JPH07163397A - 複増幅反応の同時観測および分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、複数の核酸増幅反応を同時に測定
するための装置を提供することを目的とする。 【構成】 本発明による核酸増幅反応測定装置は、複数
の核酸増幅反応を同時的に測定するために：複数の窪み
が形成された熱伝導部材を含むサーマルサイクラ；およ
び前記窪みから輻射される光を同時に検出するように配
置されるセンサーを有して構成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ）の増幅の検出、および更に特定的には複数核酸増
幅反応の同時的、実時間観測に関するものである。本発
明は、１種以上の混合物中に与えられる標的核酸の出発
濃度の定量のため、および反応動力学に対する増幅反応
条件の影響の観測のための、蓄積データの使用方法にも
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】核酸増幅検出のための種々の方法が知ら
れている。例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にお
ける出発ＤＮＡテンプレート数を定量する種々のアッセ
イが知られている。それらのいくつかは、温度の熱サイ
クル終了時のＰＣＲ生成物の測定およびこのレベルを出
発ＤＮＡ濃度に関連づけることを含む。このような終点
分析は、ＰＣＲを使用して典型的に行われてきたように
標的ＤＮＡの存在または非存在を明らかにするが、一般
的にＤＮＡ標的に出発数の使用できる測定を与えない。

【０００３】別のアッセイ法は、温度サイクル前にテン
プレートが既知濃度をもって反応混合物に添加される競
合増幅生成物の使用を含む。競合生成物のプロトコール
においては、増幅物の分別量がゲル電気泳動により試験
される。標的特異的ＰＣＲ生成物および競合ＰＣＲ生成
物の相対量が測定され、この比が標的テンプレートの出
発数を計算するために使用される。標的特異的生成物の
競合物特異的生成物に対する比が大きいほど、出発ＤＮ
Ａ濃度が高い。

【０００４】ハイブリダイゼーションまたはゲル電気泳
動等の“下流側”処理の要求に加えて、前記別のアッセ
イ法はダイナミックレンジ（すなわち、標的核酸濃度範
囲に対する感度）において更に制限されている。競合ア
ッセイでは、標的または添加される競合ＤＮＡのいずれ
かが、他方に対して大過剰量である場合に、テンプレー
ト濃度差に対する感度は信頼性が下がる。最終生成物量
を測定するアッセイのダイナミックレンジは、ある反応
が選択されたサイクル数において生成物のプラトー水準
に達してしまう場合も起こりうる点で制限されるであろ
う。これらの反応では出発テンプレート水準の差は、充
分に反映されない。更に、測定される生成物量の小さい
差は、出発テンプレート濃度の広範囲に変化する評価を
生じ、変化しうる反応条件、サンプリング上のゆらぎ、
または阻害剤の存在等によるかなりの精度低下をもたら
す。

【０００５】ＰＣＲ条件の至適化は、典型的にはＰＣＲ
生成物の最終収率および特異性に対する異なる条件の影
響を測定することにより行われる。増幅に亘って情報を
得るためには、多くの複製した試料をサーマルサイクラ
に設置し、それぞれを異なる温度サイクルにおいてサー
マルサイクラから取り出せるようにする。次いで、取り
出した試験管をゲル電気泳動により、サイクル数の関数
として分析する。この記述から明らかなように、このよ
うな至適化は、後の電気泳動分析に加えて、多くの試料
操作工程を必要とする点において、複雑でありかつ時間
を必要とする。

【０００６】大規模（例えば、臨床的）使用のためのい
ずれのアッセイも、信頼性を有するのみならず、自動化
を促進するために極力単純化されなければならない。従
って、例えば試料の出発濃度の定量および反応条件の至
適化のために使用することができ、信頼性ある結果を与
え、かつ自動化に好適な、核酸増幅を示すデータを収集
するための装置および方法が必要とされている。

【０００７】本発明の目的は、複数増幅反応混合物の測
定を実時間で同時に可能とし、而して従来技術の問題点
および不都合を解消しうる核酸増幅検出方法および装置
を提供することにある。

【０００８】この目的は、本発明によれば、複数の窪み
が形成された熱伝導部材を含むサーマルサイクラ；およ
び前記窪みから輻射される光を同時に検出するように配
置されるセンサーを有してなる装置を提供することによ
り達成される。

【０００９】好ましい実施態様において、本発明による
該装置は、更に前記サーマルサイクラと結合され、前記
熱伝導部材の前記複数の窪みが形成された部分に光を分
配するように配置された光源を有してなる。

【００１０】本発明による装置の別の好ましい実施態様
において、サーマルサイクラの熱伝導部材の窪みは、核
酸増幅反応混合物を入れる反応容器を収容すべく前記部
材表面を通して形成され、および前記センサーは、前記
反応容器が熱伝導部材の窪みに配置された場合に前記表
面および反応容器の像を形成するように、前記熱伝導部
材と光学的に結合される像形成装置である。

【００１１】本発明による装置の更に好ましい実施態様
において、サーマルサイクラの前記熱伝導部材は、それ
に形成され、核酸増幅反応混合物を受容するために適合
する複数の窪みを有し、かつ該装置は、前記熱伝導部材
の上方に配置され、前記サーマルサイクラに結合される
ハウジング；前記ハウジング内で前記窪みに向けて光を
放射すべく配置された光源；および前記ハウジング内の
前記窪みの上方に配置された光二色性鏡であって、第１
の波長を有する光について透過性であり、該第１の波長
とは異なる第２の波長の光を反射する光二色性鏡を有し
てなり；ならびに前記センサーは、前記光二色性鏡の第
２の面にて反射される光を受光すべく配置されてなる。

【００１２】本発明による装置の更に好ましい実施態様
において、サーマルサイクラの前記熱伝導部材は、それ
に形成され、核酸増幅反応混合物を受容するために適合
する複数の窪みを有し、かつ該装置は、前記熱伝導部材
の上方に配置され、前記サーマルサイクラに結合される
ハウジング；前記ハウジング内に光放射すべく配置され
た光源；前記ハウジング内に配置されたセンサー；およ
び前記ハウジング内の前記窪みの上方に配置された光二
色性鏡であって、励起光源から生成される光波長に対応
する波長を有する光について透過性であり、前記核酸増
幅混合物が熱伝導部材に形成された窪みの一つに配置さ
れ前記励起光源からの光に曝された場合に蛍光性結合試
薬を含む核酸増幅混合物から放射される蛍光の波長に対
応する波長の光を反射する光二色性鏡を有してなり、前
記鏡が、前記窪みと前記センサーとの間に光路を形成す
べく配向されてなる。

【００１３】本発明の装置の一実施態様において、各増
幅反応混合物に最初に導入された検出可能な蛍光色素の
蛍光の増大を使用して、複数のポリメラーゼ連鎖反応の
それぞれの二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の蓄積を、ＣＣ
Ｄ−カメラが同時に検出する。蛍光は、二重鎖ＤＮＡに
結合する蛍光色素から生じる。この実施態様は、光ファ
イバーの必要性、およびファイバー光学系を個々の反応
混合物と結合することに伴う問題点を有利に除去するも
のである。

【００１４】本発明の別の側面によれば、サーマルサイ
クラにおいて、該装置の一部を形成し励起光が光源から
増幅される複数の反応混合物に向けて照射される光学系
は、励起光を反応混合物に対して均一な様式で与えるよ
うに配置されている。すなわち、該光学系は、励起光が
サーマルサイクラの熱交換器に亘って基本的に均一に分
配され、それぞれの反応混合物が本質的に当量の励起光
を受光することを可能にする。

【００１５】この装置によれば、蛍光データを収集し、
標的核酸配列の初期量を定量することが可能である。定
量の好適な方法において、複数の増幅反応混合物が与え
られる。一つの増幅反応混合物は、未知濃度の特異的核
酸配列を有する。他の反応混合物は、同じ特異的核酸配
列を異なるが既知濃度で含む。既知および未知の核酸濃
度の増幅核酸反応混合物は、複数のサイクルについて並
行して熱サイクルに付される。反応混合物から輻射され
る蛍光が測定され、実時間で各反応混合物がある強度を
もって蛍光を発するために必要なサイクル数が決定され
る。未知核酸濃度の混合物についてその値に達するため
に必要とされるサイクル数が、既知核酸濃度の混合物に
ついてその値に達するために必要とされるサイクル数と
比較され、前記未知濃度の混合物中の前記特異的核酸配
列の初期濃度が得られる。

【００１６】増幅を実時間にて測定することができるた
め、少なくとも６次の強度の標的核酸濃度範囲の感度が
実現可能であることが見いだされた。加えて、複合ゲノ
ムＤＮＡの４０，０００細胞当量の背景において１００
ｓｓＤＮＡテンプレート程度の少量についての感度が得
られた。

【００１７】本発明は、更に増幅動力学に対する異なる
反応条件の効果を信頼性を持って分析するための、蛍光
データの処理方法を有利に提供する。複数の増幅が同時
に測定され得るため、多くの異なる反応変数の効果を迅
速に評価しうる。このことは、最適の収率および効率を
得るべく増幅反応を至適化するために有用である。

【００１８】実時間測定は、正確な測定可能性に対して
大きく影響しうるＰＣＲの部分阻害の場合を検出すると
いう優位点をも与える。図１６に示したように、これら
の場合は、それらの反応プロフィルによって検出可能で
あり、而してこれらの試料は再精製および再試験が可能
である。更に、試料中に核酸標的が含まれないという誤
った結論を導きうる全体が阻害される場合は、標的ＤＮ
Ａが内場合のＰＣＲであっても、所定の充分なサイクル
数では非特異的増幅生成物による蛍光が生じることから
検知可能である。期待されるサイクル数でもそのような
蛍光が観察されない場合には、阻害剤の存在が推定され
る。

【００１９】本発明の更なる優位点は、増幅の最終時点
での多くの反応生成物の収率を測定するための時間を要
する操作の必要性を除くことができる点にある。従っ
て、後のハイブリダイゼーションまたはゲル電気泳動等
の必要性が除かれる。

【００２０】上述したように、図３および図４に例示し
た本発明の非−ファイバー光学系の実施態様は多くの優
位点を有するが、好ましくはビデオカメラであるセンサ
ーは、視差を最小にするために熱伝導部材内の反応混合
物からかなりの距離をもって配置される。これに対応し
て光源も、均一な照度を与え、かつセンサーの映像との
干渉を避けるために、熱伝導部材内の反応混合物から有
為な間隔が置かれる。この配置は、一般的にはかなりの
空間を必要とするか、あるいは装置を設置するための完
全な暗室を必要とするであろう。しかしながら、多くの
臨床検査所は暗室を持たず、あるいは暗室を構築するた
めの余剰のスペースを持たない。臨床検査所において容
易に見いだされるＸ−線室は、励起光および蛍光輻射の
光学経路のための好適な環境を提供するが、このような
室の空間は、基本的にＸ−線装置により完全に占められ
ている。

【００２１】本発明の更なる実施態様によれば、励起光
および蛍光検知の構成は装置内に組み込まれ、励起光お
よび蛍光輻射の光学経路が畳み込まれて光学経路を光気
密環境中に閉じこめて装置をより小型化かつ単純化しう
る。このようにして該装置は、暗室を必要とせずに実験
台上で容易に使用しうる。

【００２２】この実施態様によれば、複数核酸の測定装
置は、核酸増幅反応物を収容するための複数の窪みが形
成された熱伝導部材を有するサーマルサイクラを同時に
含む。ハウジングは、光気密チェンバを形成するように
熱伝導部材の上方に配置される。光源は、それに露出さ
れて増幅反応物を励起させるべく、ハウジングチェンバ
内に光を輻射するように配置される。該ハウジング内の
窪みの上方に光二色性鏡が配置される。該光二色性鏡
は、第１の波長の光について透過性であり、該第１の波
長とは異なる第２の波長の光について反射性である。好
ましい実施態様において、該鏡は低透過光二色性鏡であ
る。該鏡は、光源により生成される光の波長に対応する
波長を有する光について透明または透過性であり、かつ
励起光に曝された場合に増幅反応物により輻射される蛍
光の波長に対応する波長を有する光について反射性であ
るように構築される。他の選択肢として、高透過光二色
性鏡が使用され得る。その場合には、該鏡は、光源によ
り生成される光の波長に対応する波長を有する光につい
て反射性であり、かつ励起光に曝された場合に増幅反応
物により輻射される蛍光の波長に対応する波長を有する
光について透明または透過性である。センサーも、増幅
混合物から輻射される蛍光を検出すべくハウジング内に
配置される。低透過光二色性鏡配置の場合には、該セン
サーは、鏡に反射される蛍光を受光するように配設され
る。しかしながら、高透過配置の場合には、センサーお
よび光源の位置が逆になる。

