JP3950972B2 - 生物試料の生物発光測定装置 - Google Patents

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Description

本発明は、生物試料の生物発光測定装置に関し、特に、測定部と制御部とを分離した生物試料の生物発光測定装置に関する。
種々の生物で次々と全ゲノム塩基配列が決定され、ゲノム情報を基盤とする網羅的なゲノム機能解析の重要性が増している。ゲノム機能解析の有効な方法としては、DNAアレイ法やプロテオミクス法が用いられているが、これらの方法では検出感度の低さから、全ての遺伝子の機能解析を行うことは不可能である。また、これらの方法では、mRNAや蛋白質を材料として実験を行うため、細胞を破壊する必要がある。
生物発光リアルタイム測定法（Kondo et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 90, p5672-5676; Millar et al., 1992, Plant Cell, Vol. 4, p1075-1087）は、生物を生かしたまま高感度・高精度に遺伝子発現をモニタすることのできる画期的な非破壊的測定法である。生物発光リアルタイム測定法は、ゲノム機能の網羅的解析の切り札になる方法である。
従来、生物発光の測定には放射線測定に用いるシンチレーションカウンターが利用されており、このシンチレーションカウンターを利用する方法は、生物試料を各穴に収納する複数の９６穴プレートを測定装置のプレートセット部分に専用のガイドを用いて縦積みするスタッカー方式を採用している。すなわち、この方法は、生育に光が必要な植物系生物材料を測定する際には試料の入ったプレートと何も入っていない透明プレートとを交互に積み上げ、側面から光を当てるものである（非特許文献１：Strayer et al, 2000, Science, Vol. 289, p768-771）。
より詳細に説明すると、この方法では、スタッカーを２台用意し、一方には前述のように被験試料と何も入っていない透明プレートを交互に積み上げ、もう一方のスタッカープレートを入れず空のままにしておく。生育に光が必要な植物系生物試料からの発光を測定する際には、側面から光を照射することで透明プレートを挟んでいることによりできた隙間から被験プレートに光を照射する。
測定は積み上げた一番下のプレートを抜き出して測定暗室に送り込んで行い、測定の終了したプレートはもう一方のスタッカーの一番下に移動させ、初めに積み上げていたスタッカーで新たに一番下となったプレートの測定を行っていた。全てのプレートの測定が終わったら、測定後のプレートが積み上げられていたスタッカーから測定前のプレートが積み上げられていたスタッカーに、プレートが下から順に戻されていき、測定前の状態に戻る。この一巡の動作を繰り返すことで測定を行っていた。近接した光源によっての温度が上昇してしまうので、積み上げられたプレートの固まりにファンで送風することでこの問題を多少緩和している。
藍色細菌の発光測定においては、近藤と石浦によって大規模な生物発光測定装置が開発され、一度に多検体の生物発光を全自動で測定することに成功している（Kondo et al.,1994, Journal of Bacteriology, Vol. 176, p1881-1885; Kondo et al., 1994, Science, Vol. 266, p1233-1236）。この装置では生物発光の測定に冷却CCDカメラを用いているために測定感度がシンチレーションカウンターを用いたものと比べて低い。
Strayer et al, 2000, Science, Vol. 289, p768-771。 Kondo et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 90, p5672-5676; Millar et al., 1992, Plant Cell, Vol. 4, p1075-1087 Kondo et al.,1994, Journal of Bacteriology, Vol. 176, p1881-1885; Kondo et al., 1994, Science, Vol. 266, p1233-1236
しかしながら、上述のシンチレーションカウンターを利用する方法では、各プレートに照射される光量やプレート内の各穴に照射される光量は極めて不均一であり培養が不均一となり、測定結果に大きなばらつきが生じることが分かった。また、生育に必要な光量を確保するために試料に光源を近接させる必要性があるので、光源が発する熱のためにプレートに張り付けたシールの内部で被験材料に含まれる水分が結露して、測定結果を大きくばらつかせる原因となることが分かった。さらに、測定するプレート数が変わると単位時間あたりに測定する回数が変化するため、実験毎のデータの比較・検討が容易でないことも判明した。
