CN112877477A

CN112877477A - 一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒的试剂盒及其方法

Info

Publication number: CN112877477A
Application number: CN202110377810.9A
Authority: CN
Inventors: 徐荣; 李永东
Original assignee: Ningbo Municipal Center For Disease Control & Prevention
Current assignee: Ningbo Municipal Center For Disease Control & Prevention
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2021-04-08
Publication date: 2021-06-01

Abstract

本发明公开了一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒的试剂盒及其方法，本发明通过多重序列比对人博卡病毒保守基因NP1蛋白的核苷酸序列，确定大小为270bp的DNA片段作为靶向分析序列，该序列位于NP1基因的第10‑279位点之间，基于此设计特异性RPA引物。进而优化建立适宜于快速准确进行人博卡病毒检测的重组酶聚合酶等温扩增方法。该方法检测限达252ag，高于传统PCR检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等优势，适用于人博卡病毒的临床快速检测。

Description

一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒的试剂盒及其方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒的试剂盒及其方法。

背景技术

人博卡病毒(Human bocavirus，HBoV)是一种细小病毒，已被证明是引起儿童呼吸道感染和肠胃炎的常见原因。HBoV通过空气传播，感染率高，病征与普通感冒相似，易致婴幼儿罹患肺炎、支气管炎和支气管肺炎等疾病，很难与普通感冒区分开，因此，及时发现并掌握人博卡病毒的流行现状及感染情况对于疾病治疗十分关键。

针对人博卡病毒的检测，目前已有很多种方法，如PCR扩增(微滴数字PCR、荧光定量PCR)，此类检测时间长，并且需要依赖控温准确的热循环仪器，以及昂贵的试剂，不利于对基层开展快速简便的分子诊断；ELISA免疫学方法，检测过程费时费力，且灵敏度较低。

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymeraseamplification，RPA)技术及重组酶介导的扩增(recombinase aided amplification，RAA)技术是近年来备受关注且迅速发展的等温扩增技术，主要依据T4噬菌体核酸复制机制，利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的作用，实现目的基因在恒温条件(25～42℃)下的快速扩增，20min内即可将核酸扩增至可检测水平，操作简单、快速，且可结合多种方法读取结果。利用RPA技术还可以同时检测多个靶标核酸序列，广泛应用于病原学检测领域。但目前，仍未有关于利用RPA技术检测人博卡病毒的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒的试剂盒及其方法，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等优势，适用于人博卡病毒的临床快速检测。

本发明是采用如下技术方案来实现：

一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒的RPA引物对，该引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒的试剂盒，包括如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示的引物对，以及RehydrationBuffer、模板、ddH₂O和MgAc。

一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒试剂盒的检测方法，包括以下操作：

1)提取待测样本的基因组作为DNA模板，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的RPA引物对进行重组聚合酶等温扩增；

所述重组聚合酶等温扩增的条件为：39℃，反应40min；

2)将重组聚合酶等温扩增的产物进行电泳，电泳结果中检测出132bp条带，则判断为人博卡病毒阳性；若未检测出132bp条带，则判断为人博卡病毒阴性。

重组聚合酶等温扩增的反应体系包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的RPA引物各2μL，Rehydration Buffer 25μL，模板5μL，ddH₂O 13.5μL，MgAc 2.5μL。

所述的电泳操作为：

将重组聚合酶等温扩增的产物中加入过量酚/氯仿混合液，混匀后离心；其中酚/氯的体积比为1：1；离心后取10μL上清作为扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳：140V，30min。

SEQ ID NO.3所示的序列作为遗传标记物在检测人博卡病毒试剂盒中的应用。

权利要求1所述的基于等温扩增快速检测人博卡病毒的RPA引物对在制备检测人博卡病毒的试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供了用于检测人博卡病毒的遗传标记物，并根据该遗传标记物设计了RPA引物对，具有非常好的特异性。利用本发明的RPA引物对，本发明进一步优化建立了适于快速准确进行人博卡病毒检测的等温扩增检测方法，最低检出模板量为252ag，灵敏度比传统PCR更高。该方法操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的快速诊断。

