JPH0427399A - エプシュタイン・バール・ウイルスの同時型別検出法およびｄｎａ配列 - Google Patents
エプシュタイン・バール・ウイルスの同時型別検出法およびｄｎａ配列Info
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- JPH0427399A JPH0427399A JP13361890A JP13361890A JPH0427399A JP H0427399 A JPH0427399 A JP H0427399A JP 13361890 A JP13361890 A JP 13361890A JP 13361890 A JP13361890 A JP 13361890A JP H0427399 A JPH0427399 A JP H0427399A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
１東上二上月±１
本発明はエプシュタイン・バール・ウィルスの同時型別
検圧法およびそれに用いるＤＮＡ配列に関する。
検圧法およびそれに用いるＤＮＡ配列に関する。
良米立弦１
エプシュタイン・バール・ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ、以下ＥＢＶと略記）は人類に広
く蔓延しているヘルペス属のウィルスの一種である。日
本人ではほとんどの人が乳幼児期に不顕性の初感染を終
え、免疫を獲得する。しかしその後もウィルスは一生に
わたり体内に潜伏感染し、間欠的に唾液中に産生放出き
れてくる。初感染が／４％児期を越えて起こるとかなり
重篤な急性ＥＢＶ感染症である伝染性単核症を発症する
。またＥＢＶは特異な地理的分布を示すバーキットリン
パ腫や上咽頭癌の発症と密接に関わっているｅ最近では
更にホジキン病（Ｂ’Ｊンパ腫の一種）、進行性鼻環［
（ＴＩＪンパ腫の一種）、臓器移植後の免疫抑制療法や
ＨＩＶ感染に伴う免疫不全状態で発症する悪性リンパ腫
、なとの発症にもＥＢＶが密接に関与していることが明
らかにきれている。
Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ、以下ＥＢＶと略記）は人類に広
く蔓延しているヘルペス属のウィルスの一種である。日
本人ではほとんどの人が乳幼児期に不顕性の初感染を終
え、免疫を獲得する。しかしその後もウィルスは一生に
わたり体内に潜伏感染し、間欠的に唾液中に産生放出き
れてくる。初感染が／４％児期を越えて起こるとかなり
重篤な急性ＥＢＶ感染症である伝染性単核症を発症する
。またＥＢＶは特異な地理的分布を示すバーキットリン
パ腫や上咽頭癌の発症と密接に関わっているｅ最近では
更にホジキン病（Ｂ’Ｊンパ腫の一種）、進行性鼻環［
（ＴＩＪンパ腫の一種）、臓器移植後の免疫抑制療法や
ＨＩＶ感染に伴う免疫不全状態で発症する悪性リンパ腫
、なとの発症にもＥＢＶが密接に関与していることが明
らかにきれている。
最近ＥＢＶにはＡ型とＢ型の２型が存在することが見出
され、それぞれの型の分布の違いや疾患特異性が注目き
れている。ＥＢＶの分離は正常ヒト末梢血８９２３球の
形質転換により行なわれるが、この方法は期間が数週間
以上に及ぶ上、Ｂ型は形質転換能が低いため分離しにく
い。そこでＥＢＶの検出は従来主に核抗［（ＥＢＮＡ）
などの検出により行なわれてきた。また最近ではＥＢＶ
のＤＮＡを直接検出するサザン法も用いられる。
され、それぞれの型の分布の違いや疾患特異性が注目き
れている。ＥＢＶの分離は正常ヒト末梢血８９２３球の
形質転換により行なわれるが、この方法は期間が数週間
以上に及ぶ上、Ｂ型は形質転換能が低いため分離しにく
い。そこでＥＢＶの検出は従来主に核抗［（ＥＢＮＡ）
などの検出により行なわれてきた。また最近ではＥＢＶ
のＤＮＡを直接検出するサザン法も用いられる。
Ｔｉｍｏｔｙ Ｄａｍｂａｕｇｈらは、ＥＢＶのＡ型（
Ｂ９５−８）とＢ型（ＡＧ８７６）のＵ２領域の塩基配
列を報告した（ＰｒｏｃＮａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳＡ、 Ｖｏｌ、 ８１． ｐｐ、 ７６３２
−７６３６（１９８４））。ＥＢＮＡ２タンパクは、前
記文献中のＦｉｇ、 １の１４９８番の塩基から２９６
７番の塩基までの全長１４７０塩基にコードきれる４９
０アミノ酸よりなるタンパク質と推定きれている。Ａ型
とＢ型でＵ２領域の塩基配列を比較すると、Ａ型とＢ型
の間でＥＢＮＡ２領域に多数の塩基の変異が見られ、さ
らにＡ型で４ケ所、Ｂ型で２ケ所、それぞれ異なる部位
