CN111440709A - 一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒及其应用 - Google Patents
一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111440709A CN111440709A CN202010269645.0A CN202010269645A CN111440709A CN 111440709 A CN111440709 A CN 111440709A CN 202010269645 A CN202010269645 A CN 202010269645A CN 111440709 A CN111440709 A CN 111440709A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tube
- nucleic acid
- amplification
- self
- infectious virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 54
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 37
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 37
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 title claims abstract description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 92
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 58
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims abstract description 56
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 44
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 8
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 claims description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 6
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 claims 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 21
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 abstract description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 5
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 abstract description 2
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 210000000887 face Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 2
- 101000666833 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 20.8 kDa protein in FGF-VUBI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000977027 Azospirillum brasilense Uncharacterized protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000962005 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 23.6 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000785191 Drosophila melanogaster Uncharacterized 50 kDa protein in type I retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 1
- 101000747704 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp1 Proteins 0.000 description 1
- 101000861206 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Uncharacterized protein EF_A0048 Proteins 0.000 description 1
- 101000769180 Escherichia coli Uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 1
- 101000976301 Leptospira interrogans Uncharacterized 35 kDa protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000658690 Neisseria meningitidis serogroup B Transposase for insertion sequence element IS1106 Proteins 0.000 description 1
- 101000748660 Pseudomonas savastanoi Uncharacterized 21 kDa protein in iaaL 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000584469 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P1 Proteins 0.000 description 1
- 241000190070 Sarracenia purpurea Species 0.000 description 1
- 101000818096 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 15.5 kDa protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000766081 Streptomyces ambofaciens Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in unstable DNA locus Proteins 0.000 description 1
- 101000804403 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HIT-like protein Synpcc7942_1390 Proteins 0.000 description 1
- 101000750910 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator Synpcc7942_2319 Proteins 0.000 description 1
- 101000644897 Synechococcus sp. (strain ATCC 27264 / PCC 7002 / PR-6) Uncharacterized protein SYNPCC7002_B0001 Proteins 0.000 description 1
- 101000916336 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 82 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001000760 Zea mays Putative Pol polyprotein from transposon element Bs1 Proteins 0.000 description 1
- 101000678262 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 65 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- -1 salt cation Chemical class 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒，包括采样管和裂解‑扩增管，所述采样管一端开口，另一端采用筛膜封闭，所述采样管内设有吸附过滤载体，所述裂解‑扩增管内预装有裂解介质、核酸扩增介质和核酸荧光染料的缓冲溶液；本发明还公开了试剂盒的应用，应用于呼吸道传染病毒的检测，实现受检人可自行完成的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测；通过直接采集鼻腔气溶胶即可一步完成气溶胶样品中核酸提取富集、核酸纯化扩增、核酸可视化检测，操作程序极大简化，最快15min可得到两种以上的可视化检测结果；特别适合如海关、疫区关口设卡点等场所中安全的病毒核酸快速现场筛查。
Description
技术领域
本发明涉及生物核酸检测技术领域，更具体地，涉及一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒及其应用。
背景技术
对于呼吸道传染病毒，拭子采样法是目前常用的病毒采集策略；传统的拭子采样检测法因其样本有效性差、技术要求高、处理流程长等缺陷，以及批量集中处理的拭子检测程序造成较小空间内病毒二次扩散风险，无法应用于呼吸道传染病毒的现场快速筛查。疫情高发区，防疫关口筛查等重要场合对呼吸道传染病毒的现场快速筛查提出了极高要求：
（1）操作门槛需要大幅降低。传统的呼吸道气溶胶病毒核酸检测操作，涉及三大主要程序：拭子采样、样品处理（包括细胞裂解消化、核酸提取富集、聚合酶链式反应（PCR）核酸扩增等）、仪器检测，除拭子采样外其余程序均需要专业人员在专业条件下实施，同时也需要确保实施环境的通风、灭菌、清洁条件，不利于在人口流动密集的防疫关口场合实施，如机场、关卡、海关等。
（2）筛查程序需要安全保障。在人口流动密集的防疫关口，无法大规模地为筛查程序提供全面通风、灭菌消毒的清洁条件以避免采集的病毒在环境中的自然扩散。
（3）需要精简高效的核酸扩增技术。医疗体系中常用的传染病毒核酸扩增技术为荧光定量PCR技术，PCR技术通过控温程序，在至少三个温度段中分别完成核酸解链、互补链延伸、核酸扩增的工序。对于RNA病毒，第一轮RT-PCR所需时间将近60 min，若进行多重巢式RT-PCR扩增则需要耗费的时间尺度更大。
发明内容
本发明的主要目的在于克服上述不足之处，提供一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒及其应用，实现受检人可自行完成的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测，通过直接采集鼻腔气溶胶即可一步完成气溶胶样品中核酸提取富集、核酸纯化扩增、核酸可视化检测，操作程序极大简化，最快15 min 可得到两种以上的可视化检测结果。
本发明是通过以下技术方案进行实现的：
一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒，包括采样管和裂解-扩增管，所述采样管一端开口，另一端采用筛膜封闭，所述采样管内设有吸附过滤载体，所述裂解-扩增管内预装有裂解介质、核酸扩增介质和核酸荧光染料的缓冲溶液。
作为本发明的技术方案的进一步描述，所述采样管内壁附有变色硅胶，变色硅胶具备遇水显色功能，用于验证生物样本是否成功采集。
作为本发明的技术方案的进一步描述，所述筛膜采用具有孔、可透水的滤膜，包括但不限于采用Whatman No.1或扎孔的透明胶带。
作为本发明的技术方案的进一步描述，所述吸附过滤载体包括脱脂棉或电纺丝棉。