附图说明

图1：靶序列制备的PCR电泳结果；其中，M-250bp DNA Ladder；B-HBoV-NP1线化质粒。

图2：不同对引物对人博卡病毒PCR扩增电泳结果；其中，M-50bp DNALadder；1-引物P1；2-引物P2；3-引物P3；4-引物P4。

图3：人博卡病毒PCR检测方法特异性试验电泳结果(引物P3)；其中，M-50bp DNALadder；1-腺病毒Hexon基因；2-人博卡病毒NP1基因；3-人偏肺病毒N基因；4-合胞病毒N基因。

图4：人博卡病毒病毒重酶聚合酶等温扩增检测方法灵敏度试验电泳结果；其中，M-50bp DNA Ladder；1-25.2pg；2-252fg；3-2.52fg；4-252ag。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，其中，NormalRun^TM250bp-I DNA ladder购自上海捷瑞生物工程有限公司、50bp DNA Ladder购自TIANGEN公司、DEPC购自biosharp公司。其他未进行具体说明的均可通过商业渠道购买得到。

本发明实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规的条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。

对于人博卡病毒的检测，若采用传统分离鉴定、免疫学方法检测过程费时费力，且灵敏度较低；而采用常规PCR或荧光定量PCR检测，则需经过变性、退火、延伸，加上DNA提取整个过程大概需要2～4个小时才能出结果，并且需要精密昂贵的仪器和试剂，对基层开展快速简便的分子诊断不利。基于此，本发明提供一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒的试剂盒及其方法，以实现对人博卡病毒的快速、灵敏检测。

RPA扩增的关键在于引物的设计，但RPA不同于常规的PCR反应，目前尚无用于引物设计的软件或成熟的设计原则，也没有大量的数据为其引物设计提供依据。因此，本发明首先设计了4对引物，再通过优化筛选出一对最佳的引物。

另外，在进行RPA引物设计时，靶标区域的选择也非常关键，若靶标区域过短，则会导致特异性不足，无法区分开人博卡病毒与其他人呼吸道病毒；若靶标区域过长，则引物的设计较困难，而且，长片段的扩增容易出现差错。NP1是博卡病毒属的独有编码蛋白，本发明通过对NCBI中已报道的人博卡病毒的NP1基因序列进行比对，最终找到了人博卡病毒特异性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该靶序列是检测人博卡病毒的遗传性标记物。

实施例1：靶向序列的选择和制备

从NCBI查找已公开的人博卡病毒NP1基因序列，通过多重比对，以人博卡病毒NP1基因第10-279位点间核苷酸序列作为模板，模板核苷酸序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，并整合到质粒的pBluescriptⅡSK(+)的EcoRⅠ位点，随后将重组质粒转化入大肠杆菌TOP 10体内，接种到添加了100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中；

37℃培养8h后，按照质粒小提试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit，购自TIANGEN公司，目录号DP103)说明书进行质粒提取。通过超微量分光光度计测得提取的质粒浓度为1024ng/μL，进而对质粒酶切线化，酶切体系：DNA 10μL、10×Buffer ECoRⅠ5μL、ddH₂O 33μL、ECORⅠ2μL。于37℃，8h.用1.5％琼脂糖凝胶对酶切产物进电泳，上样量15μL，120V，40min,得到一条长3176bp的条带，按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANgel Midi PurificationKit，购自TIANGEN公司，目录号DP209)说明书进行切胶回收，分装作为模板，存于-20℃。通过超微量分光光度计测得回收的核酸浓度为504ng/μL。

实施例2：引物的设计与优化

本实施例针对人博卡病毒NP1基因的保守区设计了系列的RPA引物，4对引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体见表1。

表1：针对人博卡病毒NP1基因的保守区设计的RPA引物

然后利用PCR扩增反应对表1中的引物进行筛选。

取实施例1中冻存的线化质粒作为模板，进行PCR扩增，扩增体系与条件见表2。

表2：不同引物对人博卡病毒NP1基因PCR扩增条件

对扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，上样6μL，110V,40min.电泳结果如图2所示，引物P3扩增条带亮度明显高于其他P3对扩增效果。因此，将引物P3用于等温扩增，并检测特异性和灵敏度。

