KR102603420B1 - 핵산 증폭의 저해를 감소시키는 조성물 - Google Patents
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Abstract
핵산 증폭에 대한 오염물의 저해 효과를 감소시키는 조성물이 제공된다. 본 조성물은 유효량의 제2철, 유기 철 킬레이트 시약, 및 비이온성 계면활성제를 포함한다. 선택적으로, 본 조성물은 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 본 조성물은 pH가 약 8.45 내지 8.85이다. 유기 철 킬레이트 시약은 제2철에 대하여 104.2 이상의 제1 친화도 상수를 가지고, 마그네슘에 대하여 103.8 미만의 제2 친화도 상수를 가진다. 제1 친화도 상수와 제2 친화도 상수는 pH 8.45 및 20℃의 탈이온수에서 결정된다. 또한, 본 조성물을 사용하여 핵산 증폭을 위한 샘플을 제조하는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2014년 12월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/096,217호 및 2015년 3월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/136,682호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 가출원의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
병원체 및 다른 미세유기체(microorganism)의 검출을 위한 종래의 방법은 배양 방법에 기초하지만, 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고, 수고로우며, 신속한 결과를 제공하기 위한 진단 실험실 및 품질 관리의 필요성과 더 이상 양립할 수 없다.
미세유기체를 배양하는 것, 병원체 검출에서의 위양성(false positive)과 같은 문제를 극복하기 위한 노력은 DNA 기반 진단 방법 또는 핵산 증폭 방법과 같은 유전자 검사의 개발로 이어졌다. DNA 기반 방법의 사용은 각각의 병원체 종이 다른 유기체와 구별되는 독특한 DNA 또는 RNA 시그니처(signature)를 지닌다는 전제로부터 유래된다. 이러한 기법은 가장 유망하며, 미생물의 신속하고 민감하며 특이적인 검출에 점점 더 사용되고 있다.
생물공학의 발전은 효율적인 핵산 증폭을 위한 다양한 종류의 검정의 개발로 이어졌다.
미세유기체/병원체를 함유하는 샘플의 효과적인 유전자 검사는 즉각적 또는 실시간 결과를 제공하는 신속하고 민감한 검정 방법을 필요로 한다. 분석의 시간과 민감도 및 샘플 중의 저해 물질에 의해 야기된 핵산 증폭의 저해는 유전자 검사의 유용성과 관련된 특정 제한들이다.
의도된 표적의 핵산 증폭의 저해를 효율적이고 신속하게 감소 또는 제거하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명은 핵산 증폭 반응에서 샘플 저해를 제거하는 조성물 및 이러한 조성물을 사용하는 핵산 증폭 방법을 제공한다.
제1 태양에서, 핵산 증폭 반응에서 샘플 저해를 제거하는 수성 조성물이 제공된다. 본 조성물은 유기 철 킬레이트 시약(organic iron-chelating reagent), 제2철(ferric iron), 및 0.005% (질량/부피) 이상 농도의 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 본 조성물은 pH가 약 8.45 내지 8.85일 수 있다. 유기 철 킬레이트 시약은 제2철에 대하여 104.2 이상의 제1 친화도 상수를 가질 수 있고, 마그네슘에 대하여 103.8 미만의 제2 친화도 상수를 가질 수 있으며, 여기서 제1 친화도 상수와 제2 친화도 상수는 pH 8.45 및 20℃의 탈이온수에서 결정된다.
임의의 상기 실시 형태에서, 유기 철 킬레이트 시약은 복수의 카르복실레이트 기를 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 본 조성물은 2-하이드록시프로판-1,2,3-트라이카르복실레이트를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 유기 철 킬레이트 시약은 EGTA를 포함할 수 있으며, 여기서 EGTA에 대한 제2철의 몰비는 약 0.04 내지 약 0.28이다. 임의의 상기 실시 형태에서, 본 조성물은 폴리비닐피롤리돈을 추가로 포함할 수 있다.
제2 태양에서, 본 발명은 핵산 증폭 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 유기 철 킬레이트 시약; 제2철, 폴리비닐피롤리돈, 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 표적 샘플과 접촉시켜 수성 혼합물을 형성하는 단계 - 수성 혼합물은 pH가 약 8.45 내지 8.85이고, 비이온성 계면활성제는 0.005% (질량/부피) 이상 농도로 조성물에 존재함 -; b) 단계 a)의 수성 혼합물을 열 용해(thermal lysis)에 적용시키는 단계; 및 c) 단계 b)에 후속하여, 수성 혼합물을 등온 핵산 증폭에 적용시키는 단계를 포함한다. 유기 철 킬레이트 시약은 제2철에 대하여 104.2 이상의 제1 친화도 상수를 가지고, 마그네슘에 대하여 103.8 미만의 제2 친화도 상수를 가지며, 여기서 제1 친화도 상수와 제2 친화도 상수는 pH 8.45 및 20℃의 탈이온수에서 결정된다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 등온 증폭 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 유기 철 킬레이트 시약; 제2철, 폴리비닐피롤리돈, 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 표적 샘플과 접촉시켜 수성 혼합물을 형성하는 단계 - 수성 혼합물은 pH가 약 8.45 내지 8.85이고, 비이온성 계면활성제는 0.005% (질량/부피) 이상 농도로 조성물에 존재함 -; b) 단계 a)의 혼합물을 열 용해에 적용시키는 단계; 및 c) 단계 b)에 후속하여, 혼합물을 등온 핵산 증폭에 적용시키는 단계를 포함한다. 유기 철 킬레이트 시약은 제2철에 대하여 104.2 초과의 제1 친화도 상수를 가지고, 마그네슘에 대하여 103.8 미만의 제2 친화도 상수를 가지며, 여기서 제1 친화도 상수와 제2 친화도 상수는 pH 8.45 및 20°의 탈이온수에서 결정된다.
제3 태양에서, 본 발명은 제2철, 유기 철 킬레이트 시약, 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 키트(kit)를 제공한다. 유기 철 킬레이트 시약은 제2철에 대하여 104.2 초과의 제1 친화도 상수를 가지고, 마그네슘에 대하여 103.8 미만의 제2 친화도 상수를 가지며, 여기서 제1 친화도 상수와 제2 친화도 상수는 pH 8.45 및 20°의 탈이온수에서 결정된다.
키트의 임의의 실시 형태에서, 유기 철 킬레이트 시약은 복수의 카르복실레이트 기를 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 키트는 2-하이드록시프로판-1,2,3-트라이카르복실레이트를 추가로 포함할 수 있다. 키트의 임의의 상기 실시 형태에서, 유기 철 킬레이트 시약은 에틸렌 글리콜 테트라아세트산을 포함할 수 있으며, 여기서 에틸렌 글리콜 테트라아세트산에 대한 제2철의 몰비는 약 0.04 내지 약 0.28이다. 임의의 상기 실시 형태에서, 키트는 폴리비닐피롤리돈, 플루오로계면활성제(fluorosurfactant), 지시 염료(indicator dye), 방부제, 완충제, 및 LAMP-BART 반응의 증강제(enhancer) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분을 추가로 포함할 수 있다.
전술한 내용은 본 발명의 일부 관련 목적을 약술한 것이다. 이들 목적은 의도된 발명의 더욱 두드러진 특징 및 적용의 일부를 단지 예시하는 것으로 해석되어야 한다. 본 개시 내용은 설명될 또는 실시 형태의 하기의 더욱 상세한 설명으로부터 명백해질 다른 특징 및 이점을 포함한다.
본 발명의 상기 요약은 본 발명의 각각의 개시된 실시 형태 또는 모든 구현예를 기술하기 위한 것은 아니다. 하기 설명은 예시적인 실시 형태를 더 구체적으로 예시한다. 본 출원 전체에 걸쳐 여러 곳에서, 예들의 목록을 통해 지침이 제공되며, 이 예들은 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 열거된 목록은 단지 대표적인 군으로서의 역할을 하며, 배타적인 목록으로 해석되어서는 안 된다.
이들 및 다른 실시 형태의 추가 세부 사항이 첨부 도면 및 하기 상세한 설명에서 제시된다. 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명과 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
전술한 요약뿐만 아니라 하기 본 발명의 상세한 설명도 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명의 설명을 돕기 위해, 현재 바람직하며 예시적인 것으로 간주되는 실시 형태가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 정확한 배열 및 수단으로 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 도면에서,
도 1은 단백질을 함유하는 샘플과의 LAMP-BART 반응에서의 제2철 암모늄 시트레이트(ferric ammonium citrate, FAC)의 효과의 그래프 표현을 도시한다.
도 2는 에스쿨린(esculin) 또는 6,7,-다이하이드록시쿠마린을 함유하는 샘플과의 LAMP-BART 반응에서의 FAC의 효과를 나타내는 피크까지의 시간(Time to Peak, TTP)의 박스플롯(boxplot)을 도시한다.
도 3은 LAMP-BART 반응에서 FAC에 대한 계면활성제의 효과를 나타내는 MC TTP의 박스플롯을 도시한다.
도 1은 단백질을 함유하는 샘플과의 LAMP-BART 반응에서의 제2철 암모늄 시트레이트(ferric ammonium citrate, FAC)의 효과의 그래프 표현을 도시한다.
도 2는 에스쿨린(esculin) 또는 6,7,-다이하이드록시쿠마린을 함유하는 샘플과의 LAMP-BART 반응에서의 FAC의 효과를 나타내는 피크까지의 시간(Time to Peak, TTP)의 박스플롯(boxplot)을 도시한다.
도 3은 LAMP-BART 반응에서 FAC에 대한 계면활성제의 효과를 나타내는 MC TTP의 박스플롯을 도시한다.
본 발명의 임의의 실시 형태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 이의 적용에 있어서 하기 설명에 제시되거나 하기 도면에 예시되는 성분들의 구성 및 배열의 세부 사항으로 한정되지 않는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 다른 실시 형태들이 가능하며 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 어법 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며, 제한으로서 여겨져서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 "포함하는" 또는 "갖는" 및 이들의 활용형의 사용은 그 앞에 열거된 항목 및 그 등가물뿐만 아니라 추가 항목을 포함함을 의미한다. 다른 실시 형태가 이용될 수 있으며, 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 구조적 또는 논리적 변화가 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 이제 이하에서 더 충분하게 설명될 것이다. 하기의 상세한 설명의 목적상, 본 발명은 명백히 반대로 명시되는 경우를 제외하고는 다양한 대안적인 변화 및 단계 순서를 취할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 특별히 예시된 시스템 또는 물론 다양할 수 있는 실시 형태로 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 논의된 임의의 용어의 예들을 포함하여 본 명세서의 임의의 곳에서의 예들의 사용은 단지 예시적인 것이며, 본 발명 또는 임의의 예시된 용어의 범주 및 의미를 한정하는 것이 결코 아니다. 마찬가지로, 본 발명은 본 명세서에 주어진 다양한 실시 형태로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 용어 "및/또는"은 열거된 요소들 중 하나 또는 전부, 또는 열거된 요소들 중 임의의 둘 이상의 조합을 의미한다.