【００２３】この配置を用いて、励起光源およびセンサ
ーは、熱伝導部材に比較的に近接して、例えば６〜１２
インチで設置され得、これによって励起光源および蛍光
輻射の光学経路が、比較的小さい空間を要することを可
能とする。この配置が小型であることは、サーマルサイ
クラに結合され、励起および増幅混合物の輻射光のため
の光気密チェンバまたは暗室を有効に形成するハウジン
グ内に光学経路を収容することを容易にする。このよう
にして、該装置は暗室を提供することなくほとんどどこ
ででも使用され得る。該ハウジングは、該装置と共に使
用されるモニターならびにサーマルサイクラおよびコン
ピュータに付属するＬＥＤから輻射される光等の外部光
が、センサーに到達することを有効に防止する。

【００２４】センサーを、核酸増幅反応混合物が配置さ
れる熱伝導部材に対して近接して配設させることの優位
点は、センサーの感度の要求を低減することができる点
にある。該センサーは、熱伝導部材に対してより近くに
動かされるため、反応混合物から輻射され、センサーに
到達する光の強度が上昇する。従って、ＣＣＤカメラ型
のセンサーを使用する場合には、好ましい実施態様に示
したように、感度の要求が高い場合に一般に必要とされ
る比較的高価で冷却されたＣＣＤカメラに代えて、許容
できる低い応答性および低い熱ノイズを有するより低価
格のＣＣＤカメラを用い得る。

【００２５】反応混合物窪みに対しての光源の近接も、
優位点を与える。光源を反応混合物窪みの近くに移動す
ることによって、窪みに配置される反応混合物に達する
励起光強度が上昇し、これによって蛍光輻射強度が上昇
する。このようにして、標的核酸のより低濃度も熱サイ
クルのより早い段階で検出可能である。更に、増大され
た蛍光の一部を、より狭いバンド透過をもったフィルタ
ーを使用することにより、より良い波長分解に換えるこ
とができる。このようにして、広範囲の波長が検出可能
であり、かつかなり近接した波長による標識が識別可能
である。

【００２６】この実施態様の別の側面によれば、反応混
合物を励起光に間欠的に露出するために、光源にシャッ
ターが結合される。好ましくは、該シャッターは一般に
最大の蛍光が示されるアニール化／伸長相の間に混合物
が励起光に曝されるように時間調節される。この構成
は、熱伝導部材と近接するためにかなり強烈である励起
光に対する混合物または試料の露出を低減する。他の波
長でもあり得るが典型的にはＵＶ光である励起光に対す
る試料の露出を最小化することにより、該シャッターは
試料の安定性を向上してこの系の能力を改善する。さも
なければ、強い励起光は一般にブリーチングとして知ら
れている試料の光不活性化を招きうる。

【００２７】この実施態様の更に別の側面によれば、対
物レンズが光二色性鏡とセンサーとの間に配設され、そ
れらの間で交差する視差が最小化される。

【００２８】本発明の更なる優位点は、熱伝導部材の直
上に配設され、実際に増幅混合物を入れたチューブの上
に置かれる加熱窓に関する。この加熱窓は、反応チュー
ブからの熱損失を防止し、混合物の所望の熱サイクル温
度様式を維持するために寄与し、その一方でそれを光が
透過することを許容する。好ましい実施態様によれば、
該加熱窓は、一般に約９５−１０５℃である変性温度に
維持される。

【００２９】フィルターまたはフィルターの円板は、セ
ンサーが異なる波長の光を選択的に検出可能となるよう
にセンサーと結合される。また、該フィルターは励起光
がセンサーに達することを防止しうる。フィルター円板
上に配置された複数のフィルターを使用することによ
り、例えば異なる均質ヌクレアーゼプローブ（下記）か
らの異なる波長の輻射が検出可能となるように、フィル
ターを特定のアニール化／伸長相の間に容易に交換する
ことができる。異なる輻射波長、すなわち所定の試料中
の核酸配列が検出可能であり、従って、標的配列の存在
が測定されうる。

【００３０】更に、この系の高い感度は、ここに参考と
して取り入れるＧｅｌｆａｎｄらの米国特許５，２１
０，０１５号に記載されているような均質アッセイ系を
使用して生成される蛍光の、極めて高精度の検出を可能
とする。このアッセイ系は、ハイブリッド化プローブ標
的二重鎖からアニール化した標識オリゴヌクレオチドを
切断し、検出のための標識オリゴヌクレオチド断片を放
出する核酸ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性
を使用する。このアッセイは、同じ増幅反応混合物中の
複数の核酸標的を検出するために有用である。そのよう
なプローブは、非特異性増幅生成物が存在する場合に、
標的核酸の存在を確認する場合に有用である。

【００３１】該均質アッセイは、その蛍光が通常、蛍光
エネルギー移動またはＦＥＴによって第２水準に冷却さ
れるプローブを使用する。ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌ
クレアーゼ活性は、プローブおよびクェンチャから蛍光
物質を分離し、ＦＥＴを崩壊させ蛍光を保存する。光二
色性鏡配置を取り入れた本発明の測定装置を使用して見
ることができるであろうこの変化の検出は、なんらの処
理も要しない。異なる蛍光性物質で標識された場合にこ
れらのプローブは、複数の核酸標的を検出するために使
用され得る。

【００３２】この明細書において下記の用語が使用され
る。付した定義は、開示を目的とするもので、本発明を
何ら限定するものではない。

【００３３】「標的核酸配列」なる用語は、増幅される
べき精製または部分精製核酸を指す。

【００３４】「増幅反応混合物」なる用語は、標的核酸
の増幅に使用される種々の試薬を含む水溶液を指す。こ
れらは、酵素、緩衝水溶液、塩類、増幅プライマー、標
的核酸、およびヌクレオシド三リン酸を含む。内容に依
存して該混合物は完全または不完全増幅反応混合物であ
り得る。

【００３５】「プライマー」なる用語は、プライマー伸
長生成物の合成が開始される条件下、すなわち、適切な
緩衝溶液（ｐＨ、イオン強度、補因子等）中かつ適当な
温度にて核酸テンプレートにアニール化された場合にＤ
ＮＡ合成の開始点として作用しうるオリゴヌクレオチド
を指す。

【００３６】「テンプレート」なる用語は、プライマー
がアニール化する標的核酸配列の部分を指す。

【００３７】上述したことは、先行技術の欠点および本
発明の優位点の概略的記述である。

【００３８】本発明の他の特徴、優位点および実施態様
は、以下の記述、添付する図面、および特許請求の範囲
から当業者には明らかであろう。

【００３９】図１は、ＰＣＲの連続的実時間観測を表す
グラフである。

【００４０】図２は、図１の１Ａ線部分の拡大図であ
る。

【００４１】図３は、本発明の原理に基づく増幅装置の
概略構成図である。

【００４２】図４は、サーマルサイクラの熱交換ブロッ
クおよびそのカバーを示すための図１のサーマルサイク
ラの断面拡大図である。

【００４３】図５は、図３に示す装置のブロックダイア
グラムである。

【００４４】図６は、複数の反応混合物のデジタル化し
た像を示す写真図である。

【００４５】図７は、単一の蛍光値を得るために平均化
される選択された画素配列を例示する図である。

【００４６】図８は、周期毎の蛍光測定のドリフトを示
すグラフである。

【００４７】図９は、複数の蛍光プロフィルを示すグラ
フである。

【００４８】図１０は、正規化した後の図９の蛍光値を
示すグラフである。

【００４９】図１１は、図９および図１０のプロフィル
に示される増幅生成物のゲル電気泳動を示す写真図であ
る。

【００５０】図１２は、出発テンプレートコピー数の対
数と、選択された蛍光値に達するに要するサイクル数と
の関係を示すグラフである。

【００５１】図１３〜図１６は、それぞれ異なった反応
条件の効果を示す蛍光プロフィルのグラフである。

【００５２】図１７〜図１９は、蛍光値を得るための工
程の簡略化されたフローチャートである。

【００５３】図２０は、本発明の増幅装置の実施態様と
して励起光および輻射／蛍光検出器の配置を示す部分断
面図である。

【００５４】図２１は、図２０の励起光および輻射／蛍
光検出器の配置を示す拡大した部分断面図である。

【００５５】図２２は、本発明の原理に従って使用され
る光二色性鏡の例の透過性対波長曲線を示すグラフであ
る。

【００５６】図２３は、本発明に基ずく反応混合物収容
容器上部の加熱窓の平面図である。

【００５７】本発明は、核酸増幅ならびに、増幅生成物
の検出、測定および定量に関する。本発明の増幅データ
の収集および処理系の理解を容易にするために、本発明
と組み合わせて使用するために特に好ましい核酸増幅工
程の要約を、最初に論じる。

【００５８】当業者は、本発明が核酸の二重鎖形態の増
幅を要することを認識するであろう。核酸増幅のための
周知の方法が存在する。増幅手段は臨界的なものではな
く、本発明は核酸二重鎖が形成される任意の方法を用い
ても機能する。種々の方法が、ここに参考として取り入
れるＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２９０−２９
３，１９９０年４月に検討されている。それらは、限定
されるものではないが、ＰＣＲ、ＬＣＲ、Ｑβおよび３
ＳＲを含む。３ＳＲおよびＱβは、温度サイクルを含ま
ないが、それらの増幅結果は以下に議論される蛍光検出
装置によって測定され得、本発明の原理に従って分析さ
れうる。それぞれの方法の概略を以下に記す。

【００５９】ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、ＤＮＡの加熱変
性、増幅されるべきＤＮＡ分節の両端を決める２種のオ
リゴヌクレオチドプライマーの配列へのアニール化、お
よびＤＮＡポリメラーゼを用いるアニール化プライマー
の伸長の反復サイクルを含む。該２個のプライマーは、
標的配列の反対の鎖にハイブリッドし、ポリメラーゼに
よるＤＮＡ合成がプライマー間の領域を交差して進行す
るように配向し、引き続くそれぞれのサイクルは、先行
するサイクルで合成されたＤＮＡの量を基本的に二倍に
する。このことは、特定の標的断片を、ｎをサイクル数
として約２ｎの速度で指数的に蓄積する。この技術の完
全な総説は、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎ
ｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅ
ｒｌｉｃｈＨ．Ａ．編，Ｓｔｃｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９に見いだされる。

【００６０】発明の本質的側面ではないが、本発明との
関連においてＰＣＲが使用される場合には、Ｔａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼが好ましい。熱安定性ポリメラーゼで
あるＴａｑポリメラーゼは、高温度で活性である。Ｔａ
ｑの調製方法は、参考として取り入れる米国特許第４，
８８９，８１８号に記述されている。しかしながら、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．
ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩまたはＥ．ｃｏｌｉクレ
ナウ断片等の非熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに加えて、
Ｔｈｅｒｍｕｓ種または非Ｔｈｅｒｍｕｓ種（例えばＴ
ｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ若しくはＴｈｅ
ｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）から単離される別
の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼもＰＣＲに使用され得
る。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの提供方法は、ここに
参考として取り入れる国際特許出願公開番号ＷＯ−Ａ−
９１／０９９５０およびＷＯ−Ａ−９２／０３５５６に
与えられている。

【００６１】リガーゼ連鎖反応は、ここに参考として取
り入れる国際特許出願公開番号ＷＯ８９／０９８３５に
記述されている。該方法は、標的核酸にアニール化する
オリゴヌクレオチド分節を連結するためのリガーゼの使
用を含む。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、元の標的分
子の増幅を生じ、生成物ＤＮＡの数百万の複写物を与え
うる。従って、ＬＣＲは二重鎖ＤＮＡの正味の増加を生
じる。本発明の検出方法は、ＰＣＲに加えて、ＬＣＲに
も適用できる。ＬＣＲは、オリゴヌクレオチドプローブ
等の生成物ＤＮＡの検出手段を必要とする。増幅生成物
の検出のための開示方法と組み合わせて使用される場合
には、ＬＣＲの結果は直ちに検出される。

【００６２】他の増幅スキーム、Ｑβレプリカーゼは、
ＲＮＡバクテリオファージＱβ由来のレプリカーゼを利
用する。この増幅スキームにおいては、標的配列に対し
て特異的な配列を有する修飾組換えバクテリオファージ
ゲノムが、最初に試験されるべき核酸に連結される。バ
クテリオファージプローブと試料中の核酸との間に形成
される二重鎖を富有化した後に、Ｑβレプリカーゼが添
加され、これが保持される組換えゲノムを認識して大量
の複写物を生成し始める。