上記生物試料発光測定装置は生物に発光遺伝子を組み込んで生きたままの細胞で遺伝子発現の変動を連続的に測定する生物発光リアルタイム測定法に特に適合する。該リアルタイム測定法は、任意の鍵遺伝子の発現制御に関与する突然変異体の網羅的分離に極めて有効な実験法であり、ポストゲノム時代の網羅的ゲノム機能解析の切札である。しかしながら、生物発光リアルタイム測定法の長所を最大限に活用し、測定の大規模化に対応する機器の開発はなされていないのが現状であった。
生物試料の発光の測定には一般にシンチレーションカウンターを利用するが、植物系生物材料では生育に光が必要なことから均一な生育培養条件下(特に光条件)での測定が難しかった。
また、培養・試料搬送装置とシンチレーションカウンターとを組み合わせる方法では設置に広い場所を必要とし、かつ高価になってしまう。さらにまた、シンチレーションカウンターに内蔵の制御コンピュータが高温に弱いために、15〜35℃の温度環境でしか測定をすることができなかった。
そこで、本発明は、生物試料を均一な条件下で生育しつつ、信頼性が高い発光測定が可能な生物試料の生物発光測定装置を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、発明者らは、プレート上での培養生育条件について厳密に調査研究した結果、本発明の生物試料の発光測定装置を見出すに至った。
すなわち、本発明の植物系生物試料の発光測定装置は、各々複数の植物系生物試料を収納する複数のプレートを含み、前記複数の植物系生物試料を培養することが可能な培養部と、前記複数の植物系生物試料の生物発光を測定する測定部と、前記複数のプレートを前記測定部に搬送する搬送手段と、前記搬送手段の搬送動作を制御し、かつ、前記植物系生物試料の生物発光の測定条件を制御する制御部と、記録及び/又は解析用コンピューターと、を含む植物系生物試料の発光測定装置であって、前記複数のプレートが前記発光測定装置内を巡回可能であり、かつ、前記測定部と、前記制御部及びコンピューターとを分離し、前記植物系生物試料が、培養に光を必要とする生物の試料であり、前記搬送手段が、ベルトコンベア、プレート送り出し機、プレート押し出し機で構成され、かつ、前記複数のプレートを検出するための光センサーを備えることを特徴とする。
また、本発明の植物系生物試料の発光測定装置の好ましい実施態様において、前記植物系生物試料が、培養に光を必要とする生物の試料であることを特徴とする。
また、本発明の植物系生物試料の発光測定装置の好ましい実施態様において、前記複数のプレートが、当該発光測定装置内を巡回可能であることを特徴とする。
また、本発明の植物系生物試料の発光測定装置の好ましい実施態様において、前記複数のプレートが、前記搬送手段上に設置されていることを特徴とする。
また、本発明の植物系生物試料の発光測定装置の好ましい実施態様において、前記複数のプレートが、生物試料を収納する複数の穴部を有する穴プレート本体と、該穴プレート本体の上面に張られ穴部開口をシールするシートからなることを特徴とする。
また、本発明の植物系生物試料の発光測定装置の好ましい実施態様において、前記搬送手段が、前記複数のプレートを検出するためのセンサーを備えることを特徴とする。
また、本発明の植物系生物試料の発光測定装置の好ましい実施態様において、前記センサーが、光センサーであることを特徴とする。
また、本発明の植物系生物試料の発光測定装置の好ましい実施態様において、前記センサーが、前記測定部内の発光検出器である光電子増倍管と前記プレートの相対位置を正確に決定することを特徴とする。
また、本発明の植物系生物試料の発光測定装置の好ましい実施態様において、前記搬送手段が、ベルトコンベア、プレート送り出し機、プレート押し出し機で構成されていることを特徴とする。
また、本発明の植物系生物試料の発光測定装置の好ましい実施態様において、前記制御部が、一定時間間隔で各生物試料の測定が可能となるように制御することを特徴とする。
また、本発明の植物系生物試料の発光測定装置の好ましい実施態様において、前記測定条件が、測定待ち時間、測定時間、サイクルごとの待機時間、サイクル数からなる群から選択される条件であることを特徴とする。
また、本発明の植物系生物試料の発光測定装置の好ましい実施態様において、前記装置の構成によって、少なくとも摂氏１５〜５０℃までの温度範囲で測定可能であることを特徴とする。
また、本発明の植物系生物試料の発光測定装置の好ましい実施態様において、前記装置が、さらにファンを備えることを特徴とする。
