキュベートして溶解物を生成することをさらに含む、請求項２５～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記溶解物を遠心分離し、上清を収集することをさらに含む、請求項２５～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記溶解物が室温で２分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離される、請求項３７に記載の方法。
39. 前記溶解物中の少なくとも１種の核酸を増幅することが、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲまたはＲＴ－ｑＰＣＲによって行われる、請求項２５～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記溶解物中の少なくとも１種の核酸を増幅することが、ワンステップＲＴ－ｑＰＣＲによって行われる、請求項２５～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. ＲＮＡ抽出工程を含まない、請求項２５～４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記溶解物が前記増幅に直接用いられる、請求項２５～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 少なくとも１種の前記核酸がＲＮＡウイルスに由来する、請求項２５～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２またはＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の変異体に感染した対象を同定する方法であって、
    対象から得られた生物学的サンプルから溶解物を得ること、
    前記溶解物中のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得ること、および
    前記ｃＤＮＡを前記ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ゲノムのヌクレオチド配列または前記ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の変異体のゲノムに由来するプライマーセットを用いたＰＣＲアッセイすること
    を含む、前記方法。
45. 前記溶解物が、生物学的サンプルと少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、グリセロール、および少なくとも１種の塩を含有する溶解緩衝液とを接触させることによって得られる、請求項４４に記載の方法。
46. ＲＮＡ抽出工程を含まない、請求項４４または４５に記載の方法。
47. 前記溶解物が前記逆転写に直接用いられる、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 標的核酸を増幅、同定、検出および／または分析する方法であって、
    サンプルと溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、
    前記溶解物中のＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得ること、および
    前記ｃＤＮＡを前記標的核酸に対するプライマーセットを用いてＰＣＲアッセイすること
    を含む、前記方法。
49. 前記溶解物が、前記サンプルと少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、グリセロール、および少なくとも１種の塩を含有する溶解緩衝液とを接触させることによって得られる、請求項４８に記載の方法。
50. ＲＮＡ抽出工程を含まない、請求項４８または４９に記載の方法。
51. 前記溶解物が逆転写において直接用いられる、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 溶解緩衝液を含むキットであって、前記溶解緩衝液が少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、グリセロール、および少なくとも１種の塩を含有する、前記キット。
53. 標的核酸の増幅のための少なくとも１種の試薬をさらに含む、請求項５２に記載のキット。
54. 標的核酸の増幅のための少なくとも１種のプライマーおよび／または少なくとも１種のプローブを含む、請求項５２または５３に記載のキット。
55. ワンステップＲＴ－ｑＰＣＲを用いたＲＮＡ検出用キットである、請求項５２～５４のいずれか一項に記載のキット。
56. 少なくとも１種の逆転写酵素、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ヌクレオチド、プライマー、プローブ、標識の１種以上、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５５に記載のキット。
57. 前記標的核酸がＲＮＡウイルスに由来する、請求項５２～５６のいずれか一項に記載のキット。
58. 前記ＲＮＡウイルスがコロナウイルスである、請求項５７記載のキット。
59. 前記ＲＮＡウイルスがＳＡＲＳ ＣｏＶ－２である、請求項５７または５８に記載のキット。
60. 配列番号８および／または配列番号９、またはその相補体、ならびに配列番号１１および／または配列番号１２、またはその相補体から選択されるプライマーセットを含む、請求項５９に記載のキット。
61. １～５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と、以下の成分：５～２０％のグリセロール、０．５～４ｍＭのＤＴＴ、１０～５０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、および１０～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌの１種以上とを含有する、溶解緩衝液。
62. 約３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と、以下の成分：約１０％のグリセロール、約２ｍＭのＤＴＴ、約２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、および約２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌの１種以上とを含有する、請求項６１に記載の溶解緩衝液。
63. 前記溶解緩衝液のｐＨが約７．５～約８．０である、請求項６１または６２に記載の溶解緩衝液。
64. ＲＮａｓｅ不含有水をさらに含有する、請求項６１～６３のいずれか一項に記載の溶解緩衝液。
65. 前記ＲＮａｓｅ不含有水を約１：１５～１：１（溶解緩衝液：ＲＮａｓｅ不含有水）の量で含有する、請求項６４に記載の溶解緩衝液。
66. ＲＮＡｓｅ阻害剤をさらに含有する、請求項６１～６５のいずれか一項に記載の溶解緩衝液。
67. 少なくとも１つのサンプルと溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、および
    前記溶解物中の少なくとも１種の核酸を増幅すること
    を含む、１種以上の核酸を増幅する方法における、請求項６１～６６のいずれか一項に記載の溶解緩衝液の使用。
68. 少なくとも１つのサンプルと溶解緩衝液とを接触させて溶解物を生成すること、
    前記溶解物中でＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得ること、および
    ＲＮＡウイルスの核酸配列に由来するプライマーセットを用いて前記溶解物中のＲＮＡウイルスから少なくとも１種の核酸を増幅すること
    を含む、ＲＮＡウイルスを検出する方法における、請求項６１～６６のいずれか一項に記載の溶解緩衝液の使用。

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