CN115537472A - 一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒及方法和用途 - Google Patents

一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒及方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供的一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒，本发明通过利用RAA技术结合CRISPR/Cas12a检测体系联合，基于RAA的靶向DNA特异性放大体系，以及CRISPR/Cas12a‑crRNA复合物结合RAA制备的靶标DNA，激活Cas12a蛋白的无差别的反式DNA切割活性，对ssDNA报告分子的反式切割，ssDNA报告分子被切开后产生荧光信号，进而实现对人博卡病毒1型核酸的高灵敏度、高特异性的快速检测，具有耗时短、操作简单且不依赖大型实验设备等优势。

Description

一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒及方法和用途
技术领域
本发明涉及核酸体外检测技术领域，具体涉及一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒及方法和用途。
背景技术
人博卡病毒1型(Human bocavirus，HBoV)是一种二十面体对称的无包膜单链DNA病毒，体积小，直径约20-25nm，属于细小病毒科博卡病毒1型属，基因组全长约5.5kb。人博卡病毒1型1型与人类呼吸道感染密切相关，易感人群主要是婴幼儿，临床症状表现为感冒、发烧、咳嗽、喉咙痛，是儿童呼吸道感染重要的呼吸道病原之一。该病毒具有传染性强，潜伏期短等特点，易与其他呼吸道病毒形成混合感染，常见的共感染呼吸道病原体为鼻病毒、流感病毒、呼吸道合包病毒，且目前尚无高效的人博卡病毒1型疫苗用于预防。因此，及时发现并掌握人博卡病毒1型的流行现状及感染情况对控制该病毒传播及其治疗十分关键。
现阶段针对人博卡病毒1型的检测方法主要有病毒分离培养法、免疫学方法和核酸检测法等。其中，病毒分离培养法存在操作复杂、耗时长、仪器设备及操作人员要求高等缺点，不适合早期、现场快速诊断；免疫学方法是使用较为常见的一种技术，但这种方法前提条件是需制备高质量的抗原或特异性抗体，加上婴幼儿、老人等免疫力低下人群不易产生足量的抗体，致使检测易出现假阴性结果；另外一种非常常见的检测方法是基于核酸的分子检测方法，其中qPCR技术比较常见，是当前病毒检测的金标准，但该方法需要昂贵的设备和专业的操作人员，而且一般需要两个小时以上的检测时长，很难满足经济欠发达地区开展大规模的现场核酸检测的要求，且灵敏度和特异性难以让人满意。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒及方法和用途，具有检测快速，高灵敏度和高特异性的优势。
一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒，包括独立包装的RAA体系和CRISPR/Cas12a检测体系；
所述RAA体系中包括基于人博卡病毒1型核酸设计的RAA引物对，所述RAA引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括的基于人博卡病毒1型核酸设计的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
可选的，所述RAA体系中还包括无核酸酶水、缓冲液和/或镁离子。
可选的，所述RAA体系中包括：
正向引物，浓度10μM，体积1μL；
反向引物，浓度10μM，体积1μL；
2×缓冲液，体积25μL；
镁离子，浓度280mM-300mM，体积2-3μL；
无核酸酶水，体积13.5μL-14.5μL。
可选的，制备所述crRNA的寡DNA单链序列组包括crRNA1寡DNA单链序列组或crRNA2寡DNA单链序列组；所述crRNA1寡DNA单链序列组包括crRNA1-F和crRNA1-R，crRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，crRNA1-R核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述crRNA2DNA单链序列组包括crRNA2-F和crRNA2-R，所述crRNA2-F核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述crRNA2-R核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
可选的，所述CRISPR/Cas12a检测体系中还包括Cas12a蛋白、ssDNA报告分子、缓冲液和/或无核酸酶水；
可选的，ssDNA报告分子为5’-F-TTATTATT-Q-3’，所述F为荧光素，Q为荧光淬灭剂；
可选的，F为6-羧基荧光素，Q为荧光淬灭剂BHQ1；
可选的，所述缓冲液为NEB 2.1缓冲液。
可选的，所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括：
NEB 2.1缓冲液，5μL；
crRNA，50-200μM，2.5-10μL；
ssDNA报告分子，1-2μM，2μL；
Cas12a蛋白，1-2μM，1-2μL；
无核酸酶水，26-32μL；