용어 "약"이 범위의 값 또는 종점을 설명하는 데 사용될 때, 본 발명은 언급된 특정 값과 종점 둘 모두를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다", "포함하는", "함유하는", "특징으로 하는", "갖는" 또는 이의 임의의 다른 활용형은 배타적이지 않은 포함을 망라하고자 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "핵산" 및 "핵산 서열"은 상호 교환가능하며, 한정하고자 하는 것이 아니다. "핵산"은 당업계에 공지된 의미를 가질 것이며, DNA (예를 들어, 게놈 DNA, cDNA 또는 플라스미드 DNA), RNA (예를 들어, mRNA, tRNA 또는 rRNA) 및 PNA를 지칭한다. 이것은 제한 없이, 이중 가닥 또는 단일 가닥 배열, 원형, 플라스미드, 비교적 짧은 올리고뉴클레오티드, PNA로도 일컬어지는 펩티드 핵산 등을 포함하는 매우 다양한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 게놈 DNA일 수 있으며, 이는 전체 염색체 또는 염색체의 일부를 포함할 수 있다. DNA는 코딩 서열 (예를 들어, mRNA, tRNA 및/또는 rRNA를 코딩함) 및/또는 비코딩 서열 (예를 들어, 동원체(centromere), 텔로미어, 유전자간 영역, 인트론, 트랜스포존 및/또는 마이크로새틀라이트 서열(microsatellite sequence))을 포함할 수 있다. 핵산은 자연 발생적 뉴클레오티드뿐만 아니라 인공적 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 돌연변이된 뉴클레오티드 등 중 어떠한 것도 포함할 수 있다. 핵산은 비핵산 성분, 예를 들어 (PNA에서와 같은) 펩티드, 표지 (방사성 동위원소 또는 형광 마커) 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "증폭시키는" 및 "증폭"은 폴리뉴클레오티드 서열을 선형적으로 또는 기하급수적으로 증가시키는 광범위한 기법을 지칭한다. 예시적인 증폭 기법은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 프라이머 신장 단계를 사용하는 임의의 다른 방법을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 증폭의 다른 비제한적인 예는 리가제 검출 반응 (LDR) 및 리가제 연쇄 반응 (LCR)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 증폭 방법은 열 사이클링을 포함할 수 있거나 루프 매개 등온 증폭(Loop mediated isothermal amplification, LAMP-BART)과 같이 등온적으로 수행될 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 용어 "증폭 생성물" 또는 "증폭된 생성물"은 임의의 횟수의 증폭 반응 사이클로부터의 생성물을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "중합효소 연쇄 반응" 또는 PCR은, 이중 가닥 핵산 샘플의 가닥들을 분리하는 초기 변성 단계에 이은, (i) 표적 서열을 플랭킹(flanking)하는 위치로 증폭 프라이머를 특이적으로 어닐링(annealing)시킬 수 있는 어닐링 단계; (ii) 프라이머를 5'에서 3' 방향으로 신장시켜 표적 서열에 상보적인 앰플리콘(amplicon) 폴리뉴클레오티드를 형성하는 신장 단계, 및 (iii) 표적 서열로부터의 앰플리콘의 분리를 가져오는 변성 단계의 반복으로 이루어진 핵산의 증폭이다. 상기 단계 각각을 상이한 온도에서, 바람직하게는 자동 서모사이클러(thermocycler)를 사용하여 수행할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "등온적으로 증폭되는" 또는 "등온 증폭" 및 유사 용어는 전통적인 PCR 반응과 달리 고온과 저온 사이에서의 사이클링을 필요로 하는 증폭과 대조적으로 일정한 온도에서 수행되는 핵산 증폭 방법을 지칭한다. 이는 DNA 중합효소가 가닥 치환 활성(strand displacement activity)을 갖는 DNA 중합효소일 것을 필요로 한다. 실질적으로 단일 온도에서 종종 등온 증폭을 수행하는데, 이는 프라이머가 치환된 DNA 가닥에 결합하기 때문이다. 등온 증폭에서, 핵산 샘플 및 선택적으로 모든 프라이머를 포함하는 반응 혼합물을, 증폭 전에 그리고 선택적으로 DNA 중합효소의 첨가 전에 - DNA 중합효소가 변성 온도에서 비활성화되는 경우 -, 반응 혼합물 중의 이중 가닥 핵산이 단일 가닥으로 변성되는 변성 온도 (예를 들어, 적어도 85℃ 내지 90℃)로 가열할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "의도된 표적", "표적 핵산 영역", "표적 특이적 핵산", "표적 영역", "표적 시그니처 서열", "표적 핵산(들)", "표적 핵산 서열", "표적" 또는 "표적 폴리뉴클레오티드 서열"은 관심 핵산을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "검출하는" 또는 "검출"은 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드 서열 생성물의 샘플 중의 존재 또는 부재의 개시 또는 공개를 지칭한다. 검출은 종점, 실시간, 효소적 방식으로, 그리고 증폭 생성물을 겔 상에 분해시키고 예상 증폭 생성물이 존재하는지의 여부를 결정하는 것으로 이루어지거나 당업자에게 공지된 다른 방법으로 이루어질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플"은 핵산을 함유하는 것으로 의심되는 출발 물질을 지칭한다. 샘플 중의 핵산을 검출하는 것은 미세유기체의 존재를 검출가능하게 해준다. 샘플의 예는 식품 샘플 (인간 또는 동물 소비를 위해 의도된 식품, 예를 들어 가공 식품, 식품 원료, 생산물 (예컨대, 과일 및 채소), 콩과 식물, (가축 동물 및/또는 경기용 동물로부터의) 육류, 어류, 해산물, 견과류, 음료, 드링크(drink), 발효 브로스(fermentation broth), 및/또는 상기 열거된 식품 중 임의의 것을 포함하는 선택적으로 풍부화된(enriched) 식품 매트릭스로부터의 샘플을 포함하지만 이로 한정되지 않음), 물 샘플, 환경 샘플 (예를 들어, 토양 샘플, 먼지(dirt) 샘플, 쓰레기 샘플, 하수(sewage) 샘플, 산업 폐수 샘플, 공기 샘플, 또는 호수, 강, 연못 등과 같은 다양한 수역으로부터의 물 샘플), (환경으로부터의 또는 방 또는 건물로부터의) 공기 샘플, 임상 샘플, 질병 또는 질환에 걸린 것으로 의심되는 인간으로부터 얻은 샘플, 수의학적 샘플, 법의학적 샘플, 농업적 샘플, 약제학적 샘플, 생물약제학적 샘플, 식품 가공 및 제조 표면으로부터 샘플, 및/또는 생물학적 샘플을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 비식품 샘플의 예는 배양 브로스(culture broth)일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "배양 브로스"는 미세유기체를 배양하기 위한 액체 배지를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "저해물질"은, 저해물질이 없을 때의 검정의 활성, 정밀성 또는 정확성에 대하여, 직접 또는 간접적으로 검정의 활성, 정밀성 또는 정확성을 감소시키도록 작용하는 임의의 화합물, 물질, 또는 조성물, 또는 이들의 조합을 의미한다. 저해물질은 제한 없이, 분자, 원자, 또는 분자들 또는 원자들의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "저해물질"은, 예를 들어 증폭 반응에 사용되는 효소의 저해물질을 지칭한다. 이러한 저해물질의 예는 전형적으로 단백질, 펩티드, 지질, 탄수화물, 헴(heme) 및 이의 분해 생성물, 요소, 담즙산, 휴믹산(humic acid), 다당류, 세포막, 및 세포액 성분(cytosolic component)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. PCR에 대한 인간 혈액의 주요 저해물질은, 각각 적혈구, 백혈구 및 혈장에 존재하는 헤모글로빈, 락토페린 및 IgG이다. 저해물질의 예는 또한 철 이온 또는 이의 염, 알칼리 금속 이온, 전이 금속 이온 등과 같은 다른 금속 염, 및 성장 배지에 존재하는 지시 염료를 포함한다.
