CN111394520B

CN111394520B - 一种基于rt-lamp技术检测新冠病毒用引物组及检测试剂盒

Info

Publication number: CN111394520B
Application number: CN202010312576.7A
Authority: CN
Inventors: 张子龙; 田桢干; 张威; 水晶; 李深伟; 蒋原; 张晓航
Original assignee: Shanghai International Travel Health Care Center Shanghai Customs Port Outpatient Department
Current assignee: Shanghai International Travel Health Care Center Shanghai Customs Port Outpatient Department
Priority date: 2020-04-20
Filing date: 2020-04-20
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-04-20
Also published as: CN111394520A

Abstract

本发明提供了一种基于RT‑LAMP技术检测新冠病毒用引物组及检测试剂盒，属于病毒检测技术领域。所述引物组包括两组引物组，检测新冠病毒的Orf1ab基因的RT‑LAMP引物组包括2条外引物F3/B3、2条内引物FIP/BIP和2条环引物Loop‑F/Loop‑B，检测新冠病毒的N基因的RT‑LAMP引物组包括2条外引物F3/B3、2条内引物FIP/BIP和1条环引物Loop‑F。该检测试剂盒包括所述引物组。所述试剂盒基于RT‑LAMP技术检测新冠病毒，具有特异性强、准确性好和灵敏度高的特点，与荧光RT‑PCR检测方法相比，大大缩短检测时间，实现快速高效检测新冠病毒的目的。

Description

一种基于RT-LAMP技术检测新冠病毒用引物组及检测试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种基于RT-LAMP技术检测新冠病毒用引物组及检测试剂盒。

背景技术

新冠病毒，又称为新型冠状病毒，国际病毒分类委员会已将其命名为“SARS-CoV-2”。新型冠状病毒肺炎临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现，鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒征休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。

按照最新指南规定，利用荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性仍然是确诊的金标准。但需要较昂贵的仪器和专业的技术人员，检测时间长，试验成本也偏高。

环介导等温扩增(LAMP)检测技术的特点是针对靶基因的6个区域设计 4种特异引物，在DNA聚合酶(BstDNA polymerase)的作用下，恒温条件下进行核酸扩增，具有操作简单、特异性强特点。另外通过环引物的添加，大大加快了反应的速度。LAMP检测技术最大的优势在于不依赖于昂贵的专业检测设备，该方法简便易操作，实验流程简单快速，不具备专业技能的一般人员就能在疾病现场进行快速诊断。LAMP反应成功与否的关键步骤是LAMP反应的引物设计。然而由于新冠病毒缺乏特异性扩增引物，导致 LAMP检测技术难以在新冠病毒检测中应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于RT-LAMP技术检测新冠病毒用引物组及检测试剂盒，具有检测快速准确，检测灵敏度高的特点。

本发明提供了一种基于RT-LAMP技术检测新冠病毒用引物组，包括检测新冠病毒SARS-CoV-2的Orf1ab基因的RT-LAMP引物组和检测新冠病毒 SARS-CoV-2的N基因的RT-LAMP引物组；

所述检测新冠病毒SARS-CoV-2的Orf1ab基因的RT-LAMP引物组包括2条外引物Orf1ab-F3/Orf1ab-B3、2条内引物Orf1ab-FIP/Orf1ab-BIP和2条环引物Orf1ab-Loop-F/Orf1ab-Loop-B，其中Orf1ab-F3的核苷酸序列为SEQ ID No.1，Orf1ab-B3的核苷酸序列为SEQ ID No.2，Orf1ab-FIP的核苷酸序列为SEQ ID No.3，Orf1ab-BIP的核苷酸序列为SEQID No.4，Orf1ab-Loop-F 的核苷酸序列为SEQ ID No.5，Orf1ab-Loop-B的核苷酸序列为SEQ ID No.6；

所述检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因的RT-LAMP引物组包括2条外引物N-F3/N-B3、2条内引物N-FIP/N-BIP和1条环引物N-Loop-F；所述 N-F3的核苷酸序列为SEQ IDNo.7，N-B3的核苷酸序列为SEQ ID No.8， N-FIP的核苷酸序列为SEQ ID No.9，N-BIP的核苷酸序列为SEQ ID No.10， N-Loop-F的核苷酸序列为SEQ ID No.11。