本発明の生物試料の発光測定装置によれば、高温に弱い部分と、測定部分とを分離して構成したので、広範な温度範囲において生物試料の測定が可能であるという有利な効果を奏する。
また、本発明の生物試料の発光測定装置によれば、植物の生物発光を均一に測定できるという有利な効果を奏する。すなわち、本発明によれば、プレートで生物試料の培養生育条件をより均一に設定できるので、信頼性のある測定結果を提供し得る。
また、本発明の生物試料の発光測定装置によれば、従来より小型化することが可能であるという有利な効果を奏する。
本発明の生物試料の発光測定装置は、各々複数の生物試料を収納する複数のプレートを含み、前記複数の生物試料を培養することが可能な培養部と、前記複数の生物試料の生物発光を測定する測定部と、前記複数のプレートを前記測定部に搬送する搬送手段と、前記搬送手段の搬送動作を制御する制御手段と、前記生物試料の生物発光の測定条件を制御する制御部と、記録及び/又は解析用コンピューターと、を含む生物試料の発光測定装置であって、前記測定部と、前記制御部及びコンピューターとを分離して構成される。このように分離することによって、比較的広範な温度範囲において生物試料の発光測定が可能となる。すなわち、従来型の測定装置によれば、高温に弱い制御部及び記録解析用のコンピュータが、いわゆる測定部に近接して設置されていたために、１５〜３５℃程度の温度下での測定にしか対応できなかった。これに対して、本発明の装置によれば、測定部と制御部等を分離したので、広範な温度範囲においても測定を実施することができる。
ここで、生物試料について説明すると、当該生物試料は、特に限定されるものではないが、例えば，培養に光を必要とする生物の試料又は光を必要としない生物の試料を挙げることができる。また、発光測定を行うための生物試料としては、例えば、生物試料の発光測定のために、先ず生物発光遺伝子を組み込んだ生物試料を挙げることができる。該生物試料は遺伝子操作によって作出することができる。この組換え発光生物体のゲノム配列中には、遺伝子発現を制御するプロモーター領域の後ろに蛍のルシフェラーゼなどの発光遺伝子を繋いで組込んであり、プロモーターの転写活性を生物発光として生きたままの細胞でリアルタイムで測定することができる（図１Ａ）。
また、複数のプレートについても特に限定されない。例えば，生物試料を収納するプレートは、従来周知の９６穴プレート等を用いることができ、上記組換え生物体等の生物試料を９６穴プレートに入れて透明なシールで封じて測定用試料として用いることができる（図１Ｂ）。
培養部は、植物等の生物試料を均一な条件で培養するよう設定されており、各生物試料収納プレートの穴には生物試料が収納され、例えば、光条件を均一にする場合には、培養部の上部の光源（図示せず）から光が均一に照射され一定の培養条件下に生物試料の培養が行なわれるようになっている。
本発明では、好ましい実施態様において、前記複数のプレートが当該発光測定装置内を巡回可能である。すなわち、複数のプレートが装置内、特に光源が照射されるなど、適当な生育条件が設定される領域内で巡回可能であれば、装置内に設置した生物試料に対して、ほぼ均一な培養生育条件を提供することが可能である。このような巡回は、通常装置内の内周に沿って行なうことが、均一生育条件を提供するという観点から好ましいが、巡回の仕方は、特に限定されない。要するに、生物試料へ均一な生育条件(例えば,光条件、温度条件、湿度条件など)を提供できれば、特に限定されない。
さらに、本発明において、前記複数のプレートが、前記搬送手段上に設置されていることが好ましい。これは、このようにプレートが、搬送手段上に設置されれば、測定部へ搬送するアームなどを必要としない。そればかりか、搬送手段を装置内を巡回するように設計すれば、生物試料の均一な生育条件も提供し得る利点がある。また、前記複数のプレートの形状等については、特に限定されないが、
上記穴部での結露を防止するという観点から、生物試料を収納する複数の穴部を有する穴プレート本体と、該穴プレート本体の上面に張られ穴部開口をシールするシートからなることが好ましい。なお、搬送手段で測定装置のセット部に置かれたプレートは直ちに測定暗室に送り込まれるようになっているので、上記結露を防止したプレートは結露の無い状態で測定に付される。
生物試料を収納する複数のプレートは生物試料を収納する複数の穴部を有する穴プレート本体と、該穴プレートの上面に張られ穴部開口をシールするシートとからなる生物試料収納プレートは、９６穴プレート等として周知であり市販されている。培養部にセットされた生物試料収納プレートの下面温度が穴プレートの上面のフィルム温度よりも低い温度となるよう培養部が構成すれば、フィルムの穴部内側での結露をさらに確実に防止することができ、ひいては信頼性のある測定結果が得られる。