【００６３】Ｑβ系は、プライマー配列を必要とせず、
ＰＣＲおよびＬＣＲ増幅系のような熱変性が無い。該反
応は、典型的には３７℃の一定温度で起こる。好ましい
テンプレートは、Ｑβレプリカーゼの基質である中間変
異体−１ ＲＮＡである。この系の使用によって、テン
プレートのかなりな増大が達成される。この増幅系の総
説は、国際特許出願公開番号ＷＯ８７／０６２７０およ
びＬｉｚａｒｄｉらの１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ ６：１１９７−１２０２に見いだされる。

【００６４】３ＳＲ系は、インビトロ転写に基づく増幅
系の変法である。転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）は、標
的鎖のＤＮＡ複写物を生成させるための標的鎖に対する
相補的配列に加えて、プロモーター配列をコードするプ
ライマーの使用、およびＲＮＡポリメラーゼを用いるＤ
ＮＡ複写物からのＲＮＡ複写物の生成を含む。例えば、
米国特許第４，６８３，２０２号の例９Ｂおよびヨーロ
ッパ特許出願公開ＥＰ−Ａ−０３１０，２９９を参照。
３ＳＲ系は、標的核酸の等温的複写を行うために３種類
の酵素を使用する。

【００６５】この系は、Ｔ７ ＲＮＡ ＤＮＡプライマ
ーが結合する単鎖ＲＮＡ標的から開始される。逆転写酵
素を用いてプライマーを伸長するために、ｃＤＮＡが形
成され、ＲＮＡｓｅＨが、ｃＤＮＡを異種二重鎖から遊
離する。第２のプライマーがｃＤＮＡに結合し、逆転写
酵素処理によって二重鎖ｃＤＮＡが形成される。プライ
マーの一方（または両方）は、例えばＴ７ ＲＮＡポリ
メラーゼプロモーター等のプロモーターをコードし、而
して二重鎖ｃＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのための転
写テンプレートである。

【００６６】転写適格ｃＤＮＡは、元の標的のアンチセ
ンスＲＮＡ複写物を生じる。次いで転写物は、逆転写酵
素によって、場合により逆転した反復配向において両端
に二重鎖プロモーターを含む二重鎖ｃＤＮＡに変換され
る。これらのＤＮＡは、サイクル内に再度は入り込みう
るＲＮＡを生じ得る。３ＳＲ系のより完全な記述は、両
者ともここに参考として取り入れるＧｕａｔｅｌｌｉ
ら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１９７８、およびヨーロ
ッパ特許出願公開番号ＥＰ−Ａ−０３２９，８２２に見
いだされる。ＴＡＳ系も、ここに参考として取り入れる
Ｉｎｎｉｓら編、１９９０，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ中にＧｉｎｇｅｒａｓらによって記述されている。

【００６７】本発明によれば、核酸増幅は、反応混合物
中に与えられるインターカレーティング蛍光色素等の蛍
光色素が、該混合物が２つの温度（温度サイクル）の間
の周期におけるそれぞれアニール化／伸長相において、
二重鎖核酸と結合した場合に輻射される蛍光を検出する
ことによって測定される。

【００６８】蛍光の増大は、標的核酸の正の増幅を示
す。適当なインターカレーティング試薬または色素は、
限定されるものではないが、エチジウムブロマイド、プ
ロピジウムブロマイド、プロフラビン、アクリジンオレ
ンジ、アクリフラビン、フルオロクマニン、エリプチシ
ン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、
クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニ
ウムポリピリジル、アントラマイシン、メチジウムブロ
マイド、２−［２−（４−ヒドロキシフェニル）−６−
ベンズイミダゾール−６−（１−メチル−４−ピペラジ
ル）ベンズイミダゾールトリハイドロクロライド等を含
む。

【００６９】米国特許第５，２１０，０１５号に開示さ
れる５’−３’ヌクレアーゼアッセイでの使用に好適な
先行技術に開示される蛍光剤およびＤＮＡ結合発色団
は、本発明においても有用である。好適な供与体蛍光剤
および消光剤は、供与体蛍光剤の輻射スペクトルが消光
剤の吸収スペクトルと重複するように選択される。理想
的には、蛍光剤は、散乱される励起光による干渉を最小
化するために高いストークスシフト（最大吸収波長と最
大輻射波長との間の大きい差）を有するべきである。

【００７０】この分野で周知の好ましい標識は、限定さ
れるものではないが、フルオロセインならびにＦＡＭ、
ＨＥＸ、ＴＥＴおよびＪＯＥ等の誘導体；ローダミンな
らびにＴｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＲＯＸおよびＴＡＭＲＡ等
の誘導体；ルシフアーイエローならびに７−Ｍｅ_２Ｎ−
クマリン−４−アセテート、７−ＯＨ−４−ＣＨ_３−ク
マリン−３−アセテート、および７−ＮＨ_２−４−ＣＨ
_３−クマリン−３−アセテート（ＡＭＣＡ）等のクマリ
ン誘導体を含む。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｒ
ＯＸおよびＴＡＭＲＡは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、
ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏ
ｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により市販されて
いる。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄおよび他の多くの好適な化合
物は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎ
ｅ，ＯＲ）により市販されている。エネルギー供与体と
しての使用に好適であろう化学発光および生物発光化合
物の例は、ルミノール（アミノフタルヒドラジド）およ
び誘導体、ならびにルシフェラーゼを含む。

【００７１】図１を参照して、例えば９４℃および５０
℃の２つの温度の間の反応混合物の温度サイクルを含
む、単一のポリメラーゼ連鎖反応についてのＤＮＡ増幅
を示す蛍光トレースが表される。該反応混合物は、反応
の各アニール化／伸長相の間に二重鎖ＰＣＲ生成物にイ
ンターカレートまたは結合し、蛍光を発するインターカ
レーティング蛍光性ＤＮＡ結合色素であるエチジウムブ
ロマイド（ＥｔＢｒ）を含む。従って、得られる蛍光は
二重鎖ＤＮＡの増加と共に増大する。図１に示されるよ
うに、蛍光強度は、温度とは逆に上昇および下降する。
蛍光強度は、変性温度（９４℃）にて最小であり、アニ
ール化／伸長温度（５０℃）にて最大である。而して、
５０℃における蛍光強度は、二重鎖ＤＮＡの量の増大を
反映してサイクル数依存的な増大を示す。サーマルサイ
クラが３０サイクルを完了して、２５℃に戻された際
に、蛍光は、２５℃における最初の蛍光値の３倍以上で
ある最終値にまで増大した。他方において、変性温度に
おける蛍光最小値は、多分この温度ではＥｔＢｒが結合
するべきｄｓＤＮＡが存在しないため、顕著な増大を示
さない。

【００７２】米国特許出願番号０７／６９５，２０１に
開示されるように、このデータは光ファイバーおよび分
光蛍光測定装置を使用して得た。該光ファイバーは、反
応混合物を含み、サーマルサイクラの加熱／冷却ブロッ
ク内に配設されたチューブに直接に励起光を入力するた
めに使用された。同じ光ファイバーは、蛍光輻射に対応
する値を測定する分光蛍光測定装置に蛍光輻射を戻すた
めに使用された。この構成によって、図１のデータに示
されるように反応の進行中に増幅生成物の生成が測定さ
れ得る。結合試薬により生じる信号は、反応チューブを
開封することなく検出することができるため、信号を増
幅工程の前、途中および後に測定することができる。

【００７３】単一ＰＣＲの検出、および図１のデータを
提供する装置は、以下のように構成される：光ファイバ
ーアクセサリーを有するＳｐｅｘ−Ｆｌｕｏｌｏｇ−２
蛍光測定装置（Ｓｐｅｘ カタログ番号１９５０）を、
約３．４ｎｍのバンド幅をもって５００ｎｍの励起光を
輻射するように設定した。ＧＧ４３５ｎｍの遮断フィル
ター（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｓｔ Ｉｎｃ．から購入）
を、二次光を除くために使用した。輻射光を、１３．６
ｎｍのバンド幅をもって５７０ｎｍにて検出した。ＯＧ
５３０フィルター（５３０ｎｍで遮断）を、励起光を除
くために使用した。

【００７４】０．５ｍｌポリプロピレンチューブである
反応チューブには、６０ｎｇのヒト男性ＤＮＡを入れ
た。チューブの上端部を、光ファイバーケーブルを取り
付けるために切断した。光ファイバーケーブルを、反応
チューブの上端にエポキシにより接着した。輻射光を、
チューブ内のオイルの覆いを通して集光した。黒色の
“覆い”をチューブの周囲に設け、反応物をサーマルサ
イクラ内に配置した。サーマルサイクラを、９４℃およ
び５０℃にてそれぞれ１分間で３０サイクル、次いで２
５℃での連続インキュベートを行うようにプログラムし
た。蛍光測定装置およびサーマルサイクラを同時にスタ
ートさせた。蛍光測定装置のパラメータは：５秒間の積
分時間をもった時間に基づく走査；および光源強度の変
化に対して制御するために励起光信号に対して輻射信号
の比をとる。

【００７５】本発明によれば、複数増幅反応混合物の増
幅について、実時間で同時に測定するための装置が提供
される。各反応混合物は、標的核酸配列を含む。従っ
て、例えば４８個の反応チューブを保持しうる加熱およ
び冷却ブロックを有するサーマルサイクラ（例えば、Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓから商業的に入手可能なサーマルサイクラ）を
使用して、４８の増幅反応を行うことができ、４８のす
べての試料中のＰＣＲ生成物が、試料処理、チューブの
開放またはサイクル反応の中断等無しに同時に検出され
る。同時に測定される反応の数は、加熱および冷却ブロ
ックの収容能力のみによって制限される。従って、９６
穴の加熱および冷却ブロックを用いれば、９６の増幅反
応が測定され、増幅生成物が同時に検出される。上述し
た例の場合のように、下記に示す実施態様はＰＣＲとの
組み合わせ、およびいくつかの例で標的ＤＮＡ配列の増
幅を示す特定の蛍光結合試薬により生成される信号との
組み合わせにおいて記述されるが、これらの実施態様
は、上述のように要約され、ここに参考として取り入れ
るＧｅｌｆａｎｄらの米国特許第５，２１０，０１５号
に開示されている別の増幅工程または結合試薬を用いて
も実施できる。

【００７６】複数増幅反応混合物検出装置の第１の実施
態様において、適当な光学系は、励起光をサーマルサイ
クラに設置された複数反応チューブに供給し、かつ各チ
ューブからの輻射光を測定する。そのような光学系は、
温度サイクル中のすべてのＰＣＲチューブを測定する複
数の光ファイバーを含むことができる。各光ファイバー
は、例えばＰＣＲ温度ソークの時間枠の間（例えば、図
２に示されるａ−ｃ間等のアニール化／伸長の合間）に
おいて一時に一つの迅速な測定が可能であるから、反応
チューブからの蛍光を測定するために単一の蛍光測定装
置のみが必要とされる。そのような検出系が、特定のサ
ーマルサイクラ装置または反応容器に限定されるもので
はないことは、当業者には明らかであろう。

【００７７】増幅検出構造は、励起光および蛍光輻射を
伝達するために光ファイバー導線を含む。外部光による
蛍光検出への影響を防ぐために、反応ウエルまたはチュ
ーブが遮光されている限り、光ファイバー導線を含む
か、またはそれに取り付けられ得る任意の上部プレー
ト、チューブキャップ、または蓋体も好適である。本発
明の一実施態様において、反応チューブの蓋体は、光フ
ァイバーに適合させるために除去されうる。しかしなが
ら、透明または半透明のキャップを有する反応容器に使
用は、ケーブルをチューブ内に挿入する必要性を取り除
く。ケーブルを増幅反応成分と物理的に接触さずに光フ
ァイバーケーブルと適合させ得る反応チューブが望まし
いことは明らかであろう。

【００７８】図３を参照すると、複数標的核酸配列増幅
の同時実時間検出のための装置の更なる実施態様が示さ
れ、参照番号１０が付されている。この実施態様は、上
述した光入力および蛍光出力の光ファイバー導線の必要
性、ならびにそれに伴う光ファイバーと反応チューブと
の接続に関する問題点を有利に除去する。先に論じたよ
うに、装置１０は、単純化のために蛍光性結合試薬信号
生成剤を使用するＤＮＡ標的配列のＰＣＲ増幅と関連さ
せて説明されるが、そのような増幅工程、核酸または増
幅信号生成剤に限定することを意図するものではない。