に遺伝子欠損領域が見られる。
Ｂ９５−８）とＢ型（ＡＧ８７６）のＵ２領域の塩基配
列を報告した（ＰｒｏｃＮａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳＡ、 Ｖｏｌ、 ８１． ｐｐ、 ７６３２
−７６３６（１９８４））。ＥＢＮＡ２タンパクは、前
記文献中のＦｉｇ、 １の１４９８番の塩基から２９６
７番の塩基までの全長１４７０塩基にコードきれる４９
０アミノ酸よりなるタンパク質と推定きれている。Ａ型
とＢ型でＵ２領域の塩基配列を比較すると、Ａ型とＢ型
の間でＥＢＮＡ２領域に多数の塩基の変異が見られ、さ
らにＡ型で４ケ所、Ｂ型で２ケ所、それぞれ異なる部位
に遺伝子欠損領域が見られる。
最近開発されたＰＣＲ法は少量のＤＮＡを高感度に検出
できる優れた方法であり、ＥＢＶの検出にも応用が期待
できる。Ｊｏｈｎ Ｗ、 ５ｉｘｂｅｙらは、ＥＢＶの
検出にＰＣＲ法を応用し、Ａ型とＢ型にそれぞれ特異的
なプローブを用いて、Ａ型とＢ型を別個に検出する方法
を報告している＜ＴＨＥ ＬＡＮＣＥＴ。
できる優れた方法であり、ＥＢＶの検出にも応用が期待
できる。Ｊｏｈｎ Ｗ、 ５ｉｘｂｅｙらは、ＥＢＶの
検出にＰＣＲ法を応用し、Ａ型とＢ型にそれぞれ特異的
なプローブを用いて、Ａ型とＢ型を別個に検出する方法
を報告している＜ＴＨＥ ＬＡＮＣＥＴ。
ＳＥＰＴＥＭＰＥＲ３０，１９８９，ｐｐ、７６１−７
６５）。
６５）。
明が解決しようとする課
第２図に５ｉｘｂｅｙら（前出）がＥＢＶの検出に用い
たプライマーおよびプローブの位置を示している。
たプライマーおよびプローブの位置を示している。
領域はＵ２領域中のＥＢＮＡ２領域である。彼等の方法
では、まずＡ型およびＢ型に共通な５′側プライマ〜２
３９５と３′側プライマー２４８３で増幅する。両型と
もに８９塩基対のバンドが得られる。型判定には、寛気
泳動後すザンプロットを行ない、ラジオアイントーブで
ラベルしたＡ型とＢ型にそれぞれ特異的ナフローブ２Ａ
と２Ｂを用いてハイブリダイゼーションを行なうことが
必要である。
では、まずＡ型およびＢ型に共通な５′側プライマ〜２
３９５と３′側プライマー２４８３で増幅する。両型と
もに８９塩基対のバンドが得られる。型判定には、寛気
泳動後すザンプロットを行ない、ラジオアイントーブで
ラベルしたＡ型とＢ型にそれぞれ特異的ナフローブ２Ａ
と２Ｂを用いてハイブリダイゼーションを行なうことが
必要である。
従っ工、ＥＢＶの検出と同時に型判定もできる、より簡
便なＥＢＶの検出法が待望きれていた。
便なＥＢＶの検出法が待望きれていた。
課 を解決するための手段
本発明者らは、ＥＢＶのＡ型およびＢ型のＤＮＡ配列を
比較すると、一方の型で特異的にＤＮＡ配列が欠失また
は挿入している部分があることに着目し、このような領
域をＰＣＲ法により増幅すれば、増幅されたＤＮＡの分
子量の違いにより型を判別することができることを見出
し、本発明を完成した。
比較すると、一方の型で特異的にＤＮＡ配列が欠失また
は挿入している部分があることに着目し、このような領
域をＰＣＲ法により増幅すれば、増幅されたＤＮＡの分
子量の違いにより型を判別することができることを見出
し、本発明を完成した。
本発明は、ＰＣＲ法により、検体中のＤＮＡのうち、エ
プシュタイン・バール・ウィルスのＡ型またはＢ型のい
ずれか一方に欠失または挿入を有するＤＮＡ領域を、Ａ
型およびＢ型に共通のプライマーを用いて増幅妨せ、増
幅されたＤＮＡを検出すると同時に、検出されたＤＮＡ
の分子量に基づきＡ型またはＢ型の判定を行なうエプシ
ュタイン・バール・ウィルスの同時型別検出法を提供す
る。
プシュタイン・バール・ウィルスのＡ型またはＢ型のい
ずれか一方に欠失または挿入を有するＤＮＡ領域を、Ａ
型およびＢ型に共通のプライマーを用いて増幅妨せ、増
幅されたＤＮＡを検出すると同時に、検出されたＤＮＡ
の分子量に基づきＡ型またはＢ型の判定を行なうエプシ
ュタイン・バール・ウィルスの同時型別検出法を提供す
る。
ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チエイン・リアクション）法は
、広く一般に用いられるＩ）ＮＡの増幅法であり、例え
ば、特開昭６１−２７４６９７、特開昭６２−２８１．
特開昭６２−２１４３５５、特開昭６２−２４０８６２
、特開昭６３−１０２６７７に記載されている。
、広く一般に用いられるＩ）ＮＡの増幅法であり、例え
ば、特開昭６１−２７４６９７、特開昭６２−２８１．
特開昭６２−２１４３５５、特開昭６２−２４０８６２
、特開昭６３−１０２６７７に記載されている。
