KR20220164716A - Rt-pcr을 사용한 바이러스 감염의 신속한 검출 - Google Patents

Rt-pcr을 사용한 바이러스 감염의 신속한 검출 Download PDF

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Abstract

핵산의 제조, 저장, 증폭 및/또는 검출의 1-단계 시약으로서 사용될 수 있는 1종의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 용해 완충제가 제공된다. 본 발명의 용해 완충제의 다양한 실시양태는 세포의 용해, 핵산의 저장, 핵산의 증폭, 핵산의 정제, 핵산의 검출, 및/또는 핵산의 분석을 위한 다른 절차에 적합하거나 유용한 다른 물질을 포함한다. 세포의 신속한 용해 및 생성된 세포 용해물의 RT-PCR에서의 직접 사용을 위한 것을 포함한, 용해 완충제에 기초한 방법 및 키트가 또한 제공된다.

Description

RT-PCR을 사용한 바이러스 감염의 신속한 검출
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
전자 출원을 통해 출원과 함께 제공된 서열 목록은 본 명세서의 일부이고, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
1. 분야
본 개시내용은 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)을 사용하여 생물학적 샘플로부터 바이러스 RNA를 검출하는 개선된 방법에 관한 것이다.
바이러스 RNA의 검출을 위한 일부 대표적인 RT-PCR 방법은 RNase를 불활성화시키고 RNA를 안정화시키기 위해 고도로 변성된 조건 하에 유독한 화학물질을 함유하는 용해 완충제 내에서 생물학적 샘플을 용해시키고, 이어서 후속 RT-PCR을 방해할 수 있는 이들 화학물질을 용해 완충제로부터 제거하기 위해 칼럼 정제를 사용하여 RNA를 단리하는 것을 필요로 한다. 예를 들어, 표준 트리졸(TRIzol) RNA 제조 키트에 포함된 용해 완충제는 전형적으로 단백질, 예컨대 폴리머라제를 분해 또는 변성시켜 후속 PCR 반응을 방해할 성분, 예컨대 구아니디늄 티오시아네이트, 페놀 및/또는 클로로포름을 함유한다.
이들 방법의 일부 단점은 복수의 단계, 민감도의 결여, 증가된 시간, 증가된 비용, 및 결과물을 얻는 데 시약이 필요함이다.
이러한 기술적 문제에 대한 해결책은 청구범위에 특징화된 실시양태에 의해 제공된다.
개요
본 출원은 세포 및/또는 바이러스의 용해 및 핵산의 분석에 적합한 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 1종의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 용해 완충제를 제공한다. 본 발명의 용해 완충제의 다양한 실시양태는 세포 및/또는 바이러스의 용해, 핵산의 저장, 핵산의 증폭, 핵산의 정제, 핵산의 검출, 및/또는 핵산의 분석을 위한 다른 절차에 적합하거나 유용한 다른 물질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 핵산의 제조, 저장, 증폭 및/또는 검출의 1-단계 시약으로 간주될 수 있다.
세포의 신속한 용해 및 생성된 세포 용해물의 RT-PCR에서의 직접 사용을 위한 것을 포함한, 상기 조성물에 기초한 방법 및 키트가 또한 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 본 발명의 용해 완충제를 사용하여 적어도 하나의 세포 및/또는 적어도 하나의 바이러스를 용해시키는 방법을 제공한다. 용해 방법은 일반적으로 적어도 하나의 세포 또는 적어도 하나의 바이러스를 세포 또는 바이러스가 용해되도록 하기에 충분한 시간의 양 동안 본 발명의 용해 완충제와 접촉시키는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 용해물의 사용 전에 소정 기간 동안 용해물을 저장하는 것과 같은 추가의 임의적인 단계가 용해 방법에 포함된다. 마찬가지로, 다른 예시적인 추가의 단계는 세포 용해물 내의 1개 이상의 핵산을 증폭시키고/거나 핵산(들)을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
놀랍게도, 본 발명의 단일 완충제는 세포 및 바이러스의 용해 둘 다에 적합할 수 있고, 핵산의 증폭 및 검출을 유도하는 반응의 하위-성분으로서 존재할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 본 발명의 완충제는 바이러스에 감염된 세포, 예컨대 인간 또는 동물 세포를 용해시키는 데 적합할 수 있다. 수득된 용해물은 핵산의 증폭, 검출 및 정량화를 유도하는 후속 반응에서 주형으로서 직접 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 출원은 1개 이상의 핵산을 증폭시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 방법은 생물학적 샘플을 본 발명의 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, 용해물 내의 핵산을 증폭시키는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 핵산의 증폭은 PCR 방법, 예컨대 qPCR, RT-PCR 또는 RT-qPCR에 의한 것이다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 대조군 반응, 예컨대 증폭되는 핵산의 양을 공동으로 수행되는 다른 증폭 반응에 대해, 또는 표준 증폭 곡선에 대해 정규화하는 것을 가능하게 하는 대조군 반응이 포함된다.
본 출원은 또한 키트를 제공한다. 일반적으로, 키트는 본 발명의 용해 완충제를 함유한다. 키트는 세포 또는 바이러스의 용해, 핵산의 증폭 동안 존재하는 핵산 또는 용해물의 저장, 또는 핵산의 검출 또는 정량화를 위해 사용될 수 있는 1종 이상의 물질, 시약 등을 추가로 포함할 수 있다. 실시양태에서, 세포 또는 바이러스를 용해시키고/거나, 핵산을 증폭시키고/거나, 핵산을 검출 및/또는 정량화하는 데 필요한 물질, 시약 등의 일부 또는 전부가 키트에 포함된다.
샘플을 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, 용해물 내의 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 핵산을 증폭시키는 방법에서의 용해 완충제 및 키트의 용도가 또한 제공된다.
샘플을 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, RNA 바이러스 검출의 경우에 용해물 내의 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하고, RNA 바이러스로부터 유래된 프라이머의 세트를 사용하여 용해물 내의 RNA 바이러스로부터 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는, RNA 또는 DNA 바이러스를 검출하는 방법에서의 용해 완충제 및 키트의 용도가 또한 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 샘플을 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, RNA 바이러스 검출의 경우에 용해물 내의 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하고, RNA 또는 DNA 바이러스의 핵산 서열로부터 유래된 프라이머의 세트를 사용하여 용해물 내의 RNA 또는 DNA 바이러스로부터 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는, RNA 또는 DNA 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서, 용해 완충제는 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제, 글리세롤, 및 적어도 1종의 염을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제는 친수성 폴리에틸렌 옥시드 쇄 및 방향족 탄화수소 친지성 또는 소수성 기를 갖는다.
특정한 실시양태에서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제는 트리톤(Triton) X-100이다.
특정한 실시양태에서, 용해 완충제는 비-이온성 계면활성제를 약 0.05% 내지 약 20%의 양으로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 염은 인산이나트륨이다.
특정한 실시양태에서, 용해 완충제는 하기: 트리스-HCl, 디티오트레이톨 (DTT), RNase-무함유 물, RNase 억제제, 및 그의 혼합물 중 1종 이상을 추가로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 용해 완충제의 pH는 약 7.5 내지 약 8.5이다.
특정한 실시양태에서, RNA 바이러스는 코로나바이러스이다.
특정한 실시양태에서, 코로나바이러스는 SARS CoV-2이다.
특정한 실시양태에서, 코로나바이러스는 SARS CoV-2의 변이체이다.
특정한 실시양태에서, 프라이머의 세트는 E 유전자, N 유전자 및 RdRP 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 RNA 유전자에 대한 것이다.
특정한 실시양태에서, 프라이머의 세트는 E 유전자에 대한 것이고, 서열식별번호: 8 및/또는 서열식별번호: 9, 또는 그의 상보체를 포함하거나 그로 이루어진다.
특정한 실시양태에서, 프라이머의 세트는 RdRP 유전자에 대한 것이고, 서열식별번호: 11 및/또는 서열식별번호: 12, 또는 그의 상보체를 포함하거나 그로 이루어진다.
특정한 실시양태에서, 방법은 RNA 추출 단계를 포함하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 용해물은 역전사에 직접 사용된다.
특정한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다.
특정한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 스왑을 사용하여 수집된다.
특정한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 비강 스왑이다.
특정한 실시양태에서, 적어도 하나의 샘플은 적어도 하나의 인간 세포를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 샘플을 100 μl의 용해 완충제에 넣는다.
특정한 실시양태에서, 방법은 용해 완충제 및 샘플의 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하여 용해물을 생성하는 것을 추가로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 방법은 용해물을 원심분리하고 상청액을 수집하는 것을 추가로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 용해물을 12,000 rpm에서 2분 동안 실온에서 원심분리한다.
추가 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 샘플을 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, 용해물 내의 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것을 포함하며, 여기서 용해 완충제는 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제, 글리세롤, 및 적어도 1종의 염을 포함하는 것인, 하나 이상의 핵산을 증폭시키는 방법에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제는 친수성 폴리에틸렌 옥시드 쇄 및 방향족 탄화수소 친지성 또는 소수성 기를 갖는다.
특정한 실시양태에서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제는 트리톤 X-100이다.
특정한 실시양태에서, 용해 완충제는 비-이온성 계면활성제를 약 0.05% 내지 약 20%의 양으로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 염은 인산이나트륨이다.
특정한 실시양태에서, 용해 완충제는 하기: 트리스-HCl, 디티오트레이톨 (DTT), RNase-무함유 물, RNase 억제제, 및 그의 혼합물 중 1종 이상을 추가로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 적어도 하나의 샘플은 생물학적 샘플이다.
특정한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 스왑을 사용하여 수집된다.
특정한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 비강 스왑이다.
특정한 실시양태에서, 샘플은 적어도 하나의 인간 세포를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 샘플을 100 μl의 용해 완충제에 넣는다.
특정한 실시양태에서, 방법은 용해 완충제 및 샘플의 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하여 용해물을 생성하는 것을 추가로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 방법은 용해물을 원심분리하고 상청액을 수집하는 것을 추가로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 용해물을 12,000 rpm에서 2분 동안 실온에서 원심분리한다.
특정한 실시양태에서, 용해물 내의 적어도 하나의 핵산의 증폭은 PCR, qPCR, RT-PCR, 또는 RT-qPCR에 의해 수행된다.
특정한 실시양태에서, 용해물 내의 적어도 하나의 핵산의 증폭은 1-단계 RT-qPCR에 의해 수행된다.
특정한 실시양태에서, 방법은 RNA 추출 단계를 포함하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 용해물은 증폭에 직접 사용된다.
