CN112195274A

CN112195274A - 一种新型冠状病毒的病毒样本处理液和处理方法及检测病毒的快速恒温反转录扩增试剂盒

Info

Publication number: CN112195274A
Application number: CN202011063391.3A
Authority: CN
Inventors: 赵民清; 李萌; 方园; 任云
Original assignee: Hangzhou Diyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Derlead Biotech Co ltd
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2021-01-08

Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒的病毒样本处理液和处理方法及检测新型冠状病毒的快速恒温反转录扩增试剂盒，属于病原微生物体外分子检测技术领域。本发明所述新型冠状病毒的病毒样本处理液为终浓度为0.1～1M的盐酸胍水溶液或吐温‑20的终质量百分含量为0.01％～0.1％的0.1×TE缓冲液。本发明所述病毒处理液处理后的病毒样本能够实现简便、快速的病毒核酸检测，仅需进行恒温扩增、显色法就能观察结果。

Description

一种新型冠状病毒的病毒样本处理液和处理方法及检测病毒的快速恒温反转录扩增试剂盒

技术领域

本发明涉及病原微生物体外分子检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒(2019-nCoV)的病毒样本处理液和处理方法及检测新型冠状病毒的快速恒温反转录扩增(Quick Isothermal reverse transcription Amplification，Q-IRTA)试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒2019-nCOV是一种RNA病毒，主要感染哺乳动物，人是其宿主之一，首先侵犯上呼吸道，自鼻腔、鼻咽部、口咽部，向下至喉咽部、气管、支气管、肺泡细胞，直至感染整个肺组织，引起肺的炎症。据研究，新型冠状病毒的主要致病机制是引起宿主免疫系统的强烈反应，炎症细胞大量聚集，释放细胞因子，继而引起细胞因子风暴，后续炎症反应不仅杀伤病毒，也使组织细胞大量受损，引起细胞死亡以及组织器官衰竭，尤其是肺组织，炎症反应产生大量粘性物质，堵塞气道，引起呼吸困难，导致严重缺氧，进而使宿主窒息死亡。

新型冠状病毒的传播主要是空气中的飞沫和气溶胶传播，由呼吸道吸入人体而侵入细胞。因此，带口罩是很有效的预防病毒传播的手段。同时，接触传播也是一种病毒传染的方式。由于病毒在物体表面可以存活较长的时间，所以，接触病毒的手再接触鼻腔、口腔粘膜，也可以感染病毒，所以，洗手也是一种很有效的预防手段。新型冠状病毒自从2019年12月份开始传播以来，风靡全球，病毒具有极强的传染性，又具有很强的致病性，但是，其感染率在不同的地区具有不同的特性；病死率也随地区波动很大，从0.1％至10％不等。目前对于新型冠状病毒在人群中的传播规律、易感人群、变异程度等还不太清楚，尤其是无症状带病毒者所占比例很大，竟高达50％，这对于病毒的防控产生极大的困难。虽然在恢复期的患者的传染性并没有初发病时的患者大，但是，我们对于新型冠状病毒在人体内的致病机制，种族遗传与患病率的关系等因素了解尚少，又缺乏特效治疗药物，所有针对新型冠状的疫苗尚在临床试验阶段，是否能有效地产生抗体并发挥保护作用尚不可知。在这种情况下，唯一能够防止病毒传播的有效方法是进行有效的隔离，以及进行病毒核酸的检测，及时发现并隔离患者以及无症状带病毒者。目前对新型冠状病毒的检测手段主要概况有两大类，一类是检测血中的抗体，另一类是检测呼吸道分泌物中的病毒的核酸，即病原体。前一种方法虽然能间接地发现患者有过病毒感染，但是在什么时候感染的，当前是否仍然在感染状态，很难确定。后一种方法可以有效地检测患者是否在感染当中，有没有传染性，病毒载量多少等，可以是一种明确诊断的有效手段。

新型冠状病毒的核酸检测方法主要概括为实时荧光聚合酶链反应法(Real-TimeFluorescence Polymerase Chain Reaction，荧光PCR)和恒温扩增法两种。这两种方法都是十分广泛应用的核酸检测方法，其灵敏度和特异性均很高，只是各自的原理不同，荧光PCR法目前应用最多的是TaqMan探针法，即用一对引物和一条寡核苷酸探针进行PCR扩增，探针标记有荧光素，可以直接探测荧光强度的变化而反映PCR产物生成的多少。恒温扩增法则相对复杂一些，有多种多样的扩增条件，基本上是设计多对引物，用固定温度的DNA合成酶，扩增出大量产物，用荧光素染色或使用pH指示剂产生颜色变化，直接观察结果，达到检测靶基因的目的。恒温扩增方法的灵敏度要高于TaqMan方法，致使可以早期、微量地进行核酸的检测，其结果判定也比较客观、真实。通过对微生物病原体的核酸检测，不仅可以协助判断是否有微生物病原体的感染，还可以对微生物病原体的流行进行调查和监控，帮助建立微生物病原体病的检测标准，为临床考评疗效提供依据，并能协助指导临床用药和预测疾病的发生、发展等指标。

但在核酸检测过程中，除了进行扩增反应之外，还有一个重要的环节是核酸的提取和纯化，尤其对于RNA病毒核酸的提取非常关键，因为RNA极不稳定，容易被降解，提取之后还不能直接进行扩增，需要进行逆转录成互补DNA(cDNA)才能够被扩增，核酸提取步骤通常比较耗时，消耗成本，而且有一定程度的损耗，逆转录的效率也因方法不同而异。目前缺乏一种快速简便的新型冠状病毒检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒的病毒样本处理液和处理方法及检测新型冠状病毒的快速恒温反转录扩增试剂盒。本发明所述病毒样本处理液处理后的病毒样本能够实现病毒简便、快速的检测，仅需进行恒温扩增、显色法就能观察结果。

本发明提供了一种新型冠状病毒的病毒样本处理液，所述病毒样本处理液为终浓度为终浓度为0.1～1M的盐酸胍水溶液或吐温-20的终质量百分含量为0.01％～0.1％的0.1×TE缓冲液。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述病毒样本处理液的新型冠状病毒的病毒样本的处理方法，包括以下步骤：