末法によれば、まず、検体中のＤＮＡのうち、エプシュ
タイン・バール・ウィルスのＡ型またはＢ型のいずれか
一方に欠失を有するＤＮＡ領域を、Ａ型およびＢ型に共
通のプライマーを用いて増幅させる。
タイン・バール・ウィルスのＡ型またはＢ型のいずれか
一方に欠失を有するＤＮＡ領域を、Ａ型およびＢ型に共
通のプライマーを用いて増幅させる。
検体としては、血液、唾液、その他の体液、手術やバイ
オプシーにより得た細胞や組織片などが挙げられる。
オプシーにより得た細胞や組織片などが挙げられる。
検体からのＤＮＡの分離は、常法に従い行なえばよい。
例えば、バイオプシーにより得た新鮮、凍結あるいはホ
ルマリンなどで固定した組織片からのＤＮＡの分離は、
ＳＤＳ存在下で蛋白分解酵素及びＲＮＡ分解酵素処理を
行ない、フェノール・クロロホルム抽出後、エタノール
沈殿により行なう。ＲＮＡ分解酵素処理は省いてもよい
。また、北程度の塩酸グアニジンで溶解して直接エタノ
ール沈殿でＤＮＡを分離することもできる。細胞からの
ＤＮＡの分離は、上記組織片と同様に行なえばよいが、
また、１０００個程度０少数の細胞であれば１００℃で
１０分間程度煮沸するだけでも充分である。血液からの
ＤＮＡの分離は、血液から比重遠心法でリンパ球を分離
した後、上記細胞からのＤＮＡの分離と同様にして行な
う。体液からのＤＮＡの分離は、適当な方法で体液を濃
縮するか超遠心でＥＢＶ粒子を沈殿きせた後、上記細胞
からのＤＮＡの分離と同様にして行なう。
ルマリンなどで固定した組織片からのＤＮＡの分離は、
ＳＤＳ存在下で蛋白分解酵素及びＲＮＡ分解酵素処理を
行ない、フェノール・クロロホルム抽出後、エタノール
沈殿により行なう。ＲＮＡ分解酵素処理は省いてもよい
。また、北程度の塩酸グアニジンで溶解して直接エタノ
ール沈殿でＤＮＡを分離することもできる。細胞からの
ＤＮＡの分離は、上記組織片と同様に行なえばよいが、
また、１０００個程度０少数の細胞であれば１００℃で
１０分間程度煮沸するだけでも充分である。血液からの
ＤＮＡの分離は、血液から比重遠心法でリンパ球を分離
した後、上記細胞からのＤＮＡの分離と同様にして行な
う。体液からのＤＮＡの分離は、適当な方法で体液を濃
縮するか超遠心でＥＢＶ粒子を沈殿きせた後、上記細胞
からのＤＮＡの分離と同様にして行なう。
エプシュタイン・バール・ウィルスのＡ型またはＢ型の
いずれか一方に欠失または挿入を有するＤＮＡ領域とし
ては、特に限定されるものではないが前ｋＰｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ、 Ｖｏ
ｌ、 ８１゜ｐｌ）、 ７６３２−７６３６（１９８４
）に記載のＵ２領域が挙げられる。さらに詳細には、１
６６９位−１７５５位のＢ型が欠失を有するＤＮＡ領域
、３０７０位−３０７１位のＢ型が挿入を有する（逆に
言えばＡ型が欠失を有する）ＤＮＡ領域が好ましい（本
明細書中、ＤＮＡの番号は上記文献に従う）。
いずれか一方に欠失または挿入を有するＤＮＡ領域とし
ては、特に限定されるものではないが前ｋＰｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ、 Ｖｏ
ｌ、 ８１゜ｐｌ）、 ７６３２−７６３６（１９８４
）に記載のＵ２領域が挙げられる。さらに詳細には、１
６６９位−１７５５位のＢ型が欠失を有するＤＮＡ領域
、３０７０位−３０７１位のＢ型が挿入を有する（逆に
言えばＡ型が欠失を有する）ＤＮＡ領域が好ましい（本
明細書中、ＤＮＡの番号は上記文献に従う）。
これらのＤＮＡ領域を増幅させるだめのＡ型およびＢ型
に共通のプライマーとしては、例えは１６６９位−１７
５５位のＢ型が欠失を有するＤＮＡ領域を増幅させる場
合、センスプライマーとして１４２３位−１４４３位、
１４４４位−１４６３位、１４７１位−１４９０位、１
５６６位−１５８３位などに対応するプライマーを用い
、アンチセンスプライマーとして１８１６位−１８３５
位に対応するプライマーを用いることができる。また、
３０７０位−３０７１位のＢ型が挿入を有するＤＮＡ領
域を増幅させる場合、センスプライマーとして２７７１
位−２７８９位、２９９４位−３０１３位などに対応す
るプライマーを用い、アンチセンスプライマーとして３
０７７位−３０９５位、３１３０位−３１４９位なとに
対応するプライマーを用いることができる。
に共通のプライマーとしては、例えは１６６９位−１７
５５位のＢ型が欠失を有するＤＮＡ領域を増幅させる場
合、センスプライマーとして１４２３位−１４４３位、
１４４４位−１４６３位、１４７１位−１４９０位、１
５６６位−１５８３位などに対応するプライマーを用い