また、結露防止のために、培養部に送風ファンを設け、それによって培養部の生物試料収納プレートセット部にセットされた生物試料収納プレートの下面温度が穴プレートの上面のフィルム温度よりも低い温度とし、フィルムの穴部内側での結露を防ぐことができる。ファンは、例えば、培養部、測定部、搬送手段、制御手段で構成される装置本体の内側に適宜設置することが可能である。例えば，電源周り、制御基板の近傍など適宜空きの部分に設置すればよい。
また、前記搬送手段が、前記複数のプレートを検出するためのセンサーを備えてもよい。当該センサーは、プレートの位置を特定するためのものであり、特定位置でのプレートの存在、不存在を確認することができる。センサーによって、プレートの位置決めを正確に行なうことができる。当該センサーによって、測定部内の発光検出器である光電子増倍管と前記プレートの相対位置を正確に決定することもできる。
また、好ましい実施態様において、前記搬送手段が、ベルトコンベア、プレート送り出し機、プレート押し出し機で構成されている。これらの詳細については後述する。また、当該搬送手段を制御する制御手段の動作説明についても、後述する。
次に、制御部について説明する。制御部は、搬送の動作と、生物発光の測定条件を主に制御する。すなわち、制御部は、制御コンピューターにより、搬送部分の操作制御、測定部への測定開始命令などを行なえるように設定されている。培養部及び搬送部の操作は、例えば、タッチパネルを利用して行なうことができる。
搬送の動作は、例えば、一定時間間隔で各生物試料の測定を可能とする。測定条件としては、測定待ち時間、測定時間、サイクルごとの待機時間、サイクル数からなる群から選択される条件を挙げることができる。
装置の中央部は測定暗室になっており、プレートの取り込み口と排出口の両方にシャッター1と2がついている。暗室には位置決めトレイと光センサーとを設置することで、光電子増倍管と試料プレートとの相対位置を厳密に制御することが可能である。
以下、本発明を実施例を用いて説明するが、本発明は、これら実施例に限定して解釈される意図ではない。
本発明の測定装置では、(1)搬送方式に巡回式を用いることで装置稼働中に測定試料の位置が順次入れ替わり、培養・測定条件を均一化することができ、(2)植物試料の搬送機構を巡回式にして培養部分と兼ね併せることで小型化を達成し、(3)本体（培養部、試料搬送
部、測定部で構成される）から制御部と記録・解析用コンピューターとを分離することにより、幅広い温度環境（少なくとも15〜50℃）で稼働できることを特徴とする。本発明の一実施態様における測定装置の概略図を図２に示す。また、一例として、装置の外観の写真を図16に示す。
搬送部はベルトコンベア（図３）とプレート送り出し棒（図４）、プレート押し棒（図５）、位置センサー（図６）から構成されている。
測定部に位置決めトレイと光センサーとを設置することでによる光電子増倍管と試料プレートとの相対位置を厳密に制御できるようにした（図７）。
測定試料の培養部と搬送部とを兼ね併せ、測定部と培養部・搬送部とを一体化して小型・軽量化を実現した。
高温に弱い制御部や記録・解析用コンピューターを本体（培養部、搬送部、測定部）から分離することにより（図２）、少なくとも15〜50℃での測定を可能にした。なお、試作された本発明の装置のサイズについては、装置の本体（培養部・搬送部・測定部）のサイズは縦68 cm、横93 cm、高さ36 cm、重量50 kgであり、このタイプの従来型の装置に比較して極めて小型且つ軽量のものが得られる。
装置の使用方法と動作
測定試料を入れた10枚の96穴プレート(CulturePlate-96; Perkin Elmer Life Sciences Japan, Tokyo, Japanまたはその類似品；以後プレートと呼ぶ)を図8のプレート位置 2〜11に設置する。制御部で測定条件（測定待ち時間、測定時間、サイクルごとの待機時間、サイクル数）を入力し、測定を開始する（図8）。プレート送り出し棒(機)駆動モーターは駆動シャフトとスライドスクリューとを介して、送り出し棒1を動かし、位置2〜4のプレートを培養面奥の位置（位置１〜３）に送る（図4）。測定暗室内のプレート位置決めトレイ駆動モーターはプレート位置決めトレイをプレート挿入位置センサーとセンサー検出板とで位置決めを行って、プレート挿入位置に移動する(図7A)。位置決めトレイ駆動モーターにはステッピングモーターを用いている。位置1にプレートが在ることをプレート位置検出用光センサー1（図6）で確認すると、測定暗室の両側のシャッター１と２が開く。プレート押し棒(機)駆動モーターは駆動ローラーを介してプレート押し棒を動かし、位置 1のプレートを位置決めトレイに送る（図5）。押し棒は待機位置に戻る。測定暗室のシャッター１と２は閉じる。