본 발명의 실시 형태에서, 지시 염료인 에스쿨린이 저해물질로 작용할 수 있다. 에스쿨린은 아이스쿨루스 히포카스타눔(Aesculus hippocastanum) (마로니에(horsechestnut))으로부터 얻은 쿠마린 글루코시드 (6-(베타-D-글루코피라노실옥시)-7- 하이드록시-2H-1-벤조피란-2-온, CAS No. 531-75-9)이며, 이의 파인 블루(fine blue) 형광 용액을 특징으로 한다. 에스쿨린은 대체로 지시약으로 세균 배양 브로스에 첨가하는데, 이는, 예를 들어 리스테리아(Listeria) 배양의 경우이다. 데미-프레이저(demi-Fraser, DF), UVM, 및 프레이저 브로스 베이스(broth base) (이는 리스테리아 선택 풍부화 브로스 베이스임)에서의 에스쿨린 반응은 검정 저해에 대한 매우 가능성이 높은 기여인자로 강조되어 있다. 이러한 반응에서, 하기 에스쿨린:
은 특정 세균에 의해 6,7 다이하이드록시쿠마린 (에스쿨레틴(aesculetin))과 포도당으로 가수분해된다. 이어서, 에스쿨레틴:
은 제2철 이온과 복합체화되어 흑색 복합체를 형성한다. 에스쿨레틴은 쿠마린 계열의 약물에 속하며, 쿠마린은 DNA 작용 효소의 활성을 변형시키는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "계면활성제"의 의미는 당업자에 의해 쉽게 인식되는 가장 넓은 정의이다. 즉, 계면활성제는, 액체의 표면 장력을 낮추고/낮추거나 두 액체 사이의 계면 장력을 낮추는 습윤제이다. 물에서 양전하 또는 음전하를 가지지 않지만 물에 가용성인 계면활성제는 "비이온성 계면활성제"이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비이온성 계면활성제"는 전기적으로 하전되지 않은 극성기를 갖는 계면활성제 분자를 지칭한다. 둘 이상의 비이온성 계면활성제의 조합은 용어 "비이온성 계면활성제" 내에 포함된다. 특정 실시 형태에서, 하나 이상의 계면활성제가 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 폴리비닐피롤리돈 (PVP)은 N-비닐피롤리돈 단량체로부터 제조된 수용성 중합체이다. 폴리비닐폴리피롤리돈 (PVPP)은 PVP의 고도로 가교 결합된 변형체이다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 폴리비닐피롤리돈 또는 이의 변형체는 증폭 반응 혼합물에 포함되어 저해 물질을 감소 또는 제거할 수 있다. 변형된 PVP는 PVP의 고도로 가교 결합된 불용성 변형체인 폴리비닐폴리피롤리돈 (PVPP)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. PVP와 관련된 본 명세서의 개시 내용은 PVPP에 적용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
일 실시 형태에서, 본 조성물은, 낮은 표면 장력을 제공하고 열 처리 적용에 사용될 때 양호한 열 안정성을 나타내는 코팅 첨가제의 부류에 속하는 비이온성 중합체 불소화합물계 계면활성제를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 실시 형태에 따른 비이온성 중합체 불소화합물계 계면활성제는 3MTM Novec TM 플루오로계면활성제인 FC-4430일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "에틸렌 글리콜 테트라아세트산" 및 "EGTA"는 킬레이트제인 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산을 지칭한다. EGTA는, 마그네슘에 대하여 더 낮은 친화도를 가져서 이를 칼슘 이온에 대하여 더 선택적으로 만드는 무색 고체이다. EGTA는, 살아있는 세포에서 발견되는 바와 같이 칼슘 이온이 마그네슘보다 덜 농축되어 있을 때 칼슘 이온을 킬레이트화하는 완충 용액을 제조하는 데 유용하다. EGTA는 또한 효소 검정에서 유용하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 용해"는 세포막을 파괴하여 세포 내의 물질을 방출시키는 공정, 특히 PCR, LAMP BART 방법 및 유사한 방법과 같이, 증폭 전에 세포로부터 세포내 물질을 추출하여 DNA 또는 RNA를 단리하는 공정을 지칭한다.
본 발명의 실시 형태에 따르면, 세포 용해를 열적 방법에 의해 수행할 수 있다. 열적 방법은 세포 샘플의 형태 및 반응 용기의 특징에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "미세유기체" 또는 "미생물"은 단세포 또는 다세포 유기체일 수 있는 임의의 현미경적 유기체(microscopic organism)를 지칭한다. 대체로 이 용어는, 제한 없이, 하나 이상의 세균을 포함하는 적합한 배양 배지에서 성장 및 번식할 수 있는 임의의 원핵 또는 진핵 현미경적 유기체를 지칭하는 데 사용된다. 본 발명의 범주에 포함되는 미세유기체는 원핵 생물, 즉 세균 및 고세균; 및 원생 동물, 진균, 조류 등을 포함하는 다양한 형태의 진핵 생물을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 미세유기체의 "배양" 또는 "성장"이라는 용어는 미생물 유기체를 이의 성장에 도움이 되는 조건 하에 미리 결정된 배양 배지에서 번식시킴으로써 이를 증대시키는 방법을 지칭한다. 더 구체적으로는, 이것은 미세유기체의 적어도 1회의 세포 분열을 촉진시키는 데 적합한 배양 배지 및 조건을 제공하는 방법이다. 배양 배지는 미생물 성장 등에 필요한 모든 영양소 및 필수 물리적 성장 파라미터를 함유하는 고체, 반고체 또는 액체 배지일 수 있으며, 또한 바이러스를 포함한다. 용어 "표적 미세유기체"는 검출하고자 하는 임의의 미세유기체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "풍부화"는 특정 미세유기체의 성장을 유리하게 하는 특정한 및 공지된 속성을 배지 및 조건에 제공함으로써 그 특정 미세유기체의 성장을 선택적으로 풍부화시키는 배양 방법을 지칭한다. 풍부화 배양의 환경은 선택된 미세유기체의 성장을 지원하면서 다른 것들의 성장은 저해할 것이다.
종래의 DNA 기반 방법의 사용은 저해물질의 존재에 의해 어느 정도 제한된다. 핵산 증폭 반응에 부정적인 영향을 미치는 모든 물질을 포함하는 이러한 소위 저해물질의 발생은 유전자 검사의 단점들 중 하나이다. 이러한 저해물질은 샘플 자체로부터 기원될 수 있거나 샘플 처리 또는 핵산 추출 동안 도입될 수 있다. 핵산 증폭 반응의 부분적인 또는 완전한 저해의 결과는 각각 민감도 감소 또는 위음성(false-negative) 결과이다.
수많은 유전자 기반 방법의 이용가능성에도 불구하고, 의도된 표적의 핵산 증폭의 저해를 효율적이고 신속하게 감소 또는 제거하는 단일의 신속하고 민감하고 저렴하며 덜 수고로운 방법은 존재하지 않는다. 표적 샘플 중의 병원체의 존재를 신속하게 결정하기 위해서는, 더 빠르고, 정확하고 시간이 덜 걸리며 덜 수고로운 검정 기법을 찾으려는 증가하는 필요성에 부응할 수 있는 신뢰성 있고 정확한 검정 방법을 개발할 필요가 있다.
경쟁 PCR 시스템에서, 사용 용이성에 대한 난관은 프로테아제(protease) 단계의 포함이다. 이 프로테아제 단계는 식품 단백질 (특히, 적색육(red meat))을 분해시킬 뿐만 아니라 세포를 용해시킴으로써 샘플 저해를 감소시키는 데 사용된다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 조성물 및 방법은 제2철 암모늄 시트레이트를 사용하여 저해 단백질을 중화시킴으로써 샘플을 프로테아제 처리할 필요성을 제거하는 것으로 밝혀졌다. 유리하게는, 본 발명은 단리/정제 단계를 제거하며, 이는 현재의 검정 방법을 더 빠르고 더 간단하게 만든다.
본 발명은 프로테아제 처리하거나 다른 방식으로 샘플로부터 백그라운드 단백질(background protein)을 감소시킬 필요성을 제거하는 핵산 증폭의 조성물 및 방법을 기술하고 있다. 이는 결과적으로 또한 종래의 핵산 증폭 방법의 검정 단계들 중 하나의 제거로 이어진다.
본 발명은 대체로 샘플의 핵산 증폭을 위한 신규한 조성물 (예를 들어, 수성 조성물) 및 방법에 관한 것이며, 그 방법은 크로마토그래피, 원심분리 및 그 사이에 있는 유사한 처리와 같은 단리/정제 단계 없이 세포 용해 단계 및 핵산 증폭 단계를 포함한다.
본 발명의 조성물은 전형적으로 각각의 화학 성분들을 포함하는 수용액으로 사용된다. 따라서, 임의의 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 물을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 조성물을 수성 액체 (예를 들어, 물 또는 물을 함유하는 샘플)와 혼합하여 본 발명에 따라 사용될 혼합물을 형성할 수 있다. 미리 결정된 부피의 수성 조성물을 미리 결정된 양 (예를 들어, 부피)의 샘플과 혼합하여 혼합물을 형성할 수 있으며, 이 혼합물은, 존재하는 경우, 샘플 중의 임의의 미세유기체를 용해시키도록 (예를 들어, 가열에 의해) 처리된다. 생성된 용해물의 일부를 핵산 증폭 공정에서 사용하여 본래의 샘플 중의 하나 이상의 표적 미세유기체의 존재를 나타내는 핵산 서열을 검출할 수 있다.
전형적으로, 샘플 (예를 들어, 분쇄된 쇠고기, 도체 헹굼액(carcass rinse), 공정수(process water), 환경 (예를 들어, 식품 가공 장비) 스왑(swab) 또는 스펀지로부터의 잔류물)을 수성 액체 (예를 들어, 물 또는 완충액)에 현탁시킨다. 따라서, 제1의 미리 결정된 부피의 수성 샘플을 본 조성물 또는 본 발명의 조성물을 포함하는 제2의 미리 결정된 부피의 수성 용액과 혼합하여 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 용해 처리에 적용한다. 따라서, 본 발명의 조성물의 각각의 성분은, 샘플이 조성물과 혼합될 때 발생하는 희석을 고려한 농도로 수성 조성물에 존재한다.
본 발명에 따르면, 제1의 미리 결정된 부피 대 제1의 미리 결정된 부피와 제2의 미리 결정된 부피를 혼합하여 형성된 혼합물의 부피의 비는 1:10 이하이다. 임의의 실시 형태에서, 제1의 미리 결정된 부피 대 제1의 미리 결정된 부피와 제2의 미리 결정된 부피를 혼합하여 형성된 혼합물의 부피의 비는 약 1:10 내지 약 1:300이다. 임의의 실시 형태에서, 제1의 미리 결정된 부피 대 제1의 미리 결정된 부피와 제2의 미리 결정된 부피를 혼합하여 형성된 혼합물의 부피의 비는 약 1:10, 약 1:20, 약 1:25, 약 1:30, 약 1:40, 약 1:50, 약 1:100, 약 1:200, 약 1:250, 또는 약 1:300이다.
따라서, 본 발명은 유기 철 킬레이트 시약, 제2철, 및 pH 약 8.45 내지 8.85의 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성물 (예를 들어, 수성 액체 조성물)을 제공한다. 본 조성물을 핵산 증폭 방법에서 사용하여 핵산 증폭 반응의 샘플 저해를 제거할 수 있다. 선택적으로, 본 조성물은 폴리비닐피롤리돈을 포함할 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 조성물에 대한 적합한 pH는 적어도 8.45이다. 임의의 실시 형태에서, pH는 8.45 내지 8.85의 범위 이내일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 8.65 내지 8.75의 pH를 사용할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 8.75 내지 8.85의 pH를 사용할 수 있다.
유기 철 킬레이트 시약은 제2철 (Fe+3) 철 이온에 대하여 미리 규정된 친화도 상수를 가진다. pH 8.45 및 20℃의 탈이온수에서, 유기 철 킬레이트 시약은 제2철 철 이온에 대하여 104.2 이상의 친화도 상수를 가진다. 유기 철 킬레이트 시약은 또한 마그네슘 (Mg+2) 이온에 대하여 미리 규정된 친화도 상수를 가진다. pH 8.45 및 20℃의 탈이온수에서, 유기 철 킬레이트 시약은 마그네슘 이온에 대하여 103.8 미만의 친화도 상수를 가진다. 따라서, pH 8.45의 본 발명의 수성 조성물에서, 유기 철 킬레이트 시약은 마그네슘 이온보다 제2철 철 이온에 대하여 더 높은 친화도를 가진다.