可选的，所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括：
NEB 2.1缓冲液，5μL；
crRNA，100μM，5μL；
ssDNA报告分子，1μM，2μL；
Cas12a蛋白，1μM，1μL；
无核酸酶水，32μL。
所述的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒在制备检测人博卡病毒1型核酸的产品中的用途。
一种利用所述的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒非疾病诊断的检测人博卡病毒1型核酸的方法，包括如下步骤：
S1、将待测样品DNA加入RAA体系中进行RAA等温扩增，得到RAA扩增产物；
S2、将RAA扩增产物加入CRISPR/Cas12a检测体系中进行反应；
S3、实时检测S2中CRISPR/Cas12a检测体系荧光变化，绘制荧光曲线；所绘制荧光曲线中，将随时间延长荧光值呈曲线上升的检测结果判定为阳性；将随时间延长荧光值呈水平线的结果判定为阴性；或
将免疫胶体金试纸条插入到S2中反应后的CRISPR/Cas12a检测体系中，在5min内即出现控制线和检测线两条条带的检测结果判定为阳性；5min内仅在控制线处出现条带的结果判定为阴性。
可选的，所述S1步骤中，RAA等温扩增条件为：37-40℃反应20-30min；
可选的，RAA等温扩增条件为：37℃反应20min。
可选的，所述S2步骤中，所述反应条件为：37-40℃反应20-30min；
可选的，所述反应条件为：37℃反应30min。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒，本发明通过利用RAA技术结合CRISPR/Cas12a检测体系联合，基于RAA的靶向DNA特异性放大体系，以及CRISPR/Cas12a-crRNA复合物结合RAA制备的靶标DNA，激活Cas12a蛋白的无差别的反式DNA切割活性，对ssDNA报告分子的反式切割，ssDNA报告分子被切开后产生荧光信号，进而实现对人博卡病毒1型核酸的高灵敏度、高特异性的快速检测，具有耗时短、操作简单且不依赖大型实验设备等优势。人博卡病毒1型常用的检测方法为qPCR，其检测限达103copies/μL，本发明实验表明本发明试剂盒建立的检测方法灵敏度高于qPCR，检测限可达0.5000copies/μL。
2.本发明提供的一种利用人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒非疾病诊断的检测人博卡病毒1型核酸的方法，在恒温条件下，全程1h内就能完成样品核酸提取以及检测。对设备要求不高，只需简单的恒温设备即可使反应进行，有利于在经济欠发达地区开展核酸检测。
3.本发明提供的一种利用人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒非疾病诊断的检测人博卡病毒1型核酸的方法，可通过荧光观测结果。当使用荧光检测时，CRISPR/Cas12a检测体系中DNA(ssDNA)报告系统为ssDNA报告分子，当反应结束，即可通过荧光值观测结果。适用于临床和基层医疗人员开展快速及时的病毒检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例1中人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒的灵敏度分析结果；
图2是本发明实验例1中人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒的特异性分析结果；图中：HBoV1：人博卡病毒I型，HmPV：人偏肺病毒，NOV：诺如病毒，ADV：腺病毒，C.albicans:白色念珠菌，E.coli：大肠杆菌，NC：阴性对照样品；
图3是本发明实验例1中实施例6、对比例1和对比例2的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒的灵敏度分析结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明中RAA体系中的无核酸酶水(RNase free water)、缓冲液(RehydrationBuffer)和醋酸镁(MgAc)来自齐天基因公司试剂盒(QiTian，产品编号：B00001)；体外转录试剂盒In vitro Transcription T7 Kit,购自TaKaRa公司；RAA引物对和ssDNA报告分子合成分别由上海生工和通用生物系统(安徽)有限公司完成；硕世生物科技公司的核酸快速提取试剂盒(磁珠法)提取制备临床人博卡病毒1型的样本核酸；等温扩增仪为Axxin ISO-T8。
pBluescript II SK+载体，由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；载体菌TOP10，由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。
实施例1人博卡病毒1型标准DNA的制备及RAA引物对和crRNA
本发明发现选自人博卡病毒1型保守基因NP-1中的一段基因片段(其cDNA序列如SEQ ID NO.8所示，所述基因片段命名为人博卡病毒1型标准DNA)，依据该人博卡病毒1型标准DNA特别设计的RAA引物对以及crRNA可以高灵敏度和高特异性的检测人博卡病毒1型。
人博卡病毒1型标准DNA的核苷酸序列：