プレート位置4にプレートが存在しないことをプレート位置検出用光センサー2が確認すると、ベルト駆動モーターはベルトコンベアを動かして位置5〜8のプレートを装置の右側（位置4〜7）に移す（図3）。プレート位置8にプレートが存在しないことをプレート位置検出用光センサー3が確認すると、送り出し棒2は位置9〜11のプレートを培養面手前側（位置8〜10）に送る。プレート位置センサー4と5は位置11のプレートが位置10に移動したことを確認する。測定暗室内のプレートは任意の時間（0〜999.9分）暗黒下で静置し、その後、光電子増倍管によってプレートの各穴の発光を測定する。互い違いに配置された８個の光電子増倍管（図7B、7C）はプレートの各穴ごとに発光測定を行なう。プレート位置決めトレイ駆動モーターは位置決めトレイを測定開始位置センサーで位置決めして、測定開始位置に移動させる。測定開始位置では、プレートが光電子増倍管の下になる。そして光電子増倍管昇降モーターを駆動し、光電子増倍管を下降させる。検出器ダウン位置検出用光センサーがセンサー検出板を感知すると光電子増倍管昇降モーターは停止し、光電子増倍管がプレートに接触する。プレート位置検出センサー（図7B）は測定位置にプレートが存在することを確認する。光電子増倍管は発光を測定する。測定値は各穴の測定毎に測定部からRS485を介して制御部に送信される。測定が終わると、光電子増倍管昇降モーターを駆動し、光電子増倍管を上昇させる。検出器アップ位置検出用光センサーがセンサー検出板を感知すると光電子増倍管昇降モーターは停止する。位置決めトレイ駆動モーターはプレートを次の列の測定位置に移動させるのに必要なステップ数だけ駆動することで、トレイを移動させる。この動作を繰り返すことで１２列の穴すべてを測定する。プレートの全穴の測定が終わった時点で、測定終了位置センサーで測定終了位置にプレートが存在することを確認した後、測定値を送信日時と共に一括して制御部からRS232を介して記録・解析用コンピューターに送信する（図9）。送信された測定値は測定データの送信日時と共にプレート毎にCVSファイルとして記録・解析用コンピューターに記録される。位置決めトレイ駆動モーターは位置決めトレイをプレート排出位置センサーで位置決めしてプレート排出位置に移動する。１枚のプレートの測定が終わると、プレート位置検出用光センサー4と5 (図6)で位置11(図8)にプレートが無いことを確認する。測定暗室の両側のシャッター１と２が開き、押し棒は測定暗室内のプレートを培養部の位置１１へ排出する。シャッター１と２が閉じる。
これらの一連の動作を、実験者の設定した任意の時間間隔で自動的に繰り返す。測定データは、記録・解析用コンピューターに組み込んだ解析プログラムRAP(Okamoto et al.,unpublished；特願2003-061203)によって自動的に視覚化と解析とを行なった。
まず、装置の発光検出感度と直線性を調べた。発光試料としてルシフェラーゼ(QuantiLum Recombinant Luciferase, Promega Corp.)と発光基質溶液(Steady-Glo Luciferase Assay System, Promega Corp.)を使用した。氷冷した等容量の1.33 x 10-16 〜 1.33 x 10-9 Mのルシフェラーゼ溶液と発光基質溶液とを混合し、氷上に置いたプレートの各穴に反応液を150μlずつ分注し、透明なプレートシール(PerkinElmer Life Science社のTopSeal-A)で封じた。試薬を混合した20分後に22℃に移した。22℃に移してから37分後に測定暗室に移し、5分間静置してから測定を開始した。測定は各ウェル5秒間行った。
その結果を以下に示す。ルシフェラーゼ蛋白質を用いたin vitro発光系を用いて、測定装置に組み込んだ８本の光電子増倍管の計数効率、測定可能な生物発光量のレンジ、生物発光量に対する測定値の直線性を調べることで装置の評価を行った。
ルシフェラーゼ蛋白質が存在しないバックグラウンド計数値は66 ± 12 cpsあった。ルシフェラーゼ蛋白質量が1.0 x 10-19 〜 1.0 x 10-14 molのとき、計数値はルシフェラーゼ蛋白質量に比例して直線的に増加し、4.3 x 10 〜 3.4 x 106 cpsを計数した（図11A）。ルシフェラーゼ蛋白質量が1.0 x 10-13 molのときには、光子の数え落としが起こり、計数はもはや直線的には増加しなかった。以上のことから、本装置の発光測定の検出感度は2.0 x 10-19 mol ルシフェラーゼ蛋白質であり、ダイナミックレンジは4.3 x 10 〜 3.4 x 106 cpsであった。8本の光電子増倍管の計数効率の標準偏差は測定可能範囲内では11％以下だった。各光電子増倍管のルシフェラーゼ濃度毎の測定結果の標準偏差は平均2%だった（図11B）。
実施例２