적합한 유기 철 킬레이트 시약은 유기 분자를 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 유기 철 킬레이트 시약은 수용성이다. 임의의 실시 형태에서, 유기 철 킬레이트 시약은 복수의 카르복실레이트 기를 포함한다. 적합한 유기 철 킬레이트 시약의 비제한적인 예는 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA); N,N,N',N'-테트라키스(2-피리딜메틸)에탄-1,2-다이아민 (TPEN); 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 (BAPTA); N-(2-하이드록시에틸) 에틸렌다이아민-N,N′,N′-트라이아세트산 (HEDTA); 및 이들의 염을 포함한다.
임의의 실시 형태에서, 본 조성물은 제2철을 추가로 포함한다. 따라서, 본 발명의 수성 조성물은 제2철 철 이온을 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 제2철은 제2철 암모늄 시트레이트에 의해 조성물에 제공될 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 제2철은 약 55 μM 내지 385 μM의 제2철 이온 (즉, 용해된 제2철)의 농도로 본 발명에 따른 수성 액체 조성물에 존재할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 제2철 이온의 농도는 적어도 110 μM일 수 있고, 특정한 다른 실시 형태에서 이것은 적어도 165 μM일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 제2철 이온의 농도는 적어도 220 μM일 수 있고, 다른 실시 형태에서 이것은 적어도 275 μM 또는 적어도 330 μM일 수 있다. 본 발명에 따르면, 유기 철 킬레이트 시약이 EGTA를 포함하는 수성 조성물인 경우, 그 조성물은 용해된 제2철/EGTA의 몰비가 약 0.04 내지 약 0.28이다. 특정한 바람직한 실시 형태에서, 수성 조성물은 용해된 제2철/EGTA의 몰비가 약 0.14 내지 약 0.18이다.
본 발명에 따른 액체 (예를 들어, 수성 액체) 조성물의 임의의 실시 형태에서, 제2철 (제2철 암모늄 시트레이트로 제공됨)은 (조성물이 샘플과 혼합될 때) 약 50 μM 내지 350 μM의 제2철 이온의 농도를 생성시키도록 존재한다. 특정 실시 형태에서, 제2철 이온의 농도는 적어도 100 μM일 수 있고, 특정한 다른 실시 형태에서 이것은 적어도 150 μM일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 제2철 이온의 농도는 적어도 200 μM일 수 있고, 다른 실시 형태에서 이것은 적어도 250 μM 또는 적어도 300 μM일 수 있다. 본 발명에 따르면, 유기 철 킬레이트 시약이 EGTA를 포함하는 수성 조성물인 경우, 그 조성물은 Fe3 +/EGTA의 몰비가 약 0.04 내지 약 0.28이다. 특정한 바람직한 실시 형태에서, 본 조성물은 Fe3 +/EGTA의 몰비가 약 0.14 내지 약 0.18이다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 비이온성 계면활성제를 포함한다. 따라서, 본 조성물은 하나 이상의 임의의 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 비이온성 계면활성제는 친수-친유 평형값(Hydrophilic-lipophilic balance)이 약 11 내지 약 16이다. 친수-친유 평형값이 이러한 범위인 계면활성제는 PCR 및 LAMP 핵산 증폭 반응에서 충분한 DNA 중합효소 활성을 가능하게 할 뿐만 아니라 BART 리포터 기술(reporter technology)에서 충분한 루시퍼라제 및 ATP 설푸릴라제 활성을 가능하게 한다. 적합한 비이온성 계면활성제의 예는, 예를 들어 TRITON X-100 (t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올) 및 이의 유도체, TRITON X-114, TRITON X-405, TRITON X-101, TRITON N-42, TRITON N-57, TRITON N-60, TRITON X-15, TRITON X-35, TRITON X-45, TRITON X-102, TRITON X-155, TRITON X-165, TRITON X-207, TRITON X-305, TRITON X-705-70 및 TRITON B-1956을 포함하지만 반드시 이로 한정되지는 않는 TRITONTM 시리즈의 표면활성제(detergent); 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 (POE) 소르비탄 지방산 에스테르 (예컨대, Tween), POE 알킬 에테르 (예컨대, Brij), 노닐페놀, 라우릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌·폴리옥시프로필렌 블록 중합체, POE 알킬 아민, 및 POE 지방산 비스페닐 에테르 및 플루오로계면활성제, 예컨대 3M Novec™ 조작 액체 계면활성제(engineered liquid surfactant) FC-4430 및 FC4432, 및 Dow chemical FS 시리즈 플루오로계면활성제를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 액체 (예를 들어, 수성 액체) 조성물의 임의의 실시 형태에서, 본 발명의 유리한 효과 (즉, 핵산 증폭의 촉진과 관련된 효과)가 달성될 수 있는 한 조성물 중의 이러한 계면활성제의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 임의의 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 약 0.005% (w/v) 내지 약 0.3% (w/v)의 계면활성제를 포함한다. 따라서, 임의의 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 최대 약 0.3% (w/v)의 계면활성제를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 계면활성제의 농도는 적어도 0.01% (w/v)일 수 있고, 특정한 다른 실시 형태에서 이것은 적어도 0.025% (w/v)일 수 있고, 다른 실시 형태에서 이것은 0.032% (w/v)이다.
선택적으로, 본 발명의 임의의 실시 형태에서, 공칭 분자량이 30 KDa 내지 1.3 MDa인 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 태양에서, PVP는 공칭 분자량이 360 KDa이다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 소량의 계면활성제가 사용될 때 폴리비닐피롤리돈을 조성물에 포함시킬 수 있다. 본 발명에 따른 액체 (예를 들어, 수성 액체) 조성물의 실시 형태에서, 본 조성물은 (샘플을 첨가하기 전에) 0% w/v 내지 최대 약 0.0473% w/v의 PVP를 포함할 수 있다. 비이온성 계면활성제가 0.0055% 내지 0.011% w/v의 농도로 조성물에 존재할 때, 조성물은 약 0.011% w/v 내지 약 0.0473% w/v의 PVP를 포함할 수 있다. 상기 각각의 농도는 변형된 PVP에도 적용된다.
본 발명의 임의의 실시 형태에서, 소량의 계면활성제가 사용될 때 폴리비닐피롤리돈을 조성물에 포함시킬 수 있다. 본 발명에 따른 액체 (예를 들어, 수성 액체) 조성물의 실시 형태에서, 본 조성물은 (샘플을 첨가한 후에) 0% w/v 내지 최대 약 0.043% w/v의 PVP를 포함할 수 있다. 비이온성 계면활성제가 0.005% 내지 0.01% w/v의 농도로 조성물에 존재할 때, 조성물은 약 0.01% w/v 내지 약 0.043% w/v의 PVP를 포함할 수 있다. 상기 각각의 농도는 변형된 PVP에도 적용된다.
본 발명의 특정 실시 형태에서 (예를 들어, 비이온성 계면활성제 농도가 0.01% w/v를 초과할 때), 폴리비닐피롤리돈을 조성물에 포함시키지 않을 수 있다.
본 발명의 임의의 실시 형태에서, 유기 철 킬레이트 시약은 EGTA를 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 유기 철 킬레이트 시약을 염의 형태로 조성물에 제공할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본 조성물은, 예를 들어 EGTA의 나트륨 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 본 조성물은, 예를 들어 EGTA의 칼륨 염을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 Fe3+ (예를 들어, 제2철 암모늄 시트레이트를 통해 제공됨) 및 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (예를 들어, 에틸렌 글리콜 테트라아세트산의 염 (예컨대, 1가 양이온 염)을 통해 제공됨)을 포함할 수 있다. 따라서, 조성물에는, 에틸렌 글리콜 테트라아세트산과 Fe3+의 몰비가 존재할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, Fe3+에 대한 에틸렌 글리콜 테트라아세트산의 몰비는 약 0.04 내지 약 0.28이다.
본 발명에 따른 액체 (예를 들어, 수성 액체) 조성물의 임의의 실시 형태에서, EGTA는 0.5 mM 내지 5 mM의 농도로 존재할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, EGTA에 대한 금속 이온의 몰비는 적어도 0.6이다.
본 발명의 일 실시 형태에 따르면, 샘플을 직접 시험하거나, 시험 전에 샘플을 어떤 방식으로 준비시키거나 처리할 수 있다. 예를 들어, 임의의 오염 미생물을 풍부화시키도록 샘플을 처리할 수 있고, 샘플을 추가로 처리하여 그 안에 함유된 미생물 세포/바이러스 세포/진균 세포를 분리 및/또는 용해시킬 수 있다. 샘플로부터 용해된 미생물 세포를 추가로 처리하거나 준비시켜, 오염 미생물을 검출 및/또는 확인하는 분석을 위해 미생물로부터 유전 물질을 분리 및/또는 추출할 수 있다. 일부 실시 형태는 "샘플 중의 핵산" 또는 "샘플 유래 핵산"을 지칭하며, 샘플에 포함되거나 샘플로부터 얻은 핵산을 지칭한다. 이러한 핵산을 본 명세서에 기술된 방법으로 그리고 본 명세서에 기술된 조성물을 사용하여 시험할 수 있다.
본 발명의 특정 실시 형태에서, 샘플을 분리 단계에 적용시켜 다른 미생물 및 다른 샘플 성분으로부터 관심 미생물을 초기에 분리할 수 있다. 예를 들어, 성분이 복잡한 복합 식품 샘플의 경우, 분리 방법을 사용하여 미세유기체를 식품과 분리할 수 있다. 샘플로부터 분리된 미생물은 분석 전에 풍부화시킬 수도 있다. 샘플의 분석은 하나 이상의 분자적 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일부 예시적인 실시 형태에 따르면, 샘플을 오염시킨 것으로 의심되는 하나 이상의 미생물 핵산 서열에 특이적인 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 샘플을 (예를 들어, LAMP-BART에 의해) 핵산 증폭에 적용시킬 수 있다. 이어서, 증폭 생성물을 특이적 프로브 (또는 리포터 프로브)를 사용하여 추가로 시험에 적용시켜, 샘플로부터 증폭된 미생물 핵산 서열의 검출을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 미생물 핵산 서열이 샘플로부터 증폭된 경우, 증폭 생성물에 대해 추가의 분석을 수행하여, 검출된 미생물을 추가로 확인, 정량화 및 분석 (미생물 균주, 병원성, 양 등과 같은 그러나 이로 한정되지 않는 파라미터를 결정)할 수 있다.