특정한 실시양태에서, 적어도 하나의 핵산은 RNA 바이러스로부터의 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 용해물을 수득하고, 용해물 내의 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하고, SARS CoV-2 게놈의 뉴클레오티드 서열 또는 SARS CoV-2의 변이체의 게놈으로부터 유래된 프라이머의 세트를 사용하여 cDNA를 PCR 검정에 적용하는 것을 포함하는, SARS CoV-2 또는 SARS CoV-2의 변이체로 감염된 대상체를 확인하는 방법에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서, 용해물은 생물학적 샘플을 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제, 글리세롤 및 적어도 1종의 염을 포함하는 용해 완충제와 접촉시킴으로써 수득된다.
특정한 실시양태에서, 방법은 RNA 추출 단계를 포함하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 용해물은 역전사에 직접 사용된다.
추가 측면에서, 본 발명은 샘플을 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, 용해물 내의 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하고, cDNA를 표적 핵산에 대한 프라이머의 세트를 사용하는 PCR 검정에 적용하는 것을 포함하는, 표적 핵산을 증폭, 확인, 검출 및/또는 분석하는 방법에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서, 용해물은 샘플을 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제, 글리세롤 및 적어도 1종의 염을 포함하는 용해 완충제와 접촉시킴으로써 수득된다.
특정한 실시양태에서, 방법은 RNA 추출 단계를 포함하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 용해물은 역전사에 직접 사용된다.
추가 측면에서, 본 발명은 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제, 글리세롤, 및 적어도 1종의 염을 포함하는 용해 완충제를 포함하는 키트에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서, 키트는 표적 핵산의 증폭을 위한 적어도 1종의 시약을 추가로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 키트는 표적 핵산의 증폭을 위한 적어도 1개의 프라이머 및/또는 적어도 1개의 프로브를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 키트는 1-단계 RT-qPCR을 사용한 RNA의 검출을 위한 키트이다.
특정한 실시양태에서, 키트는 적어도 1종의 리버스 트랜스크립타제, 적어도 1종의 DNA 폴리머라제, RNase 억제제, 뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 표지, 또는 그의 임의의 조합 중 1종 이상을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 표적 핵산은 RNA 바이러스로부터 유래된다.
특정한 실시양태에서, RNA 바이러스는 코로나바이러스이다.
특정한 실시양태에서, RNA 바이러스는 SARS CoV-2이다.
특정한 실시양태에서, 키트는 서열식별번호: 8 및/또는 서열식별번호: 9, 또는 그의 상보체 및 서열식별번호: 11 및/또는 서열식별번호: 12, 또는 그의 상보체로부터 선택된 프라이머의 세트를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 1-5% 트리톤 X-100 및 하기 성분: 5-20% 글리세롤, 0.5-4 mM DTT, 10-50 mM Na2HPO4, 및 10-50 mM 트리스-HCl 중 1종 이상을 포함하는 용해 완충제에 관한 것이다.
특정한 실시양태에서, 용해 완충제는 약 3% 트리톤 X-100 및 하기 성분: 약 10% 글리세롤, 약 2 mM DTT, 약 25 mM Na2HPO4, 및 약 25 mM 트리스-HCl 중 1종 이상을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 용해 완충제의 pH는 약 7.5 내지 약 8.0이다.
특정한 실시양태에서, 용해 완충제는 RNase-무함유 물을 추가로 포함한다.
특정한 실시양태에서, RNase-무함유 물은 약 1:15 내지 1:1 (용해 완충제:RNase-무함유 물)의 양으로 포함된다.
특정한 실시양태에서, 용해 완충제는 RNAse 억제제를 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 샘플을 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, 용해물 내의 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 핵산을 증폭시키는 방법에서 본 발명에 따른 용해 완충제의 용도에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 샘플을 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, 용해물 내의 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하고, RNA 바이러스의 핵산 서열로부터 유래된 프라이머의 세트를 사용하여 용해물 내의 RNA 바이러스로부터 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는, RNA 바이러스를 검출하는 방법에서 본 발명에 따른 용해 완충제의 용도에 관한 것이다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 1개의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 요금의 지불시 특허청에 의해 제공될 것이다.
본 개시내용의 성질, 목적 및 이점의 추가 이해를 위해, 하기 도면과 함께 작성된 하기 상세한 설명을 참조해야 하며, 여기서 유사한 참조 번호는 유사한 요소를 나타낸다.
도 1은 10명의 인간의 건강한 지원자의 비강 스왑으로부터 수득된 샘플 (S1-S10), 샘플이 없는 스왑 (스왑 단독, 음성 대조군), 및 주형이 없는 샘플 (NTC, 음성 대조군)에서의 상피 마커 CLDN1 및 인간 하우스키핑 유전자 RPL32에 대한 RT qPCR로부터의 증폭 곡선을 나타낸다. 적색: RPL32; 청색: CLDN1. 각각의 샘플에 대한 반응을 사중으로 수행하였다.
도 2는 도 1에 예시된 데이터의 요약을 제공한다. 각각의 샘플 (S1-S10 및 음성 대조군)에 대해, 좌측 막대는 CLDN1 검출을 나타내고, 우측 막대는 RPL32 검출을 나타낸다. 사이클 역치 (CT) 또는 교차점 (CP)은 측정된 형광이 배경 형광과 측정된 형광이 구별될 수 있는 값에 도달할 때까지의 PCR 증폭 동안의 사이클 수이다.
도 3은 표준 RNA 추출 바이러스 양성 대조군 (EAV)의 검출을 위한 RT qPCR의 민감도를 예시하는 증폭 곡선을 나타낸다.
도 4는 SARS CoV-2 E-유전자의 검출을 위한 RT qPCR의 민감도를 예시하는 증폭 곡선을 나타낸다.
도 5는 SARS CoV-2 N-유전자의 검출을 위한 RT qPCR의 민감도를 예시하는 증폭 곡선을 나타낸다.
도 6은 SARS CoV-2 RdRP 유전자의 검출을 위한 RT qPCR의 민감도를 예시하는 증폭 곡선을 나타낸다.
도 7은 SARS CoV-2 유전자 (E-유전자 및 RdRP 유전자)가 <20개 카피의 검출로 합성 SARS CoV-2 마커 올리고뉴클레오티드가 스파이킹된 10명의 건강한 인간 지원자로부터의 비강 스왑 (S1-S10)에서 검출될 수 있다는 것을 입증하는 증폭 곡선을 나타낸다. 각각의 샘플에 대한 반응을 사중으로 수행하였다.
도 8은 도 7에 예시된 데이터의 요약을 제공한다. 각각의 샘플 (S1-S10 및 음성 대조군)에 대해, 좌측 막대는 E-유전자 검출을 나타내고, 우측 막대는 RdRP-유전자 검출을 나타낸다. NTC = 주형이 없는 대조군; Pos대조군 RNA = 용해물이 없는 대조군. 사이클 역치 (CT) 또는 교차점 (CP)은 측정된 형광이 배경 형광과 측정된 형광이 구별될 수 있는 값에 도달할 때까지의 PCR 증폭 동안의 사이클 수이다.
상세한 설명
한 측면에서, 본 개시내용은 예를 들어:
(a) 임의로 세포를 포함하지 않거나 하나 이상의 세포, 예를 들어 상피 세포를 포함하는 샘플을 수득하는 단계,
(b) 샘플을 본 발명의 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하는 단계,
(c) 임의로 용해물을 동결시키는 단계,
(d) 필요한 경우, 용해물을 해동시키고, 필요한 경우, 용해물을 원심분리하는 단계,
(e) 원심분리가 필요한 경우, 상청액을 수집하고 새로운 반응 용기, 예컨대 반응 튜브 또는 마이크로타이터 플레이트로 옮기는 단계,
(f) 임의로 상청액을 동결시키는 단계,
(g) 필요한 경우, 상청액을 해동시키는 단계, 및
(h) 임의의 적합한 수단에 의해 표적 핵산을 증폭, 확인, 검출 및/또는 분석하는 단계
를 포함하는, 표적 핵산을 증폭, 확인, 검출, 정량화 및/또는 분석하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산의 증폭, 확인, 검출 및/또는 분석은 PCR 기술, 예컨대 예를 들어 PCR, qPCR, RT-PCR, RT-qPCR을 사용하여 수행된다. PCR 방법은 널리 공지되어 있고, 임의의 적합한 방법이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 표적 핵산의 증폭, 확인, 검출, 정량화 및/또는 분석은 예를 들어:
(1) qPCR 플레이트에서 대상체로부터의 적어도 하나의 바이러스 및/또는 하나 이상의 세포, 예를 들어 상피 세포를 용해시킴으로써 수득된 용해물에 PCR 마스터믹스(MasterMix), 예를 들어 qPCR 마스터믹스를 첨가하는 단계,
(2) 투명한 qPCR 호일로 qPCR 플레이트를 밀봉하는 단계,
(3) qPCR 플레이트를 원심분리하는 단계,
(4) PCR, 예를 들어 qPCR을 수행하는 단계, 및
(5) 데이터를 분석하는 단계
를 포함한다.
한 측면에서, 임의의 적합한 PCR 마스터믹스가 사용될 수 있다. qPCR 마스터믹스 제제를 포함한 여러 상업적 PCR 마스터믹스 제제가 이용가능하고, 본 발명에서 사용될 수 있다. 대안적으로, PCR 마스터믹스는 PCR 반응이 일어나는 데 필요한 성분, 예컨대 DNA 폴리머라제, 뉴클레오티드 및 마그네슘, 및 임의로 리버스 트랜스크립타제 및 RNase 억제제를 혼합함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, PCR 마스터믹스 및 용해물은 5:1 비 (PCR 마스터믹스 : 용해물)로 첨가된다.
한 측면에서, qPCR은 라이트사이클러(LightCycler)® 480 QPCR 판독기 (로슈(Roche))를 사용하는 1-단계 RT-PCR이다. 그러나, 임의의 적합한 PCR 기계가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 데이터는 라이트사이클러® 480 소프트웨어를 사용하여 분석된다. 그러나, 임의의 적합한 소프트웨어를 사용하여 PCR 데이터를 분석할 수 있다.
한 측면에서, 본원에 기재된 검정은 샘플 내의 약 20개 카피 이하, 약 10개 카피 이하, 약 5개 카피 이하, 약 4개 카피 이하, 약 3개 카피 이하, 또는 약 2개 카피 이하의 표적 핵산을 검출하기에 충분히 민감하다.
본원에 사용된 "계면활성제"의 의미는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인식되는 가장 넓은 정의이다. 즉, 계면활성제는 액체의 표면 장력을 낮추고/거나 두 액체 사이의 계면 장력을 낮추는 습윤제이다. 물에서 양전하 또는 음전하를 갖지 않지만 물에 가용성인 계면활성제는 "비-이온성 계면활성제"이다. 2종 이상의 비-이온성 계면활성제의 조합은 용어 "비-이온성 계면활성제" 내에 포괄된다.