次に、測定感度におよぼす温度の影響について調べた。アロカ、CXS-2011を標準光源として用いた。標準光源をプレートの穴に入れ、穴の計数値を15、20、25、30、35、40、45、50℃の温度環境下で測定した。
結果は以下のようである。発明した発光測定装置がどのような温度範囲で使用可能であるかを明らかにするために、装置の本体（培養部、搬送部、測定部）を様々な温度条件下において発光測定を行った(図12)。測定温度を15℃から50℃まで5℃ずつ上昇させると、バックグラウンドの計数値は3 cpsから90 cpsに上昇した。一方、標準光源の計数値は2.0 x 105 cpsで一定であった。この結果から、本装置は15〜50℃の温度範囲で発光測定が可能である。
実施例３
次に、シロイヌナズナの発光レポーター株の測定を行なった。生物発光測定のための試料として、シロイヌナズナの発光レポーター株CAB2::LUC株(Millar et al., 1992, Plant Cell Vol. 4, p1075-1087 )を使用した。この株は、クロロフィルa/b結合蛋白質をコードするシロイヌナズナCAB2遺伝子のプロモーター領域の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子LUCのコード領域を接続した発光レポーター遺伝子を野生株C24のゲノムへ遺伝子移入した株であり、概日時計によって制御されて連続明条件下で約24時間周期の生物発光リズムを示す。また、この株は、培養時に照射する光強度を下げると、生物発光量の減少と生物発光リズムの周期の延長とを示す(Millar et al., 1992, Plant Cell Vol. 4, p1075-1087; Somers et al., 1998, Development Vol. 125, p485-494)。
CAB2::LUC株の生物発光リズムの測定は以下のように行った。表面滅菌したCAB2::LUC株の種子を4℃、２日間、暗黒下に静置して発芽の同調処理を行った後、1.5%ショ糖と0.3%ゲランガムとを含むムラシゲとスクーグの固体培地（MS培地）に播種し、22.0 ± 0.5 ℃、50μmol m-2 s-1の白色光下、連続明で4日間培養して種子を発芽させた。10枚のプレートの各穴に1.5% ショ糖を含むMS液体培地を20μlずつ入れ、固体培地ごと切り出した植物体の芽生えをこのウェルに移した。そして、各ウェルに20μlの500μM D-ルシフェリン水溶液 (BIOSYNTH AG, Staad, Switzerland)を投与し、プレートシールでプレートを封じて、23.0 ± 0.5 ℃、12時間明期12時間暗期の明暗サイクル(明期には70μmol m-2 s-1の白色光を照射)を3サイクル与えて概日時計を同調させた。3回目の暗期終了直後に、プレートを測定装置にセットし、23.0 ± 0.5 ℃で、白色光を連続的に照射した。照射した白色光の各プレート位置での光量を図10に示した。全プレート位置での白色光の平均光量は68.8 ± 2.0μmol m-2 s-1であり、均一であった。
生物発光の測定は、プレートを測定暗室内で4分間暗黒下に静置して植物体のクロロフィルの遅延蛍光を減衰させた後、暗黒下で穴毎に3秒間の測定を行い、1秒あたりの発光値として記録した。この測定を90分ごとに繰り返し行った。
発光値のデータは、データ解析ソフトRAP(特願2003-061203)を用いて解析し、発光の強度や発光量の変動（発光リズム）の評価を行った。
シロイヌナズナの発光レポーター株の測定の結果を以下に示す。本発明の発光測定装置でシロイヌナズナの発光レポーター株CAB2::LUCの生物発光リズムの測定を行い、生物発光量およびリズムの周期の均一性を調べた（図13）。生物発光量は、ウェル毎で1,532 ± 112 cps（図14A）、プレート毎で1,532 ± 297 cps(表1) であり、値は均一であった。表１は、シロイヌナズナ生物発光レポーター株CAB2::LUCの測定結果のプレート毎の均一性を示す。
Figure 0003950972
生物発光リズムの周期に関しても、ウェル毎で23.2 ± 0.4 h（図14B）、プレート毎で23.2 ± 0.4 h(表1)であり、値は均一であった。
実施例４
好熱性藍色細菌の発光レポーター株を用いた発光測定を行なった。