将新型冠状病毒的病毒样本和盐酸胍水溶液混合，使盐酸胍的终浓度为0.1～1M，振荡混匀10s，13000rpm离心1.5min，得到处理后待测样本；

或，

将新型冠状病毒的病毒样本与含吐温-20的0.1×TE缓冲液混合，使吐温-20的终浓度为质量百分含量为0.01％～0.1％，95℃处理10min，冷却，13000rpm离心1.5min，得到处理后待测样本。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述病毒样本处理液的检测新型冠状病毒的快速恒温反转录扩增试剂盒，所述试剂盒包括第一引物组和/或第二引物组、上述技术方案所述病毒样本处理液、扩增反应液、阳性对照和阴性对照；

所述第一引物组包括能够扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的靶基因的引物；

所述第二引物组包括能够扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的靶基因的引物；

所述阳性对照包括含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列或含核苷酸序列如SEQID NO.2所示序列的载体。

优选的是，所述第一引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5～10所示的引物。

优选的是，所述第二引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11～16所示的引物。

优选的是，所述扩增反应液包括WarmStartDNA聚合酶、WarmStart RTx反转录酶、pH指示剂、缓冲液和dNTP。

优选的是，所述阳性对照包括含核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示序列或含核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示序列的载体。

优选的是，所述载体包括pUC-T载体。

优选的是，所述阴性对照包括0.1×TE缓冲液。

优选的是，每10μL快速恒温反转录扩增的反应体系包括：第一引物组和/或第二引物组共1μL、扩增反应液5μL、水2μL和阳性对照或阴性对照或用上述技术方案所述病毒样本处理液处理后待测样本2μL。

本发明提供了一种新型冠状病毒的病毒样本处理液。本方法通过一系列巧妙的构思和创新，发明了一种全新的病毒样本处理液，结合本发明构建的恒温扩增的引物，以及观察结果的颜色显色法，既缩短了整个反应的时间、简化了流程、提高了检测效率，又防止了病毒的污染、减少了成本、降低了使用门槛，使得原来必须在标准的分子实验室进行的检测工作，应用本发明方法之后，可以在没有任何标准分子检测实验室设备设施条件的情况下开展核酸检测，仅需要一个恒温水浴锅，或一个干式恒温器就可以进行扩增反应，反应之后产生颜色的变化来显示结果，用肉眼观察就可以判断病毒的存在与否，使核酸检测更容易，更普及，更有效。本发明后续仅需一步法即可检测新型冠状病毒的核酸，无需RNA提取，无需特殊设备，在30～60min就可以出结果。

本发明试剂盒及后续检测方法安全、有效、简便、易行，不易污染。与现有技术相比具有以下优点：

(1)采用0.1～1M盐酸胍化学法灭活病毒，仅需10s，无需进行RNA提取，直接用灭活的病毒进行恒温扩增反应，耗时：30min(N基因)或60min(ORF1ab基因)。

(2)反应体积小，仅10μL，节约成本，通量高，适合基层大规模核酸普检

(3)操作简单，时间短，无污染，无需特殊复杂设备，直接用颜色观察结果(颜色由粉红色变成黄色)；

(4)特异性强，针对新型冠状病毒的两种特异性基因，设计N基因和ORF1ab基因的恒温扩增特异性引物对，快速高效地检测出新型冠状病毒的核酸，与临床其他常见病毒、细菌、真菌等微生物无交叉反应；

(5)灵敏度高，核酸模板用量极微，仅用病毒样本处理液处理后的灭活待测样本(处理后待测样本)2μL，检测限N基因质粒为460拷贝/反应，假病毒为80拷贝/mL，ORF1ab基因为540拷贝/反应。

附图说明

图1为本发明提供的人工合成的新型冠状病毒假病毒中N基因检测假病毒浓度梯度颜色变化结果；图中显示假病毒原液十倍梯度稀释经快速恒温扩增后颜色变化结果图谱，假病毒浓度从左到右依次降低；以及阴性对照和阳性对照颜色变化结果图谱；

图2为本发明提供的新型冠状病毒N基因质粒浓度梯度颜色变化结果图；

图3为本发明提供的新型冠状病毒ORF1ab基因质粒浓度梯度颜色变化结果图；

图4为本发明提供的新型冠状病毒N基因反应体积和质粒模板加样量的优化结果图；图中质粒浓度从左到右依次降低，其中，A图显示质粒模板的加样量为1μL，B图显示质粒模板的加样量为2μL；

图5为本发明提供的新型冠状病毒ORF1ab基因反应时间的优化结果图；

图6为各种病毒样本处理方法对比图；其中，A为盐酸胍溶液处理结果图，B为吐温-20溶液处理结果图，C为TritonX-100溶液处理结果图，D为病毒RNA提取试剂盒处理结果图，图中假病毒浓度均从左到右依次降低。

具体实施方式

本发明提供了一种新型冠状病毒的病毒样本处理液，所述病毒样本处理液为终浓度为0.1～1M的盐酸胍水溶液或吐温-20的终质量百分含量为0.01％～0.1％的0.1×TE缓冲液。在本发明中，所述病毒样本处理液优选为终浓度为0.2M的盐酸胍水溶液或吐温-20的终质量百分含量为0.01％的0.1×TE缓冲液。本发明采用终浓度质量百分含量为0.01％～0.1％吐温-20的0.1×TE缓冲液灭活病毒，无需进行RNA提取，可直接用灭活的病毒进行恒温扩增反应，且能增强扩增反应。本发明采用终浓度为0.1～1M盐酸胍化学法灭活病毒，仅需10s，无需进行RNA提取，直接用灭活的病毒进行恒温扩增反应。所述恒温扩增反应耗时：30min(N基因)或60min(ORF1ab基因)。

将新型冠状病毒的病毒样本和盐酸胍水溶液混合，使盐酸胍的终浓度为0.1～1M，振荡混匀10s，13000rpm离心1.5min，得到处理后待测样本；本发明对于病毒样本的处理采取0.1～1M盐酸胍化学灭活方法，10s即可迅速灭活病毒。