【００７９】一般に装置１０は、反応チェンバーチュー
ブまたは容器２６（増幅されるべき核酸が予め付加され
る）を加熱および冷却するサーマルサイクラ１２、横方
向に設けられる励起光源またはランプ１４、像形成装置
１６（ＣＣＤカメラ１６ａ、カメラ制御部１６ｂおよび
冷却器１６ｃを含む）、ＩＴＥＸ Ｉｎｃ．から商業的
に入手可能なＰＣ ＶＩＳＩＯＮ ＰＬＵＳおよびＩＥ
ＥＥ４８８インターフェイスカード等のフレーム把持カ
ードを有するＰＣであり得るイメージプロセッサ２０を
含んでなる。これらの要素は、図５のブロックダイアグ
ラムに示されている。サーマルサイクラ１２は、好まし
い実施態様による構造において慣用のものであるが、サ
ーマルサイクラ１２のいくつかの特徴を、本発明の開示
の理解のために以下に示す。

【００８０】サーマルサイクラ１２は、反応チューブ２
６の加熱および冷却のための熱交換器２２を含む。熱交
換器２２は、好ましくはアルミニウムであり、所定数の
反応チューブ２６（例えば、０．５ｍｌエッペンドルフ
チューブ）が合致する大きさで形成された複数の窪みを
有する熱伝導ブロックである。熱交換器２２の目的は、
反応チューブ２６を支持し、かつ反応成分が種々の温度
にて利用者が定める時間インキュベートされるように、
チューブに入れた液体に対して熱エネルギーをやり取り
する熱交換器として作用させることにある。従ってサー
マルサイクラ１２は、この分野で周知のように、熱交換
器を加熱および冷却するシステム、ならびに該熱交換器
および反応チューブを加熱・冷却するための加熱および
冷却システムを制御するためのコンピュータシステムを
含む。使用者は、ディスプレイ／キーボードユーザイン
ターフェイス２８を介して、例えば図１に例示されるよ
うに所望の温度プロフィールを与えるべく、コンピュー
タまたは熱交換器および反応チューブの加熱および冷却
制御手段をプログラムする。

【００８１】サーマルサイクラ全体に加え、熱交換器
（熱伝導ブロック）、該熱交換器の加熱および冷却手
段、および該熱交換器の加熱および冷却制御手段は、こ
こに参考として取り入れる米国特許第５，０３８，８５
２号に従って構成しうる。好適なサーマルサイクラは、
図３に示されるＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９６０
０サーマルサイクラ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏ
ｒｗａｌｋ，ＣＴ）等が、商業的に入手可能である。

【００８２】しかしながら、予め負荷した反応チューブ
を加熱および冷却するための別の装置が、本発明の範囲
から離れることなく使用され得ることを理解すべきであ
る。反応チューブの加熱および冷却のためにいかなる装
置が使用されても、関連する温度に達して維持すること
ができ、時間プロフィルに対して所望の温度が達成され
ることが必要である。従って、核酸増幅のためにはこの
ような装置は、当業者に知られているようにＴ_１〉Ｔ_２
であって、変性温度Ｔ_１（約８０−１０５℃、好ましく
は９０−１００℃の範囲であり得る）およびアニール化
／伸長温度Ｔ_２（約３０−９０℃、好ましくは５０−７
０℃の範囲であり得る）の間で、増幅反応混合物を温度
サイクルに付すことが出来なければならない。

【００８３】ハンドル２７ａを含むカバーブロック２７
は、この技術で慣用であるように熱交換器２２を閉鎖お
よび開放すべく、熱交換器に摺動可能となるように結合
されている。カバーブロック２７は、図３に具体的に示
される本発明の増幅／検出工程の間、図４に示されるよ
うに後方位置に維持される。これは、カメラ１６ａが増
幅反応チューブ内から輻射される蛍光信号を受光するこ
とを可能とする。

【００８４】サーマルサイクラ１２は、サイクル数、温
度、および時間等の熱交換器および増幅反応混合物の温
度プロフィルを示すデータをライン３０を介してイメー
ジプロセッサ２０に送るための手段を備えている。その
ようなデータの転送のために、例えばＲＳ２３２バスが
ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９６００サーマルサイ
クラに与えられる。ＬＥＤディスプレイパネル２８ａ
も、そのような出力データを操作中に使用者に示す。

【００８５】ＣＣＤカメラ１６ａは、熱交換器２２およ
び反応チューブの上方に配置され、増幅の間に装置１２
により混合物が温度サイクルに付される際に、チューブ
の上端を通して反応混合物から輻射される蛍光信号を収
集する。カメラ１６ａにより捕捉される蛍光像に対する
視差の影響を低減するために、カメラ１６ａを熱交換器
２２から実用的である限り遠方に配置することが重要で
ある。しかしながら、カメラ１６ａは、反応チューブ２
６からの充分な光が捕捉できるように他の光源からの背
景ノイズを最小化すべく、熱交換器および反応チューブ
に充分に近接させなければならない。熱交換器２２と、
それに向けられるカメラレンズ４６との間の至適距離ｄ
は、使用するレンズに依存して約６インチから５フィー
トまでの範囲であることが見いだされている。例えば、
７０ｍｍレンズを使用した場合には、ｄは好ましくは約
２フィートである。興味ある蛍光が約６００ｎｍの波長
を有することから、好ましくは６００ｎｍフィルタであ
るバンド透過干渉フィルタ４８が、検出を所望の波長に
限定するためにレンズの前に配設される。

【００８６】図３を参照すると、カメラ１６ａは、熱交
換器２２および反応チューブ２６の上方に設置されるべ
く慣用の写真コピースタンド３２に取り付けて示されて
いる。コピースタンド３２は、ブラケット３６に支持さ
れた垂直支持部材３４を含む。ブラケット３６は、装置
１０を支持する載置表面３８に確保されている。摺動部
材４０が、垂直移動のために垂直部材３４に摺動可能に
取り付けられており、当業者には慣用であるように、摺
動部材４０を所定位置に固定するために、回転によって
摺動部材４０と共同するノブ４２が設けられている。カ
メラブラケット４４は、摺動部材４０に固定される一端
部とカメラ１６ａに固定される他端部とを有している。
而してカメラ１６ａの高さは、熱交換器および反応チュ
ーブの上方の所望の高さに、摺動部材４０を介して調節
されうる。カメラ１６ａは、好ましくは慣用のコンピュ
ータ制御・冷却ＣＣＤ−カメラである。冷却液は、複導
管ライン５０を介し、カメラ１６ａを通って循環され
る。該カメラは、好ましくはより低いノイズの高品質画
像を与えるべく冷却される。好適なカメラの一例は、Ｐ
ｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）からＳ
ＴＡＲ１の名称で商業的に入手可能なＣＣＤカメラであ
る。それは、ピクセルあたり１２ビットの解像度を有す
る熱電気的に冷却されるＣＣＤアレイを使用している。
それは、検出される蛍光に対して感度を変更すべく、露
出時間を変化させ得る。カメラ１６ａおよびイメージプ
ロセッサ２０の間のＩＥＥＥ４８８バス（参照番号５８
で示される）は、該イメージプロセッサ２０が、反応チ
ューブの像の露出および像を得る時間を制御し得るよう
に設けられている。

【００８７】図５を参照すると、２個のＵＶランプ１４
が、カメラ１６ａと熱交換器２２との間の光学経路に対
して横方向に配設されている。これに関しては、ランプ
１４は、それらのハウジングが全ての反応チューブとカ
メラレンズ４６との間の光学経路を妨害しないようにカ
メラレンズ４６に充分に近接することが重要である。こ
の限りにおいて、ランプ１４は、ブラケット５２を介し
てカメラブラケット４４に懸垂保持される。ランプ１４
は、励起光が反応チューブに均一に与えられるように、
熱交換器に対して平行である。導線５４は、ランプ１４
から引き出されて所望の電力を得るために標準的１１５
ボルトソケットに接続されている。ＵＶランプ１４の波
長は、核酸蛍光性結合試薬の要求に従って選択される。
例えば、エチジウムブロマイドの励起のためには、３０
２ｎｍが所望の波長である。好適な３０２ｎｍ中域ＵＶ
ランプは、Ｃｈｒｏｍａ−Ｖｕｅの名称でＵ．Ｖ．Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｃ
Ａ）から商業的に入手可能である。

【００８８】カメラ１６ａにより得られる映像は、上述
のＳＴＡＲ１システムを使用する場合にはＲＳ１７０ラ
インであるライン５６を介してイメージプロセッサ２０
に転送される。イメージプロセッサ２０は、ライン５６
上のカメラデータからデジタルイメージを生成するため
のフレームグラバーを含む。カメラ１６ａは、１２ビッ
トのデジタル出力を有するが、イメージプロセッサ２０
が８ビットのイメージプロセッサである場合にはアナロ
グ出力のカメラが使用される。そのような場合、イメー
ジプロセッサ２０は、得た像をデジタルデータとして操
作できるようにライン５６上のアナログ信号から８ビッ
トのデジタルイメージを生成するためのフレームグラバ
ーを含む。

【００８９】サーマルサイクラの出力データライン３０
は、進行中の増幅の温度プロフィル、時間、およびサイ
クルを提供するためにイメージプロセッサ２０に結合さ
れている。このようにしてプロセッサは２０は、増幅過
程において予め選択された時間にカメラ１６ａのシャッ
ターの開閉を制御するカメラ制御装置１８に、ライン５
８を介してトリガ信号を送るようにプログラムされ得
る。イメージプロセッサ２０は、カメラ１６ａを制御す
るためにＩＥＥＥ４８８ライン５８と情報交換するため
のＩＥＥＥ４８８バスカードを含む。プロセッサ２０
は、慣用のキーボードおよび／またはマウスユーザイン
ターフェイス６０／６４ならびにモニター６２も備えて
いる。装置１０の操作の一般的概要が以下に示される。

【００９０】増幅されるべき核酸、ポリマー化に触媒作
用する熱安定性酵素、特定のオリゴヌクレオチドプライ
マー、および４種類の異なるヌクレオチド三リン酸等を
含む反応混合物を入れた複数の反応チューブ２６は、熱
交換ブロック２２内に配置される（図４）。該反応チュ
ーブは、慣用のキャップ、蒸気遮蔽鉱油またはＡｍｐｌ
ｉｗａｘ^ＴＭ封止剤によって封止される。サーマルサイ
クラを起動し、反応チューブに向けられた励起ランプを
点灯する。カメラ制御装置１６ｂからの信号に応答し
て、カメラ１６ａは全ての反応チューブ２６の像をとら
え、この像はサイクルの第１のアニール化／伸長相にお
ける蛍光の種々の水準を反映する。このアナログ像は、
イメージプロセッサに送られ、ここでフレームグラバー
がアナログ／デジタル変換器にてイメージをデジタル化
する。

【００９１】図６は、６個の同時増幅の過程で得られた
３種のデジタル化された像の部分を示す。該プロセッサ
は、示したアニール化／伸長相の間の各反応チューブか
ら輻射される光強度を平均し、これらの強度値を正規化
して各反応チューブについての単一の蛍光値を決定す
る。正規化方法は、図９−図１１と関連させて下記に更
に詳細に論じられる。これは、増幅工程の各サイクルに
ついて反復される。正規化された蛍光値は、引き続く分
析およびグラフ化のためにコンピュータスプレッドシー
トに保存される。これらの正規化蛍光値は、標的核酸の
初期量（すなわち増幅前の標的核酸テンプレートの出発
数）を決定するため、あるいは反応動力学に対する増幅
反応条件の影響を分析するために処理される。上記に要
約した蛍光値の獲得および処理工程は、後に更に詳細に
議論される。