作为本发明的技术方案的进一步描述，所述裂解介质包括TritonX-100，所述核酸扩增介质包括DNA聚合酶、游离碱基和引物；特别地，对于RNA病毒的扩增，所述核酸扩增介质还包括逆转录酶，以启动RNA逆转录；所述核酸荧光染料包括SYSB Green 1。
作为本发明的技术方案的进一步描述，所述缓冲溶液为含有质量分数为0.1 %的Tween-20的10 mM Tris-HCl 缓冲溶液，其中Tris-HCl 缓冲溶液的pH值为8.0。
本发明还公开了所述的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒的应用，应用于呼吸道传染病毒的检测，包括如下步骤：
S1、取生物样本置于采样管中；
S2、将采样管的设有筛膜的一端伸入、浸没在裂解-扩增管的溶液中；筛膜用于支撑吸附过滤载体使其不扩散到裂解-扩增管的溶液中，同时裂解-扩增管的溶液通过膜孔进入采样管浸泡，使吸附过滤载体吸附的细胞或病毒等游离出来；
S3、将裂解-扩增管保温、静置，完成核酸扩增反应；
S4、进行核酸检测结果的可视化观察。
作为本发明的技术方案的进一步描述，所述步骤S1中，所述生物样本包括呼吸道气溶胶、血液或环境气溶胶。
作为本发明的技术方案的进一步描述，所述步骤S3中，所述静置时间为15-20min；所述核酸扩增反应包括环介导等温扩增反应或重组酶聚合酶扩增反应。
作为本发明的技术方案的进一步描述，所述步骤S3中，所述核酸扩增反应为环介导等温扩增反应时，裂解-扩增管保温60-65 ℃；所述核酸扩增反应为重组酶聚合酶扩增反应时，裂解-扩增管保温36-42 ℃；其中，保温方式可采用预填充了密封恒温发热材料的套管，也可简单采用恒温热水杯或受检人体温供热。
作为本发明的技术方案的进一步描述，所述步骤S4中，所述可视化观察包括向裂解-扩增管加入乙醇充分振荡后观察沉淀状态和/或在激发光照射条件下观察荧光发光状态。
以采用呼吸道气溶胶作为生物样本为例，应用于呼吸道传染病毒的检测，本发明提供的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒的原理为：
（1）受检人通过采样管内吸附过滤载体以擤鼻涕的方式呼气，鼻腔气溶胶随气溶胶中的微量水分一同在吸附过滤载体上富集，采样管内壁上预先附着遇水显色材料变色硅胶；若气溶胶样本成功在吸附过滤载体富集，采样管内壁将呈现明显显色，因变色硅胶无水时显蓝色，根据吸水度的不同转化为透明粉色（湿度35 %）、粉紫色（湿度50 %），显色根据受检人呼气量存在差异；显色状态可用于筛查防伪，也可用于质控。
（2）完成气溶胶富集后，将采样管转移至配套的裂解-扩增管预装组分液中。此时，由于裂解-扩增管组分液环境是包含了细胞裂解介质、核酸扩增组分的低浓度盐阳离子缓冲溶液，能够快速洗脱吸附过滤载体吸附的成分，使其重新游离在溶液中，同时同步地对吸附的细胞或病毒等成分进行快速裂解、消化其中多余的蛋白质和脂质，实现核酸的提取纯化，从而达到核酸释放的目的。
（3）将裂解-扩增管移入恒温保温杯后，恒温条件下触发裂解-扩增管内的核酸扩增反应，根据选用的扩增技术不同可以定制相应的引物序列和恒温条件，如适用环介导等温扩增技术(LAMP)时采用水温60-65 ℃恒温保温杯，适用重组酶聚合酶扩增技术(RPA)时采用水温36-42 ℃的恒温保温杯。
（4）完成核酸扩增反应后，向裂解-扩增管中加入乙醇等破坏剂可方便地将核酸分子沉降，通过观察沉淀产物即可快速进行可视化定性；若向裂解-扩增管中加入如SYSBGreen 1等与核酸分子结合后导致信号放大的信号探针，即可用于后续的荧光发光观察或精准定量分析。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明提供的一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒及其应用，操作门槛足够低、可满足受检人自行检测的病毒核酸快速筛查，操作简单、便携式使用；从采样、核酸富集、细胞裂解、核酸提取、核酸扩增到检测，均在封闭容器中独立完成，实现采样-检测一体化，无需额外操作，避免采集的病毒发生二次扩散的风险，安全可靠；设置遇水显色材料变色硅胶，作为防伪部件，确保采样结果真实有效；操作时间短，15-20 min可使核酸扩增达到送检水平，即最快15 min可一步封闭式完成采样-检测全过程，特别适合如海关、疫区关口设卡点等场所中安全的病毒核酸快速现场筛查；受检人可自行完成，有利于分散医疗资源压力；
2、本发明提供的一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒及其应用，采用环介导等温扩增技术（LAMP）或重组酶聚合酶扩增技术(RPA)，取代传统的荧光定量PCR技术，实现核酸扩增程序的精简高效；
3、本发明提供的一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒及其应用，通过选用不同的后续处理手段如荧光、化学发光、电化学发光的各类探针等，适用于可视化快速定性或精准定量分析；可同时提供两种以上检测结果，包括可视化激发光照射下荧光发光结果、可视化沉淀状态等，可有效规避快速检测中的假阴性、假阳性风险。
附图说明
图1为本发明实施例中的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒的主要组成示意图；
图2为本发明实施例中的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒通过LED激光光源激发实现荧光检测的使用流程示意图；
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征更易被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚的界定。
实施例1
结合附图1-2，本实施例提供了一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒，包括采样管（A管）和裂解-扩增管（B管），所述采样管（A管）一端开口，另一端采用Whatman No.1滤膜封闭，所述采样管（A管）内设有脱脂棉，其中呼吸道传染病毒为2019新型冠状病毒（SARS-nCoV-2），以鼻腔呼吸道气溶胶为样本源，快速富集扩增SARS-nCoV-2 ORF1ab、N蛋白片段并采用LAMP扩增后进行可视化定性分析。