或，

将新型冠状病毒的病毒样本与含吐温-20的0.1×TE缓冲液混合，使吐温-20的终浓度为质量百分含量为0.01％～0.1％，95℃处理10min，冷却，13000rpm离心1.5min，得到处理后待测样本，无需RNA提取。

本发明病毒的处理方法无需RNA提取，无逆转录步骤，得到的处理后待测样本后续可以结合一步法逆转录+恒温快速扩增微量靶基因的方法，借助颜色变化观察结果，并实现小反应体积(仅10μL)的扩增。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述病毒样本处理液的检测新型冠状病毒的快速恒温反转录扩增试剂盒，所述试剂盒包括第一引物组和/或第二引物组、上述技术方案所述样本处理液、扩增反应液、阳性对照和阴性对照；

在本发明中，本发明筛选能够特异检测新型冠状病毒且与其他生物特别是病原微生物种属同源性不高的N基因作为靶基因序列，靶基因扩增片段的核苷酸序列如下(217bp)：

TGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCA(SEQID NO.1)。此靶序列，特异性好，与已知冠状病毒及其他病毒序列无交叉，与常见真菌和细菌无交叉。

在本发明中，所述第一引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5～10所示的引物。该组引物扩增效率高，比qPCR方法灵敏度提高约100倍，能快速大量扩增，改变体系pH，产生颜色反应。本发明优选根据新型冠状病毒N基因靶基因序列设计快速恒温反转录扩增方法的引物，优选委托上海捷瑞生物技术有限公司合成。

本发明针对新型冠状病毒N基因靶基因的引物(第一引物组)的碱基序列为：

N-F3：5’-TGGCTACTACCGAAGAGCT-3’(SEQ ID NO.5)

N-B3：5’-TGCAGCATTGTTAGCAGGAT-3’(SEQ ID NO.6)

N-FIP:

5’-TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTGACGAATTCGTGGTGGTGA-3’(SEQ ID NO.7)

N-BIP:

5’-AGACGGCATCATATGGGTTGCAGCGGGTGCCAATGTGATC-3’(SEQ ID NO.8)

N-LF:5’-TGGACTGAGATCTTTCATTTTACCG-3’(SEQ ID NO.9)

N-LB:5’-ACTGAGGGAGCCTTGAATACA-3’(SEQ ID NO.10)。

在本发明中，所述第一引物组的引物浓度优选分别为N-F3、N-B3：2μM；N-FIP、N-BIP:16μM；N-LF、N-LB:4μM。该浓度能最大程度提高扩增效率。

在本发明中，所述第二引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11～16所示的引物。该组扩增效率高，特异性好。本发明筛选能够特异检测新型冠状病毒且与其他生物特别是病原微生物种属同源性不高的ORF1ab基因作为靶基因序列。

靶基因的扩增片段的核苷酸序列如下(289bp)：

TCCAGATGAGGATGAAGAAGAAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAGTTTGAGCCATCAACTCAATATGAGTATGGTACTGAAGATGATTACCAAGGTAAACCTTTGGAATTTGGTGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGTTGTTCAGACT(SEQ IDNO.2)。该序列稳定性高，适合设计高灵敏度引物组合，特异性强，与其他病毒类型以及其他物种的核酸序列同源性不高。

本发明优选根据新型冠状病毒ORF1ab基因靶基因序列设计快速恒温反转录扩增方法的引物，优选委托上海捷瑞生物技术有限公司合成。

根据新型冠状病毒ORF1ab基因靶基因设计的引物(第二引物组)的碱基序列为：

ORF-F3：5’-TCCAGATGAGGATGAAGAAGA-3’(SEQ ID NO.11)

ORF-B3:5’-AGTCTGAACAACTGGTGTAAG-3’(SEQ ID NO.12)

ORF-FIP:

5’-AGAGCAGCAGAAGTGGCACAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAG-3’(SEQ ID NO.13)

ORF-BIP:

5’-TCAACCTGAAGAAGAGCAAGAACTGATTGTCCTCACTGCC-3’(SEQ ID NO.14)

ORF-LF:5’-CTCATATTGAGTTGATGGCTCA-3’(SEQ ID NO.15)

ORF-LB:5’-ACAAACTGTTGGTCAACAAGAC-3’(SEQ ID NO.16)

在本发明中，所述第二引物组的引物浓度优选分别为ORF-F3、ORF-B3：2μM；ORF-FIP、ORF-BIP:16μM；ORF-LF、ORF-LB:4μM。该浓度能最大程度提高扩增效率。

在本发明中，所述扩增反应液优选包括WarmStart DNA聚合酶、WarmStart RTx反转录酶、pH指示剂、缓冲液和dNTP。在本发明中，所述扩增反应液优选取自试剂盒

Colorimetric LAMP 2X Master Mix(DNA&RNA)，购自美国NEB ENGLANDBiolabs公司，货号M1800S。使用该反应液无需单独的反转录过程，一次反应即可完成反转录和DNA扩增过程，操作方便，效率高。

本发明所述阳性对照优选包括含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列或含核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示序列的载体。更优选的，本发明所述阳性对照优选包括含长度比核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示序列长的序列，如所述阳性对照包括含核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示序列或含核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示序列的载体，阳性对照的DNA序列的长度比靶序列的要长，能完全覆盖整个快速恒温逆转录扩增的靶序列。本发明对所述阳性对照的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规阳性对照质粒构建方法即可。在本发明中，所述阳性对照中质粒的浓度优选为0.01ng/μL。该浓度能稳定检出阳性结果，且浓度低，能最大程度节约成本。

在本发明中，所述载体包括pUC-T载体。该载体操作方便，易合成稳定的质粒结构，适合进行核酸片段的克隆，而且花费时间短，速度快，并能最大程度节约成本。

在本发明中，所述阴性对照包括0.1×TE缓冲液。

在本发明中，所述快速恒温反转录扩增的反应体系优选为10μL。在本发明中，每10μL快速恒温反转录扩增的反应体系包括：第一引物组和/或第二引物组共1μL、扩增反应液5μL、水2μL和阳性对照或阴性对照或用权利要求1所述病毒样本处理液处理后待测样本2μL。