한 측면에서, 본 발명은 용해 완충제를 특징으로 한다. 놀랍게도, 본 발명의 용해 완충제는 세포 및 바이러스의 용해에 적합하고, PCR 방법, 예컨대 리버스 트랜스크립타제 PCR (RT-PCR) 및 정량적 PCR (qPCR)에 의한 핵산의 증폭을 위한 반응 혼합물의 성분으로서 포함될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
용해 완충제는 막, 예컨대 세포 막 및 바이러스 막을 파괴할 수 있는 적어도 1종의 세제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제는 친수성 폴리에틸렌 옥시드 쇄 및 방향족 탄화수소 친지성 또는 소수성 기를 갖는다. 적합한 비-이온성 계면활성제는 트리톤 X-100, 이게팔(Igepal) CA-630 (노니데트(Nonidet) P-40), 콘코(Conco) NI, 다우팍스(Dowfax) 9N, 이게팔 CO, 마콘(Makon), 뉴트로닉스(Neutronyx) 600's, 노니폴(Nonipol) NO, 플리테르젠트(Plytergent) B, 레넥스(Renex) 600's, 솔라(Solar) NO, 스테록스(Sterox), 세르포닉(Serfonic) N, T-DET-N, 테르기톨(Tergitol) NP, 트리톤 N, BIGCHAP (N,N-비스-(3-D글루콘아미도프로필)콜아미드) 또는 데옥시-BIGCHAP (N,N-비스(3-글루콘아미도프로필) 데옥시콜아미드); 데카노일-N-메틸글루카미드; n-데실 α-D글루코피라노시드; n-데실 β-D-글루코피라노시드; n-데실 β-D-말토피라노시드; 디기토닌; n-도데실 β-D-글루코피라노시드; n-도데실 α-D-말토시드; n-도데실 β-D-말토시드; 헵타노일-N-메틸글루카미드; n-헵틸 β-D-글루코피라노시드; N-헵틸 β-D-티오글루코피라노시드; n-헥실 β-D-글루코피라노시드; 1-모노올레오일-rac-글리세롤; 노나노일-N-메틸글루카미드; n-노닐 α-D-글루코피라노시드; n-노닐 β-D-글루코피라노시드; 옥타노일-N-메틸글루카미드; n-옥틸 α-D-글루코피라노시드; n-옥틸 β-D-글루코피라노시드; 옥틸 β-D-티오갈락토피라노시드; 옥틸 β-D-티오글루코피라노시드; 폴리옥시에틸렌 에스테르 (예컨대 8-스테아레이트 폴리옥시에틸렌 에스테르 (미르즈(Myrj) 45), 40-스테아레이트 폴리옥시에틸렌 에스테르 (미르즈 52), 50-스테아레이트 폴리옥시에틸렌 에스테르 (미르즈 53), 및 100-스테아레이트 폴리옥시에틸렌 에스테르 (미르즈 59)), 폴리옥시에틸렌 에테르 (예컨대 1개 이상의 에틸 기, 메틸 기, 펜틸 기, 세틸 기, 스테아릴 기, 올레일 기, 헥실 기, 옥틸 기, 데실 기, 라우릴 기, 미리스틸 기, 헵틸 기, 트리데실 기, 이소헥사데실 기, 및 그의 조합을 함유하는 것); 폴리옥시에틸렌소르비탄 에스테르 (예컨대 "트윈" 시리즈의 세제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 1개 이상의 모노라우레이트 기, 모노올레에이트 기, 모노팔미테이트 기, 모노스테아레이트 기, 트리올레에이트 기, 및 트리스테아레이트 기, 및 그의 조합을 함유하는 것); 소르비탄 에스테르 (예컨대 1개 이상의 모노라우레이트 기, 모노올레에이트 기, 모노팔미테이트 기, 모노스테아레이트 기, 세스퀴올레에이트 기, 트리올레에이트 기, 트리스테아레이트 기, 및 그의 조합을 함유하는 것); 테르기톨; n-테트라데실 β-D-말토시드; 트리톤 X-100 (t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올) 및 그의 유도체, 트리톤 X-114, 트리톤 X-405, 트리톤 X-101, 트리톤 N-42, 트리톤 N-57, 트리톤 N-60, 트리톤 X-15, 트리톤 X-35, 트리톤 X-45, 트리톤 X-102, 트리톤 X-155, 트리톤 X-165, 트리톤 X-207, 트리톤 X-305, 트리톤 X-705-70 및 트리톤 B-1956; 노닐페닐 폴리에틸렌 글리콜 (노니데트 P-40; NP-40, 이게팔 CA630)을 포함하나 반드시 이에 제한되지는 않는 트리톤 시리즈의 세제; 서피놀(Surfynol) 104, 서피놀 420, 서피놀 440, 서피놀 465, 서피놀 485, 서피놀 504, 서피놀 PSA 시리즈, 서피놀 SE 시리즈, 디놀 604, 서피놀 DF 시리즈, 서피놀 CT 시리즈, 및 서피놀 EP 시리즈, 예를 들어 서피놀 104 시리즈 (104, 104A, 104BC, 104DPM, 104E, 104H, 104NP, 104PA, 104PG50, 104S), 및 서피놀 2502; 틸록사폴(Tyloxapol); n-운데실 β-D-글루코피라노시드, 및 임의의 비-이온성 옥틸페놀 에톡실레이트 계면활성제를 포함하나, 반드시 이에 제한되지는 않는 서피놀 계면활성제의 에어 프로덕츠(Air Products) 시리즈를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가의 비제한적 예는 다우팍스(DOWFAX) 63N10, 다우팍스 63N13, 다우팍스 63N30, 다우팍스 63N40, 다우팍스 81N13, 다우팍스 81N15, 다우팍스 92N20, 다우팍스 100N15, 다우팍스 EM-51, 다우팍스 20A42, 다우팍스 20A64, 다우팍스 20A612, 다우팍스 20B102, 다우팍스 DF-101, 다우팍스 DF-111, 다우팍스 DF-112, 다우팍스 DF-113, 다우팍스 DF-114, 다우팍스 DF-117, 다우팍스 WP-310, 다우팍스 50C15, 다우팍스 DF-121, 다우팍스 DF-122, 다우팍스 DF-133, 다우팍스 DF-141, 다우팍스 DF-142, 및 다우팍스 DF-161을 포함하나 반드시 이에 제한되지는 않는, 다우 케미칼스(Dow Chemicals)의 비-이온성 계면활성제의 다우팍스 시리즈, 예컨대 계면활성제의 N-시리즈 및 DP-시리즈를 포함한다. 또 다른 추가의 비제한적 예는 10R5, 17R2, 17R4, 25R2, 25R4, 31R1, F108 시리즈, F127 시리즈, F38 시리즈, F68 시리즈, F77 시리즈, F87 시리즈, F88 시리즈, F98 시리즈, L10, L101, L121, L31, L34, L43, L44 시리즈, L61, L62 시리즈, L64, L81, L92, N-3, P103, P104, P105, P123, P65, P84, P85 및 F127을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 바스프(BASF)로부터의 계면활성제의 플루로닉 시리즈를 포함한다.
임의의 적합한 양의 세제 및/또는 비-이온성 계면활성제가 용해 완충제에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트리톤 X-100을 약 0.05% 내지 약 20%의 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 약 0.05% 내지 약 15%, 약 0.05% 내지 약 10%, 약 0.05% 내지 약 7%, 약 0.05% 내지 약 5%, 약 0.05% 내지 약 4%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.05% 내지 약 2%, 약 0.05% 내지 약 1%, 또는 약 0.05% 내지 약 0.5%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 약 0.1% 내지 약 15%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 7%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 4%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.1% 내지 약 2% 또는 약 0.1% 내지 약 1%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 약 0.5% 내지 약 15%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 7%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 4%, 약 0.5% 내지 약 3%, 또는 약 0.5% 내지 약 2%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 7%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 4%, 약 1% 내지 약 3%, 또는 약 1% 내지 약 2%의 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트리톤 X-100을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 약 2% 내지 약 15%, 약 2% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 7%, 약 2% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 4%, 또는 약 2% 내지 약 3%의 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트리톤 X-100을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 약 3% 내지 약 15%, 약 3% 내지 약 10%, 약 3% 내지 약 7%, 약 3% 내지 약 5%, 또는 약 3% 내지 약 4%의 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트리톤 X-100을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 약 0.05%, 약 0.1%, 약 0.5%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 3.5%, 약 4%, 약 4.5%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 또는 약 15%의 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트리톤 X-100을 포함한다.
용해 완충제는 1종 이상의 다른 성분을 포함할 수 있고, 이들 성분은 본원에 개시된 예시적인 성분에 의해 제한되지 않지만, 용해 완충제는 전형적으로 용매, 예컨대 물, 유기 용매, 예컨대 글리세롤, 또는 둘 다를 함유할 것이다. 사용되는 용매가 가능한 한 순수하거나 실행가능한 것이 바람직하지만, 임의의 순도의 용매가 사용될 수 있다. 따라서, 물이 용해 완충제에 포함되는 경우, 이는 증류수, 이중-증류수, 탈이온수, 멸균수, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 물 또는 임의의 다른 용매 또는 물과 임의의 다른 용매의 조합인 용매는 하나 이상의 화학적 또는 생화학적 활성, 예컨대 뉴클레아제 (예를 들어, RNase, DNase) 활성 (이에 제한되지는 않음)을 감소 또는 제거하기 위해 사용 전에 처리될 수 있다. 예를 들어, 물 또는 임의의 다른 용매 또는 물과 임의의 다른 용매의 조합은 RNase-무함유일 수 있다. 마찬가지로, 용해 완충제는 조성물을 멸균하거나 또는 하나 이상의 바람직하지 않은 화학적 또는 생화학적 활성 (예를 들어, RNase, DNase 등)을 감소 또는 제거하기 위해 멸균 기술 또는 화학물질 또는 생물제제 등으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 용해 완충제는 RNase 억제제를 함유할 수 있다.
본 발명의 용해 완충제는 또한 1종 이상의 염, 예컨대 나트륨 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 망가니즈 염, 아연 염, 코발트 염, 또는 이들 염 중 2종 이상의 조합을 포함할 수 있다. 구체적인 예시적인 염은 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화마그네슘, 염화망가니즈 및 염화칼륨을 포함한다. 염은 임의의 적합한 양으로, 세포 또는 바이러스의 용해에서의 보조제로서, 계면활성제 흐림점 및 거품 수준의 완화를 위해, 및 핵산의 증폭에 수반되는 시약의 개선된 기능을 위한 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 이유로 첨가될 수 있다.
본 발명의 용해 완충제는 또한 핵산 증폭에 포함시키기에 적합한 1종 이상의 완충제, 예컨대 트리스-HCl (이에 제한되지는 않음)을 포함할 수 있다.