5’-CTGGCAGACAACTCATCACAGGAGCAGGAGCCGCAGCCCGATCCGACACAGTGGGGAGAGAGGCTCGGGCTCATATCATCAGGAACACCCAATCAGCCACCTATCGTCTTGCACTGCTTCGAAGACCTCAGACCAAGTGATGAAGACGAGGGAGAGTACATCGGGGAAAAAAGACAATAGAACAAATCCATACACTGTATTCAGTCAACACAGAGCTTCCAATCCTGAAGCTCCAGGGTGGTGTGGGTTCTACTGGCACTCTACTCGCATTGCTAGAGATGGTACTAATTCAATCTTTAATGAAATGAAACAACAGTTTCAACAGCTACAAATTGATAATG-3’(SEQ ID NO.8)。
设计的用于扩增人博卡病毒1型标准DNA的RAA引物对，包括正向引物(RAA-F)和反向引物(RAA-R)，如下：
RAA-F：5’-CTGGCAGACAACTCATCACAGGAGCAGGAG-3’(SEQ ID NO.1)；
RAA-R：5’-CATTATCAATTTGTAGCTGTTGAAACTGTT-3’(SEQ ID NO.2)。
寻找包含CRISPR/Cas 12a识别序列TTTN(N表示碱基A、T、C或G)的靶向序列，基于靶向人博卡病毒1型标准DNA设计的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，如下：
5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAACUGUUGUUUCAUUUCAU-3’(SEQ ID NO.3)。
实施例2crRNA的制备
crRNA序列采用体外转录的方式制备，用于制备crRNA的寡DNA单链序列组，寡DNA单链序列组包括crRNA1寡DNA单链序列组或crRNA2寡DNA单链序列组；所述crRNA1寡DNA单链序列组包括crRNA1-F和crRNA1-R，所述crRNA2 DNA单链序列组包括crRNA2-F和crRNA2-R。上述寡DNA单链序列组包括：T7启动子序列(1-26nt)，该序列在crRNA的体外转录过程用于T7 RNA聚合酶的识别与结合；Cas蛋白结合的锚定支架序列(27-46nt)，该序列会产生稳定的发卡结构，有助于形成Cas12a/crRNA/靶序列复合物；以及和靶向序列互补的向导序列(28-66nt)，该片段通过与靶向序列的特异性识别和互补配对，从而促进Cas12a/crRNA/靶序列三体复合物的形成，进一步激活Cas12a的反式ssDNA剪切活性，实现针对人博卡病毒的精准检测。
人工合成的寡DNA单链序列组，如crRNA1-F和crRNA1-R所示：
crRNA1-F:
5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATCCCGATGTACTCTCCCTCGT-3’(SEQ ID NO.4)；
crRNA1-R:
5’-ACGAGGGAGAGTACATCGGGATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3’(SEQ ID NO.5)。
人工合成的寡DNA单链序列组，如crRNA2-F和crRNA2-R所示
crRNA2-F:
5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATAAACTGTTGTTTCATTTCAT-3’(SEQ ID NO.6)；
crRNA2-R:
5’-ATGAAATGAAACAACAGTTTATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3’(SEQ ID NO.7)。
以上设计的寡DNA单链序列组，由金唯智公司直接化学合成，经退火后再通过IVT试剂盒(厂家NEB,Ipswich,UK、货号E2060S)得到成熟crRNA(SEQ ID NO.3所示)。
实施例3一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒
本实施例提供了一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒，包括独立包装的RAA体系和CRISPR/Cas12a检测体系；
RAA体系包括：
正向引物(如SEQ ID NO.1所示)，浓度10μM，体积1μL；
反向引物(如SEQ ID NO.2所示)，浓度10μM，体积1μL；
2×缓冲液，体积25μL；
镁离子(醋酸镁)，浓度290mM，体积2.5μL；
无核酸酶水，体积14μL。
CRISPR/Cas12a检测体系：
NEB 2.1缓冲液，5μL；
crRNA(如SEQ ID NO.3所示)，100μM，5μL；
ssDNA报告分子，1μM，2μL；
Cas12a蛋白，1μM，1μL；
无核酸酶水，32μL。
ssDNA报告分子为5’-F-TTATTATT-Q-3’，所述F为荧光素，Q为荧光淬灭剂，F为6-羧基荧光素，Q为荧光淬灭剂BHQ1。
实施例4一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒
本实施例提供了一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒，包括独立包装的RAA体系和CRISPR/Cas12a检测体系；
RAA体系包括：
正向引物(如SEQ ID NO.1所示)，浓度10μM，体积1μL；
反向引物(如SEQ ID NO.2所示)，浓度10μM，体积1μL；