本发明采用快速恒温反转录扩增(Q-IRTA)方法，以新型冠状病毒(2019-nCoV)的编码核衣壳蛋白N基因和开放阅读框(ORF1ab)的特异性基因保守序列设计引物，配以含反转录酶和恒温扩增酶的恒温扩增反应液，采用一步法在恒定温度下进行核酸的扩增，通过反应体系颜色变化实现对样本中是否含有新型冠状病毒的RNA的检测。恒温扩增采用小体积(10μL)及微量核酸模板(2μL)，无逆转录步骤，直接进行扩增反应的创新方法。具体扩增时，本发明针对N基因的靶基因的扩增，优选65℃反应30min，针对ORF1ab基因，优选65℃反应60min。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种新型冠状病毒的病毒样本处理液和处理方法及检测新型冠状病毒的快速恒温反转录扩增试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

病毒灭活方法

采用两种方法灭活病毒：

方法一采用终浓度为0.2M盐酸胍化学法灭活病毒。具体实施流程为，取临床收集的病毒样本溶液960μL，加入40μL 5.0M的盐酸胍溶液，振荡混匀10s，13000rpm离心1.5min，即为处理后的待测样本。

方法二采用吐温-20终质量百分含量为0.01％的0.1xTE缓冲液化学法灭活病毒。具体实施流程为，取临床收集的病毒样本溶液960μL，加入40μL含质量百分含量为0.25％吐温-20的0.1xTE缓冲液，水浴锅95℃处理10min，冷却，13000rpm离心1.5min，即为处理后的待测样本。要等灭活的病毒冷却并13000rpm离心1.5min之后才可以打开管盖，以防气溶胶的播散。

实施例2

病毒灭活方法

采用两种方法灭活病毒：

方法一采用终浓度为0.4M盐酸胍化学法灭活病毒。具体实施流程为，取临床收集的病毒样本溶液920μL，加入80μL 5.0M的盐酸胍溶液，振荡混匀10s，13000rpm离心1.5min，即为处理后的待测样本。

方法二采用吐温-20终质量百分含量为0.1％的0.1xTE缓冲液化学法灭活病毒。具体实施流程为，取临床收集的病毒样本溶液600μL，加入400μL含质量百分含量为0.25％吐温-20的0.1xTE缓冲液，水浴锅95℃处理10min，冷却，13000rpm离心1.5min，即为处理后的待测样本。要等灭活的病毒冷却并13000rpm离心1.5min之后才可以打开管盖，以防气溶胶的播散。

实施例3

病毒灭活方法

采用两种方法灭活病毒：

方法一采用终浓度为0.6M盐酸胍化学法灭活病毒。具体实施流程为，取临床收集的病毒样本溶液880μL，加入120μL 5.0M的盐酸胍溶液，振荡混匀10s，13000rpm离心1.5min，即为处理后的待测样本。

方法二采用吐温-20终质量百分含量为0.05％的0.1xTE缓冲液化学法灭活病毒。具体实施流程为，取临床收集的病毒样本溶液800μL，加入200μL含质量百分含量为0.25％吐温-20的0.1xTE缓冲液，水浴锅95℃处理10min，冷却，13000rpm离心1.5min，即为处理后的待测样本。要等灭活的病毒冷却并13000rpm离心1.5min之后才可以打开管盖，以防气溶胶的播散。

实施例4

试剂盒的组成

1、引物设计

1)筛选能够特异检测新型冠状病毒且与其他生物特别是病原微生物种属同源性不高的N基因作为靶基因序列。

靶基因扩增片段的核苷酸序列如下(217bp)：

TGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCA(SEQID NO.1)

根据新型冠状病毒N基因靶基因序列设计快速恒温反转录扩增方法的引物，并委托上海捷瑞生物技术有限公司合成。

引物的碱基序列为：

N-F3：5’-TGGCTACTACCGAAGAGCT-3’(SEQ ID NO.5)

N-B3:5’-TGCAGCATTGTTAGCAGGAT-3’(SEQ ID NO.6)

N-FIP:

5’-TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTGACGAATTCGTGGTGGTGA-3’(SEQ ID NO.7)

N-BIP:

5’-AGACGGCATCATATGGGTTGCAGCGGGTGCCAATGTGATC-3’(SEQ ID NO.8)

N-LF:5’-TGGACTGAGATCTTTCATTTTACCG-3’(SEQ ID NO.9)

N-LB:5’-ACTGAGGGAGCCTTGAATACA-3’(SEQ ID NO.10)

2)筛选能够特异检测新型冠状病毒且与其他生物特别是病原微生物种属同源性不高的ORF1ab基因作为另一种靶基因序列。

靶基因的扩增片段的核苷酸序列如下(289bp)：

TCCAGATGAGGATGAAGAAGAAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAGTTTGAGCCATCAACTCAATATGAGTATGGTACTGAAGATGATTACCAAGGTAAACCTTTGGAATTTGGTGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGTTGTTCAGACT(SEQ IDNO.2)

根据新型冠状病毒ORF1ab基因靶基因序列设计快速恒温反转录扩增方法的引物，并委托上海捷瑞生物技术有限公司合成。

引物的碱基序列为：

ORF-F3：5’-TCCAGATGAGGATGAAGAAGA-3’(SEQ ID NO.11)

ORF-B3:5’-AGTCTGAACAACTGGTGTAAG-3’(SEQ ID NO.12)

ORF-FIP:

5’-AGAGCAGCAGAAGTGGCACAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAG-3’(SEQ ID NO.13)

ORF-BIP:

5’-TCAACCTGAAGAAGAGCAAGAACTGATTGTCCTCACTGCC-3’(SEQ ID NO.14)

ORF-LF:5’-CTCATATTGAGTTGATGGCTCA-3’(SEQ ID NO.15)

ORF-LB:5’-ACAAACTGTTGGTCAACAAGAC-3’(SEQ ID NO.16)

2、试剂盒的组成

1)病毒样本处理液的母液:

