JP2005052148A

JP2005052148A - 発光検出装置

Info

Publication number: JP2005052148A
Application number: JP2004292139A
Authority: JP
Inventors: Masao Kamahori; 政男釜掘; Kunio Harada; 邦男原田; Hideki Kanbara; 秀記神原
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2004-10-05
Filing date: 2004-10-05
Publication date: 2005-03-03

Abstract

【課題】多数サンプルを同時に高感度検出する小型で簡便なＤＮＡ配列検出、及び変異検出装置を提供する。
【解決手段】ＤＮＡ伸長反応及び生物発光反応を行う複数の反応セル２７と、反応セルからの発光を検出する光検出素子２９を１対１で垂直方向で対応するように密着配置する。さらに、複数の反応セルと試薬注入を行うキャピラリ２５を１対１で垂直方向で対応するように配置し、反応セルへの一括同時試薬注入を上部垂直方向から行い、反応セルからの発光検出を下部垂直方向から行う。
【選択図】図２

Description

本発明は、生体試料と試薬との反応によって放出される発光を検出する発光検出装置に関し、特に、被検体のＤＮＡ中に含まれる特定の配列の検出、遺伝子の多型性の検出、１塩基置換（ＳＮＰｓ：Single Nucleotide Polymorphisms）分析等をＤＮＡに相補鎖結合したプライマーの伸長反応時に生成するピロリン酸（ＰＰｉ：Pyrophosphoric acid）を生物発光検出することにより解析するのに有用な発光検出装置に関する。

近年の塩基配列解析技術の著しい進歩により、ヒトゲノムの全塩基配列がほぼ解析され、そのＤＮＡ塩基配列情報を医療等に幅広く利用しようとする動きが活発である。特に、ゲノムに存在する特定配列の有無の検査や特定の配列に存在するＳＮＰｓの検出が重要な課題となっている。ゲノム中の１塩基置換は約1000塩基に１つあるといわれており、各個人について膨大な数の１塩基置換が存在する。これらの１塩基置換は各個人の特性各人の個性や医薬品に対する感受性等）に関与していると考えられ、これら１塩基置換の解析は、個人の体質に合わせたテーラーメイド医療等の発展に寄与すると期待されている。

現在、様々なＳＮＰｓタイピング技術が開発され、使用されている。例えば、（１）ＤＮＡプローブがミューテーションの期待される位置で５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素で切断されるように工夫し、酵素による分解物を蛍光標識して高感度に分析するTaqmanＰＣＲ法やInvader法、（２）ジェノタイピングプライマーをターゲットＤＮＡにハイブリダイズさせて１塩基だけ相補鎖伸長反応を行ない、相補鎖伸長反応生成物を質量分析するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight/Mass Spectroscopy）、（３）環状１本鎖ＤＮＡの生成の有無に基づく増幅反応によりＳＮＰｓの存在を調べるＲＣＡ（Rolling circle amplification）法、（４）特定の塩基配列に特異的にハイブリダイズするジェノタイピングプライマーをターゲットＤＮＡにハイブリダイズさせて相補鎖伸長反応を行ない、変異の有無により生じた相補鎖伸長反応生成物をゲル電気泳動で分析するＳＮＰ−ＡＲＭＳ（Amplification refractory mutation system）法、等がある。これらの方法は、蛍光検出を行うための蛍光色素及びレーザ光源、生成物を電気泳動分離するための高圧電源、生成物を質量分析する質量分析装置等を必要とする。

一方、蛍光色素、レーザ光源、高圧電源、質量分析装置等を必要としない、生物・化学発光を用いた検出方法も開発され、使用されつつある。例えば、（５）ターゲットＤＮＡにプライマーをハイブリダイズさせ、相補鎖伸長反応で生成するピロリン酸をＡＴＰに変え、ＡＴＰにルシフェリンを作用させて発光させ、この生物発光を検出することにより、相補鎖伸長反応で取り込まれた基質（ｄＮＴＰ）を知り、プライマーの隣接部位から、順次、塩基配列決定を行うピロシーケンシング法や、ピロシーケンシング法を利用したＳＮＰｓ検出法（Anal. Biochemistry 280, (2000)103-110）、（６）ターゲットＤＮＡに人工ミスマッチプライマーをハイブリダイズさせ、プライマーの一方向の伸長反応に伴って、ｎ個の塩基伸長により遊離するｎ個のピロリン酸をＡＴＰに変え、ＡＴＰにルシフェリンを作用させて発光させ、この生物発光を検出することにより、相補鎖伸長反応の有無を知り、ＳＮＰｓ検出を行う方法（特開2002-101899号公報）等がある。これらの生物発光を用いる検出方法は、装置の小型化・低コスト化が容易であり、簡便で大量処理に適した方法として注目を集めている。