【００９２】まず、輻射蛍光に対するカメラの各露光の
タイミングについて議論する。最大の蛍光は、温度サイ
クル中の増幅工程における各サイクルのアニール化／伸
長相（図２の間隔ａ−ｃ参照）において起こり、かつ、
これは核酸増幅の水準の指標であることから、カメラ１
６ａによって所定のサイクルの一つの像のみを得る場合
には、サイクルのこの相において撮らなければならな
い。この時に、最も強い信号が得られ、しかもこの間の
信号が、生成される物質の量を最もよく表すからであ
る。しかしながら、反応を通しての他のデータは、増幅
の全過程の分析において有用であり得ることから、１サ
イクルあたり１つ以上の像を得ることが好ましいであろ
うことは理解されなければならない。例えば、図２の参
照記号ｂに示されるようにアニール化／伸長温度に達し
た後、２０秒後にそれぞれの像が得られる。この例の場
合においては、アニール化温度が６８℃であるとき、サ
ーマルサイクラ１２によってＲＳ２３２ライン３０を介
して６８℃の温度が示されてから２０秒後に、プロセッ
サ２０がカメラ制御装置１６ａにカメラシャッター（示
していない）をトリガーする信号を送り出す。露出時間
は、当業者には明らかであるようにアプリケーション毎
に変化する。カメラシャッターを開放するためのトリガ
ーは、オペレータにより温度および時間出力データをデ
ィスプレイ２８ａ上の表示を見てマニュアルで行われう
ることは自明である。

【００９３】ＣＣＤ−カメラは、露出中に受けた光を合
わせ、その時間における熱交換器内の全ての反応チュー
ブの蛍光を示す像を形成する。この像は、ライン５６を
介してイメージプロセッサ２０に送られる。プロセッサ
２０に結合されたモニター６２は、図６に６４Ａ−Ｃで
示される３個のウインドウを表示する。ウインドウ６４
Ａは、カメラの視野をモニターすることができ、カメラ
露出制御等の機能のカメラ操作時にはメニューを与え
る。ウインドウ６４Ｂは、デジタル像を表示し、処理
（例えば下記に示す平均化）すべきイメージの部分をマ
ニュアルで選択することを可能とする。ウインドウ６４
Ｃは、コンピュータオペレーティングシステムのコマン
ド行を表示する。該プロセッサは、イメージをデジタル
化し、それをウィンドウ６４Ｂに表示し、これは、ユー
ザが１つの反応チューブの単一の像を含む像領域に、ピ
クセルの群を指定するために使用される。コンピュータ
グラフィクスの分野の当業者には明らかなように、これ
はウィンドウ６４Ｂの反応チューブ２６のデジタル化イ
メージの部分の周囲にマウスを使用してボックスを描く
ことによるか、あるいは、いずれのピクセルがどの反応
チューブに属するかを決定するために各ピクセルの蛍光
を見るプログラムを使用して行われる。これは、図７
に、６ｘ６ピクセル配列が単一の反応チューブ２６の像
を含む例として示されている。この配列の大きさは、単
に例示のために選択されたものであって、本発明の範囲
を離れることなく別の配列の大きさが使用可能であるこ
とが理解されなければならない。ピクセル値“５”は、
有意ではない蛍光を示すもので、熱交換器上面から輻射
される蛍光に対応し、一方においてピクセル値“２０
０”は、６ｘ６ピクセル配列中に検出される最大蛍光を
示し、ピクセルに像形成される反応チューブの部分から
輻射される蛍光に対応する。ピクセル値“１００”は、
熱交換器および反応チューブの部分から輻射される蛍光
に対応する。当然のことながら、これらの特定のピクセ
ル値は、実際の値を示すものではなく、単に例示するも
のである。

【００９４】次いで、イメージプロセッサ２０は、反応
チューブを含む領域に指定された配列内のピクセル値を
平均化し、核酸増幅工程のサイクル１について、その反
応チューブの単一の蛍光値を得る。しかしながら、各反
応チューブについて単一の蛍光値を得ることは、ピクセ
ル値の総和をとる等の別の方法によっても行うことがで
きる。６ｘ６配列の輪郭を描き、第１の反応チューブを
含むボックスは、次いで次の反応チューブを含むように
移動され、ここにおいてピクセル値平均化工程が反復さ
れ、サイクル１について各チューブに対し、蛍光値が指
定されるまで単一蛍光値が得られる。他の方法として、
所定サイクルについて各反応チューブの蛍光値を得る工
程は、並行する工程として行われうる。各反応チューブ
について蛍光値の計算工程は、増幅工程が完了するまで
各サイクルで反復される。

【００９５】最初、すなわち熱交換ブロック２２に反応
チューブ２６が負荷される際に、対照チューブ２６Ｃも
ウエル２４の一つに負荷される。対照チューブの目的
は、例えば微少な温度変動または励起光強度のゆらぎに
よるサイクル毎の測定の変動に対して、一定蛍光源を与
えることにある。このようにして、各反応チューブにつ
いて得られる蛍光値は、以下のようにして変動を補償す
るために補正され得る。該対照チューブ２６Ｃは、エチ
ジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）等の蛍光色素のみが予め
負荷される。対照チューブは核酸を含まないため、温度
サイクルの間に蛍光の増幅は起こらない。従って、対照
チューブは、増幅の間に励起光を受けても本質的に一定
の蛍光量を輻射し、増幅工程をとおして基線として機能
する。このことは、対照チューブの蛍光強度が数サイク
ルに亘ってプロットされた図８に例示されている。

【００９６】図８を参照すると、ｉ_０は、対照チューブ
の初期蛍光強度であり、基線を確立する。サイクル２に
おいて、対照チューブ２６の記録された強度は低下し始
めて蛍光のゆらぎが起こっていることを示している。而
して実線７２のサイクル４は、見かけの強度値に対応す
る。例えばサイクル４において、カメラがサイクル４の
アニール化／伸長相のデータを収集する場合に、対照チ
ューブ蛍光の見かけの値はｉ_Ａ４である。次いで、その
サイクルについて補正因子ｉ_０／ｉ_Ａ４が決定される。
それぞれの反応チューブについて得られるそれぞれの蛍
光値は、実際の蛍光値を与えるべく補正因子が乗じられ
る。前述のことが各サイクルについて反復される。要約
すると、補正因子は一般的にｉ_０／ｉ_Ａｎとして記述さ
れ、ここににおいて、ｉ_０は対照チューブの初期蛍光値
であり、ｉ_Ａｎはサイクル数ｎにおいて得られた対照チ
ューブの見かけの蛍光値である。例えば平均化（上述し
た）によって反応チューブについて得られた各蛍光値
に、補正値が乗じられる。上述のことが各サイクルにつ
いて反復される。

【００９７】正規化および定量化は、例示の目的で特定
の例について作成したデータを参照して記述される。そ
のデータは、図９に例示される。当業者には明らかなよ
うに、本発明は、ＰＣＲまたは特定の増幅反応混合物、
増幅数、サーマルサイクラ、温度プロフィル、蛍光像が
撮られる時間間隔等に限定することを意図するものでな
いことが理解されなければならない。以下に詳細に記述
するように、最初に未知であった濃度の増幅反応混合物
における標的配列の初期濃度を定量するために、標的核
酸配列の出発濃度が異なる増幅反応混合物を測定するこ
とのみを必要とする。

【００９８】図９は、上述の原理に従い、５５サイクル
についてＣＣＤカメラを用いて同時に測定される８個の
ＰＣＲ増幅から得られた蛍光値を示す。而して、これら
の値は、上述したように各反応チューブについて得られ
（例えば各ピクセル配列を平均化することによる）、測
定変動（例えば揺らぎ）の発生について補正した値を表
す。この例では、下記に更に詳細に記述されるように試
料の末知の出発量の定量を容易にするために、７つの反
応混合物は、既知濃度の特定ＤＮＡ標的配列（すなわち
既知量の出発試料）を含む。第８の混合物は、標的ＤＮ
Ａを含まず、背景情報を与えるための参照反応物として
機能する。７つの既知試料の増幅は、単鎖のＨＩＶテン
プレートＤＮＡの連続希釈を使用して開始された。

【００９９】希釈物調製前に、１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．３；３ｍＭ ＭｇＣｌ_２；２．５ＵのＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎ
ｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）；各１００μＭ ｄＮＴＰ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４
μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド（ＢｉｏＲａｄ，Ｒ
ｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）；各１００ｐモルのＨＩＶ特異
的（ｇａｇ領域）オリゴヌクレオチドプライマーＳＫ１
４５およびＳＫ４３１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎ
ｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）および３００ｎｇのヒト胎盤ＤＮ
Ａ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む１０
０μｌの体積中にＰＣＲ反応混合物を調製する。ＨＩＶ
ｇａｇ領域のＭ１３サブクローンを、標的核酸テンプレ
ートとして使用した。

【０１００】１０^８テンプレートから出発して、１０倍
希釈を１０^２テンプレートまで調製し、１４２ｂｐＰＣ
Ｒ生成物を生じるためのＨＩＶ特異的プライマーと共に
使用した。これらの初期濃度から生成された図９の蛍光
プロフィルは、それぞれ参照番号１０^８、１０^７・・・
１０^２が付されている。テンプレート無添加の参照増幅
も測定した。この混合物の蛍光プロフィルは、参照番号
０を付した線によって示されている。完全ＨＩＶゲノム
についてリンパ球ＤＮＡのＰＣＲ−ベーススクリーニン
グを模倣するために、全ての反応物は３００ｎｇまたは
４０，０００個細胞相当量のヒトゲノムＤＮＡを含んで
いた。

【０１０１】温度サイクルは、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ ９６００サーマルサイクラ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）にて、２温
度プログラム：９４℃で１５秒間の変性；６８℃で３０
秒間のアニール化／伸長を用いて５５サイクル行われ
た。反応の特異性を改善するためのこの分野で慣用の
“ホットスタート”を行うため、７５℃にて初期維持を
使用し、この間に試料がこの温度に達した後にＭｇＣｌ
_２（１２μｌの体積中）を添加した（Ｃｈｏｕ，Ｑ．，
Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍ．，Ｂｉｒｃｈ Ｄ．Ｅ．，Ｒａｙ
ｍｏｎｄ，Ｊ．およびＢｌｏｃｈ，Ｗ．“プレーＰＣＲ
ミスプライミングおよびプライマー二量化の防止は、低
コピー数増幅を改善する”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：１７１７−１７２３，１９
９２参照）。各温度サイクルについての蛍光像を、約１
秒の露光でアニール化温度での３０秒間の維持において
２０秒に、ＣＣＤカメラにより撮った。上述したよう
に、加熱カバーブロック２７を使用せず、反応チューブ
から離して撮影を可能とした。

【０１０２】図９に示したように、各反応からの蛍光
は、初期の温度サイクルにおいてはほとんど変化せず、
次いで検出可能な量のＰＣＲ生成物が生じると上昇す
る。反応物中の出発テンプレートが多いほど、そのよう
な蛍光の上昇がより早く起こる。例えば、最も高濃度の
出発テンプレート、すなわち１０^８のテンプレートを有
して出発した反応混合物から輻射される蛍光に対応する
蛍光曲線を示す１０^８と記した曲線を参照のこと。図９
に示されるように１０^８曲線は予想通り最初に立ち上が
る。

【０１０３】しかしながら、異なる増幅から得られる初
期の蛍光値においては、それらは同一でなければならな
いにも関わらず、かなりの偏差がある。反応チューブ内
の単鎖ＤＮＡの変化量は、単一のチューブから予想され
る全蛍光に対しての影響が無視できる程度の少量である
ことから、同じでなければならない。この変位の原因
は、照度の不均質性または不均一性、視差、およびチュ
ーブキャップによる蛍光の変化する減衰であると考えら
れている。キャップを使用せず、上記遮蔽鉱油またはＡ
ｍｐｌｉｗａｘＴＭ封止剤を通しての増幅の測定は、こ
の変位を除去しないまでも低減する。

【０１０４】照度の不均質性、視差および変化する減
衰、および而して図９に示された変動を補償するため
に、プロセッサは各増幅の正規化因子を決定する。各因
子は、サイクル１で得られたデータに基づいて決定さ
れ、それは各反応の観測された初期蛍光値に対する全て
の反応の平均初期蛍光値の比である。プロセッサは、各
増幅について、全ての蛍光値にそれぞれの正規化因子を
乗じる。この正規化の結果は図１０に示されている。而
して、１０^８出発テンプレートコピーを含む反応につい
て、比（正規化因子）は、サイクル１の８つの全ての蛍
光値の和を、図９に示す１０^８の反応の初期蛍光値であ
る８５で除したものである。次いで、１０^８で示す反応
の蛍光値は全てこの因子が乗じられ、図１０に示す正規
化曲線が作られる。各反応曲線は同様にして正規化され
る。この正規化は、像の変位の原因が、全ての範囲の信
号強度に亘って蛍光信号を比例的に減衰または増加させ
るとの仮定に基づいている。