用于灭活处理病毒的病毒样本处理液的母液，(1)由含5.0M的盐酸胍，或(2)由0.25％吐温-20的0.1xTE缓冲液组成。

2)扩增反应液：

含WarmStartDNA聚合酶、WarmStart RTx反转录酶、pH指示剂、缓冲液，dNTP。

3)引物混合液1：

N基因3对特异性引物(含上下游)混合液，浓度分别为N-F3、N-B3：2μM；N-FIP、N-BIP:16μM；N-LF、N-LB:4μM。

4)引物混合液2：

ORF1ab基因3对特异性引物(含上下游)混合液，浓度分别为ORF-F3、ORF-B3：2μM；ORF-FIP、ORF-BIP:16μM；ORF-LF、ORF-LB:4μM。

5)阳性对照

含N基因片段的质粒和含ORF1ab基因片段的质粒混合液，其浓度均为0.01ng/μL。

为了使新型冠状病毒检测试剂盒有阳性对照，特意设计了引物用于扩增阳性对照序列，阳性对照序列针对本试剂盒的快速恒温逆转录扩增的靶序列(包括上述新型冠状病毒的N基因和ORF1ab基因的靶序列)，且此阳性对照的DNA序列的长度比靶序列的要长，这样就能完全覆盖整个快速恒温逆转录扩增的靶序列。

阳性对照为分别含新型冠状病毒的N基因和ORF1ab基因的阳性对照DNA序列的2种克隆质粒，浓度分别为0.01ng/μL。

阳性对照的制备过程为：

(1)二种克隆质粒的构建

提取新型冠状病毒的基因组DNA；以该基因组DNA为模板，采用引物N-F/N-R进行PCR扩增，扩增得到新型冠状病毒的N基因阳性对照DNA片段；回收并纯化PCR产物，将其连入质粒载体(pUC-T)中，转化大肠杆菌DH5α，重组转化子测序验证，新型冠状病毒的N基因阳性对照DNA片段(Nc)如下所示。重组转化子培养后提取质粒，得到克隆质粒Nc-T。

N-F：5’-TGGACCCCAAAATCAGCG-3’(SEQ ID NO.17)

N-R：5’-TTAGGCCTGAGTTGAGTCAGCA-3’(SEQ ID NO.18)

Nc序列(1249bp)：

TGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAA(SEQ ID NO.3)

提取新型冠状病毒的基因组DNA；以该基因组DNA为模板，采用引物ORF-F/ORF-R进行PCR扩增，扩增得到新型冠状病毒的ORF1ab基因阳性对照DNA片段；回收并纯化PCR产物，将其连入质粒载体(pUC-T)中，转化大肠杆菌DH5α，重组转化子测序验证，新型冠状病毒的ORF1ab基因阳性对照DNA片段(ORFc)如下所示。重组转化子培养后提取质粒，得到克隆质粒ORFc-T。

ORF-F：5’-TGAGTTCGCCTGTGTTGTGG-3’(SEQ ID NO.19)

ORF-R：5’-CTTGCATGGCATTGTTAGTAGCC-3’(SEQ ID NO.20)

ORFc序列(647bp)：

TGAGTTCGCCTGTGTTGTGGCAGATGCTGTCATAAAAACTTTGCAACCAGTATCTGAATTACTTACACCACTGGGCATTGATTTAGATGAGTGGAGTATGGCTACATACTACTTATTTGATGAGTCTGGTGAGTTTAAATTGGCTTCACATATGTATTGTTCTTTTTACCCTCCAGATGAGGATGAAGAAGAAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAGTTTGAGCCATCAACTCAATATGAGTATGGTACTGAAGATGATTACCAAGGTAAACCTTTGGAATTTGGTGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGTTGTTCAGACTATTGAAGTGAATAGTTTTAGTGGTTATTTAAAACTTACTGACAATGTATACATTAAAAATGCAGACATTGTGGAAGAAGCTAAAAAGGTAAAACCAACAGTGGTTGTTAATGCAGCCAATGTTTACCTTAAACATGGAGGAGGTGTTGCAGGAGCCTTAAATAAGGCTACTAACAATGCCATGCAAG(SEQ ID NO.4)

(2)含新型冠状病毒N基因和ORF1ab基因阳性对照DNA序列的2种克隆质粒混合，调节浓度两者终浓度均为0.01ng/μL。

6)阴性对照

阴性对照含0.1xTE缓冲液。

试剂盒的组成如表1所示。

表1试剂盒的组成

实施例5

试剂盒的检测方法

1.样本处理

(1)如果用5.0M的盐酸胍处理病毒样本(终浓度为0.2M，灭活病毒并释放核酸)，则标本试管充分震荡摇匀(冻存标本使用前应在室温融解并充分混匀)，取960μL病毒样本溶液，向样本溶液中加入40μL病毒样本处理液(室温混匀后使用)，充分震荡摇匀，然后离心13000rpm，1.5min，病毒灭活处理后可以直接用于核酸的扩增反应。

(2)如果用0.25％的吐温-20，0.1xTE处理病毒样本(终浓度为0.01％，灭活病毒并释放核酸)，则标本试管充分震荡摇匀(冻存标本使用前应在室温融解并充分混匀)，取960μL病毒样本溶液，向样本溶液中加入40μL 0.25％的吐温-20，0.1xTE病毒处理液(室温混匀后使用)，充分震荡摇匀，95℃水浴或干浴10min，置常温水中冷却半分钟后，13000rpm离心1.5min，病毒灭活处理后可以直接用于核酸的扩增反应。

阴性对照品和阳性对照品无需处理，在室温下融化并振荡均匀，瞬时离心，备用。

2.扩增反应试剂准备

取出试剂盒中各组分，在冰上或室温融化，充分混匀，瞬时离心，备用，并准备好灭菌纯化水(用户自备)。计算需要进行的反应管数n(反应管n1＝样本数+阴性对照1管+阳性对照1管，反应管n2＝样本数+阴性对照1管+阳性对照1管)。单份反应管体系如表2所示：