본 발명의 용해 완충제는 또한 1종 이상의 환원제를 포함할 수 있다. 환원제는 결합 (예컨대 디술피드 결합)을 파괴하는 것을 돕는데, 이는 RNA의 2차 구조를 느슨하게 하고, 리버스 트랜스크립타제 (RT) 효소 전사 개시를 용이하게 할 수 있다. 임의의 적합한 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 (DTT)이 용해 완충제에 포함될 수 있다.
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 발명의 용해 완충제는 아마도 감염된 세포 (예컨대 상피 세포) 뿐만 아니라 바이러스 둘 다의 용해에 필요하다. 후속 PCR 반응, 예컨대 RT-PCR을 방해하지 않는 한, 임의의 적합한 용해 완충제가 사용될 수 있다.
용해 완충제의 pH는 임의의 적합한 pH일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제의 pH는 약 6.5 내지 약 8.5 또는 약 7.0 내지 약 8.5이다. 예를 들어, 용해 완충제의 pH는 약 7.5 내지 약 8.5 또는 약 7.5 내지 약 8.0일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제의 pH는 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 또는 약 8.5이다.
본 발명의 용해 완충제는 농축된 스톡 용액으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 농축된 스톡 용액은 100X 스톡, 50X 스톡, 20X 스톡, 10X 스톡, 5X 스톡 또는 2X 스톡으로서 제제화될 수 있다.
본 발명의 용해 완충제는 사전에 제조될 수 있고, 임의로 사용 전에 희석될 수 있다. 용해 완충제는 후속 RT-PCR을 방해하지 않는 임의의 적합한 희석제에 희석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해 완충제는 사용 전에 물로 희석된다. 다른 실시양태에서, 용해 완충제는 배지, 예컨대 예를 들어 수송/저장 배지로 희석된다. 용해 완충제는 임의의 적합한 비로 희석될 수 있다. 예를 들어, 용해 완충제는 100:1, 50:1, 25:1, 20:1, 10:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:40, 1:50, 또는 1:100 (용해 완충제:희석제)으로 희석될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 용해 완충제는 1-5% 트리톤 X-100 및 하기 성분: 5-20% 글리세롤, 0.5-4 mM DTT, 10-50 mM Na2HPO4, 및 10-50 mM 트리스-HCl 중 1종 이상을 포함하는 농축 스톡일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 용해 완충제는 약 3% 트리톤 X-100 및 하기 성분: 약 10% 글리세롤, 약 2 mM DTT, 약 25 mM Na2HPO4, 및 약 25 mM 트리스-HCl 중 1종 이상을 포함하는 농축된 스톡일 수 있다. 농축 스톡의 pH는 약 7.5 내지 약 8.0, 바람직하게는 약 7.8일 수 있다.
농축된 스톡은 사용 전에 RNase-무함유 물과 같은 희석제로 희석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 농축된 스톡은 사용 전에 RNase-무함유 물로 1:15에서 1:1로 희석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 농축된 스톡은 사용 전에 RNase-무함유 물로 1:6으로 희석될 수 있다.
일부 측면에서, 용해 완충제에 대한 RNase 억제제는 사용 전에 첨가된다. 일부 실시양태에서, RNase 억제제는 사용 전에 약 1:100 내지 약 1:10000의 양으로 용해 완충제에 첨가된다. 일부 실시양태에서, RNase 억제제는 사용 전에 약 1:1000의 양으로 용해 완충제에 첨가된다.
방법
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 용해 완충제를 사용하여 적어도 하나의 세포 또는 바이러스를 용해시키는 방법을 제공한다. 방법은 적어도 하나의 세포 또는 바이러스를 세포 또는 바이러스가 용해되도록 하기에 충분한 시간의 양 동안 본 발명의 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다.
세포는 임의의 진핵 세포일 수 있다. 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 파충류 세포 및 곤충 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 관심 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 인간 세포, 원숭이 세포, 래트 세포, 마우스 세포, 개 세포, 고양이 세포, 돼지 세포, 말 세포, 햄스터 세포, 토끼 세포, 개구리 세포, 곤충 세포 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 상피 세포이다.
"적어도 하나의 세포"는 단일 세포뿐만 아니라 단일 세포 유형을 의미한다. 따라서, 둘 이상의 세포는 동일한 세포 유형의 2개 이상의 세포뿐만 아니라 2종의 상이한 세포 유형의 1개 이상의 세포를 의미할 수 있다. 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 단일 세포 유형의 집단이 존재하든 2종 이상의 세포 유형의 집단이 존재하든 상관이 없다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 방법 (하기 논의된 것 포함)은 언급된 효과를 제공할 것이다.
또한, 용어 "적어도 하나의 세포" 및 "세포"는, 달리 나타내지 않는 한, 단일 세포, 단일 유형의 세포의 집합, 또는 다중 유형의 세포의 집합 (각각의 유형의 적어도 1개의 세포가 존재함)을 정의하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
유사하게, 용어 "적어도 1종의 바이러스" 및 "바이러스"는, 달리 나타내지 않는 한, 단일 바이러스, 단일 유형의 바이러스의 집합, 또는 다중 유형의 바이러스의 집합 (각각의 유형의 적어도 1개의 바이러스가 존재함)을 정의하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 세포 또는 적어도 하나의 바이러스는 생물학적 샘플에 존재한다.
일부 측면에서, 생물학적 샘플은 스왑을 사용하여 수집된다. 예를 들어, 스왑을 사용하여 임의의 점막, 예컨대 코, 볼, 인두 또는 입으로부터 생물학적 샘플을 수집할 수 있다. 한 측면에서, 스왑을 사용하여 관심 세포, 예를 들어 상피 세포가 위치하는 임의의 장소로부터 샘플을 수집할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 비강 스왑이다. 또 다른 실시양태에서, 생물학적 샘플은 체액 (비인두 흡인물, 객담, 타액, 소변, 혈액 등), 배설물, 세척액 등이다.
생물학적 샘플은 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간으로부터의 것일 수 있다.
예를 들어 액체 샘플 및 표면으로부터의 도말과 같은 다른 유형의 샘플이 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
샘플은 임의로 용해 전에 임의의 적합한 수단에 의해 저장될 수 있다. 저장 수단은 샘플의 유형 및 저장 길이에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 실온 (예를 들어, 22-25℃)에서 저장되거나, 얼음 상에 놓이거나, 또는 단기 저장을 위해 냉장되거나 (예를 들어, 4℃), 또는 장기 저장을 위해 동결될 수 있다. 동결된 생물학적 샘플은 예를 들어 -20℃, -80℃ 또는 액체 질소에서 저장될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플, 예컨대 생물학적 샘플은 임의의 적합한 시간 동안 임의의 적합한 온도에서 저장하기 위해 수송 또는 저장 매체에 배치된다.
임의로 적어도 하나의 세포를 포함하는 샘플이 본 발명의 용해 완충제와 접촉되는 시간의 양은 다양할 수 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플이 본 발명의 용해 완충제와 접촉되는 시간의 양은 적어도 하나의 세포 또는 바이러스의 용해되도록 하기에 충분한 시간의 양이다. 용해 반응의 화학적 성질로 인해, 시간이 매우 짧을 수 있고, 예컨대 1초 이하일 수 있는 것으로 생각된다. 그러나, 시간은 그렇게 제한될 필요는 없다. 실제로, 용해 완충제가 핵산의 후속 저장 및/또는 증폭 동안 존재할 수 있기 때문에, 용해 시간은 비교적 길 수 있다. 적합한 시간은 1초 이하 내지 수분, 수시간 또는 수일의 범위일 수 있다. 예시적인 접촉 시간은 10초, 15초, 20초, 25초, 30초, 35초, 40초, 45초, 50초, 55초, 1분, 90초, 2분, 5분, 10분, 20분, 30분 또는 그 초과를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
다양한 실시양태에서, 추가의 임의적인 단계가 용해 방법에 포함된다. 세포 또는 바이러스 용해는 본 발명의 용해 완충제의 사용에 의해 추가의 단계 없이 발생할 것으로 입증되었다. 그러나, 용해를 촉진하기 위해, 세포 및/또는 바이러스는 하나 이상의 기계적 파괴 기술에 노출될 수 있다. 볼텍싱, 반복 피펫팅, 반전, 진탕 및 교반을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 공지된 기계적 파괴 기술이 사용될 수 있다. 따라서, 용해는 적어도 부분적으로 균질화에 의해 달성될 수 있다. 용해물의 궁극적인 용도에 따라, 기계적 기술은, 사용될 때, 핵산에 대한 전단 응력을 최소화하기 위해 부드럽게 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해는 적어도 부분적으로 생물학적 또는 생화학적 물질의 작용을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 용해는 프로테이나제, 예컨대 프로테이나제 K의 존재 하에 달성될 수 있다.
임의의 적합한 부피의 용해 완충제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있고, 샘플에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 50 μl, 약 100 μl, 약 200 μl 또는 그 초과의 부피의 용해 완충제가 사용된다. 일부 실시양태에서, 100 μl 부피의 용해 완충제가 사용된다.
용해물의 동결은 세포 및/또는 바이러스 용해를 개선시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 용해물은 분석 전에 임의로 동결될 수 있다. 용해물은 1회 또는 1회 초과로 동결될 수 있다. 다시 말해서, 용해물은 1회 또는 복수의 동결-해동 사이클에 적용될 수 있다. 임의의 적합한 조건을 사용하여 용해물을 동결시킬 수 있다. 온도 및 지속기간은 다양한 인자, 예컨대 샘플의 크기 및 유형 및 용해물의 양에 따라 최적화될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 용해물은 분석 전에 -20℃ 이하의 온도에서 인큐베이션된다. 예를 들어, 용해물은 분석 전에 약 -20℃, 약 -80℃, 또는 약 -120℃로부터 선택되지만 이에 제한되지는 않는 온도에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해물은 분석 전에 드라이 아이스 상에 놓인다. 용해물은 임의의 적합한 시간의 양 동안 상기 기재된 바와 같이 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해물은 -20℃ 이하의 온도에서 적어도 약 10분 동안 인큐베이션될 수 있다. 예를 들어, 용해물은 -20℃ 이하의 온도에서 약 10분, 약 30분, 약 1시간, 또는 약 24시간, 또는 그 초과 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해물은 분석 전에 -80℃의 온도에서 10분 동안 인큐베이션된다.
용해 방법의 또 다른 임의적인 단계는 사용 전 소정 기간 동안 용해물을 저장하는 것이다. 이러한 실시양태에서, 용해물은 임의의 수의 온도에서 저장될 수 있다. 예를 들어, 이는 비교적 고온 (예를 들어, 37℃), 실온 (예를 들어, 22℃ - 25℃)에서, 냉장고 (예를 들어, 4℃)에서, 동결 (예를 들어, -20℃) 또는 급속 동결 (예를 들어, -80℃ 이하)되어 저장될 수 있다.