【０１０５】図１０を参照すると、全ての反応は本質的
に同じ初期蛍光値を有し、ほとんどの反応プロフィール
は、使用した希釈系列と矛盾無く規則的な間隔をもって
いる。これらプロフィールは、形が極めて類似し、ほぼ
並行である。充分なＰＣＲの初期または対数相は、各サ
イクルでＤＮＡコピー数を二倍にする。出発テンプレー
トの各１０倍希釈は、ＰＣＲ生成物の収量を所定濃度に
するために、３．３２回の更なるサイクルを必要とする
ことが予想される。従って、正規化した値は、蛍光水準
の多くの範囲で期待通りの様相を呈する。図１０の検証
により、１０^２コピーと０コピーとの間を除いて、各希
釈物はほぼ３サイクルをもって分離されていることが分
かる。このサイクル数−オフセットは、ＰＣＲの対数相
を過ぎることを表していることも明らかである。対照的
に、図９の比正規化データにおいて希釈物間を分離する
サイクル数は、広範囲で変化する。

【０１０６】図１０に示すような正規化蛍光データを使
用して、標的核酸の初期量が定量され、あるいは増幅反
応の動力学に対する異なる反応条件の効果が分析されう
る。標的の初期量の定量を最初に議論する。図１２は、
テンプレートコピーの出発数の対数と、図１０の増幅に
ついて任意に選択した蛍光水準である１９０に達するた
めに必要なサイクル数との直線関係を示す。図１２に示
す線は、１０^８個から１０^３個までの初期コピーのデー
タ点に合致する回帰である（ｒ^２＞． ９９）。１０^２
の初期コピーに対応するデータ点は、この線からの統計
的に有為な偏差を有している（０コピーは対数プロット
上に乗らない）。１０^２コピーのデータ点を除いて回帰
線から最も逸脱するデータ点は、１０^５であり、これは
合わせた線の方程式を使用して既知の初期コピー数より
１３％低い値を予想する。図１０にて選択される蛍光水
準を１２５−２２５のいずれとしても同様な結果が得ら
れる。

【０１０７】１０^２コピーにおけるデータ点の線形性か
らの偏差の理由は、図１１に増幅生成物のゲル電気泳動
分析によって示されている。増幅の特異性は、テンプレ
ートの１０^８から始まり１０^５コピー数まで、視認でき
る生成物が期待される大きさのもののみである。１０^４
個の出発コピーを使用した場合に、より小さい非特異的
増幅生成物がようやく見えるようになる。１０^３コピー
を使用した場合には、この生成物は更に目立つようにな
り、また１０^２コピーを使用すると、同じ量の非特異的
生成物およびＨＩＶ−特異的生成物が生じる。テンプレ
ート無添加の対照においては、非特異的生成物のみが生
じる。特異的生成物による蛍光を非特異的生成物のもの
から区別することはできないため、このアッセイの感度
の基線は、特異的生成物の付加的合成が反応プロフィー
ルに対して影響を与えない程度に非特異的生成物が多く
合成されるサイクル数である。濃度決定が一組の標準、
すなわち既知量の出発標的核酸配列を入れた反応チュー
ブである限り、この基線は線形性からの変位が始まるサ
イクル数よりも有意に大きいであろう。実際的には、１
０^２テンプレート未満での反応プロフィールの試料毎の
変位は、このレベルより低い場合の定量の再現性を複雑
にすることが観察された（データは示さない）。

【０１０８】試料中の標的核酸の初期量を定量するため
に、最初に一組の標準からの正規化蛍光データを、初期
標的核酸量と、この装置の検出範囲内で任意に選択され
る蛍光値に達するために必要なサイクル数（図１２に示
すように）との関係を確立するために使用した。この任
意の蛍光値（ＡＦＶ）は、好ましくは図１０に示すよう
に異なる標準の間が平行となるような反応プロフィール
の領域で選択される。このことは、選択されるＡＦＶ
が、最も高い既知標的核酸濃度を使用する標準にて得ら
れる最大蛍光値の０．１〜０．５倍である場合に、一般
に事実であろう。

【０１０９】各標準についてＡＦＶ選択後、ＡＦＶに最
も近くに得られた補正および正規化蛍光値が選択され
る。この値、ならびにこの値が生じるサイクルの４サイ
クル先行する値および４サイクル遅れる値を取り、サイ
クル数（少数であり得る）を蛍光と関連させる回帰線を
合わせる。次いでＡＦＶを、この回帰線の方程式に代入
し、この標準試料についてＡＦＶに達するに要するサイ
クル数の値を得る。

【０１１０】各標準についてＡＦＶに達するために必要
なサイクル数を決定した後には、初期標的核酸量と、Ａ
ＦＶに達するために必要なサイクル数とを関連づけるデ
ータに回帰線を合わせる。ここで、標準試料と共に増幅
された未知試料の初期標的核酸量を決定するために、標
準試料について行ったのと同様にしてＡＦＶに達するた
めに要するサイクル数を求める。このサイクル数（少数
であり得る）を合わせた回帰線の方程式に代入し、方程
式より未知試料中の初期標的核酸量にあたる数値を得
る。この工程はそれぞれの未知試料について反復されう
る。ここに記載したデータ処理は、プログラムするに適
したマイクロプロセッサにより容易かつ高速で行われう
る。

【０１１１】この核酸定量方法は、色素の非配列特異的
結合から生じる傾向を用いる場合のみならず、米国特許
第５，２１０，０１５号に記述された均質増幅／検出系
において使用されるようなオリゴヌクレオチドプローブ
の配列特異的結合により生じる蛍光を使用する場合にも
適用できる。これらのプローブは、上記特許に記述され
るように、別の光源およびフィルターを必要とする。そ
れぞれ識別可能な蛍光をもった複数の配列特異的プロー
ブの使用は、単一増幅反応中の複数の核酸標的配列の検
出および定量を可能とする。

【０１１２】図１３〜図１６を参照すると、ＰＣＲに対
する異なる反応条件の影響の分析が議論される。一般的
に、これらの影響は、標準ＰＣＲの成分の添加、控除ま
たは変更、ならびにそれによる反応プロフィールの変化
の観察によって測定することができる。図１３は、Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼの力価測定を示す。１０^８の標的
ＨＩＶテンプレートを含む９個の複写ＰＣＲを、図中に
示したＴａｑポリメラーゼ濃度の範囲を使用して開始し
た。反応あたり１〜１０単位の酵素量について、全ての
反応でほぼ同じサイクルで蛍光が検出可能となった。こ
のことは、これらの酵素量の差異が早いサイクルでの増
幅効率にほとんど影響しないことを示している。ＰＣＲ
生成物量の差異は、後のサイクルになって明らかになる
が、５０サイクルで、１単位の場合に比べて１０単位を
使用するとほぼ２倍のＤＮＡが生成される。ゲル電気泳
動（示していない）によると、これらの反応において
は、非特異的、非−ＨＩＶ ＰＣＲ生成物の生成された
証拠は無かった。０．５単位のみのＴａｑポリメラーゼ
を使用すると、検出可能な生成物が突然に無くなる。Ｐ
ＣＲは、ＤＮＡが濃度において指数的に増大する工程で
あるから、増幅がそれ以下では起こらない酵素の閾値が
存在することは、多分驚くべきことではない。

【０１１３】増幅の動力学に対するプライマー濃度の変
更の影響も測定され得る。図１４は、２μＭ（各プライ
マー）から０．０５μＭまで低下するプライマー濃度を
使用したＨＩＶテンプレート（１０^８初期ｓｓＤＮＡコ
ピー）を検出するＰＣＲのプロフィールを示す。各ＰＣ
Ｒにおいて、一定の酵素濃度（２．５Ｕ）を使用した。
０．０５から０．４μＭまでのプライマー濃度では、反
応物のＤＮＡ濃度はある水準までは上昇するが、一定値
に止まることに注意したい。図５のデータを使用し、１
０．６ｐｍｏｌｅ／μｇの１４２ｂｐＰＣＲ生成物を仮
定してこれらの最終生成物量を推定すると、０．０５、
０．１０および０．２０μＭのプライマーについて、そ
れぞれ０．０５、０．１０および０．２０μＭの生成物
が生じたことが分かる。これらの濃度においては、プラ
イマー濃度は明らかに生成物ＤＮＡの収量の制限因子で
ある。対照的に、０．８μＭプライマー濃度およびそれ
以上では、ＤＮＡ量は図１４に示すように温度サイクル
毎に上昇し続け、またプライマーの増大量はプロフィー
ルに影響しない。図１４のデータを比較すると、これら
の反応はプライマーではなく酵素により制限されること
が結論される。

【０１１４】１００μｌの反応物あたり、１μＭのプラ
イマーおよび２．５Ｕの酵素を用いて、ＫＣｌ濃度を変
化させた結果が、図１５に示されている。ＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ活性は、ＫＣｌの高濃度によって大きく阻
害される。これと矛盾せず、１２５ｍＭ以上のＫＣｌ濃
度においては、検出されるＰＣＲ生成物はない。テンプ
レートとして活性化サケ精子ＤＮＡを用いると、５０−
９０ｍＭ ＫＣｌにおいて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
活性が至適となる。このアッセイは、５０、７５および
１００ｍＭ ＫＣｌにて生成物収量が最大であり、０ｍ
Ｍ ＫＣｌではわずか半分程度が生成することを示し
た。この差異は、低イオン強度がプライマーアニール化
を不安定にするためであり得るが、０ｍＭ ＫＣｌを使
用する増幅の効率が約２０サイクルまでは５０−１００
ｍＭ ＫＣｌの場合とほとんど同じであるという観察と
は合致しない。後のサイクルにおいてのみ、図１４の少
量のポリメラーゼを用いて得た結果に類似して生成物の
少量が低下する。プライマーのアニール化が不安定化さ
れるのであれば、増幅効率は全てのサイクルに亘って減
少するものと予想される。

【０１１５】最後に、ＰＣＲの既知の阻害剤であるヘマ
チンを、種々の濃度をもってＰＣＲに添加した。ヘマチ
ンを、０．２μＭのプライマー濃度を使用したことを除
いて先に使用したＨＩＶ試験系と同様な系に添加した。
図１６に示されるように、０．２μＭ以上のヘマチン濃
度においては、検出可能なＤＮＡ生成物を得られなかっ
た。０．１μＭにおいては、生成物の検出が３−４サイ
クル遅れ、このことは、０ｍＭ ＫＣｌまたは低減した
酵素を用いて得た結果とは対照的に、増幅効率が初期お
よび後期の増幅サイクルの両者において悪影響を受けて
いることを示唆している。この反応プロフィールの差異
は、部分的に阻害されるＰＣＲを阻害されない反応と区
別しうることを示唆している。

【０１１６】図１７−１９を参照すると、本発明の装置
により実施される工程を例示する単純化したフローチャ
ートが示される。図１７は、全体の蛍光値を得る工程を
例示し、一方図１８−１９は、蛍光の平均および正規化
のサブルーチンを示す。

【０１１７】図１７を参照すると、工程が開始され、サ
イクル１の蛍光値が得られる。次いで、プロセッサが各
試料について正規化因子を計算する。次いでそのサイク
ルの各値について、それぞれの蛍光値にそれぞれの正規
化因子を乗ずることによって、蛍光値が正規化される。
次いでプロセッサは、正規化した値を出力し、次のサイ
クルの蛍光値が得られる。これが、全ての蛍光像を処理
するまで反復される。いかにして蛍光値が得られるかを
例示する図１８を参照すると、サーマルサイクラが起動
され、励起光源にエネルギーが供給され、ここでカメラ
制御装置はトリガー信号を待つ。カメラ制御装置がプロ
セッサからのトリガー信号を受けると、これはカメラに
信号を送り、カメラシャッターをｎ秒間開放し、ここで
カメラはシャッターが閉じるまで蛍光を示すピクセル値
の和を取る。該アナログ像はイメージプロセッサに送ら
れ、ここでイメージプロセッサのフレームグラバーが、
像をデジタル化する。この時点において、デジタル化イ
メージを引き続く処理のために保存することができ、あ
るいは実時間で処理することができる。後者の場合、次
いでイメージプロセッサは一つの反応チューブを包含す
る領域のピクセルの群を指定し、そしてその領域の全て
の値を平均化して単一の蛍光値を得、これが保存され
る。プロセッサは、これらの工程をそのサイクルにおい
て全ての反応チューブについて、単一の蛍光値を得るま
で反復する。該プロセッサは、そのサイクルについての
保存された値を出力する。これが、そのサイクルに亘っ
て反復される。図１９は、図１７に例示された正規化因
子を得るためのサブルーチンを示す。最初にサイクル１
の全ての基底値について平均値を得る。次いでその平均
値はサイクル１の各蛍光値で除され、各増幅反応混合物
についての正規化因子が得られ、これは残るサイクルに
おいて使用される。フローチャートはサイクル毎の補正
を含まないが、それはプロセッサによって対応されう
る。