、アンチセンスプライマーとして１８１６位−１８３５
位に対応するプライマーを用いることができる。また、
３０７０位−３０７１位のＢ型が挿入を有するＤＮＡ領
域を増幅させる場合、センスプライマーとして２７７１
位−２７８９位、２９９４位−３０１３位などに対応す
るプライマーを用い、アンチセンスプライマーとして３
０７７位−３０９５位、３１３０位−３１４９位なとに
対応するプライマーを用いることができる。
これらのプライマーは、下記のＤＮＡ配列を有し、プラ
イマーＡ−Ｅ、プライマーＧ−Ｊと命名された。
イマーＡ−Ｅ、プライマーＧ−Ｊと命名された。
１４２３位−１４４３位ニプライマーＥ５’−ＡＣＣＴ
ＧＴＧＧＩＴＧＧＧＣＡＧＧ’ＩＡＣＡ−３１４４４位
−１４６３位ニプライマーＣ５’−ＴＧＣＣＡＡＣＡＡ
ＣＣＩＴＣＩＡＡＧＣＡ−３１４７１位−１４９０４９
０位ニブライマーＢ５ＧＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＡＴＣ
？ＧＣ−３１５６６位−１５８３位ニプライマーＡ５’
−ＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣｒ（ＪＣ−３１８１６
位−１８３５位ニプライマーＤ５’−ＧＧＣＩＣＩＩＧ
ＴＧＴＣＣＡＧＧＣＡＴＣ−３２７７１位−２７８９位
ニプライマーＪ５’−ＩＴＴＣＡＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧ
ＡＡＣＣ−３２９９４位−３０１３位ニプライマー〇５
’−ＣＡＡＴＧＴＡ’ｆＣＣＣＡＡＡＩＡＡＡＴＧ−３
３０７７位−３０９５位ニプライマーＨ５’−ＧＩＴＧ
ＧＴＧＧＡＡＴＡＧＣＴＡＡＡＣ−３３１３０位−３１
４９位：プライマーエ５’−ＴＧＧＣＡＡＡＧＴＧＣＴ
ＧＡＧＡＧＣＡＡ−３これらのプライマーは、上記のＤ
ＮＡ配列を全て有している必要はなく、プライマーとし
て特異的に機能する鎖長を有していれば充分であり、上
記ＤＮＡ配列のうち連続した１６塩基以上を含むもので
あればよい。もちろん、上記ＤＮＡ配列すべてを含むさ
らに長鎖のＤＮＡ配列をプライマーとして用いてもよい
。
ＧＴＧＧＩＴＧＧＧＣＡＧＧ’ＩＡＣＡ−３１４４４位
−１４６３位ニプライマーＣ５’−ＴＧＣＣＡＡＣＡＡ
ＣＣＩＴＣＩＡＡＧＣＡ−３１４７１位−１４９０４９
０位ニブライマーＢ５ＧＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＡＴＣ
？ＧＣ−３１５６６位−１５８３位ニプライマーＡ５’
−ＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣｒ（ＪＣ−３１８１６
位−１８３５位ニプライマーＤ５’−ＧＧＣＩＣＩＩＧ
ＴＧＴＣＣＡＧＧＣＡＴＣ−３２７７１位−２７８９位
ニプライマーＪ５’−ＩＴＴＣＡＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧ
ＡＡＣＣ−３２９９４位−３０１３位ニプライマー〇５
’−ＣＡＡＴＧＴＡ’ｆＣＣＣＡＡＡＩＡＡＡＴＧ−３
３０７７位−３０９５位ニプライマーＨ５’−ＧＩＴＧ
ＧＴＧＧＡＡＴＡＧＣＴＡＡＡＣ−３３１３０位−３１
４９位：プライマーエ５’−ＴＧＧＣＡＡＡＧＴＧＣＴ
ＧＡＧＡＧＣＡＡ−３これらのプライマーは、上記のＤ
ＮＡ配列を全て有している必要はなく、プライマーとし
て特異的に機能する鎖長を有していれば充分であり、上
記ＤＮＡ配列のうち連続した１６塩基以上を含むもので
あればよい。もちろん、上記ＤＮＡ配列すべてを含むさ
らに長鎖のＤＮＡ配列をプライマーとして用いてもよい
。
これらのプライマーの組合わせとしては、Ａとり、Ｂと
ＤＳ Ｃとり、Ｅとり、、ＪとＨ，ＪとＩ、ＧとＨ，Ｇ
と１がある。これらのうちでは、検出感度や特異的増幅
の程度を検討した結果、ＪとＨあるいはＪと工が最も好
ましい組合わせであった。
ＤＳ Ｃとり、Ｅとり、、ＪとＨ，ＪとＩ、ＧとＨ，Ｇ
と１がある。これらのうちでは、検出感度や特異的増幅
の程度を検討した結果、ＪとＨあるいはＪと工が最も好
ましい組合わせであった。
これらのプライマーの調製は、常法に従えばよく、例え
は、β−Ｌｉｎｋベータシアノエチルホスホアミダイト
試薬（ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社製）を
用いて、ＤＮＡ合成機Ｃｙｃｌｏｎｅ（Ｂｉｏｓｅａｒ
ｃｈ社製）により所望のＤＮＡ配列のプライマーを調製
する。得られたプライマーの精製は、例えば、（１）逆