本发明提供了一种基于RT-LAMP技术新冠病毒检测试剂盒，包括所述的引物组。

优选的，在检测新冠病毒SARS-CoV-2的Orf1ab基因的RT-LAMP引物组中，Orf1ab-F3、Orf1ab-B3、Orf1ab-FIP、Orf1ab-BIP、Orf1ab-Loop-F和 Orf1ab-Loop-B的摩尔比为1:1:8:8:2:2。

优选的，在检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因的RT-LAMP引物组中， N-F3、N-B3、N-FIP、N-BIP和N-Loop-F的摩尔比为1:1:8:8:2。

优选的，还包括LAMP 2×MasterMix和荧光染料试剂。

优选的，所述试剂盒的检测灵敏性为40～100拷贝/20μL。

本发明提供的基于RT-LAMP技术检测新冠病毒用引物组，包括检测新冠病毒SARS-CoV-2的Orf1ab基因的RT-LAMP引物组和检测新冠病毒 SARS-CoV-2的N基因的RT-LAMP引物组。本发明以Orf1ab基因和N基因作为检测新冠病毒的靶标片段来设计RT-LAMP检测引物，经过优化筛选，得到的两组引物组在检测新冠病毒时均具有特异性强的特点，同时采用两组靶标引物组检测大大提高了其准确性；另外，与现有行业检测金标准-荧光定量PCR检测方法相比，能够达到相似的检测灵敏度，检测灵敏度达到40 拷贝/20μL，而检测时间缩短至40min，比荧光定量PCR检测方法(耗时 90min)缩短了50min，实现快速高效准确检测。

附图说明

图1为含Target-Orf1ab片段重组质粒RT-LAMP灵敏度检测结果；

图2为含Target-SARS-CoV-2-Orf1ab片段重组质粒RT-LAMP的特异性检测结果；

图3为以Orf1ab片段为靶标的RT-LAMP检测的样本特异性检测结果；

图4为含Target-N片段重组质粒RT-LAMP灵敏度检测结果；

图5为以N片段为靶标RT-LAMP检测的样本特异性检测结果；

图6为含Target-Orf1ab片段重组质粒RT-PCR灵敏度检测结果；

图7为以Orf1ab片段为靶标的RT-PCR检测的样本特异性检测结果；

图8为含Target-N片段重组质粒RT-PCR灵敏度检测结果；

图9为对比例1中Orf1ab片段引物组2对不同浓度的模版扩增结果；

图10为对比例2中N片段引物组2对不同浓度的模版扩增结果。

具体实施方式

所述检测新冠病毒SARS-CoV-2的Orf1ab基因的RT-LAMP引物组包括 2条外引物Orf1ab-F3/Orf1ab-B3、2条内引物Orf1ab-FIP/Orf1ab-BIP和2条环引物Orf1ab-Loop-F/Orf1ab-Loop-B，其中Orf1ab-F3的核苷酸序列为SEQ ID No.1，Orf1ab-B3的核苷酸序列为SEQ ID No.2，Orf1ab-FIP的核苷酸序列为SEQ ID No.3，Orf1ab-BIP的核苷酸序列为SEQID No.4，Orf1ab-Loop-F 的核苷酸序列为SEQ ID No.5，Orf1ab-Loop-B的核苷酸序列为SEQ ID No.6；

在本发明中，所述检测新冠病毒用引物组以新冠病毒特异性Orf1ab基因和N基因为靶标序列来设计RT-LAMP引物。所述Orf1ab基因的核苷酸序列为SEQ ID No.12，所述N基因的核苷酸序列为SEQ ID No.13。本发明提供的引物组与以特异性Orf1ab基因和N基因为靶标设计的其他引物组相比，具有特异性强、灵敏高、准确性好的特点。本发明对所述引物的制备方法不做特殊限制，采用本领域所熟知的合成方法即可。