【０１１８】図２１および２２を参照すると、装置１０
との組み合わせにおいて使用される、励起光および蛍光
輻射検出の構成の更なる実施態様が示される。この励起
光および蛍光検出構造は、全体として参照番号１００が
付され、全体に窪み２４を光気密的に覆うためのシェル
またはハウジング１０２、窪みに配置される反応試料に
励起光を供給するためのランプまたは光源１４’、反応
試料から輻射される蛍光を検知するためのセンサーまた
はカメラ１６ａ’および本質的に輻射のみがカメラ１６
ａ’により検出されるように、励起光と蛍光とを分離す
るための光二色性鏡を有してなる。蛍光または輻射デー
タは、上述のように処理される。

【０１１９】ハウジングまたはシェル１０２は、頂壁部
１０６、側壁部１０８、１１０、前壁部１１２および後
壁部１１４を有して示される。シェルまたはハウジング
１０２は、該ハウジングが熱交換器２２を覆うようにサ
ーマルサイクラ１２の上部面上に載置され、而して核酸
増幅試料を保持するように構成される多数のチューブ２
６を受容すべく適当な寸法をもって形成される窪み２４
を内包する。更に特定的には、ハウジング１０２は、試
料チューブ２６を入れた試料のための光気密的チェンバ
を形成し、かつ光源と試料との間、および試料とセンサ
ーとの間の光経路を形成するように構成されている。従
って、該ハウジングは、それらの間に光気密的結合を与
えるように、サーマルサイクラ１２に載置されている。
更に、励起光源またはランプ１４’およびカメラ１６
ａ’のレンズピース１２０を保持すべく構成された孔部
１１６および１１８を除いて、シェルまたはハウジング
の壁部は無孔であり、かつ本質的に不透明材料からなっ
ている。加うるに、壁部は、好ましくはプラスチック等
の比較的に低熱伝導性材料からなり、熱伝導部材２２お
よびチューブ２６内の試料からの熱移動を妨害する。ハ
ウジングのための好ましい材料の一つは、ポリカーボネ
ートである。

【０１２０】ハウジングまたはシェル１０２のないぶ、
而して熱交換器２２内の試料にアクセスするための機構
が付設される。図２０および２１を参照すると、通路を
与えるべく前壁部１１２は、ヒンジ１２２を介して頂壁
部１０６に回動可能に取り付けられる特定の構造をハウ
ジングに関して記述したが、励起光および蛍光輻射の光
経路のための光気密的チェンバ、ならびに下記により詳
細に示されるハウジング１０２内に収容される要素のた
めのハウジングを形成する別の構造も使用できることが
理解されなければならない。

【０１２１】ランプまたは光源１４’は、ランプ１４と
は構成上本質的に異なる。ランプ１４’は、この技術で
慣用であるように集光シールドまたは覆い１４ａ’およ
びランプ１４と同様に光輻射のためのバルブまたはフィ
ラメント１４ｂ’を含む。ランプ１４ａ’は、試験され
る試料中に存在する蛍光性結合試薬を励起させるために
必要な光の波長に対応する波長の光を供給すべく選択さ
れる。例えば、蛍光性結合試薬としてエチジウムブロマ
イドを使用する場合には、光源１４’は、好ましくは約
３０２ｎｍの波長のＵＶ光を輻射するように選択され
る。３０２ｎｍ（ＵＶ）項を供給する適当な光源は、モ
デル番号ＵＶＭ−５７（３０２ｎｍ）としてＵ．Ｖ．Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（ＣＡ）から商業的に入手可
能である。しかしながら、エチジウムブロマイドは、約
３０２ｎｍに加えて、約４８０ｎｍの波長によっても励
起されうることが理解されなければならない。更に、他
のＤＮＡ結合色素または前述した５’ヌクレアーゼ均質
アッセイプローブ等の他の蛍光剤は、非−ＵＶ波長で励
起されうる。従って、４８０ｎｍの光を生じる光源も他
の選択肢として使用され得る。しかしながら、４８０ｎ
ｍ光を生じる光源は一般的に可視光のスペクトルを与え
る。従って、そのような光源を使用する場合には、所望
の４８０ｎｍの出力を得るためにフィルターが使用され
る。一般に所望の波長が反応混合物に供給される限り、
任意の光源が使用できる。モノクロモメーターおよびレ
ーザは、好ましい光源の例である。

【０１２２】ランプ１４’は、励起光が、不均一光の分
布を最小化し、窪み２４に入れた試料に向けるように窪
み２４上の中央に位置する孔部１１６を通して向けられ
るようにハウジング１０２に取り付けられる。ランプ１
４’は別の位置にも設置可能であることを理解しなけれ
ばならない。例えば、ランプ１４’をハウジング１０２
内に完全に収容して孔部１１６を除くこともできる。し
かしながら、光輻射要素、例えばバルブ１４ｂは、好ま
しくは熱交換器２２の上面に平行であり、かつ窪み上方
の中央に位置させて、上述したように熱交換器上の光分
布の均一性を向上する。所望の波長を得るためにフィル
ターを使用する場合には、該フィルターは、例えばラン
プの光学経路と窪み２４の試料との間の孔部１１６にお
いてハウジングに取り付けられてよい。

【０１２３】好ましくは低経路光二色性鏡である光二色
性鏡１０４は、熱交換器２２の直上に、ランプ１４’お
よびカメラ１６ａ’の配向に適合させるために熱交換器
上面に対して好ましくは約４５°の角度で配置される。
図に示した構成において、光二色性鏡１０４は、励起光
源１４’から輻射される波長に対応する波長を有する光
について透過性または透明であり、かつ、励起光に露出
された場合に窪み２４内の試料から輻射される波長に対
応する波長を有する光について反射性であるように構成
された低経路光二色性鏡である（図２１参照）。当然の
ことながら、光二色性鏡の透過性および反射性の特徴
は、特定の応用に応じて選択される。例えば、蛍光性結
合試薬としてエチジウムブロマイドを使用する場合に
は、上述したように励起光波長は、約３０２または４８
０ｎｍであり得る。いずれの場合においても、輻射波長
は約６００ｎｍである。従って、光二色性鏡は、約３０
２または４８０ｎｍの波長を有する光について透過性で
あるか、あるいは約３０２および４８０ｎｍの光の両者
について透過性であるように構成される。両方の場合に
おいて、該光二色性鏡は、約６００ｎｍの波長を有する
光について反射性であるように構成される。図２２は、
蛍光性結合試薬としてエチジウムブロマイドを使用する
場合の、光二色性鏡についての好適な特性の代表例であ
る透過性対波長曲線を示す。この例においては、該光二
色性鏡は、約３００〜５１０ｎｍ（後者はカットオフ波
長）の範囲の波長を有する光について高度に透過性であ
り、波長が６００に近づくに従って、高度に反射性とな
る。図２２に例示される特性を有する光二色性鏡は、フ
ルオレセイン等の別の蛍光性結合試薬が使用される場合
にも使用され得ることが指摘される。フルオレセイン
は、それぞれ約４９５および５２２ｎｍの励起および輻
射波長を有する。透過性および反射性の程度に関して
は、励起光の約８５％を透過し、一方カメラ１６ａ’に
向けた輻射蛍光の９８％を反射することができる図２２
に示した鏡は、本発明に従ってエチジウムブロマイドを
用いて核酸増幅を検出するために好適な結果を与えた。

【０１２４】次の記述は、本発明を例示するためのもの
であって、限定を意図するものではない。蛍光性結合試
薬としてエチジウムブロマイドを使用した場合に励起お
よび輻射光を分離するための適当な光二色性鏡の明細は
次の通りである：ＵＶ透過５１０ｎｍカットオフショー
トパス：透過率≧８０％平均（３００−５００ｎｍ）お
よび≧６５％絶対（３００ｎｍにて）；反射率≧９０％
絶対（５２５−６１０ｎｍ）；硬質反射性酸化物表面被
覆；基質−Ｃｏｒｎｉｎｇ７９４０ Ｆｕｓｅｄ Ｓｉ
ｌｉｃｏｎ；および面取り０．０１０ｘ４５°（全エッ
ジ）。好適な光二色性鏡の製造者としては、Ｏｍｅｇａ
Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（ＶＴ）およびＪａｎｏｓ
Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（ＶＴ）が含まれる。

【０１２５】低経路構成について説明したが、別法とし
て高経路光二色性鏡も使用しうる。しかしながら、高経
路光二色性鏡を使用する場合には、ランプ１４’とカメ
ラ１６ａ’の位置を逆転しなければならないことは当業
者には明らかであろう。

【０１２６】図２０および２１に示される実施態様の要
素の配置に戻ると、光二色性鏡１０４は、熱交換器２２
にアクセスするために回動可能となるように、隆起また
は突出部１２６に、ヒンジ１２８を介して回動可能に保
持されている。隆起または突出部１２６は、頂壁部１０
６から伸びて光源１４’からの光がヒンジ１２８を越え
てカメラ１６ａに向けられることを防止するかまたは最
小にすべく構成されている。

【０１２７】図２１に概略が示され、参照番号１２４が
付された光シャッターは、好適な実施態様に従って、反
応試料の励起光に対する露光を制限するように提供され
る。図２１に概略が示されるように、シャッター１２４
は、頂壁部１０６に摺動可能に取り付けられ、孔部１１
６が開放される第１の位置（実線で示される）および孔
部１１６が閉鎖される第２の位置（破線で示される）の
間を移動可能となっている。該シャッターは、この技術
で慣用であるように、閉鎖位置に向けてバネにより付勢
去れ、開放位置にソレノイド駆動されうる。該シャッタ
ーは、例えば最大蛍光値が期待されるＰＣＲの各サイク
ルのアニール化／伸長相においてのみ開放されるように
制御されうる。このようにして、該シャッターは、試料
の安定性を増大してシステムの性能を改善する。この実
施態様においてはランプが反応試料により近接するた
め、試料は比較的強い励起光強度に曝され、このことは
“ブリーチング”としても知られる試料の分解または光
不活性化を招き得る。シャッターは、試料が露光される
時間を最小にし、而してブリーチングの問題を除くか、
または有意に低減する。該シャッターはハウジング１０
２と組み合わせて示されているが、これは熱伝導ブロッ
ク、従って試料の直上に配置されるランプ１４’と組み
合わされてもよく、あるいは試料の励起光への露出を制
御する別の方法であってもよい。そのような露出を制御
または時間制限する別の機構も採用しうる。

【０１２８】対物または平凸レンズ１３０が、光二色性
鏡１０４とカメラ１６ａ’のレンズピース１２０との間
に配設される。対物レンズ１３０は、鏡１０４で反射さ
れた光線を内方に変位させ、これにより試料および熱交
換器２２から輻射される蛍光の全てをレンズピース１２
０に向かわせる。好ましくは対物レンズ１３０は、摺動
可能にハウジング１０２に取り付けられ、当業者には明
らかなように、これによって試料輻射の波長に応じてレ
ンズピース１２０に近づけ、あるいは遠ざけることがで
きる。

【０１２９】単一フィルターまたはフィルター円盤等の
複数のフィルターを、特定の波長のみの検出を許容する
ようにカメラに取り付けることができる。図２１を参照
すると、フィルター円盤１３２が、この技術で慣用であ
るようにレンズピース１２０に取り付けられており、複
数の水準または標的が検出および測定可能である。すな
わち、フィルターは円盤の回転により交換可能であり、
検出が所望の波長に限定される。交換工程は、適用に応
じて各アニール化／伸長相の間、予め選択されたサイク
ル数の後に行われうる。別の方法としては、分光イメー
ジャ等の波長を識別するカメラの使用も考慮される。

【０１３０】図２１を参照すると、加熱された透明また
は透過性窓若しくは部材１３４が、温度サイクル条件を
改善するために設けられる。部材１３４は、試料の有効
な励起およびそれに伴う蛍光の検出を可能とするように
少なくとも充分に透過性でなければならない。加熱部材
または窓１３４は、例えば水晶からなり、反応チューブ
２６上に置かれるか、あるいはそれから僅かに上方に置
かれる。加熱部材１３４は、一般に予め選択されたプロ
フィールに極力合うように反応混合物の温度サイクルの
温度プロフィールを維持し、また逆流を最小とするため
に設けられる。好ましくは、加熱部材は、約９５−１０
５℃、好ましくは１００℃に維持される。すなわち窓は
好ましくは変性温度に対応する温度に維持される。部材
１３４は、例えばニクロム線または慣用の方法によって
他の加熱要素により加熱される。