表2单份反应管体系

扩增反应液

引物混合液1

引物混合液2

灭菌纯化水

样本或对照品

总体积

反应管1

5μL

1μL

/

2μL

10μL

反应管2

5μL

/

1μL

2μL

10μL

按反应管数n计算上述各试剂(除了样本或对照品)的用量，并加入合适的离心管中，充分混匀(可以使用移液器缓慢反复吹打混匀，但同时应避免液体飞溅或产生大量气泡)，瞬时离心，按8μL/管分装到扩增反应管中。

3.加样

按一定顺序向扩增反应管中分别加入2μL的阴性对照品、阳性对照品、病毒样本处理上清液，盖紧反应管，轻弹混匀后瞬时离心。

4.扩增反应及显色检测

将上述扩增反应管做好标记，按一定顺序放入恒温水浴锅，或电控恒温仪或PCR仪内进行反应，按下列条件进行扩增反应：

反应管1(N基因)：65℃、30min；

反应管2(ORF1ab基因)：65℃、60min。

5.结果分析

反应结束后，将反应管从水浴锅或恒温仪器中取出，平衡至室温，等待1min，观察并记录颜色(图1为N基因假病毒的扩增结果；图2为N基因质粒的扩增结果；图3为ORF1ab基因质粒的扩增结果。黄色为新型冠状病毒阳性，红色为阴性)。

6.质控标准

本试剂盒阴、阳性对照应同时满足以下条件，否则本次实验视为无效，需要重做：在反应进行后，阳性对照反应管的颜色转为黄色，阴性对照反应管的颜色仍为粉红色，说明反应正常进行，且试剂盒内的试剂均无异常，质控正常。

【阳性判断值】

反应完成后，反应管1或者2，或者两个反应管均由红色转变为黄色或橘黄色，即判断样品为携带新型冠状病毒的阳性样本。颜色参考可与阳性对照和阴性对照的结果进行比较。

【检验结果的解释】

1、每次实验均需检测阴性质控品、阳性质控品，质控品结果均需满足质控标准要求，方可对样本结果进行判定；

2、阳性样本显黄色程度与浓度有关，当病毒样本中靶基因的核酸浓度较低时，反应管会显现橘黄色或橘红色，呈现弱阳性；

3、30min(反应管1)或60min(反应管2)反应结束后，反应管在室温放置一段时间后(5min)，橘黄色或橘红色的反应管颜色会逐步加深变为明显黄色，此为正常现象，红色反应管不会发生此类变化，反应结束应及时观察实验结果。如果操作人员在30min内无时间观察结果或需要将不同批次结果进行统一判定，请在30min(N基因)或60min(ORF1ab基因)(65℃)扩增反应后，将反应管立即转入85℃水浴，10min，以灭活管中核酸扩增酶。

实施例6

试剂盒的性能评价

1、病毒处理方法的选择

本实验以假病毒(新型冠状病毒)为例，假病毒购自北京擎科生物科技有限公司杭州分公司。

方法1：盐酸胍溶液处理法。将假病毒溶液进行10倍梯度稀释(可用0.1×TE)，然后加入盐酸胍水溶液，使盐酸胍终浓度为0.2M，震荡混匀，13000rpm离心1.5min，备用；

方法2：吐温-20溶液处理法。将假病毒溶液进行10倍梯度稀释(可用0.1×TE)，然后加入含吐温-20的0.1×TE溶液，使吐温-20终质量百分含量为0.01％，95℃处理10min，冷却后，震荡混匀，13000rpm离心1.5min，备用；

方法3：TritonX-100溶液处理法。将假病毒溶液进行10倍梯度稀释(可用0.1×TE)，然后加入含TritonX-100的0.1×TE溶液，使TritonX-100终质量百分含量为0.01％，95℃处理10min，冷却后，震荡混匀，13000rpm离心1.5min，备用；

方法4：病毒RNA提取试剂盒(DP315-R)处理法(购自天根生化科技(北京)有限公司)。将假病毒溶液进行10倍梯度稀释(可用0.1×TE)，然后按说明书要求进行RNA的提取，备用；

采用本发明实施例4的试剂盒，按照实施例5的方法，对假病毒进行检测。

表3不同病毒处理方法结果

由表3和图6可知，A为盐酸胍溶液处理结果图，B为吐温-20溶液处理结果图，C为TritonX-100溶液处理结果图，D为病毒RNA提取试剂盒处理结果图，图中假病毒浓度均从左到右依次降低。4种方法比较可知，方法1盐酸胍溶液处理法结果最优，假病毒原液稀释10^-8倍仍能检出阳性结果，其次依次是方法2和方法4，方法3效果最差。方法4采用RNA提取，容易产生污染(如稀释10^-7倍结果)，因此优选方法1盐酸胍溶液处理法为最佳。

2、检测限

1)本试剂盒与新型冠状病毒假病毒(N基因)的剂量效应曲线

表4假病毒N基因稀释梯度实验结果(见图1)

稀释倍数	颜色	判断结果
			10<sup>-1</sup>	黄色	阳性+
10<sup>-2</sup>	黄色	阳性+
			10<sup>-3</sup>	黄色	阳性+
10<sup>-4</sup>	黄色	阳性+
			10<sup>-5</sup>	黄色	阳性+
10<sup>-6</sup>	黄色	阳性+
			10<sup>-7</sup>	黄色	阳性+
10<sup>-8</sup>	黄色	阳性+
			10<sup>-9</sup>	红色	阴性-
阳性对照	黄色	阳性+
			阴性对照	红色	阴性-

由表4和图1可知，假病毒原液稀释10^-8倍时，仍可检出阳性结果。将原液浓度为8x10⁹拷贝数/mL的假病毒(表示假病毒浓度的单位是拷贝数/mL)进行十倍梯度稀释，即当假病毒浓度为80拷贝数/mL仍可检出阳性结果。

2)本试剂盒与新型冠状病毒N基因质粒的剂量效应曲线

采用本发明实施例4的试剂盒，按照实施例5的方法，对N基因质粒浓度进行十倍梯度之后，再进行检测。

表5 N基因质粒浓度梯度实验结果(见图2)