용해 방법은 또한 세포 및/또는 바이러스 성분을 다른 세포 및/또는 바이러스 성분으로부터 분리하도록 하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 방법은 용해물을 원심분리하여 용해되지 않은 세포 및/또는 바이러스, 세포 및/또는 바이러스 막 및 단백질을 핵산으로부터 제거하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하지는 않지만, 이는 또한 예를 들어 1종 이상의 염, 유기 용매 (예를 들어, 알콜)의 첨가에 의해, 또는 열 처리 및 후속 원심분리를 통해 다른 것으로부터 1종 이상의 세포 또는 바이러스 성분을 침전시키는 것을 포함할 수 있다. 세포 및/또는 바이러스 성분을 서로 분리하기 위한 다른 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있으며, 각각은 목적하는 결과에 기초하여 선택된다. 적절한 기술의 선택 및 수행은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 수준 내에 있다.
용해 방법은 또한 1개 이상의 용해물 성분의 조작을 포함할 수 있다. 따라서, 방법은 용해물로부터의 하나 이상의 핵산의 정제 및/또는 용해물로부터의 하나 이상의 핵산의 증폭을 포함할 수 있다. 용해 방법의 다양한 실시양태는 용해물과 함께 사용하는 것으로 공지된 임의의 모든 절차를 포함한다.
한 실시양태에서, 적어도 하나의 세포 및/또는 적어도 하나의 바이러스를 용해시키는 방법은 본 발명의 용해 완충제를 적어도 하나의 세포 및/또는 적어도 하나의 바이러스에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 용해 완충제 및 적어도 하나의 세포 및/또는 적어도 하나의 바이러스의 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 샘플을 본 발명의 용해 완충제와 혼합하는 것을 포함하는, 샘플을 용해시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 스왑, 예컨대 비강 스왑이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 적어도 하나의 세포, 예컨대 상피 세포 및/또는 적어도 하나의 바이러스, 예컨대 코로나바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비강 스왑을 본 발명의 용해 완충제 100 μl에 넣는다. 일부 실시양태에서, 방법은 비강 스왑을 짜내어 샘플을 용해 완충제 내로 방출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 용해 완충제 및 생물학적 샘플의 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하여 용해물을 생성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 용해물을, 예를 들어 12,000 rpm에서 2분 동안 실온에서 원심분리하고, 상청액을 수집하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 1개 이상의 핵산을 증폭시키는 방법을 제공한다. 일반적으로, 방법은 샘플을 본 발명의 용해 완충제와 접촉시켜 상기 기재된 바와 같은 용해물을 생성하고, 용해물 내의 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것을 포함한다.
핵산의 증폭을 위한 수많은 기술이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 광범위하게 실시되며, 이들 기술 중 임의의 것이 본 발명의 방법에 따라 적용가능하다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 속도, 감수성, 특정한 유형의 핵산 (예를 들어, RNA 대 DNA)을 증폭시키는 데 있어서의 유용성, 및 신뢰성을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 수의 고려사항에 기초하여 증폭 방법을 선택할 수 있다.
방법이 핵산의 단리 또는 정제 (적어도 어느 정도까지)를 포함할 수 있지만, 놀랍게도 표적 핵산의 증폭이 핵산의 사전 정제 없이 달성될 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 용해물은 직접적인 핵산 증폭에 적합하다. 일부 실시양태에서, 증폭은 PCR 기술에 의한 것이다. 특정 실시양태에서, PCR 기술은 qPCR 또는 RT-PCR (RT-qPCR 포함)이다.
1개 이상의 RNA가 관심 핵산인 경우, 본 방법은 증폭 이전에, 또는 증폭 시점에 cDNA 합성을 포함할 수 있다. 수많은 cDNA 합성 프로토콜이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 임의의 적합한 프로토콜이 사용될 수 있다. 예를 들어, 퀀타바이오(Quantabio)로부터의 qScript XLT 리버스 트랜스크립타제를 사용하여 RNA 주형으로부터 cDNA를 제조할 수 있다.
본 발명의 방법은 포유동물 생물학적 샘플, 예컨대 비강 스왑, 또는 비-생물학적 샘플 내에서 바이러스 RNA 또는 DNA를 검출하는 데 사용하기에 특히 매우 적합한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 방법은 통상적인 바이러스 RNA 또는 DNA 검출 검정에 비해 여러 이점을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 RNA 추출 단계에 대한 필요성을 피함으로써, 노동력을 감소시키고 본 발명의 방법을 더 빠르게 만든다. RNA 추출 키트, 예컨대 현재 미국 COVID-19 시험에서 질병 관리 예방 센터 (CDC)에 의해 요구되는 QIAamp® DSP 바이러스 RNA 미니 키트 (퀴아젠(Qiagen))는 일반적으로 증폭 방법을 방해할 수 있는 성분으로부터 핵산을 분리 및 정제하기 위한 칼럼을 함유한다. 따라서, RNA 추출 단계의 제거는 또한 칼럼이 필요하지 않기 때문에 물질 소비를 감소시킨다. 또한, RNA 추출에 필요한 시약이 항상 용이하게 이용가능한 것은 아니며, 따라서 이들 시약의 제거는 검정의 이용가능성을 증가시킨다. 이는 범유행 동안, 예를 들어 높은 부피의 시험 샘플이 분석될 필요가 있고 신속한 결과가 수득되는 경우에 특히 중요할 수 있다. 정확하고 민감한 바이러스 RNA 검출을 위한 고처리량의 신속한 방법을 제공하는 것은 유의한 이점이다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 생물학적 또는 비-생물학적 샘플 (예를 들어, 비강 스왑)을 용해 완충제와 함께 인큐베이션하고, 용해물을 RT-PCR (예를 들어, 1-단계 RT-qPCR)에 직접 사용하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 RNA 또는 DNA 추출 단계 없이 수행된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 대조군 반응, 예컨대 증폭되는 핵산의 양을 공동으로 수행되는 다른 증폭 반응과 관련하여, 또는 표준 증폭 곡선과 관련하여 정규화하는 것을 허용하는 대조군 반응이 포함된다. 이러한 대조군 반응은 하나 이상의 외인성 핵산을 반응에 첨가하고 그 핵산에 대한 증폭을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 대조군 반응은 관심 세포 또는 생물학적 샘플 내에 천연적으로 존재하는 핵산 내에 존재하는 서열을 증폭시키는 것을 포함할 수 있고, 이때 이러한 서열은 카피수 및 증폭 효율이 공지되어 있다. 다른 실시양태에서, 공지된 서열에 대한 대조군 반응은 관심 증폭이 수행되는 반응 용기와 별개의 반응 용기에서 수행된다. 다양한 다른 대조군 반응이 공지되어 있고, 증폭 반응에 널리 사용되며, 이들 대조군 반응 중 임의의 것이 증폭 과정에서의 1개 이상의 단계의 성공 및 효율을 결정하기 위해 본 발명의 방법에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대조군 반응은 진료의가 특정한 세포 용해물 샘플에 존재하는 세포의 수를 평가하고, 따라서 원하는 경우에 정규화하도록 하는 내부 대조군이다. 이러한 방식으로, 샘플 중 표적 핵산 (예를 들어, 특정 바이러스 RNA 또는 DNA 유전자)의 양에 관한 결론을 내릴 수 있다. 보다 구체적으로, 2개의 상이한 샘플의 증폭 결과를 비교할 때, 원래의 샘플 내의 세포 또는 바이러스의 수, 성공적으로 용해된 세포 또는 바이러스의 수, 또는 각각의 샘플로부터 유리된 핵산의 총량을 높은 정확도로 결정하는 것은 종종 가능하지 않다. 따라서, 상이한 샘플에서의 표적 핵산의 총량을 정확하게 비교하는 것은 가능하지 않다. 현재, 하우스키핑 유전자 또는 rRNA 종은 상이한 세포 또는 조직으로부터의 샘플을 표준화 또는 정규화하기 위한 마커로서 사용된다. 그러나, 현재 사용되는 내부 표준은 일관성이 없는 것으로 보고되었고, 따라서 내부 대조군에 필요한 정확도 및 반복성을 제공하지 않는다.
따라서, 상이한 샘플 및 세포 유형 사이에서 표준화된 내부 대조군은 PCR 프로토콜의 바람직한 특징이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 주어진 세포 또는 바이러스의 1개 이상의 염색체 상의 고유한 서열에 특이적인 프라이머를 조성물, 방법 및 키트 내에 포함시킴으로써 이러한 내부 대조군을 포괄한다. 이들 고유한 게놈 서열은 반수체 게놈당 단지 1개의 카피 (즉, 세포당 2개의 카피)로 존재하기 때문에, 이들은 특정한 증폭 절차를 위한 표준 곡선을 제조하는 데 사용될 수 있다. 시험 샘플에 대한 증폭 반응 (동일한 반응 용기 또는 동일한 성분을 포함하는 제2 반응 용기)에 프라이머를 포함시키면 고유한 게놈 서열에 대한 증폭 곡선이 생성된다. 이들 곡선을 각각의 프라이머 세트에 대한 표준 곡선과 비교할 수 있고, 핵산의 양, 및 따라서 원래의 샘플 내의 세포 또는 바이러스의 수를 계산할 수 있다. 이러한 지식으로, 다수의 상이한 샘플 내의 표적 핵산의 양을 결정할 수 있고, 다른 샘플과 정확하게 비교할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 용해 완충제를 사용하여 RNA 또는 DNA 바이러스를 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 RNA 또는 DNA 바이러스, 예컨대 비제한적으로 토가바이러스, 코로나바이러스, 레트로바이러스, 피코르나바이러스, 칼리시바이러스, 레오바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 랍도바이러스, 부이나바이러스, 아레나바이러스 또는 피보바이러스를 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 바이러스는 코로나바이러스, 예컨대 비제한적으로 코로나 SARS 바이러스, 예컨대 SARS CoV 또는 SARS CoV-2 또는 이들 바이러스의 변이체이다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 SARS CoV-2를 검출하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 SARS CoV-2로 감염된 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 용해물을 수득하고, 용해물 내의 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하고, SARS CoV-2 게놈의 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 프라이머의 세트를 사용하여 cDNA를 PCR 검정에 적용하는 것을 포함하는, SARS CoV-2로 감염된 대상체를 확인하는 방법에 관한 것이다.
프라이머
임의의 적합한 프라이머가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 적합한 프라이머는 확인될 관심 표적 핵산에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 관심있는 공통 핵산을 확인하는 데 유용한 몇몇 프라이머는 상업적으로 입수가능하고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 프라이머는 RNA 바이러스 게놈, 예컨대 SARS CoV-2 게놈 또는 SARS CoV-2 변이체의 게놈에 대한 것이다. 완전한 SARS CoV-2 게놈 서열은 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 MN908947.3에서 찾아볼 수 있다. SARS CoV 함유 프라이머의 검출을 위한 키트는 다양한 판매업체로부터 상업적으로 입수가능하다. 이러한 프라이머가 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 E 유전자, N 유전자, 또는 RdRP 유전자에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 E 유전자에 대한 것이고, 서열식별번호: 8 및/또는 서열식별번호: 9, 또는 그의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 RdRP 유전자에 대한 것이고, 서열식별번호: 11 및/또는 서열식별번호: 12, 또는 그의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진다.