【０１３１】図２３を参照すると、ニクロム線加熱素子
を用いた加熱部材が示される。加熱部材は９個の窪みの
みを有する熱交換器を覆って示されているが、これは単
に図面を簡略化するためである。ニクロム線１３６は、
部材１３４に埋設するか、または表面に保持させてもよ
い。好ましくはこの線は、熱交換器の窪み上を通らない
ように配置され、而して励起および輻射光の光学経路を
妨害しないようになされる。該線は、素子１３４の温度
を所望の温度に維持する慣用の温度制御装置１３８に結
合されている。

【０１３２】ディスプレイは、標的配列の存在ならびに
その濃度を示す表示データのプロセッサに結合される。
更に、増幅の継続的測定（前述した）によって、検出さ
れた増幅の表示手段は、増幅の進行に従って表示されう
る。このことは温度サイクル時間の低減を可能にする。
例えば反応混合物が標的配列を含むことの決定を比較的
早い段階で行うことができる場合には、試料を取り出し
て他のものをその場所に設置することができる。これに
より処理量が増大する。このことは、熱交換器に異なる
反応混合物（例えば、遺伝性疾患についてのいくつかの
試験、ＨＩＶについてのいくつかの試験等）を９６ウエ
ルにのぼる数で負荷した場合、あるいは混合物が異なる
時間に負荷された場合に特に有利である。

【０１３３】上述したものは本発明の特定の実施態様の
詳細な説明である。本発明の範囲内において、開示され
た実施態様からの離脱も可能であり、また自明な修飾も
あり得ることは、当業者には理解される。本発明の範囲
の全体は、特許請求の範囲およびそれらの均等物により
与えられる。従って、特許請求の範囲および明細書は、
本発明に与えられる保護の全範囲を不当に狭めて解釈さ
れるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＰＣＲの連続的実時間観測を表すグ
ラフである。

【図２】 図２は、図１の１Ａ線部分の拡大図である。

【図３】 図３は、本発明の原理に基づく増幅装置の概
略構成図である。

【図４】 図４は、サーマルサイクラの熱交換ブロック
およびそのカバーを示すための図１のサーマルサイクラ
の断面拡大図である。

【図５】 図５は、図３に示す装置のブロックダイアグ
ラムである。

【図６】 図６は、ディスプレイ上に写る中間調画像の
写真であり、複数の反応混合物のデジタル化した像を示
す。

【図７】 図７は、単一の蛍光値を得るために平均化さ
れる選択された画素配列を例示する図である。

【図８】 図８は、周期毎の蛍光測定のドリフトを示す
グラフである。

【図９】 図９は、複数の蛍光プロフィルを示すグラフ
である。

【図１０】 図１０は、正規化した後の図９の蛍光値を
示すグラフである。

【図１１】 図１１は、ゲル電気泳動の写真であり、図
９および図１０のプロフィルに示される増幅生成物のゲ
ル電気泳動を示す。

【図１２】 図１２は、出発テンプレートコピー数の対
数と、選択された蛍光値に達するに要するサイクル数と
の関係を示すグラフである。

【図１３】 図１３は、ポリメラーゼ量の異なった反応
条件の効果を示す蛍光プロフィルのグラフである。

【図１４】 図１４は、プライマー濃度の異なった反応
条件の効果を示す蛍光プロフィルのグラフである。

【図１５】 図１５は、ＫＣｌ濃度の異なった反応条件
の効果を示す蛍光プロフィルのグラフである。

【図１６】 図１６は、ヘマチン濃度の異なった反応条
件の効果を示す蛍光プロフィルのグラフである。

【図１７】 図１７は、蛍光値を得るための工程の簡略
化されたフローチャートである。

【図１８】 図１８は、蛍光値を得るための工程の簡略
化されたフローチャートである。

【図１９】 図１９は、蛍光値を得るための工程の簡略
化されたフローチャートである。

【図２０】 図２０は、本発明の増幅装置の実施態様と
して励起光および輻射／蛍光検出器の配置を示す部分断
面図である。

【図２１】 図２１は、図２０の励起光および輻射／蛍
光検出器の配置を示す拡大した部分断面図である。

【図２２】 図２２は、本発明の原理に従って使用され
る光二色性鏡の例の透過性対波長曲線を示すグラフであ
る。

【図２３】 図２３は、本発明に基く反応混合物収容容
器上部の加熱窓の平面図である。

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 複数の核酸増幅反応を同時的に測定する
   装置であって：複数の窪みが形成された熱伝導部材を含
   むサーマルサイクラ；および前記窪みから輻射される光
   を同時に検出するように配置されるセンサーを有してな
   る核酸増幅反応測定装置。
2. 【請求項２】 前記サーマルサイクラと結合され、前記
   熱伝導部材の前記複数の窪みが形成された部分に光を分
   配するように配置された光源を更に有してなる請求項１
   に記載の核酸増幅反応測定装置。
3. 【請求項３】 各光輻射窪みに関し、前記センサーによ
   り検出される光の平均値を生成する手段を更に有する請
   求項１に記載の核酸増幅反応測定装置。
4. 【請求項４】 前記熱伝導部材に、複数のサイクル数で
   予め選択された温度対時間の様式に従って温度サイクル
   を与える手段、およびそれぞれ蛍光性結合試薬を含み、
   それぞれ別個の前記窪みに配置される複数の核酸増幅反
   応混合物を有し；前記光源は、前記熱伝導部材の部分お
   よび複数の反応混合物に本質的に均一な光線を与え；か
   つ前記センサーは、前記光線によって励起された各増幅
   反応混合物から放射される蛍光を同時に検出すべく前記
   熱伝導部材に光学的に結合されてなる、請求項１に記載
   の核酸増幅反応測定装置。
5. 【請求項５】 各励起反応混合物について、検出された
   蛍光に基づいて平均蛍光強度を生成する手段を更に有し
   てなる請求項４に記載の核酸増幅反応測定装置。
6. 【請求項６】 前記平均蛍光強度値から標準化蛍光強度
   値を生成する手段を更に有してなる請求項５に記載の核
   酸増幅版応測定装置。
7. 【請求項７】 サーマルサイクラの熱伝導部材の窪み
   は、核酸増幅反応混合物を入れる反応容器を収容すべく
   前記部材表面を通して形成され；および前記センサー
   は、前記反応容器が熱伝導部材の窪みに配置された場合
   に前記表面および反応容器の像を形成するように、前記
   熱伝導部材と光学的に結合される像形成装置であること
   を特徴とする請求項１に記載の核酸増幅反応測定装置。
8. 【請求項８】 前記熱伝導部材表面に光を供給すべく配
   置された光源を含んでなる請求項７に記載の核酸増幅反
   応測定装置。
9. 【請求項９】 前記光源が前記熱伝導部材表面に亘って
   本質的に均一に分配されるように配置される請求項８に
   記載の核酸増幅反応測定装置。
10. 【請求項１０】 前記光源が、ＵＶランプを含んでなる
    請求項８に記載の核酸増幅反応測定装置。
11. 【請求項１１】 前記像形成装置が、ＣＣＤ−像形成配
    列を含んでなる請求項７に記載の核酸増幅反応測定装
    置。
12. 【請求項１２】 サーマルサイクラの前記熱伝導部材
    は、それに形成され、核酸増幅反応混合物を受容するた
    めに適合する複数の窪みを有し、かつ該装置は、 前記
    熱伝導部材の上方に配置され、前記サーマルサイクラに
    結合されるハウジング；前記ハウジング内で前記窪みに
    向けて光を放射すべく配置された光源；および前記ハウ
    ジング内の前記窪みの上方に配置された光二色性鏡であ
    って、第１の波長を有する光について透過性であり、該
    第１の波長とは異なる第２の波長の光を反射する光二色
    性鏡を有してなり；ならびに前記センサーは、前記光二
    色性鏡の第２の面にて反射される光を受光すべく配置さ
    れてなることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅反
    応測定装置。
13. 【請求項１３】 前記光二色性鏡は、励起光源から生成
    される光波長に対応する波長を有する光について透過性
    であり、前記核酸増幅混合物が熱伝導部材に形成された
    窪みの一つに配置され前記励起光源からの光に曝された
    場合に蛍光性結合試薬を含む核酸増幅混合物から放射さ
    れる蛍光の波長に対応する波長の光を反射する光二色性
    鏡である請求項１２に記載の核酸増幅反応測定装置。
14. 【請求項１４】 前記光二色性鏡が、約２００−５５０
    ｎｍの範囲の波長を有する光について透過性である請求
    項１２に記載の核酸増幅反応測定装置。
15. 【請求項１５】 前記ハウジングが不透明材料を有し、
    前記光二色性鏡およびセンサーが配置される光−不漏チ
    ェンバを形成すべく構成される請求項１２に記載の核酸
    増幅反応測定装置。
16. 【請求項１６】 前記熱伝導部材が、上部表面を有し、
    前記光二色性鏡が前記上部表面に対して約４５°の角度
    をなす請求項１２に記載の核酸増幅反応測定装置。
17. 【請求項１７】 前記センサーが、荷電結合装置を含ん
    でなる請求項１２に記載の核酸増幅反応測定装置。
18. 【請求項１８】 前記光源の一つに組み合わされるシャ
    ッター、および予め選択される間隔をもって前記窪みを
    前記光源に露出することを許容するハウジングを含んで
    なる請求項１２に記載の核酸増幅反応測定装置。
19. 【請求項１９】 透明材料を有する窓およびそれに結合
    される加熱要素を更に含み、前記窓は前記窪みの上方、
    かつ前記光二色性鏡の下方に配置される請求項１２に記
    載の核酸増幅反応測定装置。
20. 【請求項２０】 前記光二色性鏡と前記センサーとの間
    に配置される対物レンズを更に有してなる請求項１２に
    記載の核酸増幅反応測定装置。
21. 【請求項２１】 前記センサーに結合されるフィルター
    ホイールを更に含んでなる請求項２１に記載の核酸増幅
    反応測定装置。
22. 【請求項２２】 サーマルサイクラの前記熱伝導部材
    は、それに形成され、核酸配列および蛍光性結合試薬を
    含む核酸増幅反応混合物を受容するために適合する複数
    の窪みを有し、かつ該装置は、 前記熱伝導部材の上方に配置され、前記サーマルサイク
    ラに結合されるハウジング；前記ハウジング内で光を放
    射すべく配置された光源；前記ハウジング内に配置され
    るセンサー；および前記ハウジング内の前記窪みの上方
    に配置された光二色性鏡であって、励起光源から生成さ
    れる光波長に対応する波長を有する光について透過性で
    あり、前記核酸増幅混合物が熱伝導部材に形成された窪
    みの一つに配置され前記励起光源からの光に曝された場
    合に蛍光性結合試薬を含む核酸増幅混合物から放射され
    る蛍光の波長に対応する波長の光を反射する光二色性鏡
    を有してなり、前記鏡が、前記窪みと前記センサーとの
    間に光路を形成すべく配向されてなることを特徴とする
    請求項１に記載の核酸増幅反応測定装置。
23. 【請求項２３】 前記光二色性鏡が第１の表面および第
    ２の表面を有し、前記第１の表面は全体に前記光源に面
    し、前記第２の表面は全体に前記窪みおよびセンサーに
    面してなる請求項２２に記載の核酸増幅反応測定装置。
24. 【請求項２４】 試料中の特定核酸配列定量に際して、 それぞれ異なる既知濃度の特定の核酸配列、および蛍光
    性結合試薬を含む複数の増幅反応混合物を与え；未知濃
    度の前記特定の核酸配列、および蛍光性結合試薬を含む
    増幅反応混合物を与え；前記既知および未知濃度の増幅
    反応混合物を、並行して複数サイクルについて熱サイク
    ルに付し；各反応混合物が、所定の強度をもって蛍光を
    発するに要するサイクル数を測定し、 未知核酸濃度の混合物について前記値に達するために要
    するサイクル数を、既知核酸濃度の混合物について前記
    値に達するために要するサイクル数と比較し、未知濃度
    の混合物中の前記特定の核酸配列の初期量を得ることを
    含んでなる特定核酸配列の定量方法。