2×缓冲液，体积25μL；
镁离子(醋酸镁)，浓度280mM，体积3μL；
无核酸酶水，体积14.5μL。
CRISPR/Cas12a检测体系：
NEB 2.1缓冲液，5μL；
crRNA(如SEQ ID NO.3所示)，50μM，10μL；
ssDNA报告分子，2μM，2μL；
Cas12a蛋白，1μM，2μL；
无核酸酶水，32μL。
ssDNA报告分子为5’-F-TTATTATT-Q-3’，所述F为荧光素，Q为荧光淬灭剂，F为6-羧基荧光素，Q为荧光淬灭剂BHQ1。
实施例5一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒
本实施例提供了一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒，包括独立包装的RAA体系和CRISPR/Cas12a检测体系；
RAA体系包括：
正向引物(如SEQ ID NO.1所示)，浓度10μM，体积1μL；
反向引物(如SEQ ID NO.2所示)，浓度10μM，体积1μL；
2×缓冲液，体积25μL；
镁离子(醋酸镁)，浓度300mM，体积2μL；
无核酸酶水，体积13.5μL。
CRISPR/Cas12a检测体系：
NEB 2.1缓冲液，5μL；
crRNA(如SEQ ID NO.3所示)，200μM，2.5μL；
ssDNA报告分子，1μM，2μL；
Cas12a蛋白，2μM，1μL；
无核酸酶水，26μL。
ssDNA报告分子为5’-F-TTATTATT-Q-3’，所述F为荧光素，Q为荧光淬灭剂，F为6-羧基荧光素，Q为荧光淬灭剂BHQ1。
实施例6一种检测人博卡病毒1型核酸的方法
本实施例提供了利用实施例3中的试剂盒检测人博卡病毒1型核酸的方法，包括如下步骤：
(1)人博卡病毒1型基因组DNA的提取
取200μL临床组织液，根据江苏硕世生物公司提供的核酸快速提取试剂盒(磁珠法)(SDKF60101)以及全自动核酸提取仪(SSNP-3000A)提取待测样品DNA，具体的操作参见该试剂盒产品说明书。
(2)靶向核酸RAA扩增
将步骤(1)中的待测样品DNA(3-5微升)加入RAA体系中，置于37℃反应30min。
(3)CRISPR/Cas12a体系检测
将步骤(2)中获得的RAA扩增产物(5μL)加入到CRISPR/Cas12a检测体系中，混合均匀后置于37℃反应30min，使用等温扩增仪ISO-T8测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，每10s检测一次，持续检测30min，将检测15min的荧光数值为反应值。
实施例7一种检测人博卡病毒1型核酸的方法
本实施例与实施例6的区别在于，利用实施例4中的试剂盒检测人博卡病毒1型核酸的方法；步骤(2)中，RAA等温扩增条件为：40℃反应30min；步骤(3)中，混合均匀后置于40℃反应30min。
实施例8一种检测人博卡病毒1型核酸的方法
本实施例与实施例6的区别在于，利用实施例5中的试剂盒检测人博卡病毒1型核酸的方法；步骤(2)中，RAA等温扩增条件为：37℃反应20min；步骤(3)中，混合均匀后置于37℃反应20min，反应结束后，将免疫胶体金试纸条(Tiosbio cas12/13专用核酸检测试纸条，南京沃博生物科技有限公司)插入到反应后的CRISPR/Cas12a检测体系中，在5min内即出现控制线和检测线两条条带的检测结果判定为阳性；5min内仅在控制线处出现条带的结果判定为阴性。
对比例1一种检测人博卡病毒1型核酸的方法
本对比例与实施例6的区别在于，RAA引物对的正向引物为5’-CTGGCAGACAACTCATCACAGGAGCAGGAG-3’(SEQ ID NO.1)和反向引物5’-CATTATCAATTTGTAGCTGTTGAAACTGTT-3’(SEQ ID NO.2)，crRNA的核苷酸序列为5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCCGAUGUACUCUCCCUCGU-3’(SEQ ID NO.9)，针对的人博卡病毒1型的靶点序列为ACGAGGGAGAGTACATCGGG。
对比例2一种检测人博卡病毒1型核酸的方法
本对比例与实施例6的区别在于，RAA引物对的正向引物为5’-CTGGCAGACAACTCATCACAGGAGCAGGAG-3’(SEQ ID NO.1)和反向引物5’-CATTATCAATTTGTAGCTGTTGAAACTGTT-3’(SEQ ID NO.2)，crRNA的核苷酸序列为5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCAAUGCGAGUAGAGUGCCAG-3’(SEQ ID NO.10)，针对的人博卡病毒1型的靶点序列为CTGGCACTCTACTCGCATTG。
实验例1灵敏度和特异性检测
标准模板质粒DNA的制备
由上海生工公司合成人博卡病毒1型标准DNA(SEQ ID NO.8)并构建到pBluescript II SK+载体的EcoRⅠ位点，命名为pBlu-HBoV-N，继而转化入载体菌TOP 10内；
在添加了200μg/mL(终浓度)氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养8h后，按照质粒小提试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit，购自TIANGEN公司，目录号DP103)说明书进行质粒提取。