由表5和图2可知，N基因质粒浓度为1×10^-6ng/μL，仍可检出阳性结果。

1)本试剂盒与新型冠状病毒ORF1ab基因质粒的剂量效应曲线

采用本发明实施例4的试剂盒，按照实施例5的方法，对ORF1ab基因质粒进行检测。

表6 ORF1ab基因质粒浓度梯度实验结果(见图3)

质粒浓度梯度(ng/uL)	颜色	判断结果
			10<sup>-1</sup>	黄色	阳性+
10<sup>-2</sup>	黄色	阳性+
			10<sup>-3</sup>	黄色	阳性+
10<sup>-4</sup>	黄色	阳性+
			10<sup>-5</sup>	黄色	阳性+
10<sup>-6</sup>	黄色	阳性+
			10<sup>-7</sup>	红色	阴性-
阳性对照	黄色	阳性+
			阴性对照	红色	阴性-

由表6和图3可知，ORF1ab基因质粒浓度为1×10^-6ng/μL，仍可检出阳性结果。

3、反应体系的优化

1)反应体积和模板加样量的优化

将N基因质粒进行梯度稀释，选用临界检测限的浓度进行实验，采用本发明实施例4的试剂盒，按照实施例5的方法进行检测。

表7不同反应体积和加样量的组成

表8反应体积和模板加样量优化实验结果(见图4)

由表8和图4所示，当核酸模板的加样量在1μL时(A)，无论反应体积是10μL，15μL，20μL，均有1管的颜色不变(红色)；但是，当核酸模板的加样量在2μL时(B)，在低浓度的3复管中(10^-6ng/μL)，无论反应体积大小(10μL，15μL，20μL)，均变成黄色，其中以10μL的反应体积颜色变化最深(深黄色)，可知：1、在三种反应体积即10μL、15μL、20μL进行实验，当加样量为1μL时，检测限10^-6ng/μL结果不稳定；当加样量为2μL时，检测限10^-6ng/μL结果均很稳定。2、上述结果表明，不论反应体积如何，模板加样量2μL比1μL的结果稳定；在此基础上，为节约成本，选用反应体积为10μL为最优反应条件。

2)反应时间的优化

方法：将ORF1ab质粒进行10倍梯度稀释，采用本发明实施例4的试剂盒，按照实施例5的方法进行检测。

表9反应时间的优化结果(见图5)

由表9和图5可知，反应时间为60min时，ORF1ab基因引物扩增的灵敏度最高，因此确定ORF1ab基因引物反应时间为60min。

4、冻融稳定性

对试剂盒进行冻融稳定性试验，将试剂置于-20℃±5℃冰箱中，进行反复冻融实验，采用本发明实施例4的试剂盒，按照实施例5的方法进行检测，实验结果表明，快速恒温逆转录扩增试剂反复冻融6次实验结果正常，因此试剂盒可至少冻融6次。

表10冻融稳定性实验结果

实施例7

实际病毒样本检测并与qPCR方法进行比对。

在本实验中，选取了9个2019-COVID患者的咽试子样本各2mL(咽拭子收集患者咽部分泌物后溶解在3mL生理盐水中，然后于-80℃冰箱冷冻保存，实验时将样本拿至室温融解，取2mL原液分成2份，每份1mL。新冠病毒样本来源于山西省疾病预防控制中心(CDC))。对这些样本分别采用本发明实施例4的试剂盒(不使用试剂盒中的样本处理液对病毒样本进行处理，以证明本申请试剂盒本身的优势)，按照实施例3的方法(同理，不进行实施例5的样本处理操作)进行检测。同时，用qPCR核酸检测试剂盒(上海伯杰医疗科技有限公司，2019新型冠状病毒(ORF1ab/N基因)核酸检测试剂盒)进行同步检测，比对两种试剂盒的效果。

表11样本的制备和反应体系(N基因)

表12两个试剂盒结果分析

注：+为阳性、+/-为疑似、-为阴性。

由表12结果可知，qPCR试剂盒共检出5例阳性样本，4例疑似样本，而本试剂盒共检出7例阳性样本，2例疑似样本，本试剂盒检出效果优于qPCR试剂盒。由表11可知，qPCR试剂盒所用样本需要提取浓缩，本试剂盒样本可94℃，10min处理后直接使用，操作更方便；本试剂盒25μL体系加样量1μL，其浓度稀释了25倍，而qPCR试剂盒20μL体系加样量5μL，其浓度仅稀释了4倍，计算qPCR试剂盒所加模板样本较本试剂盒所加模板样本的浓度高6.25倍；另外，qPCR试剂盒经过RNA提取，样本中病毒的RNA被浓缩了20倍(1000μL÷50μL＝20倍)，如果考虑RNA提取会损耗，最大效率仅有80％，则RNA被浓缩了20x80％＝16倍。而本发明是从病毒样本原液1000μL中仅取1μL，未经浓缩。计算qPCR试剂盒原始样本中病毒RNA浓缩16倍+模板浓度高出6.25倍计算，两者合计共比本试剂盒的病毒样本的加样浓度高出6.25x16＝100倍。但是，本发明病毒核酸扩增方法虽然所用病毒核酸的浓度比qPCR试剂盒低100倍，但是检测效果反而比qPCR试剂盒的要更好，由此可知，本发明试剂盒比qPCR试剂盒的灵敏度高出至少100倍。结论是本发明试剂盒与qPCR试剂盒相比，具有样本量少，时间短，设备简单，成本低，灵敏度高，效果好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州缔园生物技术有限公司