프로브
임의의 적합한 핵산 프로브가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 적합한 핵산 프로브는 확인될 관심 표적 핵산에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 관심 공통 핵산을 확인하는 데 유용한 몇몇 프로브는 상업적으로 입수가능하고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 프로브는 RNA 또는 DNA 바이러스 게놈, 예컨대 SARS CoV-2 게놈, SARS CoV-2 변이체의 게놈에 대한 것이다. SARS CoV 함유 핵산 프로브의 검출을 위한 키트는 다양한 판매업체로부터 상업적으로 입수가능하다. 이러한 프로브가 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, 핵산 프로브는 E 유전자, N 유전자, 또는 RdRP 유전자에 대한 것이다. 일부 실시양태에서, 핵산 프로브는 E 유전자에 대한 것이고, 서열식별번호: 7, 또는 그의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 핵산 프로브는 RdRP 유전자에 대한 것이고, 서열식별번호: 10, 또는 그의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 프로브는 5' 및/또는 3' 말단에서, 예를 들어 형광단 및/또는 켄처로 태그부착될 수 있다. 태그는 임의의 적합한 태그, 예컨대 HEX 태그 또는 BHQ1 태그일 수 있다.
본원에 기재된 RT-qPCR 프로토콜은 CoV-2에 대한 표준 진단 택맨-기반 RT-qPCR 방법에 기초한다. 원칙적으로, 프로토콜은 다양할 수 있고, 예컨대 예를 들어 다른 바이러스 유전자가 측정될 수 있고, 상이한 프라이머 및 프로브 서열, 상이한 마스터 믹스, 켄처, 형광단, 장치 등이 사용될 수 있다. 다른 RT-qPCR 방법, 예컨대 sybr 그린 기반 방법이 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
키트가 또한 제공된다. 일반적으로, 키트는 본 발명의 용해 완충제를 함유한다. 키트는 세포 또는 바이러스의 용해, 핵산 또는 세포 용해물의 저장, 또는 핵산의 조작 또는 분석, 예컨대 핵산의 증폭을 위해 사용될 수 있는 1종 이상의 물질, 시약 등을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 바이러스를 용해시키고/거나, 핵산을 증폭시키고/거나, 핵산을 정제하는 데 필요한 물질, 시약 등의 일부 또는 전부가 키트에 포함된다.
예를 들어, 키트는 본 발명의 용해 완충제를 보유하는 용기, 및 동일한 또는 별개의 용기 내에 표적 핵산의 증폭을 위한 적어도 하나의 시약을 함유할 수 있다. 따라서, 이는 표적 핵산의 증폭을 위한 적어도 1개의 프라이머, 예컨대 2개의 프라이머를 포함할 수 있다. 이는 또한, 반드시는 아니지만, 키트 내의 1개 이상의 다른 프라이머(들)에 대한 표적인 동일한 핵산 (및 심지어 동일한 핵산 내의 동일한 서열)일 수 있는, 표적 핵산의 증폭을 위한 적어도 1개의 다른 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 1개 이상의 고유한 게놈 서열을 증폭시키기 위한 2개 이상의 프라이머를 포함한다.
본 발명의 키트는 본 발명의 용해 완충제를 추가로 포함하는, 핵산의 분석을 위한 키트일 수 있다. 예를 들어, 이는 본 발명의 용해 완충제를 함유하는 적어도 1개의 용기를 추가로 포함하는, 1-단계 RT-qPCR을 사용하여 RNA를 검출하기 위한 키트일 수 있다. 이러한 키트는 적어도 1종의 리버스 트랜스크립타제, 적어도 1종의 DNA 폴리머라제, 예컨대 Taq DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, Pfx DNA 폴리머라제, Tli DNA 폴리머라제, Tfl DNA 폴리머라제, 및 클레나우, RNase 억제제, 뉴클레오티드 (예를 들어, 임의의 또는 모든 4종의 공통 데옥시뉴클레오티드), 프라이머, 프로브, 또는 표지 (예컨대, 예를 들어 SYBR 그린), 또는 이들 중 2종 이상의 임의의 조합을 패키징된 조합으로 포함할 수 있다. 대안적으로, 이는 2-단계 RT-qPCR을 사용한 RNA의 검출에 사용될 수 있는 키트일 수 있다. 대안적으로, 키트는 PCR 기술, 예컨대 qPCR을 사용한 DNA의 검출에 사용될 수 있는 것일 수 있다. 또한, 키트는 짧은 간섭 RNA (siRNA)의 검출에 사용되는 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 형질감염 또는 형질전환 시약을 포함한다.
키트는 성분을 단일 패키지 내에 또는 동일한 키트 내의 하나 초과의 패키지 내에 포함할 수 있다. 하나 초과의 패키지가 키트 내에 포함되는 경우, 각각의 패키지는 독립적으로 단일 성분 또는 다중 성분을 임의의 적합한 조합으로 함유할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 단일 키트 내의 둘 이상의 패키지 또는 용기의 조합물은 "패키징 조합된" 것으로 지칭된다. 키트 및 키트 내의 용기는 임의의 공지된 물질로 제작될 수 있다. 예를 들어, 키트 자체는 플라스틱 물질 또는 판지로 제조될 수 있다. 성분을 보유하는 용기는 예를 들어 플라스틱 물질 또는 유리일 수 있다. 하나의 키트 내의 상이한 용기는 상이한 물질로 제조될 수 있다. 실시양태에서, 키트는 그 내에 또 다른 키트를 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 핵산을 정제하기 위한 키트를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 표적 서열을 증폭시키는 데 유용한 1종 이상의 성분을 포함할 수 있다. 실시양태에서, PCR을 수행하는 데 필요한 시약 및 공급물의 일부 또는 전부가 키트에 포함된다. 일부 실시양태에서, qPCR을 수행하기 위한 일부 또는 모든 시약 및 공급물이 키트에 포함된다. 다른 실시양태에서, RT-PCR을 수행하기 위한 일부 또는 모든 시약 및 공급물이 키트에 포함된다. 시약의 비제한적 예는 완충제 (예를 들어, 트리스, HEPES 등을 함유하는 완충제), 염 및 주형 의존성 핵산 연장 효소 (예컨대 열안정성 효소, 예컨대 Taq 폴리머라제), 효소의 활성에 적합한 완충제, 및 효소에 의해 필요한 추가의 시약, 예컨대 dNTP, dUTP 및/또는 UDG 효소이다. 공급기의 비제한적 예는 반응 용기 (예를 들어, 미세원심분리 튜브)이다.
키트는 dsDNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는 핵산을 검출하기 위한 적어도 1종의 염료를 포함할 수 있다. 실시양태에서, 키트는 dsDNA를 검출하는 서열-비-특이적 염료, 예컨대 SYBR® 그린 염료 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 오리건주 유진)를 포함한다. 염료는 바람직하게는 용기에 단독으로 함유된다. 실시양태에서, 염료는 농축된 스톡 용액, 예를 들어 50X 용액으로서 제공된다. 실시양태에서, 키트는 수동 참조 염료를 포함한다. 이들 실시양태에서, 수동 참조 염료는 별개의 용기에서 키트에 단독으로 포함될 수 있다. 수동 참조 염료는 농축된 스톡 용액으로서, 예를 들어 1 mM 스톡 용액으로서 제공될 수 있다. 비-배타적 예시적인 수동 참조 염료는 ROX 염료이다. 실시양태에서, 키트는 DNA-검출 염료 또는 수동 참조 염료를 함유한다. 다른 실시양태에서, 키트는 DNA-검출 염료 및 수동 참조 염료 둘 다를 함유한다.
본 발명은 일반적으로 연구 및 진단 둘 다에 사용하기에 적합하다. 즉, 본 발명의 조성물 및 방법은 다양한 핵산 또는 발현된 유전자를 확인하기 위해, 또는 다른 연구 목적을 위해 사용될 수 있다. 마찬가지로, 조성물 및 방법은 인간 및 동물의 수많은 질환 또는 장애를 진단하는 데 사용될 수 있다. 또한, 이들은 이환된 또는 달리 오염된 식제품 (예를 들어, 1종 이상의 병원성 유기체로 감염된 식품), 또는 샘플 중 독성 물질 또는 독소-생산 유기체의 존재를 확인하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 조성물 및 방법은 인간 건강 및 수의학적 적용, 뿐만 아니라 식품 시험 및 국토 안보 적용을 갖는다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 잘 이해될 수 있으며, 이는 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
물질 및 방법
비강 스왑을 크라프트 코튼 스왑 (카탈로그 번호 87104**260; 타미야(Tamiya))을 사용하여 수집하고, 100 μl 용해 완충제 (3% 트리톤 X-100, 10% 글리세린, 2 mM DTT, 25 mM Na2HPO4, 25 mM 트리스(TRIS) HCL; pH 7.8)를 함유하는 1.5 ml 반응 튜브 또는 딥 웰 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 용해 완충제를 실온에서 저장하고, 사용 전에 RNase-무함유 물 (인비트로젠(Invitrogen), 초순수 증류수 Dnase/Rnase 무함유, 10977-035)로 1:6 희석하였다. 사용 당일에: 100 μl 샘플 용해 부피당 0.1 μl RNAse 억제제 (NEB, M0314L, 40 U/μl).
스왑을 용해 완충제에 넣은 후, 스왑을 눌러 샘플을 용해 완충제 내로 방출하고, 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 직접 사용을 위해 얼음 상에서 유지하거나, -20℃ (단기) 또는 -80℃ (장기 저장)에서 동결시켰다.
사용 전에, 샘플을 해동시키고 (필요한 경우), 12,000 rpm에서 2분 동안 실온에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 새로운 반응 튜브 또는 딥 웰 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 샘플은 임의로 실시간 1-단계 RT-PCR로 진행하기 전에 이 단계에서 동결될 수 있다.