通过超微量分光光度计(B-500Biophotometer，上海元析仪器有限公司)测得提取的质粒浓度。
1、灵敏度检测
1)
将人博卡病毒1型的标准模板质粒DNA，进行10倍梯度稀释，制备浓度从1.05×103copies/μl到5.0×10-1copies/μl的系列浓度的标准模板质粒DNA，将其作为模板DNA(待测样品)。阴性对照：模板DNA用灭菌双蒸水替代。然后按照实施例6实施，结果如图1所示，当模板浓度为5.00×10-1copies/μl时，荧光曲线仍有上升，则该方法检测人博卡病毒1型的灵敏度可达5.00×10-1copies/μl。
2)
将人博卡病毒1型的标准模板质粒DNA(浓度为1×102copies/μl)，将其作为模板DNA(待测样品)。空白：模板DNA用灭菌双蒸水替代。然后分别按照实施例6、对比例1、对比例2实施，结果如图3所示：
实施例6的crRNA检测的灵敏度高，能够有效的激活Cas12a蛋白剪切活性。
对比例1的结果显示，对比例1中的crRNA检测的灵敏度较低，不能够有效地激活Cas12a蛋白剪切活性。
对比例2的结果显示，对比例2中的crRNA序列检测的灵敏度较低，不能够与Cas12a蛋白以及靶标特异性结合，从而不能够激活Cas12a蛋白剪切活性。
2、特异性检测
将人博卡病毒1型的基因组DNA、人偏肺病毒、诺如病毒、腺病毒的cDNA、大肠杆菌、白色念珠菌的基因组DNA作为模板DNA(浓度为1.00×105copies/μl)。然后按照实施例6实施，结果如图2所示，人博卡病毒1型的检测体系与其他病原体并无交叉反应，特异性较好。
实验例2对人博卡病毒1型临床样品的核酸检测
为了进一步评价本发明建立的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒及检测方法的效果，对30份疑似HBoV临床样品，利用江苏硕世生物公司提供的核酸快速提取试剂盒(磁珠法)(SDKF60101)以及全自动核酸提取仪(SSNP-3000A)提取待测样品DNA，分别按照实施例6和人博卡病毒1型qPCR试剂盒(厂家Applied Biosystems，货号F455S)对样品进行核酸快速检测。
选取30份临床样品进行分析，其中22份为博卡病毒1型阳性样品，有8份为博卡病毒1型阴性样品；结果临床样品的检测结果如表1所示，20份阳性检测结果与荧光定量PCR检测一致，8份阴性样品检测结果与荧光定量PCR检测一致，而本发明建立的检测方法的检测结果与qPCR检测结果一致率分别达90.9％和100％(表1)。
表1基于RPA-Cas12a和qPCR方法的临床样本检测结果比对
Figure BDA0003724839000000151
Figure BDA0003724839000000161
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 华中科技大学协和深圳医院
<120> 一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒及方法和用途
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctggcagaca actcatcaca ggagcaggag 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cattatcaat ttgtagctgt tgaaactgtt 30
<210> 3
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga uaaacuguug uuucauuuca u 41
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaattaata cgactcacta tagggtaatt tctactaagt gtagatcccg atgtactctc 60
cctcgt 66
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgagggaga gtacatcggg atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60
aatttc 66
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaattaata cgactcacta tagggtaatt tctactaagt gtagataaac tgttgtttca 60
tttcat 66
<210> 7
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaaatgaa acaacagttt atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60
aatttc 66
<210> 8
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctggcagaca actcatcaca ggagcaggag ccgcagcccg atccgacaca gtggggagag 60
aggctcgggc tcatatcatc aggaacaccc aatcagccac ctatcgtctt gcactgcttc 120
gaagacctca gaccaagtga tgaagacgag ggagagtaca tcggggaaaa aagacaatag 180
aacaaatcca tacactgtat tcagtcaaca cagagcttcc aatcctgaag ctccagggtg 240