相カラムＨＰＬＣ１■Ｎａｎ５ｏｒｂ（第一化学）、０
ＰＣ（ＡＢＩ）、０ＬＩＧｏ−ＰＡＣ（Ｂｉｏｓｅａｒ
ｃｈ）などのＤＮＡ精製用のディスポーザルカラムを用
いる方法、０）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法など
により行なうことができる。
は、β−Ｌｉｎｋベータシアノエチルホスホアミダイト
試薬（ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社製）を
用いて、ＤＮＡ合成機Ｃｙｃｌｏｎｅ（Ｂｉｏｓｅａｒ
ｃｈ社製）により所望のＤＮＡ配列のプライマーを調製
する。得られたプライマーの精製は、例えば、（１）逆
相カラムＨＰＬＣ１■Ｎａｎ５ｏｒｂ（第一化学）、０
ＰＣ（ＡＢＩ）、０ＬＩＧｏ−ＰＡＣ（Ｂｉｏｓｅａｒ
ｃｈ）などのＤＮＡ精製用のディスポーザルカラムを用
いる方法、０）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法など
により行なうことができる。
これらのプライマーを用いるＤＮＡの増幅は、通常のＰ
ＣＨ法の条件下で行なえばよい。検体中のＤＮＡ量は０
５μｇ程度を基準とするが、それ以下でもよい。プライ
マーの濃度は、１０−１００９Ｍ程度が好ましい。好ま
しいＰＣＨの条件は、デナテユレーション９４℃前後・
１〜５分、アニーリング４５〜５５℃・１〜５分、ポリ
メリゼーション７２°ＣＭ後・１〜１０分で２５〜５０
サイクルである。また、全サイクルが終わった後で反応
液を１０００〜ｔｏｏｏｏ倍程に希釈して再度同じプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅を繰り返すことにより、感度
をさらに上げることができる。
ＣＨ法の条件下で行なえばよい。検体中のＤＮＡ量は０
５μｇ程度を基準とするが、それ以下でもよい。プライ
マーの濃度は、１０−１００９Ｍ程度が好ましい。好ま
しいＰＣＨの条件は、デナテユレーション９４℃前後・
１〜５分、アニーリング４５〜５５℃・１〜５分、ポリ
メリゼーション７２°ＣＭ後・１〜１０分で２５〜５０
サイクルである。また、全サイクルが終わった後で反応
液を１０００〜ｔｏｏｏｏ倍程に希釈して再度同じプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅を繰り返すことにより、感度
をさらに上げることができる。
増幅されたＤＮＡの検出は、通常の方法で行なえばよく
、例えばＤＮＡをポリアクリルアミドゲルまたはアガロ
ースゲル電気泳動後、エチジウムプロミド染色して紫外
線照射により検出する。また、電気泳動後、ゲルからサ
ザンブロット法によりＤＮＡを膜上に移し取り、ラベル
したプローブとハイブリダイズきせて検出することがで
きる。
、例えばＤＮＡをポリアクリルアミドゲルまたはアガロ
ースゲル電気泳動後、エチジウムプロミド染色して紫外
線照射により検出する。また、電気泳動後、ゲルからサ
ザンブロット法によりＤＮＡを膜上に移し取り、ラベル
したプローブとハイブリダイズきせて検出することがで
きる。
プローブのラベルとしては、放射性アイソトープ、螢光
色素、ビオチン化などがある。また、予めラベルしたプ
ライマーを用いてＰＣＲを行なうと増幅ＤＮＡは既にラ
ベルされた状態になるのでそれをゲルのままあるいはサ
ザン法で膜に移し取って検出する。ラベルとしては、放
射性アイソトープ、螢光色素、ビオチン化などがある。
色素、ビオチン化などがある。また、予めラベルしたプ
ライマーを用いてＰＣＲを行なうと増幅ＤＮＡは既にラ
ベルされた状態になるのでそれをゲルのままあるいはサ
ザン法で膜に移し取って検出する。ラベルとしては、放
射性アイソトープ、螢光色素、ビオチン化などがある。
検出されたＤＮＡは、検出と同時に、その分子量に基づ
きＡ型またはＢ型の判定を行なう。上記のプライマーＪ
とＩを用いる場合には、Ａ型では３７９塩基対のバンド
が、Ｂ型では４８４塩基のバンドが増幅きれる。このよ
うに、増幅バンドのサイズの違いによりＥＢＶの検出と
同時に型判定をすることができる。
きＡ型またはＢ型の判定を行なう。上記のプライマーＪ
とＩを用いる場合には、Ａ型では３７９塩基対のバンド
が、Ｂ型では４８４塩基のバンドが増幅きれる。このよ
うに、増幅バンドのサイズの違いによりＥＢＶの検出と
同時に型判定をすることができる。
これらの検出および型判定は、エチジウムプロミド染色
でも充分であるが、サザンブロットを行ない、ラジオア
イソトープあるいはその他の方法で標識したプローブで
検出することにより、さらに検出感度を高めることがで