본 발명은 대체로 핵산 증폭 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 본 발명에 따른 임의의 조성물 (예를 들어, 수성 조성물)을 표적 샘플과 접촉시켜 pH가 약 8.45 내지 8.85인 수성 혼합물을 형성하는 단계; b) 단계 a)의 수성 혼합물을 열 용해에 적용시키는 단계; 및 c) 단계 b)에 후속하여, 수성 혼합물의 일부를 등온 핵산 증폭에 적용시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 임의의 실시 형태에서, 핵산 증폭 방법은 a) 본 발명에 따른 임의의 조성물 (예를 들어, 수성 조성물)을 표적 샘플과 접촉시켜 pH가 약 8.45 내지 8.85인 수성 혼합물을 형성하는 단계; b) 단계 a)의 수성 혼합물을 열 용해에 적용시키는 단계; 및 c) 단계 b)에 후속하여, 수성 혼합물을 등온 핵산 증폭에 적용시키는 단계를 포함하며, 상기 방법은 샘플에 존재하는 방해 성분에 의해 야기되는 핵산 증폭의 저해를 제거한다.
본 발명은 대체로 핵산 증폭 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 본 발명에 따른 임의의 조성물 (예를 들어, 수성 조성물)을 샘플과 접촉시켜 pH가 약 8.45 내지 8.85인 수성 혼합물을 형성하는 단계; b) 단계 a)의 수성 혼합물을 열 용해에 적용시키는 단계; 및 c) 단계 b)에 후속하여, 수성 혼합물의 일부를 등온 핵산 증폭에 적용시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 증폭 방법은 등온적으로 수행할 수 있다. 등온 기법은 루프 매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 치환 증폭 (SDA), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 반응은 가닥 치환 반응을 사용하여 일정한 온도에서 진행된다. 샘플, 프라이머, 가닥 치환 활성을 갖는 DNA 중합효소 및 기질의 혼합물을 일정한 온도에서 인큐베이션함으로써 증폭을 단일 단계로 완료할 수 있다. 표적 핵산 서열의 카피 수를 증가시키는 단계 또는 반응 이외에, 증폭 방법은 증폭된 표적 핵산 서열을 검출하는 단계 또는 반응을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 검출 단계 또는 반응은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 생체발광 실시간 리포터(bioluminescent real-time reporter) (BART) 단계 또는 반응을 포함한다.
본 발명의 실시 형태에서, 등온 증폭 반응은 루프 매개 등온 증폭 (LAMP-BART) 방법이다. LAMP는 등온 조건 하에서 높은 특이성, 효율 및 신속성으로 DNA를 증폭시킬 수 있다. LAMP 방법은 Bst DNA 중합효소, 및 표적 DNA의 총 6개의 별개의 서열을 인식하며 가닥 치환 활성을 갖는 4개 내지 6개의 특이적으로 설계된 프라이머들의 세트를 필요로 한다. 루프 매개 등온 증폭 (LAMP)에서는, 각각 표적 유전자 상의 6개 내지 8개의 별개의 영역을 인식하도록 특이적으로 설계된 4개 내지 6개의 상이한 프라이머의 사용에 의해 표적 특이적 증폭을 달성한다. 이러한 방법은 전형적으로 15분 내지 60분 후에 핵산 카피 수를 109배 내지 1010배 증폭시킨다. 또한, 증폭 반응에서, 예를 들어 ATP-설푸릴라제, 아데노신-5'-O-퍼설페이트, 루시페린 및 루시퍼라제의 존재는 생체발광 (즉, BART 반응)을 통한 LAMP 매개 증폭 반응의 검출을 가능하게 한다.
프라이머 이외에, LAMP-BART 기법은 Tris, 황산염 화합물 (예를 들어, MgSO4, NH4SO4) 및 염화칼륨을 사용하여 효소 작용성을 유지시킨다. 따라서, 이러한 화합물은 LAMP-BART 연계 반응을 촉진시키는 증강제로 작용한다. Tris는 유기 화합물 (더 공식적으로는 트리스 (하이드록시메틸) 아미노메탄으로 알려져 있으며, 화학식은 (HOCH2)3CNH2임)이다. LAMP와 같은 가닥 치환 기법은 완충액으로 Tris를 사용하며, 이는 반응을 최적 pH로 유지시킨다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 수성 조성물)은 조성물을 포함하는 수용액의 대략적인 온도를 모니터링하도록 지시 염료를 선택적으로 포함할 수 있다. 유리하게는, 지시 염료는 조성물을 포함하는 수성 혼합물이 조성물과 접촉 중인 미생물 세포의 열 용해에 적합한 대략적인 범위의 온도 (예를 들어, 약 100℃)에 도달하였음을 나타내는 제1의 가시적 지시 (예를 들어, 제1의 관찰가능한 색)를 제공할 수 있다. 또한, 지시 염료는 조성물을 포함하는 수성 혼합물이, 그 혼합물의 일부를 분리하여 이를 핵산 증폭 반응에 투입하기에 적합한 온도 (예를 들어, ℃ 이하)로 냉각되었음을 나타내는 제2의 가시적 지시 (예를 들어, 제2의 색)를 제공할 수 있다. 수성 혼합물의 pH가 가열 및 냉각 단계 동안 변화함에 따라 특정 pH 지시약 (예를 들어, 약 8.8 내지 약 7.2의 pH 사이에서 적어도 부분적으로 확장되는 전이 범위를 갖는 것)을 쉽게 모니터링할 수 있다.
적합한 가시적인 염료는, 예를 들어 pH가 8.8을 초과할 때 적자색(reddish-purple color)을 띠고 pH가 7.2 미만일 때 황색을 띠는 크레졸 레드(Cresol Red)를 포함한다.
본 발명의 임의의 실시 형태에서, 지시 염료는 크레졸 레드일 수 있다.
LAMP를 사용하는 경우, 2쌍 또는 3쌍의 프라이머 및 복제 활성 이외에 높은 가닥 치환 활성을 갖는 중합효소를 사용하여 표적 핵산 서열을 60℃ 내지 65℃의 일정한 온도에서 증폭시킨다. 루프 매개 등온 증폭 (LAMP) 반응은 고도로 특이적이고 민감한 등온 핵산 증폭 반응이다. LAMP는 정방향 내부 프라이머 (FIP), 역방향 내부 프라이머 (BIP), 정방향 치환 프라이머 (F3) 및 역방향 치환 프라이머 (B3)로 명명되는 4개의 필수 프라이머들의 프라이머 세트를 사용한다. 이러한 4개의 상이한 프라이머를 사용하여 표적 유전자 상의 6개의 별개의 영역을 확인하는데, 이는 특이성을 크게 증가시켜 준다. 이들 프라이머의 특정 작용 성질로 인해, LAMP에서 생성된 DNA의 양은 PCR 기반 증폭보다 상당히 더 많다. 또한, 반응을 효과적으로 가속화하는 2개의 선택적인 프라이머를 포함시킬 수 있으며, 이들은 정방향 루프 프라이머 (LF) 및 역방향 루프 프라이머 (LB)로 명명된다. 내부 프라이머 (FIP 및 BIP)는 표적 DNA의 센스 및 안티센스 가닥 서열을 함유하는 한편, 치환 프라이머 (F3 및 B3) 및 루프 프라이머 (LF 및 LB)는 각각 단일 표적 서열을 함유한다. 루프 프라이머 (LF 및 LB)를 반응에 포함시킬 때 총 8개의 표적 서열이 인식된다. DNA 중합효소를 사용하여 관심 표적 서열을 증폭시킨다. 자연계에서 발견되지 않는 유전자 조작된 DNA 중합효소를 포함하는 많은 다양한 DNA 중합효소를 사용할 수 있는데, 가장 통상적인 것은 Bst DNA 중합효소이며, 한편 게오바실루스 종 (Geobacillus sp.)의 큰 단편 (GspSSD) DNA 중합효소는 덜 자주 사용된다.
내부 프라이머 (FIP 및 BIP)에 의해 프라이밍(priming)되는 DNA 합성에 의해 LAMP 반응을 개시한다. 이후에, 치환 프라이머 (F3 또는 B3)에 의해 프라이밍되는 DNA 합성이 이어지며, 이는 단일 가닥 DNA를 방출시킨다. 이 단일 가닥 DNA는, 표적의 다른 말단에 혼성화되는 제2의 내부 및 치환 프라이머에 의해 프라이밍되는 DNA 합성을 위한 주형의 역할을 한다. 이는 스템-루프(stem-loop) DNA 구조를 생성시킨다. 후속 LAMP 사이클링에서, 하나의 내부 프라이머는 생성물 상의 루프에 혼성화되어 치환 DNA 합성을 개시한다. 이는 본래의 스템-루프 DNA 및 스템의 길이가 2배인 새로운 스템-루프 DNA를 생성시킨다. 사이클링 반응은 1시간 미만 이내에 표적의 대략 109개의 카피를 계속 축적시킨다. 1개 또는 2개의 루프 프라이머 (LF 및/또는 LB)의 포함은, 내부 프라이머에 의해 혼성화되어 가닥 치환 DNA 합성을 프라이밍하는 루프를 제외하고는 스템-루프에 혼성화됨으로써 LAMP 반응을 가속화한다. 다양한 LAMP 증폭 검출 방법이 존재한다. 피로인산마그네슘이 양성 LAMP 반응에서 침전됨에 따라 혼탁한 샘플의 가시적인 확인을 통해 비특이적인 표적 검출을 얻을 수 있다. 양성 반응의 더 나은 가시성을 위해, 다양한 작용제(agent), 예를 들어 하이드록시 나프톨 블루(hydroxy naphthol blue) 또는 칼세인(calcein)을 반응에 첨가할 수 있다. 대안적으로, 반응 시약에 첨가되거나 종말점 분석을 위해 반응의 완결 후에 첨가되는, DNA 삽입 염료(intercalating dye), 예를 들어 크레졸 레드, SYBR 그린(green), 피코그린(Picogreen) 또는 프로피디움 요오다이드를 사용하여 형광 검출을 달성할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물에 현탁된 샘플을 표적 핵산 종에 대한 등온 핵산 증폭 반응 성분과 접촉시켜 증폭 반응 혼합물을 제공하는 단계; 등온 핵산 증폭 반응이 진행되기에 충분한 조건 하에서 증폭 반응 혼합물을 인큐베이션하여 생성물을 제공하는 단계; 및 표적 핵산 종의 지시자가 생성물에 존재하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 증폭 반응 혼합물의 등온 반응을 수행하여 생성물을 제공하는 단계 - 그 혼합물은 본 발명에 따른 조성물 및 표적 핵산 종에 대한 핵산 증폭 반응 성분과 혼합된 샘플을 포함하는 용해물을 포함함 -; 및 표적 핵산 종의 지시자가 생성물에 존재하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
등온 증폭 반응 성분은 용액 상태로 그리고/또는 건조 (예를 들어, 동결건조) 형태로 제공될 수 있다. 하나 이상의 성분이 건조 형태로 제공될 때, 재현탁 또는 재구성 완충액을 또한 사용할 수 있다. 대안적으로, 샘플과 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 수성 혼합물을 형성한 후에 그리고 수성 혼합물을 열 용해 절차에 적용시킨 후에, 수성 혼합물을 사용하여 등온 반응 성분을 재구성할 수 있다.