실시간 1-단계 RT-PCR 검정을 위해, 10 μl 멀티피펫 또는 자동화 피펫팅 시스템 (예를 들어, 사이비 웰 배리오(Cybi Well Vario), 아날리틱 제나(Analytik Jena))을 사용하여 2 μl 용해물을 384-웰 QPCR 마이크로플레이트 (라이트사이클러® 480 멀티웰 플레이트 384 화이트, 4 바코드 번호: 05217555001)로 옮겼다. 8 μl PCR 마스터믹스 (퀀타바이오, 울트라플렉스(UltraPlex)™ 1-단계 터프믹스(ToughMix)®, 번호: 95166-01K)를 100 μl 멀티피펫 또는 분배기를 사용하여 첨가하였다. 이어서, 마이크로플레이트를 투명한 qPCR 호일 (마이크로앰프(MicroAmp)™ 광학 접착 필름, 써모사이언티픽(ThermoScientific), 4311971)을 사용하여 수동으로 또는 가열 밀봉기로 밀봉하고, 1500 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 1-단계 RT-PCR을 LC480 (로슈, 384 웰)을 사용하여 수행하고, 데이터를 LC480 소프트웨어로 분석하였다. 사이클 역치 (CP 또는 Cp)를 각각의 반응에 대해 계산하고, 이는 측정된 형광이 배경 형광과 측정된 형광이 구별될 수 있는 값에 도달할 때까지의 PCR 증폭 동안의 사이클 수를 나타낸다.
프로브/프라이머:
CLDN1 (유전자 ID: 9076; 클라우딘 1, 인간 상피 세포 마커)
CLDN1_프로브: 5'_HEX-CAGGCTCTCTTCACTGGCTGGGC-BHQ1_3' (서열식별번호: 1)
CLDN1_F1 (정방향 프라이머): 5'-CCAGTCAATGCCAGGTACGA-3' (서열식별번호: 2)
CLDN1_R1 (역방향 프라이머): 5'-GAAGGCAGAGAGAAGCAGCA-3' (서열식별번호: 3)
RPL32 (유전자 ID: 6161; 리보솜 단백질 L32; 인간 하우스키핑 유전자)
RPL32_프로브: 5'_HEX-AATTAAGCGTAACTGGCGGAAACCC-BHQ1_3' (서열식별번호: 4)
RPL32_F1 (정방향 프라이머): 5'-GCACCAGTCAGACCGATATGT-3' (서열식별번호: 5)
RPL32_R1 (역방향 프라이머): 5'-ACCCTGTTGTCAATGCCTCT-3' (서열식별번호: 6)
E 유전자 사르베코(Sarbeco) (E 유전자, SARS CoV2 유전자)
E_유전자 사르베코_P1 (프로브): 5'-Hex-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ-1-3' (서열식별번호: 7)
E_유전자 사르베코_F1 (정방향 프라이머): 5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3' (서열식별번호: 8)
E_유전자 사르베코_R2 (역방향 프라이머): 5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3' (서열식별번호: 9)
RdRP_SARSr (RdRP SARS CoV2 유전자; SARS CoV2에 특이적임, SARS CoV는 검출되지 않을 것임)
RdRP_SARSr-P2 (프로브): 5'-Hex-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-BHQ-1-3' (서열식별번호: 10)
RdRP_SARSr-F2 (정방향 프라이머): 5'-GTGARATGGTCATGTGTGGCGG-3' (서열식별번호: 11)
RdRP_SARSr-R1 (역방향 프라이머): 5'-CARATGTTAAASACACTATTAGCATA-3' (서열식별번호: 12)
실시예 1 - 상피 세포의 검출.
상피 마커 CLDN1 및 인간 하우스키핑 유전자 RPL32에 대한 RT qPCR을 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게, 10명의 건강한 인간 지원자로부터의 비강 스왑을 수집하고, 상기 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 용해시켰다. 용해물을 동결 없이 RT qPCR에 직접 사용하였다. 대조군 샘플은 스왑 단독 (샘플 없는 스왑) 및 NTC (주형이 없는 대조군)를 포함하였다.
CLDN1 및 RPL32 프로브 및 프라이머는 반응에서 각각의 올리고의 최종 농도가 333 nM이도록 포함되었다.
PCR 반응 설정: 2.5 μl 울트라플렉스 1-단계 터프 믹스 (4X), 2.5 μl 프라이머/프로브 믹스, 2.0 μl 용해된 비강 샘플 분취물, 3.0 μl RNase-무함유 물.
PCR 프로토콜: 역전사를 50℃에서 10분 동안 수행한 후, 95℃에서 5분 동안 변성시켰다. 45 사이클: 1분 95℃ + 30초 60℃, 또는 보다 바람직하게는 15초 95℃ + 1분 60℃. 사이클링 후, 냉각을 40℃에서 30초 동안 수행하였다.
각각의 샘플로부터의 증폭 곡선은 도 1에 제공되고, 도 2에 요약된다. 이들 데이터는 유전자가 RNA 추출 단계의 포함 없이 제조된 비강 스왑 샘플로부터 신뢰할 수 있게 검출될 수 있음을 예시한다. 검출 수준의 가변성은 개별 샘플링에 기인할 수 있다.
실시예 2 - RT qPCR에 의한 바이러스 유전자 검출의 감수성
사용된 RT-qPCR 프로토콜은 하기: 8분 RT 단계를 사용함을 제외하고는 티브 몰비올(TIB MOLBIOL)/로슈 키트 매뉴얼에 기재된 바와 같았다. 임의로, 울트라플렉스™ 1-단계 터프믹스®를 로슈 RNA 바이러스 마스터 믹스 대신에 사용하였다. 프로토콜은 하기 표 1에 제공된다.
표 1.
Figure pct00001
바이러스 RNA 추출 키트 (라이트믹스(LightMix)® 모듈러 EAV RNA 추출 대조군, 티브 몰비올 카탈로그 번호 58-0909-96)에서 통상적으로 사용되는 바이러스 양성 대조군의 검출을 위한 RT qPCR의 민감도를 시험하였다. 이는 바이러스 주형 RNA를 PCR 믹스에 다양한 희석 (희석하지 않음, 1:10, 1:100, 1:1000)으로 첨가한 전형적인 RT qPCR 반응이었다. 용해물은 사용하지 않았다. 이 유전자에 대한 RT qPCR의 감도를 시험하였다. 증폭 곡선은 도 3에 제시되고, 데이터는 하기 표 2에 제공된다.
표 2.
Figure pct00002
3종의 CoV-2 유전자: E-유전자 (라이트믹스® 모듈러 SARS 및 우한(Wuhan) CoV E-유전자, 티브 몰비올 카탈로그 번호 53-0776-96), N-유전자 (라이트믹스® 모듈러 SARS 및 우한 CoV N-유전자, 티브 몰비올 카탈로그 번호 53-0775-96), 및 RdRP-유전자 (라이트믹스® 모듈러 우한 CoV RdRP-유전자, 티브 몰비올 카탈로그 번호 53-0777-96)의 검출을 위한 RT qPCR의 민감도를 EAV 양성 대조군의 검출에 대해 상기 기재된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 다양한 농도의 각각의 유전자를 PCR 믹스 (2X 스톡, 1X 스톡, 1:10 희석, 1:100 희석)에 포함시켰으며, 이는 시험된 대략 1000개의 카피 (2X), 500개의 카피 (1X), 50개의 카피 (1:10) 및 5개의 카피 (1:100)에 상응한다.
E-유전자의 검출을 위한 증폭 곡선은 도 4에 제시되고, 데이터는 하기 표 3에 제공된다.
표 3.
Figure pct00003
N-유전자의 검출을 위한 증폭 곡선은 도 5에 제시되고, 데이터는 하기 표 4에 제공된다.
표 4.
Figure pct00004
SARS CoV-2의 검출에 특이적인 RdRP-유전자의 검출을 위한 증폭 곡선은 도 6에 제시되고, 데이터는 하기 표 5에서 제공된다.
표 5.
Figure pct00005
실시예 3 - 비강 스왑 용해물에서의 CoV-2 유전자의 검출
실시예 2에서 시험된 바이러스 유전자 중 2종 (E-유전자 및 RdRP 유전자)에 대한 RT qPCR을 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게, 10명의 건강한 인간 지원자로부터의 비강 스왑 (S1-S10)을 수집하고, 상기 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 용해시켰고, 이에 CoV-2 RNA 주형 (티브몰비올)을 첨가 (스파이킹)하였다. 용해물을 동결 없이 RT qPCR에 직접 사용하였다.
각각의 샘플 S1-S10에 대해, 하기 반응을 수행하였다: 1) E-유전자_샘플 (CoV-2 RNA 주형이 첨가되지 않음; E-유전자 프로브/프라이머가 포함됨); 2) E-유전자_스파이크RNA (CoV-2 RNA 주형이 첨가됨; E-유전자 프로브/프라이머가 포함됨); 3) E-유전자_PosCntlRNA (CoV-2 RNA 주형 단독; E-유전자 프로브/프라이머가 포함됨); 4) NTC_E-유전자 (주형 음성 대조군 없음); 5) RdRP-유전자 (CoV-2 RNA 주형이 첨가되지 않음; RdRP 프로브/프라이머가 포함됨); 6) RdRP-유전자_스파이크RNA (CoV-2 RNA 주형이 첨가됨; RdRP-유전자 프로브/프라이머가 포함됨); 7) RdRP-유전자_PosCntlRNA (CoV-2 RNA 주형 단독; RdRP-유전자 프로브/프라이머가 포함됨); 및 8) NTC_RdRP-유전자 (주형 음성 대조군 없음). 각각의 반응을 사중으로 수행하였다.
E-유전자 프로브 및 프라이머를 하기 최종 농도로 포함시켰다: E_유전자 사르베코_P1 프로브 400 nM, E_유전자 사르베코_F1 정방향 프라이머 400 nM, E_유전자 사르베코_R2 역방향 프라이머 200 nM, 또는 보다 바람직하게는 E_유전자 사르베코_P1 프로브 200 nM, E_유전자 사르베코_F1 정방향 프라이머 400 nM, E_유전자 사르베코_R2 역방향 프라이머 400 nM.
RdRP 프로브 및 프라이머를 하기 최종 농도로 포함시켰다: RdRP_SARSr-P2 프로브 600 nM, RdRP_SARSr-F2 정방향 프라이머 800 nM, RdRP_SARSr-R1 역방향 프라이머 100 nM, 또는 보다 바람직하게는 RdRP_SARSr-P2 프로브 100 nM, RdRP_SARSr-F2 정방향 프라이머 600 nM, RdRP_SARSr-R1 역방향 프라이머 800 nM.
PCR 반응 설정: 2.5 μl 울트라플렉스 1-단계 터프 믹스 (4X), 2.5 μl 프라이머/프로브 믹스 (4x), 라이트믹스 키트로부터의 0.25 μl 양성 대조군 RNA, 2.0 μl 용해된 비강 샘플 분취물, 2.75 μl RNase-무함유 물. 샘플 1) 및 5)에서, 양성 대조군 RNA를 첨가하지 않았고, 3.0 μl RNase-무함유 물을 첨가하였다.
PCR 프로토콜: 역전사를 50℃에서 10분 동안 수행한 후, 95℃에서 5분 동안 변성시켰다. 45 사이클: 1분 95℃ + 30초 60℃, 또는 보다 바람직하게는 15초 95℃ + 60초 60℃. 사이클링 후, 냉각을 40℃에서 30초 동안 수행하였다.