gtgtgggttc tactggcact ctactcgcat tgctagagat ggtactaatt caatctttaa 300
tgaaatgaaa caacagtttc aacagctaca aattgataat g 341
<210> 9
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
uaauuucuac uaaguguaga ucccgaugua cucucccucg u 41
<210> 10
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
uaauuucuac uaaguguaga ucaaugcgag uagagugcca g 41

Claims (9)

1.一种人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒，其特征在于，包括独立包装的RAA体系和CRISPR/Cas12a检测体系；
所述RAA体系中包括基于人博卡病毒1型核酸设计的RAA引物对，所述RAA引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括的基于人博卡病毒1型核酸设计的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述RAA体系中还包括无核酸酶水、缓冲液和/或镁离子。
3.根据权利要求2所述的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述RAA体系中包括：
正向引物，浓度10μM，体积1μL；
反向引物，浓度10μM，体积1μL；
2×缓冲液，体积25μL；
镁离子，浓度280mM-300mM，体积2-3μL；
无核酸酶水，体积13.5μL-14.5μL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒，其特征在于，制备所述crRNA的寡DNA单链序列组包括crRNA1寡DNA单链序列组或crRNA2寡DNA单链序列组；所述crRNA1寡DNA单链序列组包括crRNA1-F和crRNA1-R，crRNA1-F的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，crRNA1-R核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述crRNA2DNA单链序列组包括crRNA2-F和crRNA2-R，所述crRNA2-F核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述crRNA2-R核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
可选的，所述CRISPR/Cas12a检测体系中还包括Cas12a蛋白、ssDNA报告分子、缓冲液和/或无核酸酶水；
可选的，ssDNA报告分子为5’-F-TTATTATT-Q-3’，所述F为荧光素，Q为荧光淬灭剂；
可选的，F为6-羧基荧光素，Q为荧光淬灭剂BHQ1；
可选的，所述缓冲液为NEB 2.1缓冲液。
5.根据权利要求4所述的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括：
NEB 2.1缓冲液，5μL；
crRNA，50-200μM，2.5-10μL；
ssDNA报告分子，1-2μM，2μL；
Cas12a蛋白，1-2μM，1-2μL；
无核酸酶水，26-32μL；
可选的，所述CRISPR/Cas12a检测体系中包括：
NEB 2.1缓冲液，5μL；
crRNA，100μM，5μL；
ssDNA报告分子，1μM，2μL；
Cas12a蛋白，1μM，1μL；
无核酸酶水，32μL。
6.权利要求1-5任一项所述的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒在制备检测人博卡病毒1型核酸的产品中的用途。
7.一种利用权利要求1-5任一项所述的人博卡病毒1型核酸快速检测试剂盒非疾病诊断的检测人博卡病毒1型核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将待测样品DNA加入RAA体系中进行RAA等温扩增，得到RAA扩增产物；
S2、将RAA扩增产物加入CRISPR/Cas12a检测体系中进行反应；
S3、实时检测S2中CRISPR/Cas12a检测体系荧光变化，绘制荧光曲线；所绘制荧光曲线中，将随时间延长荧光值呈曲线上升的检测结果判定为阳性；将随时间延长荧光值呈水平线的结果判定为阴性；或
将免疫胶体金试纸条插入到S2中反应后的CRISPR/Cas12a检测体系中，在5min内即出现控制线和检测线两条条带的检测结果判定为阳性；5min内仅在控制线处出现条带的结果判定为阴性。
8.根据权利要求7所述的检测人博卡病毒1型核酸的方法，其特征在于，所述S1步骤中，RAA等温扩增条件为：37-40℃反应20-30min；
可选的，RAA等温扩增条件为：37℃反应20min。
9.根据权利要求7或8所述的检测人博卡病毒1型核酸的方法，其特征在于，所述S2步骤中，所述反应条件为：37-40℃反应20-30min；
可选的，所述反应条件为：37℃反应30min。
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