使用前，向受检人发放采样管（A管）、裂解-扩增管（B管）、水温为63 ℃的恒温保温杯。
本实施例提供了连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒的应用，应用于呼吸道传染病毒的检测，包括如下步骤：
S1、取生物样本置于采样管中，进行鼻腔气溶胶病毒的快速提取富集：受检人将采样管（A管）的呼气端口探入鼻腔，仅通过受测鼻腔向管内呼气15秒，即完成采样操作。
S2、将采样管的设有Whatman No.1滤膜的一端伸入、浸没在裂解-扩增管的溶液中，进行病毒快速裂解与核酸快速扩增：将完成采样的采样管（A管），以Whatman No.1封闭端口朝下的方式伸入裂解-扩增管（B管）中预装溶液中，使采样管（A管）三分之二长度浸没在溶液中，拧紧裂解-扩增管（B管）管盖进行封闭，轻柔摇晃，使脱脂棉吸附的细胞或病毒等成分快速分散在裂解-扩增管（B管）的缓冲溶液中；
S3、将裂解-扩增管保温、静置，完成核酸扩增反应：将裂解-扩增管（B管）放入恒温保温杯中，静置15 min。裂解-扩增管（B管）预装有用于细胞裂解与核酸扩增的功能溶液，具体成分包括：含有适量SYSB Green 1、质量分数0.5 %的Triton X-100、质量分数0.1 %的Tween-20、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、过量游离碱基、针对每种靶标核酸片段设计的一套四种短链引物（FIP、F3、BIP、B3）的10 mM Tris-HCl 缓冲溶液，其中Tris-HCl 缓冲溶液的pH值为8.0。
其中，八种短链引物的序列如下所示：
FIPORF1ab：5'-CCCTGT-3'
F3ORF1ab：5'-GGG-3'
BIPORF1ab：3'-AGCGAU-5' or 3'-AGCGAT-5'
B3ORF1ab：3'-TGA-5'
FIPN：5'-GAAGAA-3'
F3N：5'-CCC-3'
BIPN：3'-AAGGAG-5'
B3N：3'-CTG-5'
S4、进行核酸检测结果的可视化观察：
方式一：向裂解-扩增管（B管）中快速加入适量乙醇后拧紧管盖封闭，充分振荡后观察沉淀状态；若裂解-扩增管（B管）底有沉淀，则检测结果为阳性。
方式二：在激发光照射条件下观察荧光发光状态；若裂解-扩增管（B管）内荧光信号明显增强，则检测结果为阳性。
实施例2
结合附图1-2，本实施例提供了一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒，包括采样管（A管）和裂解-扩增管（B管），所述采样管（A管）一端开口，另一端采用Whatman No.1滤膜封闭，所述采样管（A管）内设有电纺丝棉，其中呼吸道传染病毒为2019新型冠状病毒（SARS-nCoV-2），以鼻腔呼吸道气溶胶为样本源，快速富集扩增SARS-nCoV-2 ORF1ab、N蛋白片段并采用RPA扩增后进行可视化定性分析。
使用前，向受检人发放采样管（A管）、裂解-扩增管（B管）、水温为37 ℃的恒温保温杯。
本实施例提供了连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒的应用，应用于呼吸道传染病毒的检测，包括如下步骤：
S1、取生物样本置于采样管中，进行鼻腔气溶胶病毒的快速提取富集：受检人将采样管（A管）的呼气端口探入鼻腔，仅通过受测鼻腔向管内呼气15秒，即完成采样操作。
S2、将采样管的设有Whatman No.1滤膜的一端伸入、浸没在裂解-扩增管的溶液中，进行病毒快速裂解与核酸快速扩增：将完成采样的采样管（A管），以Whatman No.1封闭端口朝下的方式伸入裂解-扩增管（B管）中预装溶液中，使采样管（A管）三分之二长度浸没在溶液中，拧紧裂解-扩增管（B管）管盖进行封闭，轻柔摇晃，使电纺丝棉吸附的细胞或病毒等成分快速分散在裂解-扩增管（B管）的缓冲溶液中；
S3、将裂解-扩增管保温、静置，完成核酸扩增反应：将裂解-扩增管（B管）放入恒温保温杯中，静置20 min。裂解-扩增管（B管）预装有用于细胞裂解与核酸扩增的功能溶液，具体成分包括：含有适量SYSB Green 1、质量分数0.5 %的Triton X-100、质量分数0.1 %的Tween-20、重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶、逆转录酶、过量游离碱基、针对每种靶标核酸片段设计的一套两种短链引物的10 mM Tris-HCl 缓冲溶液，其中Tris-HCl 缓冲溶液的pH值为8.0。
其中，两种短链引物的序列如下所示：
靶标1（ORF1ab）：
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
靶标2（N）：
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
S4、进行核酸检测结果的可视化观察：
方式一：向裂解-扩增管（B管）中快速加入适量乙醇后拧紧管盖封闭，充分振荡后观察沉淀状态；若裂解-扩增管（B管）底有沉淀，则检测结果为阳性。
方式二：在激发光照射条件下观察荧光发光状态；若裂解-扩增管（B管）内荧光信号明显增强，则检测结果为阳性。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒，其特征在于，包括采样管和裂解-扩增管，所述采样管一端开口，另一端采用筛膜封闭，所述采样管内设有吸附过滤载体，所述裂解-扩增管内预装有裂解介质、核酸扩增介质和核酸荧光染料的缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒，其特征在于，所述采样管内壁附有变色硅胶。
3.根据权利要求1所述的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒，其特征在于，所述吸附过滤载体包括脱脂棉或电纺丝棉。
4.根据权利要求1所述的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒，其特征在于，所述裂解介质包括TritonX-100，所述核酸扩增介质包括DNA聚合酶、游离碱基和引物，所述核酸荧光染料包括SYSB Green 1。
5.根据权利要求1所述的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲溶液为含有质量分数为0.1 %的Tween-20的10 mM Tris-HCl 缓冲溶液，其中Tris-HCl 缓冲溶液的pH值为8.0。