在本发明中，所述引物组中每条引物单独分装，在使用前进行稀释和混合。在检测新冠病毒SARS-CoV-2的Orf1ab基因的RT-LAMP引物组中， Orf1ab-F3、Orf1ab-B3、Orf1ab-FIP、Orf1ab-BIP、Orf1ab-Loop-F和 Orf1ab-Loop-B的摩尔比优选为1:1:8:8:2:2。在检测新冠病毒SARS-CoV-2的 N基因的RT-LAMP引物组中，N-F3、N-B3、N-FIP、N-BIP和N-Loop-F的摩尔比优选为1:1:8:8:2。按照以上各引物的摩尔比进行配制引物混合液，有利于提高检测结果的准确性。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括LAMP 2×Master Mix和荧光染料试剂。本发明对所述LAMP 2×Master Mix的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的LAMP 2×Master Mix的来源即可。在本发明实施例中，所述 LAMP 2×MasterMix的品牌为NEB，型号为WarmStart。本发明对所述荧光染料试剂的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的荧光染料试剂即可。在本发明实施例中，所述荧光染料购自NEB公司。

在本发明中，所述试剂盒的使用方法，优选包括以下步骤：

1)100μL LAMP Primer Mix配制，将100μmol/L的FIP引物16μL， 100μmol/L的BIP引物16μL，100μmol/L的F3引物2μL，100μmol/L的B3 引物2μL，100μmol/L的Loop-F引物4μL，100μmol/L的Loop-B引物4μL 混合(若无Loop-B引物，用ddH₂O补足)，加ddH₂O补足至100μL；

2)人工合成新冠病毒的Orf1ab片段和N片段，以含Orf1ab或N靶标片段的质粒(pUC57-Orf1ab或pUC57-N)作为模板，配制LAMP反应体系；每个LAMP反应体系总体积为20μL：WarmStart LAMP 2×MasterMix 10μL，LAMP Primer Mix 2μL，Fluorescent dye(50×)0.2μL，模板1μL，加ddH₂O 补足至20μL；

3)将配制得到的LAMP反应体系进行LAMP反应，反应程序为65℃ 反应40min，95℃灭活1min结束反应；

4)根据荧光曲线是否为“S”型曲线来判断是否含有新冠病毒，具有“S” 型曲线表明检测样本中含有新冠病毒。

在本发明中，新冠病毒Orf1ab基因的RT-LAMP引物组和N基因的 RT-LAMP引物组分别进行RT-LAMP反应。如果两个靶标一致，则按照一致结果判定；如果两个靶标一个阳性，一个阴性，则重复检测，如果检测结果仍为一个阴性，一个阳性，则按照阳性判定。

在本发明中，灵敏度实验结果表明，所述试剂盒的检测灵敏性为40～100 拷贝/20μl。

在本发明中，为了确定检测试剂盒的特异性，用本发明提供的试剂盒对 SARS-CoV-2、SARS-2003和bat-SL-CoVZC45同时进行RT-LAMP检测，结果表明含SARS-CoV-2的Orf1ab片段的重组质粒RT-LAMP检测荧光曲线呈 “S”型曲线，信号起跳位点<30；含SARS-2003和bat-SL-CoVZC45的Orf1ab 片段的重组质粒RT-LAMP检测无荧光曲线变化。这表明本发明提供的引物组或试剂盒具有特异性强的特点。

在本发明中，为了验证检测试剂盒的准确性，以能力验证样本为检测对象，结果表明：3份SARS-CoV-2阳性样本的RT-LAMP检测荧光曲线呈“S” 型曲线，信号起跳位点<25；3份SARS-CoV-2阴性样本的RT-LAMP检测无荧光曲线。RT-LAMP检测试剂盒检测4种其他动物冠状病毒，检测结果无荧光曲线变化。

在本发明中，以临床样本作为检测对象，分别用本发明提供的RT-LAMP 检测试剂盒和荧光RT-PCR检测方法(参见中国疾病预防控制中心的文件《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》)进行检测，结果表明50份临床样本的两种检测方法得到的检测结果完全一致。这表明本发明提供的检测试剂盒可以替换目前采用荧光定量PCR检测方法检测新冠病毒，同时缩短检测时间，有利于高效快速实现疑似人群的筛查。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于RT-LAMP技术检测新冠病毒用引物组及检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