所设计的RPA引物对P3如下：

上游引物F：5’-GGAAGAGACACTGGCAGACAA-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物R：5’-TCGAAGCAGTGCAAGACGATA-3’(SEQ ID NO.2)。

上述RPA引物对的特异性好，所扩增的片段位于人博卡病毒的NP1基因第10-279位点之间，大小为270bp。

基于上述RPA引物对构建的RPA体系可以实现对人博卡病毒的快速、灵敏检测。

包括以下操作：

所述重组聚合酶等温扩增的条件为：39℃，反应40min；

所述的电泳操作为：

实施例3：特异性实验

采用实施例1中相同的靶序列制备方法，合成腺病毒Hexon基因、人偏肺病毒N基因、和合胞病毒N基因，分别做为模板，使用实施例2中优选的引物P3进行RPA扩增，具体操作参照RPA扩增试剂盒说明书(RAA Nucleic Acid Amplification Kit，购自江苏奇天基因生物科技有限公司，产品货号B00000)，于39℃反应30min，通过凝胶电泳检测。实验结果如图3所示，只有人博卡病毒为阳性，其他的均为阴性，说明本发明的RPA检测体系特异性良好。

实施例4：灵敏度实验

将实施例1中冻存的线化质粒用TE缓冲液进行10倍梯度稀释至10^-10，将10^-4、10^-6、10^-8、10^-10分别作为模板参照RPA扩增试剂盒，利用引物P3进行扩增，条件与实施例3一致。

结果表明：本发明RPA方法最低检出模板量为252ag；灵敏度高于常规PCR，而且，本发明的检测方法更为简单简单、快速，尤其适于现场检测，对实验条件的要求更宽松。

因此，基于上述特异性的、快速的检测结果，本发明提出以下应用：

所述的基于等温扩增快速检测人博卡病毒的RPA引物对P3在制备检测人博卡病毒的试剂盒中的应用。

序列表

<110> 一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒的试剂盒及其方法

<120> 宁波市疾病预防控制中心

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequences)

<400> 1

ggaagagaca ctggcagaca a 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequences)

<400> 2

tcgaagcagt gcaagacgat a 21

<210> 3

<211> 270

<212> DNA

<213> 人博卡病毒(Human bocavirus)

<400> 3

gggaatatga aagacaagca tcgctcctac aaaagaaaag ggagtccaga aagaggggag 60

aggaagagac actggcagac aactcatcac aggagcagga gccgcagccc gatccgacac 120

aatggggaga gaggctcggg ctcatatcat caggaacacc caatcagcca cctatcgtct 180

tgcactgctt cgaagacctc agaccaagtg atgaagacga gggagagtac atcggggaaa 240

aaagacaata gaacaaatcc atactctgta 270

Claims

1.一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒的RPA引物对，其特征在于，该引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

2.一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒的试剂盒，其特征在于，包括如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示的引物对，以及RehydrationBuffer、模板、ddH₂O和MgAc。

3.一种基于等温扩增快速检测人博卡病毒试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下操作：

所述重组聚合酶等温扩增的条件为：39℃，反应40min；

4.如权利要求3所述的基于等温扩增快速检测人博卡病毒试剂盒的检测方法，其特征在于，重组聚合酶等温扩增的反应体系包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的RPA引物各2μL，Rehydration Buffer 25μL，模板5μL，ddH₂O 13.5μL，MgAc 2.5μL。

5.如权利要求3所述的基于等温扩增快速检测人博卡病毒试剂盒的检测方法，其特征在于，所述的电泳操作为：

6.SEQ ID NO.3所示的序列作为遗传标记物在检测人博卡病毒试剂盒中的应用。

7.权利要求1所述的基于等温扩增快速检测人博卡病毒的RPA引物对在制备检测人博卡病毒的试剂盒中的应用。