Thermosynechococcus elongatusのpsbA1発光レポーター株を用いた。この株は、T. elongatusのpsbA1遺伝子のプロモーター配列の下流に耐熱性バクテリア Xenorhabdus luminescence由来のルシフェラーゼ遺伝子オペロン（Xl luxAB ）を接続した発光レポーター遺伝子を野生型のゲノムへ遺伝子移入した株である。psbA1遺伝子の転写活性は日周変動し概日リズムを示すので、psbA1発光レポーター株に発光基質を投与すれば、生物発光リズムを観察できる。psbA1発光レポーター株の細胞を52℃、50 μmol m-2 s-1の白色光の連続照射下、BG-11固体培地上で培養しコロニーを形成させた。プレートの各穴に20 μlのBG-11液体培地を入れ、そこにBG-11固体培地ごと切り出したコロニー（１個または複数個）を入れた。そして、コロニーを入れた穴に近接する穴に0.1 %の濃度でサラダ油に溶かしたn-decanalを20 μl入れ、プレートをプレートシールで密閉した。バクテリアルシフェラーゼの発光基質であるn-decanalは、揮発性であり、プレート内で揮発して気相から細胞内へ浸透する。生物時計を同調させるために、プレートは41℃、12時間の暗条件下に静置した。その後プレートを本発明の発光測定装置に設置し、41℃、50 μmol m-2 s-1の白色光の連続照射下で細胞を培養しながら発光を測定した。生物発光の測定は、プレートを暗黒下に３分間静置してクロロフィルの遅延蛍光の減衰を待った後、暗黒下で３秒間の測定を行い、１秒間あたりの発光値として記録した。測定データの解析はデータ解析ソフトRAP（特願2003-061203）を用いて行った。
好熱性藍色細菌T. elongatusのpsbA1発光レポーターを用いた測定の結果を以下に示す。
本発明の発光測定装置で、T. elongatusのpsbA1発光レポーター株を41℃の高温条件下で培養しながら発光測定を行い、この株の生物発光リズムを測定することに成功した（図15）。少なくとも10日間のリズム測定を連続的に行うことができた。この結果から、本発明の装置は、41℃という高温条件下でも長時間にわたる連続測定が可能である。
このように、本発明においては、測定部と、制御部とを分離したので、植物での大規模な生物発光測定と少なくとも15〜50℃の幅広い温度環境下での生物発光測定とを達成した。また、本発明は以下の3つの特徴をもつ事が明らかとなった。
測定試料の搬送方式を巡回式にすることで、均一な光条件下での培養と測定とを実現した。搬送方式に巡回式を用いることで測定期間中に測定試料の位置を入れ替え、培養・測定条件を均一にすることができた。
本研究で発明者らが開発した発光リズム測定装置は96穴マイクロプレートを10枚までセットでき、一度に960個体の植物体を培養しながら生物発光を全自動で連続測定することが可能であることが判明した。また、本装置は、一般的なシンチレーションカウンターを用いたときに比べ、装置の設置に要する空間が小さいため、同じ実験スペースでより多検体の植物の生物発光を測定することができる。本装置によって達成された発光強度やリズムの周期は、本発明者らが以前に開発したシンチレーションカウンターに平板状の培養搬送機を組み合わせた装置(特願2003-060069)で得られた結果よりもさらに均一性が高かった(Okamoto et al., unpublished)。これはプレートを巡回させることによって、全てのプレートの培養条件が均一化されているためであると推測できる。
また、開発した測定装置は耐熱性の低い制御部分を培養・測定部分から分離しているため、既存の測定装置よりもより高い温度条件下で測定を行うことが出来る事がわかった。少なくとも50℃までの高温条件下で稼働させることが可能なこの発光リズム測定装置を用いれば、例えば好熱性生物種をその生育に適した温度条件下でその生物発光の測定を行うことも可能である。本発明者らは、耐熱性の発光タンパク質をコードする遺伝子を好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatus BP-1に組み込んで、その生物発光リズムを測定することに成功している (Onai et al., unpublished)。
ArabidopsisやT. elongatusではすでに全ゲノム塩基配列が決定されているが(The Arabidopsis Genome Initiative, 2000, Nature Vol. 408, p796-815; Nakamura et al., 2000, DNA Res. Vol. 9, p123-130）、大半の遺伝子の機能は未解明のままである。ポストゲノム時代におけるゲノムの機能解析法の一つとして、生物発光を利用した遺伝子発現の大規模リアルタイム解析法は極めて有効である。開発した生物発光自動測定装置は、遺伝子発現の大規模解析において極めて強力な道具となると考えられる。
生物に発光遺伝子を組み込んで生きたままの細胞で遺伝子発現の変動を連続的に測定する生物発光リアルタイム測定法（図１A）は、任意の鍵遺伝子の発現制御に関与する突然変異体の網羅的分離に極めて有効な実験法であり、ポストゲノム時代の網羅的ゲノム機能解析の切札である。本発明によれば、このような解析において利用可能である。