각각의 샘플로부터의 증폭 곡선은 도 7에 제공되고, 도 8에 요약된다. 데이터는 하기 표 6에 제시된다.
표 6.
Figure pct00006
이들 데이터는 SARS CoV-2 유전자가 RNA 추출 단계의 포함 없이 제조된 비강 스왑 샘플로부터 신뢰할 수 있게 검출될 수 있음을 예시한다. CoV-2 감염 환자의 비강 스왑에 존재하는 바이러스 RNA가 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다는 것을 입증하기 위해 추가의 연구가 수행될 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 참고문헌이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시되는 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 임의의 참고문헌의 인용은 출원일 이전의 그의 개시내용에 대한 것이며, 본 개시내용이 선행 발명에 의해 이러한 참고문헌보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
상기 기재된 각각의 요소, 또는 둘 이상이 함께 또한 상기 기재된 유형과 상이한 다른 유형의 방법에서 유용한 용도를 찾을 수 있음을 이해할 것이다. 추가의 분석 없이, 상기 내용은 본 개시내용의 요지를 충분히 밝힐 것이므로, 다른 사람들은, 현재 지식을 적용함으로써, 선행 기술의 관점에서, 첨부된 청구범위에 제시된 본 개시내용의 일반적 또는 구체적 측면의 본질적인 특징을 타당하게 구성하는 특색을 빠트리지 않으면서 다양한 적용을 위해 이를 용이하게 적합화할 수 있다. 상기 실시양태는 단지 예로서 제시되고; 본 개시내용의 범주는 하기 청구범위에 의해서만 제한되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayer AG <120> RAPID DETECTION OF VIRAL INFECTION USING RT-PCR <130> BHC201020 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CLDN1 probe <400> 1 caggctctct tcactggctg ggc 23 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CLDN1 forward primer <400> 2 ccagtcaatg ccaggtacga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CLDN1 reverse primer <400> 3 gaaggcagag agaagcagca 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RPL32 probe <400> 4 aattaagcgt aactggcgga aaccc 25 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RPL32 forward primer <400> 5 gcaccagtca gaccgatatg t 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RPL32 reverse primer <400> 6 accctgttgt caatgcctct 20 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> E gene Sarbeco probe <400> 7 acactagcca tccttactgc gcttcg 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> E gene Sarbeco forward primer <400> 8 acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> E gene Sarbeco reverse primer <400> 9 atattgcagc agtacgcaca ca 22 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RdRP SARS CoV2 probe <400> 10 caggtggaac ctcatcagga gatgc 25 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RdRP SARS CoV2 forward primer <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> R = G or A <400> 11 gtgaratggt catgtgtggc gg 22 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RdRP SARS CoV2 reverse primer <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> R = G or A <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> S = G or C <400> 12 caratgttaa asacactatt agcata 26

Claims (68)

  1. 적어도 하나의 샘플을 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, RNA 바이러스 검출의 경우에 용해물 내의 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하고, RNA 또는 DNA 바이러스의 핵산 서열로부터 유래된 프라이머의 세트를 사용하여 용해물 내의 RNA 또는 DNA 바이러스로부터 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는, RNA 또는 DNA 바이러스를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 용해 완충제가 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제, 글리세롤, 및 적어도 1종의 염을 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제가 친수성 폴리에틸렌 옥시드 쇄 및 방향족 탄화수소 친지성 또는 소수성 기를 갖는 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제가 트리톤(Triton) X-100인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 완충제가 비-이온성 계면활성제를 약 0.05% 내지 약 20%의 양으로 포함하는 것인 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 염이 인산이나트륨인 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 완충제가 하기: 트리스-HCl, 디티오트레이톨 (DTT), RNase-무함유 물, RNase 억제제, 및 그의 혼합물 중 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 완충제의 pH가 약 7.5 내지 약 8.5인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 바이러스가 코로나바이러스인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 코로나바이러스가 SARS CoV-2인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 코로나바이러스가 SARS CoV-2의 변이체인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머의 세트가 E 유전자, N 유전자 및 RdRP 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 RNA 유전자에 대한 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 프라이머의 세트가 E 유전자에 대한 것이고, 서열식별번호: 8 및/또는 서열식별번호: 9, 또는 그의 상보체를 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 프라이머의 세트가 RdRP 유전자에 대한 것이고, 서열식별번호: 11 및/또는 서열식별번호: 12, 또는 그의 상보체를 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 추출 단계를 포함하지 않는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 용해물이 역전사에 직접 사용되는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 생물학적 샘플이 스왑을 사용하여 수집되는 것인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 생물학적 샘플이 비강 스왑인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 샘플이 적어도 하나의 인간 세포를 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 100 μl의 용해 완충제에 넣는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 완충제 및 샘플의 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하여 용해물을 생성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 용해물을 원심분리하고 상청액을 수집하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 용해물을 12,000 rpm에서 2분 동안 실온에서 원심분리하는 것인 방법.
  25. 적어도 하나의 샘플을 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, 용해물 내의 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것을 포함하며, 여기서 용해 완충제는 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제, 글리세롤, 및 적어도 1종의 염을 포함하는 것인, 하나 이상의 핵산을 증폭시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제가 친수성 폴리에틸렌 옥시드 쇄 및 방향족 탄화수소 친지성 또는 소수성 기를 갖는 것인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제가 트리톤 X-100인 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 완충제가 비-이온성 계면활성제를 약 0.05% 내지 약 20%의 양으로 포함하는 것인 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 염이 인산이나트륨인 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 완충제가 하기: 트리스-HCl, 디티오트레이톨 (DTT), RNase-무함유 물, RNase 억제제 및 그의 혼합물 중 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 샘플이 생물학적 샘플인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 생물학적 샘플이 스왑을 사용하여 수집되는 것인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 생물학적 샘플이 비강 스왑인 방법.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 적어도 하나의 인간 세포를 포함하는 것인 방법.
  35. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 100 μl의 용해 완충제에 넣는 것인 방법.
  36. 제25항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 완충제 및 샘플의 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하여 용해물을 생성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  37. 제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 용해물을 원심분리하고 상청액을 수집하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 용해물을 12,000 rpm에서 2분 동안 실온에서 원심분리하는 것인 방법.
  39. 제25항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 용해물 내의 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것이 PCR, qPCR, RT-PCR, 또는 RT-qPCR에 의해 수행되는 것인 방법.
  40. 제25항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 용해물 내의 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것이 1-단계 RT-qPCR에 의해 수행되는 것인 방법.
  41. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 추출 단계를 포함하지 않는 방법.
  42. 제25항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 용해물이 증폭에 직접 사용되는 것인 방법.
  43. 제25항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산이 RNA 바이러스로부터의 것인 방법.
  44. 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 용해물을 수득하고, 용해물 내의 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하고, SARS CoV-2 게놈의 뉴클레오티드 서열 또는 SARS CoV-2의 변이체의 게놈으로부터 유래된 프라이머의 세트를 사용하여 cDNA를 PCR 검정에 적용하는 것을 포함하는, SARS CoV-2 또는 SARS CoV-2의 변이체로 감염된 대상체를 확인하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 용해물이 생물학적 샘플을 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제, 글리세롤 및 적어도 1종의 염을 포함하는 용해 완충제와 접촉시킴으로써 수득되는 것인 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, RNA 추출 단계를 포함하지 않는 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 용해물이 역전사에 직접 사용되는 것인 방법.
  48. 샘플을 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, 용해물 내의 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하고, cDNA를 표적 핵산에 대한 프라이머의 세트를 사용하는 PCR 검정에 적용하는 것을 포함하는, 표적 핵산을 증폭, 확인, 검출 및/또는 분석하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 용해물이 샘플을 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제, 글리세롤 및 적어도 1종의 염을 포함하는 용해 완충제와 접촉시킴으로써 수득되는 것인 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, RNA 추출 단계를 포함하지 않는 방법.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 용해물이 역전사에 직접 사용되는 것인 방법.
  52. 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제, 글리세롤 및 적어도 1종의 염을 포함하는 용해 완충제를 포함하는 키트.
  53. 제52항에 있어서, 표적 핵산의 증폭을 위한 적어도 1종의 시약을 추가로 포함하는 키트.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 표적 핵산의 증폭을 위한 적어도 1개의 프라이머 및/또는 적어도 1개의 프로브를 포함하는 키트.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 1-단계 RT-qPCR을 사용하여 RNA를 검출하기 위한 키트인 키트.
  56. 제55항에 있어서, 적어도 1종의 리버스 트랜스크립타제, 적어도 1종의 DNA 폴리머라제, RNase 억제제, 뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 표지, 또는 그의 임의의 조합 중 1종 이상을 포함하는 키트.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산이 RNA 바이러스로부터 유래된 것인 키트.
  58. 제57항에 있어서, RNA 바이러스가 코로나바이러스인 키트.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, RNA 바이러스가 SARS CoV-2인 키트.
  60. 제59항에 있어서, 서열식별번호: 8 및/또는 서열식별번호: 9, 또는 그의 상보체 및 서열식별번호: 11 및/또는 서열식별번호: 12, 또는 그의 상보체로부터 선택된 프라이머의 세트를 포함하는 키트.
  61. 1-5% 트리톤 X-100 및 하기 성분: 5-20% 글리세롤, 0.5-4 mM DTT, 10-50 mM Na2HPO4, 및 10-50 mM 트리스-HCl 중 1종 이상을 포함하는 용해 완충제.
  62. 제61항에 있어서, 약 3% 트리톤 X-100 및 하기 성분: 약 10% 글리세롤, 약 2 mM DTT, 약 25 mM Na2HPO4, 및 약 25 mM 트리스-HCl 중 1종 이상을 포함하는 용해 완충제.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 용해 완충제의 pH가 약 7.5 내지 약 8.0인 용해 완충제.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, RNase-무함유 물을 추가로 포함하는 용해 완충제.
  65. 제64항에 있어서, RNase-무함유 물이 약 1:15 내지 1:1 (용해 완충제:RNase-무함유 물)의 양으로 포함되는 것인 용해 완충제.
  66. 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, RNAse 억제제를 추가로 포함하는 용해 완충제.
  67. 적어도 하나의 샘플을 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, 용해물 내의 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 핵산을 증폭시키는 방법에서의 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 따른 용해 완충제의 용도.
  68. 적어도 하나의 샘플을 용해 완충제와 접촉시켜 용해물을 생성하고, 용해물 내의 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하고, RNA 바이러스의 핵산 서열로부터 유래된 프라이머의 세트를 사용하여 용해물 내의 RNA 바이러스로부터 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는, RNA 바이러스를 검출하는 방법에서의 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 따른 용해 완충제의 용도.
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