<120> 一种新型冠状病毒的病毒样本处理液和处理方法及检测病毒的快速恒温反转录扩增试剂盒

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 217

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggctactac cgaagagcta ccagacgaat tcgtggtggt gacggtaaaa tgaaagatct 60

cagtccaaga tggtatttct actacctagg aactgggcca gaagctggac ttccctatgg 120

tgctaacaaa gacggcatca tatgggttgc aactgaggga gccttgaata caccaaaaga 180

tcacattggc acccgcaatc ctgctaacaa tgctgca 217

<210> 2

<211> 289

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccagatgag gatgaagaag aaggtgattg tgaagaagaa gagtttgagc catcaactca 60

atatgagtat ggtactgaag atgattacca aggtaaacct ttggaatttg gtgccacttc 120

tgctgctctt caacctgaag aagagcaaga agaagattgg ttagatgatg atagtcaaca 180

aactgttggt caacaagacg gcagtgagga caatcagaca actactattc aaacaattgt 240

tgaggttcaa cctcaattag agatggaact tacaccagtt gttcagact 289

<210> 3

<211> 1249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggaccccaa aatcagcgaa atgcaccccg cattacgttt ggtggaccct cagattcaac 60

tggcagtaac cagaatggag aacgcagtgg ggcgcgatca aaacaacgtc ggccccaagg 120

tttacccaat aatactgcgt cttggttcac cgctctcact caacatggca aggaagacct 180

taaattccct cgaggacaag gcgttccaat taacaccaat agcagtccag atgaccaaat 240

tggctactac cgaagagcta ccagacgaat tcgtggtggt gacggtaaaa tgaaagatct 300

cagtccaaga tggtatttct actacctagg aactgggcca gaagctggac ttccctatgg 360

tgctaacaaa gacggcatca tatgggttgc aactgaggga gccttgaata caccaaaaga 420

tcacattggc acccgcaatc ctgctaacaa tgctgcaatc gtgctacaac ttcctcaagg 480

aacaacattg ccaaaaggct tctacgcaga agggagcaga ggcggcagtc aagcctcttc 540

tcgttcctca tcacgtagtc gcaacagttc aagaaattca actccaggca gcagtagggg 600

aacttctcct gctagaatgg ctggcaatgg cggtgatgct gctcttgctt tgctgctgct 660

tgacagattg aaccagcttg agagcaaaat gtctggtaaa ggccaacaac aacaaggcca 720

aactgtcact aagaaatctg ctgctgaggc ttctaagaag cctcggcaaa aacgtactgc 780

cactaaagca tacaatgtaa cacaagcttt cggcagacgt ggtccagaac aaacccaagg 840

aaattttggg gaccaggaac taatcagaca aggaactgat tacaaacatt ggccgcaaat 900

tgcacaattt gcccccagcg cttcagcgtt cttcggaatg tcgcgcattg gcatggaagt 960

cacaccttcg ggaacgtggt tgacctacac aggtgccatc aaattggatg acaaagatcc 1020

aaatttcaaa gatcaagtca ttttgctgaa taagcatatt gacgcataca aaacattccc 1080

accaacagag cctaaaaagg acaaaaagaa gaaggctgat gaaactcaag ccttaccgca 1140

gagacagaag aaacagcaaa ctgtgactct tcttcctgct gcagatttgg atgatttctc 1200

caaacaattg caacaatcca tgagcagtgc tgactcaact caggcctaa 1249

<210> 4

<211> 647

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgagttcgcc tgtgttgtgg cagatgctgt cataaaaact ttgcaaccag tatctgaatt 60

acttacacca ctgggcattg atttagatga gtggagtatg gctacatact acttatttga 120

tgagtctggt gagtttaaat tggcttcaca tatgtattgt tctttttacc ctccagatga 180

ggatgaagaa gaaggtgatt gtgaagaaga agagtttgag ccatcaactc aatatgagta 240

tggtactgaa gatgattacc aaggtaaacc tttggaattt ggtgccactt ctgctgctct 300

tcaacctgaa gaagagcaag aagaagattg gttagatgat gatagtcaac aaactgttgg 360

tcaacaagac ggcagtgagg acaatcagac aactactatt caaacaattg ttgaggttca 420

acctcaatta gagatggaac ttacaccagt tgttcagact attgaagtga atagttttag 480

tggttattta aaacttactg acaatgtata cattaaaaat gcagacattg tggaagaagc 540

taaaaaggta aaaccaacag tggttgttaa tgcagccaat gtttacctta aacatggagg 600

aggtgttgca ggagccttaa ataaggctac taacaatgcc atgcaag 647

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggctactac cgaagagct 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcagcattg ttagcaggat 20

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tctggcccag ttcctaggta gtgacgaatt cgtggtggtg a 41

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agacggcatc atatgggttg cagcgggtgc caatgtgatc 40

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggactgaga tctttcattt taccg 25

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actgagggag ccttgaatac a 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tccagatgag gatgaagaag a 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agtctgaaca actggtgtaa g 21

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agagcagcag aagtggcaca ggtgattgtg aagaagaaga g 41

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcaacctgaa gaagagcaag aactgattgt cctcactgcc 40

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctcatattga gttgatggct ca 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acaaactgtt ggtcaacaag ac 22

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tggaccccaa aatcagcg 18

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttaggcctga gttgagtcag ca 22

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgagttcgcc tgtgttgtgg 20

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cttgcatggc attgttagta gcc 23

Claims

1.一种新型冠状病毒的病毒样本处理液，其特征在于，所述病毒样本处理液为终浓度为0.1～1M的盐酸胍水溶液或吐温-20的终质量百分含量为0.01％～0.1％的0.1×TE缓冲液。

2.一种基于权利要求1所述病毒样本处理液的新型冠状病毒的病毒样本的处理方法，包括以下步骤：

或，

3.一种基于权利要求1所述病毒样本处理液的检测新型冠状病毒的快速恒温反转录扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一引物组和/或第二引物组、权利要求1所述病毒样本处理液、扩增反应液、阳性对照和阴性对照；

所述阳性对照包括含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列或含核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示序列的载体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第一引物组包括核苷酸序列如SEQID NO.5～10所示的引物。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第二引物组包括核苷酸序列如SEQID NO.11～16所示的引物。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液包括WarmStart DNA聚合酶、WarmStart RTx反转录酶、pH指示剂、缓冲液和dNTP。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括含核苷酸序列如SEQID NO.3所示序列或含核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示序列的载体。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述载体包括pUC-T载体。

9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照包括0.1×TE缓冲液。

10.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，每10μL快速恒温反转录扩增的反应体系包括：第一引物组和/或第二引物组共1μL、扩增反应液5μL、水2μL和阳性对照或阴性对照或用权利要求1所述病毒样本处理液处理后待测样本2μL。