きる０例えば、プライマーＪと１を用いる場合には、プ
ライマーＧおよび／またはＨを標識してプローブとする
ことができる（第１図参照）。また、プライヤーＪとＨ
を用いる場合には、プライマーＧを標識してプローブと
することができる。
でも充分であるが、サザンブロットを行ない、ラジオア
イソトープあるいはその他の方法で標識したプローブで
検出することにより、さらに検出感度を高めることがで
きる０例えば、プライマーＪと１を用いる場合には、プ
ライマーＧおよび／またはＨを標識してプローブとする
ことができる（第１図参照）。また、プライヤーＪとＨ
を用いる場合には、プライマーＧを標識してプローブと
することができる。
以下に、実施例により本発明をきらに詳細に説明するが
、本発明を限定するものではない。
、本発明を限定するものではない。
Ｋ墓！
プライマーは、ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ
社製のβ−Ｌｉｎｋベータシアノエチルホスホアミダイ
ト試薬を用い、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社のＤＮＡ合成機（
ｙｃｌｏｎｅにより合成した。合成されたＤＮＡはＮｅ
ｎ５ｏｒｂ（第一化学社製）を用いて精製した。
社製のβ−Ｌｉｎｋベータシアノエチルホスホアミダイ
ト試薬を用い、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社のＤＮＡ合成機（
ｙｃｌｏｎｅにより合成した。合成されたＤＮＡはＮｅ
ｎ５ｏｒｂ（第一化学社製）を用いて精製した。
旦Ｊノロ１隻遵
細胞あるいは組織からのＤＮＡの分離はＳＤＳ存在下で
蛋白分解酵素及びＲＮＡ分解酵素処理を行ない、フェノ
ール・クロロホルム抽出１．エタノール沈殿により行な
った。唾液からのＤＮＡの分離は、超遠心の後、ＳＤＳ
存在下で蛋白分解酵３１Ｌ理、フェノール争クロロホル
ム抽出、エタノール沈殿により行なった。
蛋白分解酵素及びＲＮＡ分解酵素処理を行ない、フェノ
ール・クロロホルム抽出１．エタノール沈殿により行な
った。唾液からのＤＮＡの分離は、超遠心の後、ＳＤＳ
存在下で蛋白分解酵３１Ｌ理、フェノール争クロロホル
ム抽出、エタノール沈殿により行なった。
ＰＣＨ
ＰＣＨの条件は、デナチュレーション９４℃１分、アニ
ーリング５１℃１分、ポリメリゼーション７２℃２分で
４０サイクル行なった。その後、 ６％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で増幅バンドを分離しエチジウムプロ
ミドで染色した。プライマーとしては、プライマーＪと
Ｉを用いた。
ーリング５１℃１分、ポリメリゼーション７２℃２分で
４０サイクル行なった。その後、 ６％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で増幅バンドを分離しエチジウムプロ
ミドで染色した。プライマーとしては、プライマーＪと
Ｉを用いた。
級Ｌ
Ａ型標準検体としてはＡ型ＥＢＶを保有する細胞株Ｂ９
５−９及びＲａｊｉのＤＮＡ、 Ｂ型標準検体としては
Ｂ型ＥＢＶを保有する細胞株Ｊｉｊｏｙｅ及びＡＧ８７
６のＤＮＡ 。
５−９及びＲａｊｉのＤＮＡ、 Ｂ型標準検体としては
Ｂ型ＥＢＶを保有する細胞株Ｊｉｊｏｙｅ及びＡＧ８７
６のＤＮＡ 。
また陰性検体としてはＥＢＶを保有していない細胞株Ｂ
ｒＡＢ及びに５６２のＤＮＡを用いた。標準検体を用い
た検討では、エチジウムプロミド染色のレベルで、Ａ型
標準検体で３３０塩基対付近に、またＢ型標準検体で４
６０塩基対付近に増幅バンドが認められ、一方陰性検体
ではいずれの増幅バンドも見られなかった。
ｒＡＢ及びに５６２のＤＮＡを用いた。標準検体を用い
た検討では、エチジウムプロミド染色のレベルで、Ａ型
標準検体で３３０塩基対付近に、またＢ型標準検体で４
６０塩基対付近に増幅バンドが認められ、一方陰性検体
ではいずれの増幅バンドも見られなかった。
さらに、増幅バンドは、サザンプロットによりプローブ
Ｇと反応することが確０ξれた。
Ｇと反応することが確０ξれた。
次に臨床検体を用いた検討を行なった。まず、悪性腫瘍
で、悪性リンパ腫３例中１例にＡ型、上咽頭癌１１例中
８例にＡ型、１例にＢ型を検出した。ＥＢＶの検出に関
しては並行して行なった標準的な廿ザンプロット法の結
果と完全に一致していた。また、各種耳鼻咽喉科領域疾
患患者の唾液よりのＥＢＶの検出では２８例中７例にＡ
型を検出した。
で、悪性リンパ腫３例中１例にＡ型、上咽頭癌１１例中
８例にＡ型、１例にＢ型を検出した。ＥＢＶの検出に関