6.一种权利要求1所述的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒的应用，其特征在于，应用于呼吸道传染病毒的检测，包括如下步骤：
S1、取生物样本置于采样管中；
S2、将采样管的设有筛膜的一端伸入、浸没在裂解-扩增管的溶液中；
S3、将裂解-扩增管保温、静置，完成核酸扩增反应；
S4、进行核酸检测结果的可视化观察。
7.根据权利要求6所述的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒的应用，其特征在于，所述步骤S1中，所述生物样本包括呼吸道气溶胶、血液或环境气溶胶。
8.根据权利要求6所述的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒的应用，其特征在于，所述步骤S3中，所述静置时间为15-20 min；所述核酸扩增反应包括环介导等温扩增反应或重组酶聚合酶扩增反应。
9.根据权利要求8所述的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒的应用，其特征在于，所述步骤S3中，所述核酸扩增反应为环介导等温扩增反应时，裂解-扩增管保温60-65℃；所述核酸扩增反应为重组酶聚合酶扩增反应时，裂解-扩增管保温36-42 ℃。
10.根据权利要求6所述的连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒的应用，其特征在于，所述步骤S4中，所述可视化观察包括向裂解-扩增管加入乙醇充分振荡后观察沉淀状态和/或在激发光照射条件下观察荧光发光状态。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010269645.0A CN111440709A (zh) | 2020-04-08 | 2020-04-08 | 一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010269645.0A CN111440709A (zh) | 2020-04-08 | 2020-04-08 | 一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111440709A true CN111440709A (zh) | 2020-07-24 |
Family
ID=71657468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010269645.0A Pending CN111440709A (zh) | 2020-04-08 | 2020-04-08 | 一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111440709A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114073829A (zh) * | 2020-08-13 | 2022-02-22 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 带有采样功能的口罩及其配套样本采集管 |
| CN114164084A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-03-11 | 中国医科大学附属盛京医院 | 一种采样检测一体化检测管结构 |
| CN115851429A (zh) * | 2023-03-03 | 2023-03-28 | 杭州优思达生物技术股份有限公司 | 一种多功能集成分子检测管及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090061450A1 (en) * | 2006-03-14 | 2009-03-05 | Micronics, Inc. | System and method for diagnosis of infectious diseases |
| CN102409079A (zh) * | 2010-08-26 | 2012-04-11 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 一种新型传染病核酸快速检测试剂盒及其检测方法 |
| US20180258419A1 (en) * | 2015-05-14 | 2018-09-13 | Longhom Vaccines and Diagnostics, LLC | Rapid Methods for the Extraction of Nucleic Acids from Biological Samples |
| US20190330675A1 (en) * | 2012-02-17 | 2019-10-31 | Research Triangle Institute | Fiber sampler for recovery of bioaerosols and particles |
-
2020
- 2020-04-08 CN CN202010269645.0A patent/CN111440709A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090061450A1 (en) * | 2006-03-14 | 2009-03-05 | Micronics, Inc. | System and method for diagnosis of infectious diseases |
| CN102409079A (zh) * | 2010-08-26 | 2012-04-11 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 一种新型传染病核酸快速检测试剂盒及其检测方法 |
| US20190330675A1 (en) * | 2012-02-17 | 2019-10-31 | Research Triangle Institute | Fiber sampler for recovery of bioaerosols and particles |