특정 증폭 반응 유형에 따라, 반응 혼합물은 완충액, 염, 뉴클레오티드, 및 반응이 진행되는 데 필요한 바와 같은 다른 성분을 함유할 수 있다. 반응에 적절한 특정 온도에서 반응 혼합물을 인큐베이션할 수 있다.
표적 핵산은 동물 (예를 들어, 인간), 식물, 진균 (예를 들어, 효모), 원생 동물, 세균 또는 바이러스 종에 존재하는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산은 관심 유기체의 게놈에 (예를 들어, 염색체 상에) 또는 염색체외 핵산 상에 존재할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적 핵산은 RNA, 예를 들어 mRNA이다. 특정 실시 형태에서, 표적 핵산은 관심 유기체에 특이적이며, 즉, 표적 핵산은 다른 유기체에서 발견되지 않거나 관심 유기체와 유사한 유기체에서 발견되지 않는다.
본 발명은 샘플에서 미세유기체를 검출하는 방법을 필요로 하는 다양한 분야에서 여러 가지의 응용을 가지며, 여기서 조성물은 열 용해 단계 동안 샘플이 유지되는 현탁 매체로서 사용될 수 있고, 조성물은 LAMP-BART 핵산 증폭 시약의 동결건조 펠릿이 용해되어 반응하게 하는 수성 매체로서 사용될 수 있다.
본 발명은 사용자가 샘플을, 유기 철 킬레이트 시약, 제2철, 및 비이온성 계면활성제, EGTA (또는 이의 1가 염), 및 선택적으로 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 pH 약 8.4 내지 8.85의 조성물과 단지 접촉시켜 수성 혼합물을 형성하고; 후속하여 수성 혼합물을 용해 절차 (예를 들어, 열 용해 절차)에 적용시키고; 수성 혼합물을 냉각시킨 후, 미세유기체의 검출을 위해 수성 혼합물을 등온 핵산 증폭 반응에 적용시키는 것을 수월하게 해줄 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 키트를 제공한다. 대체로, 키트는 본 발명에 따른 유기 철 킬레이트 시약, 제2철, 비이온성 계면활성제, 및 선택적으로 폴리비닐피롤리돈을 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 키트는 유기 철 킬레이트 시약, 제2철 및 비이온성 계면활성제를 포함한다. 유기 철 킬레이트 시약은 제2철에 대하여 104.2 이상의 제1 친화도 상수를 가지고, 마그네슘에 대하여 103.8 미만의 제2 친화도 상수를 가지며, 여기서 제1 친화도 상수와 제2 친화도 상수는 pH 8.45 및 20°의 탈이온수에서 결정된다.
키트의 임의의 실시 형태에서, 유기 철 킬레이트 시약은 복수의 카르복실레이트 기를 포함할 수 있다. 임의의 상기 실시 형태에서, 키트는 2-하이드록시프로판-1,2,3-트라이카르복실레이트 (시트르산)를 추가로 포함할 수 있다. 키트의 임의의 상기 실시 형태에서, 유기 철 킬레이트 시약은 EGTA를 포함할 수 있으며, 여기서 EGTA에 대한 제2철의 몰비는 약 0.04 내지 약 0.28이다.
다른 실시 형태에서, 키트는 플루오로계면활성제, 지시 염료, 방부제, 완충제, 및 LAMP-BART 반응의 증강제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성분을 추가로 포함할 수 있다. 키트의 임의의 실시 형태에서, 임의의 하나 이상의 전술한 성분은 키트에 조성물 중에 존재할 수 있다. 본 키트는 표적 핵산의 증폭을 위해 적어도 하나의 프라이머, 예를 들어 2개의 프라이머를 포함할 수 있다. 이것은, 키트 내의 하나 이상의 다른 프라이머(들)에 대한 표적인 동일한 핵산 (및 심지어 동일한 핵산 내의 동일한 서열)일 수 있지만 반드시 그렇지는 않은 표적 핵산의 증폭을 위한 적어도 하나의 다른 프라이머도 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 키트는 하나 이상의 독특한 게놈 서열을 증폭시키기 위한 둘 이상의 프라이머를 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 키트는 단일 패키지 또는 동일한 키트 내의 1개 초과의 패키지에 성분들 (즉, 조성물, 이의 성분, 플루오로계면활성제, 지시 염료, 방부제, 완충제 및/또는 LAMP-BART 반응의 증강제)을 포함한다. 1개 초과의 패키지가 키트에 포함되는 경우, 각각의 패키지는 독립적으로 단일 성분 또는 다수의 성분을 임의의 적합한 조합으로 함유할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단일 키트에서의 둘 이상의 패키지 또는 컨네이터(container)의 조합은 "패키징된 조합으로"로 지칭된다.
키트의 임의의 실시 형태에서, 유기 철 킬레이트 시약, 제2철, 폴리비닐피롤리돈, 비이온성 계면활성제, 플루오로계면활성제, 지시 염료, 방부제, 완충제 또는 증강제 중 임의의 하나 이상이 수용액 상태로 처리된다. 임의의 실시 형태에서, 수용액은 pH가 약 8.45 내지 8.85일 수 있다.
키트 및 키트 내의 컨테이너는 임의의 공지된 재료로 제조될 수 있다. 예를 들어, 키트 자체는 플라스틱 재료 또는 판지(cardboard)로 만들어질 수 있다. 성분을 수용하는 컨테이너는, 예를 들어 플라스틱 재료 또는 유리일 수 있다. 하나의 키트 내의 다양한 컨테이너가 다양한 재료로 만들어질 수 있다. 실시 형태에서, 키트는 그 안에 다른 키트를 함유할 수 있다.
본 발명의 키트는 표적 서열을 증폭시키는 데 유용한 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 실시 형태에서, LAMP-BART 방법을 수행하는 데 필요한 시약 및 공급품 중 일부 또는 전부가 키트에 포함된다. 시약의 비제한적인 예는 완충액 (예를 들어, Tris, HEPES 등을 함유하는 완충액), 염, 및 주형 의존성 핵산 신장 효소 (예를 들어, Taq 중합효소와 같은 열안정성 효소), 이 효소의 활성에 적합한 완충액, 및 이 효소에 필요한 추가의 시약, 예컨대 dNTP, dUTP, 및/또는 UDG 효소이다. 실시 형태에서, 본 키트는 효소 반응을 촉진시키도록 염화칼륨 및 황산암모늄과 같은 증강제를 포함한다. 공급품의 비제한적인 예는 반응 용기 (예를 들어, 마이크로퓨지(microfuge) 튜브)이다.
본 키트는 높은 민감도, 높은 특이성, 조작의 용이성, 육안으로 결과를 판단할 수 있는 능력 등의 이점을 가진다.
예시적인 실시 형태
실시 형태 A는 조성물이며, 상기 조성물은,
유기 철 킬레이트 시약;
제2철; 및
0.005% (질량/부피) 이상 농도의 비이온성 계면활성제를 포함하고;
이 조성물은 pH가 약 8.45 내지 8.85이고;
유기 철 킬레이트 시약은 제2철에 대하여 104.2 초과의 제1 친화도 상수를 가지고, 마그네슘에 대하여 103.8 미만의 제2 친화도 상수를 가지며, 여기서 제1 친화도 상수와 제2 친화도 상수는 pH 8.45 및 20℃의 탈이온수에서 결정된다.
실시 형태 B는, 물을 추가로 포함하며, 비이온성 계면활성제는 0.005% (질량/부피) 이상 농도로 조성물에 존재하는, 실시 형태 A의 조성물이다.
실시 형태 C는, 유기 철 킬레이트 시약이 복수의 카르복실레이트 기를 포함하는, 실시 형태 A 또는 실시 형태 B의 조성물이다.
실시 형태 D는, 유기 철 킬레이트 시약이 수용성인, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 E는, 유기 철 킬레이트 시약이 EGTA; N,N,N',N'-테트라키스(2-피리딜메틸)에탄-1,2-다이아민; 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산; N-(2-하이드록시에틸)-에틸렌다이아민-N,N′,N′-트라이아세트산; 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시 형태 D의 조성물이다.
실시 형태 F는, 유기 철 킬레이트 시약이 EGTA를 포함하며, EGTA에 대한 제2철의 몰비는 약 0.04 내지 약 0.28인, 실시 형태 E의 조성물이다.
실시 형태 G는, EGTA가 0.5 mM 내지 5 mM의 농도로 존재하는, 실시 형태 F의 조성물이다.
실시 형태 H는, EGTA가 나트륨 염 또는 칼륨 염으로 조성물에 존재하는, 실시 형태 F 또는 실시 형태 G의 조성물이다.
실시 형태 I는, 2-하이드록시프로판-1,2,3-트라이카르복실레이트를 추가로 포함하며, 유기 철 킬레이트 시약과 2-하이드록시프로판-1,2,3-트라이카르복실레이트는 별개의 분자인, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 J는, 비이온성 계면활성제의 친수-친유 평형값이 약 11 내지 약 16인, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 K는, 비이온성 계면활성제가 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 노닐페놀, 라우릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌·폴리옥시프로필렌 블록 중합체, 폴리옥시에틸렌 알킬 아민, 및 폴리옥시에틸렌 지방산 비스페닐 에테르, 및 전술한 비이온성 계면활성제 중 임의의 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 L은, 비이온성 계면활성제가 최대 약 0.3% 질량/부피의 농도로 존재하는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 M은, 제2철이 50 μM 내지 300 μM의 농도로 수성 조성물에 용해되어 있는, 실시 형태 B 내지 실시 형태 L 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 N은, 폴리비닐피롤리돈을 추가로 포함하는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 O는, 폴리비닐피롤리돈이 최대 0.043% w/v의 농도로 존재하는, 실시 형태 N의 조성물이다.