通过GISAID中下载的SARS-CoV-2基因组，NCBI下载其他常见冠状病毒SARS-2003、bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21、SARS coronavirus ZS-B、SARS coronavirusZS-C、SARS coronavirus Sin3408L、SARS coronavirus Sin3765V、SARS coronavirusTaiwan TC3序列，BioEdit和SnapGene序列比较分析，得到特异性的Orf1ab片段和N片段序列，并以此设计RT-LAMP 引物组。

1.RT-LAMP引物组的设计及优化

1)利用在线设计软件Primer ExplorerV5，对特异性Orf1ab片段的6个区域设计RT-LAMP引物，包括2条外引物Orf1ab-F3/Orf1ab-B3，2条内引物Orf1ab-FIP/Orf1ab-BIP，在F2和F1C区域之间以及B2和B1C区域之间设计Orf1ab-Loop-F引物和Orf1ab-Loop-B引物，采用LAMP技术检测含 SARS-CoV-2的Orf1ab片段的重组质粒(pUC57-Orf1ab，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)，LAMP的反应体系为20μL，包括含target-Orf1ab 片段的重组质粒为模板1μL，WarmStart LAMP 2×MasterMix 10μL，LAMP Primer Mix 2μL，Fluorescent dye(50×)0.2μL，ddH₂O 6.8μL。LAMP反应程序为65℃反应40min，95℃灭活1min结束反应。其中，LAMP Primer Mix 的配制方法为100μmol/L的FIP引物16μL，100μmol/L的BIP引物16μL， 100μmol/L的F3引物2μL，100μmol/L的B3引物2μL，100μmol/L的Loop-F引物4μL，100μmol/L的Loop-B引物4μL，加ddH₂O补足至100μL。

Orf1ab基因引物序列如下：

引物组1：Orf1ab-F3：5’-AACTCAATATGAGTATGGTACTG-3’(SEQ ID No.1)；

Orf1ab-B3：5’-CTGAACAACTGGTGTAAGTTC-3’(SEQ ID No.2)；

Orf1ab-FIP：5’-TTGCTCTTCTTCAGGTTGAAGAGCTTACCAAGGTAAA CCTTTGGA-3’(SEQID No.3)；

Orf1ab-BIP：5’-TTGGTCAACAAGACGGCAGTCATCTCTAATTGAGG TTGAACC-3’(SEQ IDNo.4)；

Orf1ab-Loop-F：5’-AGCAGAAGTGGCACCAAAT-3’(SEQ ID No.5)；

Orf1ab-Loop-B：5’-AGGACAATCAGACAACTACTATTCA-3’(SEQ ID No.6)。

2)利用在线设计软件PrimerExplorerV5，对特异性的N片段的5个区域设计RT-LAMP引物，包括2条外引物N-F3/N-B3，2条内引物N-FIP/N-BIP，在F2和F1C区域之间设计N-Loop-F引物，采用LAMP技术检测含 SARS-CoV-2的N片段的重组质粒(pUC57-N，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)，LAMP反应体系为20μL，包括含target-N片段的重组质粒为模板1μL，WarmStart LAMP 2×Master Mix 10μL，LAMP Primer Mix 2μL， Fluorescentdye(50×)0.2μL，ddH₂O 6.8μL。LAMP反应程序为65℃反应 40min，95℃灭活1min结束反应。其中，LAMP Primer Mix的配制方法为 100μmol/L的FIP引物16μL，100μmol/L的BIP引物16μL，100μmol/L的 F3引物2μL，100μmol/L的B3引物2μL，100μmol/L的Loop-F引物4μL，加ddH₂O补足至100μL。