| US20180258419A1 (en) * | 2015-05-14 | 2018-09-13 | Longhom Vaccines and Diagnostics, LLC | Rapid Methods for the Extraction of Nucleic Acids from Biological Samples |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 国家药典委员会, 中国医药科技出版社 * |
| 张贵刚等: "牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立", 《中国预防兽医学报》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114073829A (zh) * | 2020-08-13 | 2022-02-22 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 带有采样功能的口罩及其配套样本采集管 |
| CN114164084A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-03-11 | 中国医科大学附属盛京医院 | 一种采样检测一体化检测管结构 |
| CN115851429A (zh) * | 2023-03-03 | 2023-03-28 | 杭州优思达生物技术股份有限公司 | 一种多功能集成分子检测管及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111440709A (zh) | 一种连续一体化呼吸道传染病毒自行检测试剂盒及其应用 | |
| CN105154314B (zh) | 一种集提取、扩增和检测一体化的基因检测装置 | |
| CN109628277B (zh) | 一种外泌体内肿瘤标志miRNA的分离和检测系统及方法 | |
| JP2009524063A (ja) | 迅速な試験用器具 | |
| CN205115443U (zh) | 一种集提取、扩增和检测一体化的基因检测装置 | |
| US20200347465A1 (en) | Detection of sars-cov-2 in a plurality of biological samples | |
| JP2002543826A (ja) | 生物学的流体の検査装置および検査方法 | |
| JP5069871B2 (ja) | 新規な癌細胞検出試料調製用キット及びそれを用いた癌細胞検出用キット | |
| Satoh et al. | Virus concentration using polyethyleneimine-conjugated magnetic beads for improving the sensitivity of nucleic acid amplification tests | |
| CN111944927A (zh) | 新冠病毒核酸10合1混采检测技术 | |
| US20100099195A1 (en) | Zinc-Based Screening Test and Kit for Early Diagnosis of Prostate Cancer | |
| CN105717310A (zh) | 一种检测白细胞中结核分枝杆菌的免疫荧光染色方法及试剂盒 | |
| CN114164084A (zh) | 一种采样检测一体化检测管结构 | |
| Xiao et al. | Integrating microneedle DNA extraction to hand-held microfluidic colorimetric LAMP chip system for meat adulteration detection | |
| JP2021047170A (ja) | 生物学的試料を調製および分析するためのマイクロ流体装置 | |
| CN101591714A (zh) | 一种赤点石斑鱼神经坏死病毒检测用引物组、检测方法和快速诊断试剂盒 | |
| CN211339511U (zh) | 用于lamp或rt-lamp的一体化试纸条 | |
| CN103757118B (zh) | 一种检测人心脏微血管损伤标志物miRNA21的引物及其应用 | |
| Annino et al. | Determination of 3-methoxy-4-hydroxymandelic acid (VMA) in urine by thin-layer chromatography | |
| CN112662731A (zh) | 一种冠状病毒样本保存液及其应用 | |
| US20200216870A1 (en) | Non-purified nucleic acid amplification method and device | |
| CN107121421A (zh) | 用于现场检测水样中重金属离子的便携式目测荧光仪及方法 | |
| CN105759038A (zh) | 一种检测生物样品中结核分枝杆菌的免疫检测方法及试剂盒 | |
| JP2022033527A (ja) | Ｒｎａろ過器及びｒｎａろ過方法 | |
| CN108950064B (zh) | 检测眼部微量生物样本中ebv感染的试剂盒和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20220629 Address after: Unit 702, 7th floor, no.6, helix 3 Road, Guangzhou International Biological Island, Guangzhou, Guangdong 510000 Applicant after: GUANGZHO WEIDI MEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 510275 No. 135 West Xingang Road, Guangdong, Guangzhou Applicant before: SUN YAT-SEN University |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200724 |