図１は、生物発光レポーター系の概念図とシロイヌナズナの発光レポーター株の写真を示す。図１Aは、生物発光レポーター系の概念図を示す。図１Bでは、固体培地上に生育させたシロイヌナズナ発光レポーター株CAB2::LUCをプレートの各穴に入れ、プレートシールで封じた。 図2は、巡回型試料交換機付き発光測定装置の概観と部分名称を示す。 図3は、ベルトコンベアの詳細図を示す。 図4は、プレート送り出し棒の詳細図を示す。 図5は、プレート押し棒の詳細図を示す。 図6は、搬送部の位置センサーの位置の一実施態様を示す。搬送時にプレートの位置を確認するための光センサーの位置を黒丸1〜4で示した。プレートの移動に関与する部品を示した。青色はベルトコンベアを示す。 図7は、測定暗室の詳細図を示す。図７Aが、位置決めトレイの構造の一実施態様を示し、図７Bが、光電子増倍管と上下機構の構造の一実施態様を示し、図７Cが、光電子増倍管の配置と位置決めトレイの動作の一例を示す。 図8は、装置の測定動作を示す概念図である。測定中のプレートの移動に関与する部品とプレート位置を示す。橙色の矢印は測定中のプレートの動きを示す。青色はベルトコンベアを示す。 図9は、装置の各部の接続と信号伝達経路の一例を示す。 図10は、各位置におけるシロイヌナズナの発光レポーター株CAB2::LUCへの照射光量を示す。各プレート位置（位置1〜11）におけるシロイヌナズナの発光レポーター株への照射光量（位置番号の下の数値；単位はμmol m-2 s-1）を示す。 図11は、光電子増倍管の計数効率を示す。図11Aルシフェラーゼ発光試薬を用いて発光測定した際の8本の光電子増倍管の計数値のプロットを示す。図11Bバックグラウンドの計数値と各ルシフェラーゼ量における光電子増倍管の計数値を示す。 図12は、測定感度への温度の影響を示す。 図13は、シロイヌナズナ生物発光レポーター株CAB2::LUCの生物発光リズムを示す。 図14は、シロイヌナズナ生物発光レポーター株CAB2::LUCの生物発光測定結果の穴毎の均一性を示す。図14Aは、各穴の生物発光量の相対値を示す。図14Bは、生物発光リズムの周期を示す。 図15は、好熱性藍色細菌T. elongatusのpsbA1発光レポーター株の生物発光リズムを示す。 図16は、本発明の発光測定装置の一実施態様の外観を示す写真である。

Claims (9)

  1. 各々複数の植物系生物試料を収納する複数のプレートを含み、前記複数の植物系生物試料を培養することが可能な培養部と、前記複数の植物系生物試料の生物発光を測定する測定部と、前記複数のプレートを前記測定部に搬送する搬送手段と、前記搬送手段の搬送動作を制御し、かつ、前記植物系生物試料の生物発光の測定条件を制御する制御部と、記録及び/又は解析用コンピューターと、を含む植物系生物試料の発光測定装置であって、前記複数のプレートが前記発光測定装置内を巡回可能であり、かつ、前記測定部と、前記制御部及びコンピューターとを分離し、前記植物系生物試料が、培養に光を必要とする生物の試料であり、前記搬送手段が、ベルトコンベア、プレート送り出し機、プレート押し出し機で構成され、かつ、前記複数のプレートを検出するための光センサーを備えることを特徴とする植物系生物試料の発光測定装置。
  2. 前記複数のプレートが、前記搬送手段上に設置されている請求項１記載の装置。
  3. 前記複数のプレートが、植物系生物試料を収納する複数の穴部を有する穴プレート本体と、該穴プレート本体の上面に張られ穴部開口をシールするシートからなることを特徴とする請求項１又は２項記載の装置。
  4. 培養部が、当該培養部にセットされた複数のプレートの底面の温度が前記穴プレート本体の上面にセットされたフィルム温度よりも低い温度となっている請求項１〜３項のいずれか１項に記載の装置。
  5. 前記センサーが、前記測定部内の発光検出器である光電子増倍管と前記プレートの相対位置を正確に決定する請求項１〜４項のいずれか１項に記載の装置。
  6. 前記制御部が、一定時間間隔で各植物系生物試料の測定が可能となるように制御する請求項１〜５項のいずれか１項に記載の装置。
  7. 前記測定条件が、測定待ち時間、測定時間、サイクルごとの待機時間、サイクル数からなる群から選択される条件である請求項１〜６項のいずれか１項に記載の装置。
  8. 前記装置の構成によって、少なくとも摂氏１５〜５０℃までの温度範囲で測定可能である請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
  9. 前記装置が、さらにファンを備える請求項１〜８項のいずれか１項に記載の装置。
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