N基因引物组1：

N-F3：5’-CCAGAATGGAGAACGCAGTG-3’(SEQ ID No.7)；

N-B3：5’-CCGTCACCACCACGAATT-3’(SEQ ID No.8)；

N-FIP：5’-AGCGGTGAACCAAGACGCAGGGCGCGATCAAAACAACG-3’ (SEQ ID No.9)；

N-BIP：5’-AATTCCCTCGAGGACAAGGCGAGCTCTTCGGTAGTAGCC AA-3’(SEQ ID No.10)；

N-Loop-F：5’-TTATTGGGTAAACCTTGGGGC-3’(SEQ ID No.11)。

检测结果表明，上述两组引物组能够得到标准的“S”型扩增曲线，说明建立的LAMP扩增方法适用新冠病毒的检测。

实施例2

LAMP检测方法的最低检测限度

1)含Orf1ab靶标片段的重组质粒(pUC57-Orf1ab)用ddH₂O做梯度稀释，拷贝数依次为10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、 10²copies/μL、10copies/μL、1copies/μL。用实施例1建立的LAMP检测方法进行检测，确定检测方法对阳性核酸的最小检测量。由图1可知，随着反应体系中模板浓度的降低，LAMP检测方法的最低检测限度为100copies/20μL。

2)含N靶标片段的重组质粒(pUC57-N)用ddH₂O做梯度稀释，拷贝数依次为10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、 10²copies/μL、10copies/μL、1copies/μL。用建立的LAMP检测方法进行检测，确定检测方法对阳性核酸的最小检测量。由图4可知，随着反应体系中模板浓度的降低，LAMP检测方法的最低检测限度为40copies/20μL。

对照例1

1)利用在线设计软件Primer ExplorerV5，对特异性Orf1ab片段的设计 RT-LAMP引物，包括2条外引物Orf1ab-F3/Orf1ab-B3，2条内引物 Orf1ab-FIP/Orf1ab-BIP，采用LAMP技术检测含SARS-CoV-2的Orf1ab片段的重组质粒(pUC57-Orf1ab，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)， LAMP的反应体系为20μL，包括含target-Orf1ab片段的重组质粒为模板1μL， WarmStart LAMP 2×Master Mix 10μL，LAMP Primer Mix 2μL，Fluorescentdye(50×)0.2μL，ddH₂O 6.8μL。LAMP反应程序为65℃反应40min，95℃灭活1min结束反应。其中，LAMP PrimerMix的配制方法为100μmol/L的FIP 引物16μL，100μmol/L的BIP引物16μL，100μmol/L的F3引物2μL， 100μmol/L的B3引物2μL，加ddH₂O补足至100μL。

Orf1ab基因引物组2的核苷酸序列：(无环引物Loop-F/B)

Orf1ab-F3：5’-AACTCAATATGAGTATGGTACTG-3’(SEQ ID No.1)；

Orf1ab-B3：5’-CTGAACAACTGGTGTAAGTTC-3’(SEQ ID No.2)；

Orf1ab-BIP：5’-TTGGTCAACAAGACGGCAGTCATCTCTAATTGAGG TTGAACC-3’(SEQ IDNo.4)。

采用不同拷贝浓度的含SARS-CoV-2的Orf1ab片段的重组质粒为模版 (1×10⁶copies/μl、1×10⁵copies/μl、1×10⁴copies/μl、1×10³copies/μl、 10²copies/μL、10copies/μL、1copies/μL)采用上述体系进行LAMP扩增，结果见图9。

由图9可知，Orf1ab引物组2的扩增灵敏度为1000copies/20μl，比本发明保护的引物组1的检测灵敏度低一个数量级。

对照例2

利用在线设计软件PrimerExplorerV5，对特异性的N片段的5个区域设计RT-LAMP引物，包括2条外引物N-F3/N-B3，2条内引物N-FIP/N-BIP，采用LAMP技术检测含SARS-CoV-2的N片段的重组质粒(pUC57-N，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)，LAMP反应体系为20μL，包括含 target-N片段的重组质粒为模板1μL，WarmStart LAMP 2×MasterMix 10μL， LAMP Primer Mix 2μL，Fluorescent dye(50×)0.2μL，ddH₂O 6.8μL。LAMP 反应程序为65℃反应40min，95℃灭活1min结束反应。其中，LAMP Primer Mix的配制方法为100μmol/L的FIP引物16μL，100μmol/L的BIP引物16μL， 100μmol/L的F3引物2μL，100μmol/L的B3引物2μL，加ddH₂O补足至 100μL。

N基因-引物组2：(无环引物Loop-F)