실시 형태 P는, 플루오로계면활성제를 추가로 포함하는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 Q는, 플루오로계면활성제가 FC-4430TM인, 실시 형태 P의 조성물이다.
실시 형태 R은, 지시 염료를 추가로 포함하는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 S는, 지시 염료가 크레졸 레드인, 실시 형태 R의 조성물이다.
실시 형태 T는, 방부제를 추가로 포함하는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 U는, 방부제가 메틸아이소티아졸리논인, 실시 형태 T의 조성물이다.
실시 형태 V는, 샘플에서 미세유기체를 검출하는 데 사용하기 위한, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 W는, 샘플이 식품 샘플, 임상 샘플 또는 배양 브로스인, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 X는, 식품 샘플이 단백질을 포함하는, 실시 형태 W의 조성물이다.
실시 형태 Y는, 단백질이 페리틴(ferritin)인, 실시 형태 X의 조성물이다.
실시 형태 Z는, 샘플이 배양 브로스를 포함하는, 선행하는 실시 형태들 중 어느 하나의 조성물이다.
실시 형태 AA는, 샘플이 에스쿨린을 포함하는, 실시 형태 Z의 조성물이다.
실시 형태 AB는 등온 핵산 증폭 방법이며, 상기 방법은,
a) 실시 형태 B 내지 실시 형태 AA 중 어느 하나의 조성물을 표적 샘플과 접촉시켜 수성 혼합물을 형성하는 단계;
b) 단계 a)의 수성 혼합물을 열 용해 공정에 적용시키는 단계; 및
c) 단계 b) 후에, 수성 혼합물을 등온 핵산 증폭 공정에 적용시키는 단계를 포함한다.
실시 형태 AC는, 샘플에 존재하는 방해 성분에 의해 야기되는 핵산 증폭의 저해를 제거하기 위한, 실시 형태 AB의 방법이다.
실시 형태 AD는, 등온 핵산 증폭 방법이 루프 매개 등온 증폭 (LAMP) 방법인, 실시 형태 AB 또는 실시 형태 AC의 방법이다.
실시 형태 AE는, 샘플이 식품 샘플, 임상 샘플 또는 배양 브로스인, 실시 형태 AB 내지 실시 형태 AD 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 AF는, 식품 샘플이 단백질을 포함하는, 실시 형태 AE의 방법이다.
실시 형태 AG는, 단백질이 페리틴인, 실시 형태 AF의 방법이다.
실시 형태 AH는, 샘플이 배양 브로스인, 실시 형태 AB 내지 실시 형태 AG 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 AI는, 샘플이 에스쿨린을 포함하는, 실시 형태 AH의 방법이다.
실시 형태 AJ는, 샘플이 단계 a) 전에 약 41.5℃의 배양 브로스에서 인큐베이션되는, 실시 형태 AB 내지 실시 형태 AI 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 AK는, 조성물이 완충제, 및 LAMP-BART 반응을 촉진하는 증강제를 추가로 포함하는, 실시 형태 AB 내지 실시 형태 AJ 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 AL은, 증강제가 염화칼륨, 황산암모늄, 황산마그네슘 7수화물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시 형태 AK의 방법이다.
실시 형태 AM은, 완충제가 Tris 염기를 포함하는, 실시 형태 AK 또는 실시 형태 AL의 방법이다.
실시 형태 AN은, 수성 혼합물을 열 용해 공정에 적용시키는 단계가 수성 혼합물을 약 15분 동안 약 100℃로 가열하는 단계 및 후속하여 혼합물을 약 5분 동안 약 40℃로 냉각시키는 단계를 포함하는, 실시 형태 AB 내지 실시 형태 AM 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 AO는, 혼합물을 약 40℃로 냉각시킨 후, 혼합물을 LAMP-BART 등온 증폭을 위한 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 실시 형태 AN의 방법이다.
실시 형태 AP는,
제2철;
유기 철 킬레이트 시약; 및
비이온성 계면활성제를 포함하는 키트이며;
여기서, 유기 철 킬레이트 시약은 제2철에 대하여 104.2 이상의 제1 친화도 상수를 가지고, 마그네슘에 대하여 103.8 미만의 제2 친화도 상수를 가지며, 여기서 제1 친화도 상수와 제2 친화도 상수는 pH 8.45 및 20℃의 탈이온수에서 결정된다.
실시 형태 AQ는, 유기 철 킬레이트 시약이 복수의 카르복실레이트 기를 포함하는, 실시 형태 AP의 키트이다.
실시 형태 AR은, 유기 철 킬레이트 시약이 에틸렌 글리콜 테트라아세트산; N,N,N',N'-테트라키스(2-피리딜메틸)에탄-1,2-다이아민; 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산; N-(2-하이드록시에틸)-에틸렌다이아민-N,N′,N′-트라이아세트산; 및 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시 형태 AP의 키트이다.
실시 형태 AS는, 폴리비닐피롤리돈을 추가로 포함하는, 실시 형태 AP 내지 실시 형태 AR 중 어느 하나의 키트이다.
실시 형태 AT는, 비이온성 계면활성제가 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 노닐페놀, 라우릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌·폴리옥시프로필렌 블록 중합체, 폴리옥시에틸렌 알킬 아민, 폴리옥시에틸렌 지방산 비스페닐 에테르, 및 전술한 비이온성 계면활성제 중 임의의 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시 형태 AP 내지 실시 형태 AS 중 어느 하나의 키트이다.
실시 형태 AU는, 유기 철 킬레이트 시약이 EGTA, BAPTA, HEDTA, TPEN, 또는 임의의 전술한 유기 철 킬레이트 시약의 1가 양이온성 염을 포함하는, 실시 형태 AP 내지 실시 형태 AT 중 어느 하나의 키트이다.
실시 형태 AV는, 1가 양이온성 염이 나트륨 염 및 칼륨 염으로부터 선택되는, 실시 형태 AU의 키트이다.
실시 형태 AW는, 플루오로계면활성제를 추가로 포함하는, 실시 형태 AP 내지 실시 형태 AV 중 어느 하나의 키트이다.
실시 형태 AX는, 플루오로계면활성제가 FC-4430TM인, 실시 형태 AW의 키트이다.
실시 형태 AY는, 지시 염료를 추가로 포함하는, 실시 형태 AP 내지 실시 형태 AX 중 어느 하나의 키트이다.
실시 형태 AZ는, 지시 염료가 크레졸 레드인, 실시 형태 AY의 키트이다.
실시 형태 BA는, 방부제를 추가로 포함하는, 실시 형태 AP 내지 실시 형태 AZ 중 어느 하나의 키트이다.
실시 형태 BB는, 방부제가 메틸아이소티아졸리논인, 실시 형태 BA의 키트이다.
실시 형태 BC는, 완충제를 추가로 포함하는, 실시 형태 AP 내지 실시 형태 BB 중 어느 하나의 키트이다.
실시 형태 BD는, 완충제, 및 LAMP-BART 반응을 촉진하는 증강제를 추가로 포함하는, 실시 형태 AP 내지 실시 형태 BC 중 어느 하나의 키트이다.
실시 형태 BE는, 증강제가 염화칼륨, 황산암모늄, 황산마그네슘 7수화물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시 형태 BD의 키트이다.
실시 형태 BF는, 완충제가 Tris 염기를 포함하는, 실시 형태 BE의 키트이다.
실시 형태 BG는, 유기 철 킬레이트 시약, 제2철, 폴리비닐피롤리돈, 및 비이온성 계면활성제 중 적어도 하나가 수성 매체 중에 처리되는, 실시 형태 AP 내지 실시 형태 BF 중 어느 하나의 키트이다.
실시 형태 BH는, 수성 매체의 pH가 약 8.45 내지 8.85인, 실시 형태 BG의 키트이다.
실시 형태 BI는, 사용 설명서를 포함하는, 실시 형태 AP 내지 실시 형태 BH 중 어느 하나의 키트이다.
실시예
본 발명의 목적 및 이점이 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이들 실시예에 언급된 특정 물질 및 이의 양뿐만 아니라 다른 조건 및 세부 사항은 본 발명을 부당하게 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 달리 표시되지 않는 한, 모든 부 및 백분율은 중량 기준이며, 모든 물은 증류수이고, 모든 분자량은 중량 평균 분자량이다.
실시예 1- 단백질을 함유하는 샘플과의 LAMP-BART 반응에서 제2철과 유기 철 킬레이트 시약을 포함하는 조성물의 효과.
샘플: 생고기(Raw meat)
25 g의 살코기 80%의 분쇄된 쇠고기 샘플을, Nasco Whirl-pak® 필터 백(filter bag) 내의 225 mL의 실온의 데미-프레이저 (3M)에 첨가하고, 혼합물을 2분 동안 소화처리(stomaching)하였다. 소화처리된 혼합물이 들어 있는 백을 37℃ 인큐베이터에 넣고, 풍부화를 위해 24시간 동안 인큐베이션하였다. 풍부화된 샘플의 20 μL 분취량을, 각각 150 μM, 100 μM, 50 μM 또는 0 μM 제2철 암모늄 시트레이트를 함유하는 580 μL의 4가지 상이한 용해 용액 제형(formulation)에 3회 반복하여 첨가하였다. 제2철 암모늄 시트레이트 이외에, 4가지 용해 용액 각각은 하기 표 1에 제시된 바와 같은 시약을 함유하였다.
표 1: 용해 용액을 위한 기본 제형. 다양한 농도의 제2철 암모늄 시트레이트를 실시예 1에 기술된 바와 같이 이러한 기본 제형에 첨가하였다.
[표 1]
용해 용액의 튜브를 100℃ 3M 가열 블록(heat block) 상에서 15분 동안 가열하고, 약 40℃로 냉각하고, 20 μL 분취량을 일반 기질 대조(generic matrix control) LMAP-BART 펠릿 (Part No. MDMC96NA, 미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 3M Company로부터 입수가능함)에 첨가하였다. 펠릿을 MDS 기기 (Part No. MDS 100; 미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 3M Company로부터 입수가능함)에 넣고, 생체발광 (즉, BART 반응)을 75분 동안 기록하였다.