しては並行して行なった標準的な廿ザンプロット法の結
果と完全に一致していた。また、各種耳鼻咽喉科領域疾
患患者の唾液よりのＥＢＶの検出では２８例中７例にＡ
型を検出した。
λ且二皇玉
本発明のＥＢＶの同時型別検出法により、微量の検体か
ら極めて高感度に短時間でＥＢＶのＤＮＡを検出すると
同時に型判定することが可能となった。これによりＥＢ
Ｖ感染が疑われる急性及び慢性の感染症、ＥＢＶ感染の
関与が疑われる各種悪性ｍｓ、各種慢性疾患などでＥＢ
Ｖのゲノムの検出と型判定を迅速高感度に行なうことが
可能となり、本発明の方法はＥＢＶが関連する疾患の診
断や治療、またＥＢＶの疫学的研究に大きく貢献するも
のである。
ら極めて高感度に短時間でＥＢＶのＤＮＡを検出すると
同時に型判定することが可能となった。これによりＥＢ
Ｖ感染が疑われる急性及び慢性の感染症、ＥＢＶ感染の
関与が疑われる各種悪性ｍｓ、各種慢性疾患などでＥＢ
Ｖのゲノムの検出と型判定を迅速高感度に行なうことが
可能となり、本発明の方法はＥＢＶが関連する疾患の診
断や治療、またＥＢＶの疫学的研究に大きく貢献するも
のである。
第１図は、本発明のプライマーＪおよびＩおよびプロー
ブＧおよびＨの位置を示す。 第２図は、５ｉｘｂａｙらが用し）たプライマーおよび
プローブの位置を示す。
ブＧおよびＨの位置を示す。 第２図は、５ｉｘｂａｙらが用し）たプライマーおよび
プローブの位置を示す。
Claims (6)
- （１）ＰＣＲ法により、検体中のＤＮＡのうち、エプシ
ュタイン・バール・ウィルスのＡ型またはＢ型のいずれ
か一方に欠失または挿入を有するＤＮＡ領域を、Ａ型お
よびＢ型に共通のプライマーを用いて増幅させ、増幅さ
れたＤＮＡを検出すると同時に、検出されたＤＮＡの分
子量に基づきＡ型またはＢ型の判定を行なうエプシュタ
イン・バール・ウィルスの同時型別検出法。 - （２）該ＤＮＡ領域がＵ２領域である請求項１に記載の
検出法。 - （３）該挿入が第１図に記載のＢ型の挿入である請求項
１に記載の検出法。 - （４）該プライマーがＤＮＡ配列； ５’ＴＴＴＣＡＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＡＡＣＣ３’のう
ち連続した１６塩基以上からなる部分を含むプライマー
およびＤＮＡ配列； ５’ＴＧＧＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＧＡＧＣＡＡ３’の
うち連続した１６塩基以上からなる部分を含むプライマ
ーである請求項１に記載の検出法。 - （５）該プライマーがＤＮＡ配列； ５’ＴＴＴＣＡＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＡＡＣＣ３’のう
ち連続した１６塩基以上からなる部分を含むプライマー
およびＤＮＡ配列； ５’ＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＧＣＴＡＡＡＣ３’のう
ち連続した１６塩基以上からなる部分を含むプライマー
である請求項１に記載の検出法。 - （６）以下のＤＮＡ配列からなる群から選択されるＤＮ
Ａ配列。 （ａ）ＤＮＡ配列； ５’ＴＴＴＣＡＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＡＡＣＣ３’のう
ち連続した１６塩基以上からなる部分を含むＤＮＡ配列
、 （ｂ）ＤＮＡ配列； ５’ＴＧＧＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＧＡＧＣＡＡ３’の
うち連続した１６塩基以上からなる部分を含むＤＮＡ配
列、および （ｃ）ＤＮＡ配列； ５’ＧＴＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＧＣＴＡＡＡＣ３’のう
ち連続した１６塩基以上からなる部分を含むＤＮＡ配列
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13361890A JPH0427399A (ja) | 1990-05-23 | 1990-05-23 | エプシュタイン・バール・ウイルスの同時型別検出法およびｄｎａ配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13361890A JPH0427399A (ja) | 1990-05-23 | 1990-05-23 | エプシュタイン・バール・ウイルスの同時型別検出法およびｄｎａ配列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0427399A true JPH0427399A (ja) | 1992-01-30 |