N-F3：5’-CCAGAATGGAGAACGCAGTG-3’(SEQ ID No.7)；

N-B3：5’-CCGTCACCACCACGAATT-3’(SEQ ID No.8)；

N-FIP：5’-AGCGGTGAACCAAGACGCAGGGCGCGATCAAAACAACG-3’ (SEQ ID No.9)；

N-BIP：5’-AATTCCCTCGAGGACAAGGCGAGCTCTTCGGTAGTAGCC AA-3’(SEQ ID No.10)。

采用不同拷贝浓度的含SARS-CoV-2的N基因片段的重组质粒为模版 (1×10⁶copies/μl、1×10⁵copies/μl、1×10⁴copies/μl、10³copies/μL、10²copies/μL、10copies/μL、1copies/μL)，采用上述体系进行LAMP扩增结果见图10。

由图10可知，N基因引物组2的扩增灵敏度为10000copies/20μl，比本发明保护的引物组1的检测灵敏度低两个数量级。

实施例3

RT-LAMP检测方法的特异性检测

以含Target-SARS-CoV-2-Orf1ab片段的重组质粒、 Target-SARS-2003-Orf1ab片段的重组质粒(SARS-2003-Orf1ab基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.14)、Target-bat-SL-CoVZC45-Orf1ab片段的重组质粒(bat-SL-CoVZC45-Orf1ab基因片段核苷酸序列为SEQID No.15)为检测对象，并以ddH₂O作为阴性对照，运用实施例1的筛选得到的LAMP检测方法，确定特异性检测结果。其中上述3个重组质粒委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。

结果见图2。由图2可知，仅有含Target-SARS-CoV-2-Orf1ab片段质粒 RT-LAMP检测有“S”型荧光曲线，检测结果呈阳性，其余核酸LAMP检测无荧光曲线，检测结果均为阴性。

实施例4

小量样本验证RT-LAMP检测的准确性

提取上海市临检中心的能力验证样本和4种其他动物冠状病毒和1种流行病毒(包括犬冠状病毒CCV、猫传染性腹膜炎病毒FIPV、猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪流行性腹泻病毒PEDV和甲流阳性样本FluA)的RNA，运用实施例1中筛选的LAMP检测方法进行RT-LAMP检测方法检测。

图3为能力验证样本和4种其他动物冠状病毒的RT-LAMP检测结果。由图3看出，6份能力验证样本中，Orf1ab片段的RT-LAMP检测方法成功检测阳性样本2012、2014、2015，阴性样本2011、2013、2016检测呈阴性， 4种动物冠状病毒和1种流行病毒的核酸检测呈阴性。

提取上海市临检中心的能力验证样本核酸，运用本发明提供的试剂盒N 基因为靶标的RT-LAMP检测试剂盒检测。由图5看出，6份能力验证样本中，N片段的RT-LAMP检测方法成功检测阳性样本2012、2014、2015，阴性样本2011、2013、2016检测呈阴性。

实施例5

RT-LAMP检测与荧光RT-PCR检测方法比较结果

荧光RT-PCR检测方法如下：Orf1ab和N基因的扩增引物信息如下：

Orf1ab-F	CCCTGTGGGTTTTACACTTAA(SEQ ID No.16)
		Orf1ab-R	ACGATTGTGCATCAGCTGA(SEQ ID No.17)
Orf1ab-Probe	CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG(SEQ ID No.18)
		Ngene-F	GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT(SEQ ID No.19)
Ngene-R	CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG(SEQ ID No.20)
		Ngene-Probe	TTGCTGCTGCTTGACAGATT(SEQ ID No.21)

荧光RT-PCR扩增体系如下：

试剂	体积
		之江RNA扩增酶干粉球	/
ddH<sub>2</sub>O	16.0μL
		Primer-F(10μM)	1.6μL
Primer-R(10μM)	1.6μL
		Primer-Probe	0.8μL
模板	5.0μL

荧光RT-PCR扩增程序如下：45℃10min；95℃15min；95℃15s，50℃ 60s，40个循环。

结果分析：

荧光RT-PCR检测方法对含Target-Orf1ab片段质粒的最小检测量为 70copies/25μL(如图6)，含Target-N片段质粒的最小检测量为700copies/25μL (如图8)。