도 1은 Fe+3 농도를 증가시키는 것이 더 빠른 반응 시간을 가져오는 용량 의존성 반응으로의 저해 완화를 나타낸다. 이것은 BART 광 방출에 대한 다양한 농도의 Fe+3의 효과를 나타낸다. 광 세기는 핵산 증폭에 정비례하는 상대 광 단위(Relative Light Unit, RLU)로 측정한다. 도 1은 150 μM 농도의 Fe+3가 최대 RLU 피크를 발생시켰고; 100 μM 및 50 μM 농도의 Fe+3는 더 작은 피크를 발생시켰으며; RLU는 Fe+3 의 부재(0 μM) 하에 최소였음을 보여준다. 또한, 반응 시간은 Fe+3 농도가 높을수록 훨씬 빨랐으며, Fe+3의 부재(0 μM) 하에 가장 느린 것으로 나타났다.
이는 본 발명의 조성물이 생고기 샘플에 존재하는 단백질에 의해 야기되는 핵산 증폭 저해의 감소/제거를 일으킨다는 사실을 나타낸다.
실시예 2- 에스쿨린 또는 에스쿨레틴을 함유하는 샘플의 LAMP-BART 반응에서 제2철과 유기 철 킬레이트 시약을 포함하는 조성물의 효과.
데미-프레이저 (3M) 중의 리스테리아 종 (LM 7244)의 하룻밤 배양물을 하기와 같이 4가지 상이한 배지에서 (10-6배까지) 연속 희석시켰다:
1. 데미-프레이저 (DF) - FAC 없음
2. 데미-프레이저 + FAC (100 μL/10 mL)
3. 데미-프레이저 + 6,7 다이하이드록시쿠마린 [에스쿨레틴] (0.52 g/L)
4. 데미-프레이저 + 6,7 다이하이드록시쿠마린 [에스쿨레틴] (0.52 g/L)+ FAC (100 μL/10 mL)
이어서, 상기 배지 각각을 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 20 μL의 각각의 샘플을 상기 표 1에 기재된 바와 같은 580 μL의 용해 제형에 첨가하고, 가열 블록 상에서 15분 동안 비등시키고, 20 μL 분취량을 3M™ 분자 검출 시스템(Molecular Detection System, MDS) 1.0 L. 모노시토게네스(L. monocytogenes) 펠릿(part no. MDALM96NA; 미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 3M Company로부터 입수가능함)에 첨가하였다.
도 2는 상기와 같이 시험한 4가지 배지에 관한 LAMP-BART 반응에서의 "피크까지의 시간" (TTP)의 플롯이다. "TTP"는 3M 분자 검출 시스템을 사용하여 양성 결과에 이르기까지의 시간의 양 (분)을 지칭한다. 도 2에 사용된 바와 같은 단어 "쿠마린"은 에스쿨린의 효소 가수분해 생성물인 6,7,-다이하이드록시쿠마린을 지칭한다.
이는 본 발명의 조성물이 에스쿨린 또는 이의 분해 생성물에 의해 야기되는 핵산 증폭 저해의 감소/제거를 일으킨다는 사실을 나타낸다.
실시예 3- LAMP-BART 반응에서 제2철과 유기 철 킬레이트 시약을 포함하는 조성물에 대한 계면활성제의 효과.
볼튼 브로스(Bolton Broth) 중의 25 g의 닭 부위 및 조각 샘플을 5% 레이킹된(laked) 말 혈액과 함께 41.5℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다:
1) 브로스 배양물의 3개의 반복된 20 μL 분취량을 580 μl의 용해 용액을 함유하는 별개의 튜브에 첨가하였다.
2) 튜브를 가열 블록에 15분 동안 넣어 두었다.
3) 그 후, 튜브 랙(tube rack)을 실온의 냉각 블록(chill block) 상에 5분 동안 놓아 두었다.
4) 최종적으로, 20 μL의 용해물을 사용하여 MDS 기질 대조 펠릿을 재구성하고, 등온 증폭 반응을 실행하였다.
용해 용액은, TRITON-X-100의 양을 달리 하고 황산마그네슘 7수화물 (73.8 mg/L)이 추가로 존재한 것을 제외하고는 표 1에 기재된 바와 동일하였다. 계면활성제 및 FAC는 표 2에 열거된 농도에 따라 달리 하였다.
[표 2]
도 3은 표 2에 기재된 데이터의 박스플롯이며, 이는 계면활성제 수준을 주어진 계면활성제 (TRITON X-100 임계 미셀 농도 (Critical Micelle Concentration, CMC) = 190 ppm)의 CMC 미만으로 제어함으로써 제2철 이온의 항-저해 효과를 더해주고, 성능의 향상 (즉, 더 빠른 양성 결과까지의 시간)을 가져온다는 것을 보여준다. 이론에 구속됨이 없이, 그 효과는 생고기 샘플로부터의 단백질 가용화의 감소로 인한 것일 수 있는 것으로 조사되었다. 효과적인 계면활성제 농도의 하한은 약 20 ppm이다. 20 ppm 미만의 계면활성제 농도에서, 등온 증폭 반응은 저해되었는데, 이는 아마도 튜브 벽에 들러붙는 증폭/검출 검정 효소에 기인했을 것이다. 용해 완충액 중의 제2철 암모늄 시트레이트 이외에, 계면활성제 수준이 계면활성제의 CMC 미만으로 유지될 때 유리한 효과가 존재한다.
본 발명은 대체로 연구 및 진단 둘 모두에 사용하기에 적합하다. 즉, 다양한 핵산 또는 발현된 유전자를 확인할 목적으로 또는 다른 연구 목적으로 본 발명의 조성물, 방법 및 키트를 사용할 수 있다. 마찬가지로, 본 조성물, 방법 및 키트를 사용하여 인간 및 동물의 수많은 질병 또는 장애를 진단할 수 있다. 또한, 이를 사용하여 병이 있거나 다른 방식으로 오염된 식품 생성물 (예를 들어, 하나 이상의 병원성 유기체/미세유기체로 감염된 식품), 또는 샘플 중의 독성 물질 또는 독소 생성 유기체의 존재를 확인할 수 있다. 따라서, 본 조성물 및 방법은 인간 건강 및 수의학 응용뿐만 아니라 식품 시험 및 국토 안보 응용을 가진다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물, 그리고 전자적으로 입수가능한 자료의 완전한 개시 내용이 참고로 포함된다. 본 출원의 개시 내용과 본 명세서에 참고로 포함된 임의의 문헌의 개시 내용(들) 사이에 임의의 불일치가 존재하는 경우, 본 출원의 개시 내용이 우선할 것이다. 전술한 상세한 설명 및 실시예들은 단지 이해의 명료성을 위해 제시되었다. 이로부터의 어떠한 불필요한 제한도 없음이 이해되어야 한다. 당업자에게 자명한 변화가 청구범위에 의해 규정되는 본 발명 내에 포함될 것이므로, 본 발명은 제시되고 설명된 정확한 세부 사항으로 한정되지 않는다.
모든 표제는 독자의 편의를 위한 것이며, 명시되지 않는 한, 표제 이후의 본문의 의미를 제한하기 위해 사용되어서는 안 된다.
본 명세서에 예시적으로 기술된 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들)의 부재 하에 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어 본 명세서에서 각각의 경우에, 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진", 및 "이루어진" 중 임의의 용어는 다른 두 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 방식으로 사용되며, 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서 제시되고 설명된 특징들 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배제하려는 의도는 없고, 다양한 변형이 청구된 본 발명의 범주 내에서 가능하다는 것이 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시 형태 및 선택적인 특징들에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본 명세서에 개시된 개념의 변형 및 변화가 당업자에 의해 이루어질 수 있으며 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구범위에 의해 규정되는 바와 같은 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 간주된다는 것이 이해되어야 한다.
Claims (20)
- 등온 핵산 증폭 반응에서 샘플 저해를 제거하는 수성 조성물로서, 상기 수성 조성물은,
유기 철 킬레이트 시약(organic iron-chelating reagent)으로서, 상기 유기 철 킬레이트 시약은 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA), N,N,N',N'-테트라키스(2-피리딜메틸)에탄-1,2-다이아민, 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산, N-(2-하이드록시에틸) 에틸렌다이아민-N,N′,N′-트라이아세트산, 및 이들의 염의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 유기 철 킬레이트 시약;
제2철(ferric iron); 및
0.005% (질량/부피) 이상이고 0.019% (질량/부피) 미만의 농도의 비이온성 계면활성제를 포함하며;
상기 수성 조성물은 pH가 8.45 내지 8.85이고;
상기 유기 철 킬레이트 시약은 제2철에 대하여 104.2 이상의 제1 친화도 상수를 가지고, 마그네슘에 대하여 103.8 미만의 제2 친화도 상수를 가지며, 여기서 상기 제1 친화도 상수와 상기 제2 친화도 상수는 pH 8.45 및 20℃의 탈이온수에서 결정되는, 수성 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 유기 철 킬레이트 시약은 EGTA를 포함하며, 여기서 상기 EGTA에 대한 제2철의 몰비는 0.04 내지 0.28인, 수성 조성물. - 제1항에 있어서,
2-하이드록시프로판-1,2,3-트라이카르복실레이트를 추가로 포함하며, 여기서 상기 유기 철 킬레이트 시약과 상기 2-하이드록시프로판-1,2,3-트라이카르복실레이트는 별개의 분자인, 수성 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 비이온성 계면활성제는 친수-친유 평형값(Hydrophilic-lipophilic balance)이 11 내지 16인, 수성 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 제2철은 50 μM 내지 350 μM의 농도로 상기 수성 조성물에 용해되어 있는, 수성 조성물. - 제1항에 있어서,
폴리비닐피롤리돈을 추가로 포함하는, 수성 조성물. - 제1항에 있어서,
플루오로계면활성제(fluorosurfactant)를 추가로 포함하는, 수성 조성물. - 제1항에 있어서,
지시 염료(indicator dye)를 추가로 포함하는, 수성 조성물. - 등온 핵산 증폭 방법으로서, 상기 방법은,
a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 표적 샘플과 접촉시켜 수성 혼합물을 형성하는 단계;
b) 단계 a)의 상기 수성 혼합물을 열 용해 공정에 적용시키는 단계; 및
c) 단계 b)에 후속하여, 상기 수성 혼합물의 일부를 등온 핵산 증폭 공정에 적용시키는 단계를 포함하는, 방법. - 삭제
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