Family
ID=15109033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13361890A Pending JPH0427399A (ja) | 1990-05-23 | 1990-05-23 | エプシュタイン・バール・ウイルスの同時型別検出法およびｄｎａ配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0427399A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0640828A1 (en) * | 1993-08-27 | 1995-03-01 | F. Hoffmann-La Roche AG | Monitoring multiple reactions simultaneously and analyzing same |
| US6171785B1 (en) | 1991-05-02 | 2001-01-09 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and devices for hemogeneous nucleic acid amplification and detector |
| US8926905B2 (en) | 2004-06-07 | 2015-01-06 | Fluidigm Corporation | Optical lens system and method for microfluidic devices |
-
1990
- 1990-05-23 JP JP13361890A patent/JPH0427399A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6171785B1 (en) | 1991-05-02 | 2001-01-09 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and devices for hemogeneous nucleic acid amplification and detector |
| US6814934B1 (en) | 1991-05-02 | 2004-11-09 | Russell Gene Higuchi | Instrument for monitoring nucleic acid amplification |
| EP0640828A1 (en) * | 1993-08-27 | 1995-03-01 | F. Hoffmann-La Roche AG | Monitoring multiple reactions simultaneously and analyzing same |
| US8926905B2 (en) | 2004-06-07 | 2015-01-06 | Fluidigm Corporation | Optical lens system and method for microfluidic devices |
| US9234237B2 (en) | 2004-06-07 | 2016-01-12 | Fluidigm Corporation | Optical lens system and method for microfluidic devices |
| US9663821B2 (en) | 2004-06-07 | 2017-05-30 | Fluidigm Corporation | Optical lens system and method for microfluidic devices |
| US10106846B2 (en) | 2004-06-07 | 2018-10-23 | Fluidigm Corporation | Optical lens system and method for microfluidic devices |
| US10745748B2 (en) | 2004-06-07 | 2020-08-18 | Fluidigm Corporation | Optical lens system and method for microfluidic devices |
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