荧光RT-PCR检测方法对上海市临检中心能力验证样本检测，Orf1ab片段(如图7)和N片段(如图9)的RT-PCR检测阳性样本2012、2014、2015，阴性样本2011、2013、2016检测呈阴性。

根据上述结果可以看出，采用本发明提供的检测试剂盒的Orf1ab基因为靶标基因的检测灵敏度方面较为相似，而N片段为靶标基因的检测灵敏度方面较荧光RT-PCR方法有较大提高，提高了16倍。

实施例6

临床样本检测结果

选取了50份临床样本，运用本发明提供的RT-LAMP检测试剂盒和荧光 RT-PCR检测方法进行平行检测，具体方法参见实施例1和实施例5。

结果表明，针对Orf1ab片段的RT-LAMP检测试剂盒检测结果：阳性1 0份，阴性40份，与荧光RT-PCR检测结果一致；针对N片段的RT-LAMP 检测试剂盒检测结果：阳性10份，阴性40份，与荧光RT-PCR检测结果一致(见表1)。

表1基于RT-LAMP检测试剂盒的灵敏性与特异性

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海国际旅行卫生保健中心（上海海关口岸门诊部）

<120> 一种基于RT-LAMP技术检测新冠病毒用引物组及检测试剂盒

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aactcaatat gagtatggta ctg 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgaacaact ggtgtaagtt c 21

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgctcttct tcaggttgaa gagcttacca aggtaaacct ttgga 45

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttggtcaaca agacggcagt catctctaat tgaggttgaa cc 42

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcagaagtg gcaccaaat 19

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggacaatca gacaactact attca 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccagaatgga gaacgcagtg 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgtcaccac cacgaatt 18

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agcggtgaac caagacgcag ggcgcgatca aaacaacg 38

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aattccctcg aggacaaggc gagctcttcg gtagtagcca a 41

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttattgggta aaccttgggg c 21

<210> 12

<211> 640

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aagtaaatga gttcgcctgt gttgtggcag atgctgtcat aaaaactttg caaccagtat 60

ctgaattact tacaccactg ggcattgatt tagatgagtg gagtatggct acatactact 120

tatttgatga gtctggtgag tttaaattgg cttcacatat gtattgttct ttctaccctc 180

cagatgagga tgaagaagaa ggtgattgtg aagaagaaga gtttgagcca tcaactcaat 240

atgagtatgg tactgaagat gattaccaag gtaaaccttt ggaatttggt gccacttctg 300

ctgctcttca acctgaagaa gagcaagaag aagattggtt agatgatgat agtcaacaaa 360

ctgttggtca acaagacggc agtgaggaca atcagacaac tactattcaa acaattgttg 420

aggttcaacc tcaattagag atggaactta caccagttgt tcagactatt gaagtgaata 480

gttttagtgg ttatttaaaa cttactgaca atgtatacat taaaaatgca gacattgtgg 540

aagaagctaa aaaggtaaaa ccaacagtgg ttgttaatgc agccaatgtt taccttaaac 600

atggaggagg tgttgcagga gccttaaata aggctactaa 640

<210> 13

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttcaactggc agtaaccaga atggagaacg cagtggggcg cgatcaaaac aacgtcggcc 60

ccaaggttta cccaataata ctgcgtcttg gttcaccgct ctcactcaac atggcaagga 120

agaccttaaa ttccctcgag gacaaggcgt tccaattaac accaatagca gtccagatga 180

ccaaattggc tactaccgaa gagctaccag acgaattcgt ggtggtgacg gtaaaatga 239

<210> 14

<211> 640

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaggctgttg tgaagacttt acaaccagtt tctgatctcc ttaccaacat gggtattgat 60

cttgatgagt ggagtgtagc tacattctac ttatttgatg atgctggtga agaaaacttt 120

tcatcacgta tgtattgttc cttttaccct ccagatgagg aagaagagga cgatgcagag 180

tgtgaggaag aagaaattga tgaaacctgt gaacatgagt acggtacaga ggatgattat 240

caaggtctcc ctctggaatt tggtgcctca gctgaaacag ttcgagttga ggaagaagaa 300

gaggaagact ggctggatga tactactgag caatcagaga ttgagccaga accagaacct 360

acacctgaag aaccagttaa tcagtttact ggttatttaa aacttactga caatgttgcc 420

attaaatgtg ttgacatcgt taaggaggca caaagtgcta atcctatggt gattgtaaat 480

gctgctaaca tacacctgaa acatggtggt ggtgtagcag gtgcactcaa caaggcaacc 540

aatggtgcca tgcaaaagga gagtgatgat tacattaagc taaatggccc tcttacagta 600

ggagggtctt gtttgctttc tggacataat cttgctaaga 640

<210> 15

<211> 640

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgtgttgttg ctgatgctgt cataaaaact ttacaaccag tatctgaact aatcatacca 60

ctgggcattg atttagacga gtggagtatg gctacatact acttgtttga tgagtccggt 120

gaatttaaat tgtcttcaca tatgtactgt tctttctacc ctcctgaaga tgaaggggaa 180

gatgattgtg aagaaggaca gtgtgaacca tcaactcaat atgagtatgg tactgaggat 240

gactaccaag gtaaaccttt ggagtttggt gctacttctt tttcttcttc ttcacaggaa 300

gaagaacaag aagaggattg gttagaatct gatagtcagg acggccaaga gactgcagtt 360

gaagaaaata aaataccgag tgttgaagtt ccacctgttt tgcaggtgga atcaacacca 420

gttgttactg aaactagtga acaaaataat ttcacaggtt atttaaaatt aactgacaat 480

gtcttcatta aaaatgctga cattgtagaa gaagctaaaa aggtaaagcc tacagtagtt 540

gttaatgcag ctaatgttta ccttaaacat ggaggaggtg ttgctggagc tttaaataag 600

gcaactaaca acgccatgca ggttgaatct gataagtaca 640

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttgctgctgc ttgacagatt 20

Claims

1.一种基于RT-LAMP技术检测新冠病毒用引物组，其特征在于，包括检测新冠病毒SARS-CoV-2的Orf1ab基因的RT-LAMP引物组和检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因的RT-LAMP引物组；

所述检测新冠病毒SARS-CoV-2的Orf1ab基因的RT-LAMP引物组包括2条外引物Orf1ab-F3/Orf1ab-B3、2条内引物Orf1ab-FIP/Orf1ab-BIP和2条环引物Orf1ab-Loop-F/Orf1ab-Loop-B，其中Orf1ab-F3的核苷酸序列为SEQ ID No.1，Orf1ab-B3的核苷酸序列为SEQ IDNo.2，Orf1ab-FIP的核苷酸序列为SEQ ID No.3，Orf1ab-BIP的核苷酸序列为SEQ ID No.4，Orf1ab-Loop-F的核苷酸序列为SEQ ID No.5，Orf1ab-Loop-B的核苷酸序列为SEQ IDNo.6；

所述检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因的RT-LAMP引物组包括2条外引物N-F3/N-B3、2条内引物N-FIP/N-BIP和1条环引物N-Loop-F；所述N-F3的核苷酸序列为SEQ ID No.7，N-B3的核苷酸序列为SEQ ID No.8，N-FIP的核苷酸序列为SEQ ID No.9，N-BIP的核苷酸序列为SEQ ID No.10，N-Loop-F的核苷酸序列为SEQ ID No.11。

2.一种基于RT-LAMP技术新冠病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于，在检测新冠病毒SARS-CoV-2的Orf1ab基因的RT-LAMP引物组中，Orf1ab-F3、Orf1ab-B3、Orf1ab-FIP、Orf1abBIP、Orf1ab-Loop-F和Orf1ab-Loop-B的摩尔比为1:1:8:8:2:2。

4.根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于，在检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因的RT-LAMP引物组中，N-F3、N-B3、N-FIP、N-BIP和N-Loop-F的摩尔比为1:1:8:8:2。

5.根据权利要求2～4任意一项所述检测试剂盒，其特征在于，还包括LAMP 2×MasterMix和荧光染料试剂。