従来技術の中で、低ランニングコストでかつ高スループットな解析を可能にするのは生物発光検出法を用いた（５）及び（６）の方法である。これらの検出方法を利用すると、測定に必要な試薬を加え、その際生じる生物発光強度を測定することにより生体試料をＤＮＡ解析できる小型で安価な装置が実現可能である。

上記の生物発光を用いたＤＮＡ解析法で一つのサンプルを測定する場合には、光電子倍増管を用いて小型の装置を作製することは容易である（Electrophoresis, 22 (2001) 3497-3504）。しかし、多数のサンプルを同時に測定する場合には、光電子倍増管を用いて時分割にスキャンするか、あるいはＣＣＤカメラを用いて同時計測しなければならず、検出部分が大型で高価になる問題があった（WO99/66313）。光電子倍増管を用いて時分割測定する場合には、検出感度が測定サンプル数に比例して低下する問題がある。また、ＣＣＤカメラを用いた測定の場合には、通常、サンプルプレートには９ｍｍピッチの９６穴サンプルプレートか４．５ｍｍピッチの３８４穴サンプルプレートを使用する。これらのサンプルプレートを一括検出するためには、検出部に１／４−１／８の縮小光学系を用いなければならず、検出感度が１桁以上低下する問題がある。

また、上記の生物発光検出法を用いたＤＮＡ解析法は、生物発光を検出する検出部の他に微量試薬を同時に加える装置も必要であるが、小型で簡便な手法がない。特に、試薬コスト低減のために、反応容積を５μＬ以下にすると、加える試薬量は０．１μＬ以下になり、０．１μＬ以下の微量試薬を再現良く、複数の反応セルに同時に注入する機構が必要であるが、現在のところ、このような微量同時送液機構は知られていない。その際、マイクロリッターオーダーの微量溶液を取り扱うため、溶液が直ぐに蒸発する問題もある。

本発明の目的は、ランニングコストが安く、複雑な光学系及び送液系を使用せず、多数サンプルを同時に高感度検出できる小型で簡便な生体試料の発光検出装置を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明による発光検出装置は、１次元的又は２次元的に配列された透明な底部を有する複数の反応セルを備える反応槽と、反応槽の上方に位置し、下面に複数の反応セルと一対一に対応付けられる複数本のキャピラリを備える送液部と、送液部を反応槽に対して上下方向に駆動する駆動部と、反応セルと一対一に対応して反応槽の下面に近接して配列された複数の光検出素子を有する光検出部とを含み、反応槽の各反応セル内で発生する発光を光検出部の複数の光検出素子によって個別に検出することを特徴とする。

反応槽の複数の反応セルと反応セルから生じる生物発光等の発光を検出する検出素子を１対１で垂直方向で対応するように密着して配置する構造を採用することにより、複雑な光学系を使用せずに高集光効率で発光を検出できるため、簡便に高感度化が達成できる。また、反応セルへの試薬注入を反応槽の上部垂直方向から行い、反応セルからの生物発光等の発光検出を反応槽の下部垂直方向から行うことにより、装置の小型化及び大きな受光立体角の確保し、小型で高感度な装置を実現できる。更に、複数の反応セルと試薬注入を行う送液部を１対１で垂直方向で対応するように配置することで、複雑な駆動部を用いない簡単な装置構成で一括同時反応・検出を実現できる。

反応槽と検出部が密着することにより問題となる静電誘導によるノイズ（微小擬電流）を除去するために、反応槽と光検出部との間に接地した光透過性の導電膜を配置するのが好ましい。

送液部は、試薬を入れる試薬容器と、試薬容器と複数本のキャピラリとを連通する流路と、試薬容器内を加圧する加圧手段とを備え、キャピラリを流量制御用部材とし、加圧手段によって試薬容器内を所定時間加圧する定圧加圧送液法によって複数本のキャピラリの先端から複数の反応セルに試薬を均等に送液するのが好ましい。定圧加圧方式は、３気圧以上の高圧ボンベ、またはコンプレッサ等の圧力源からの圧縮空気（１〜２気圧程度）を使用して、電磁弁等の圧力切り替え装置により数秒程度の圧力を加えることにより行なうことができる。

また、マイクロリットルオーダーの微量反応溶液の乾燥による影響を低減するために、反応槽に送液部が駆動するときにだけ開き、それ以外のときには閉まっている可動式の蓋を取り付けるのが好ましい。すなわち、反応槽に設けられた複数の反応セルと同じ位置関係を有する複数の開口を備え反応槽の上面に配置される蓋を用意し、その蓋を、蓋の複数の開口と反応槽の複数の反応セルとが合致する位置と合致しない位置との間に駆動する駆動手段とを備えるのが好ましい。

この発光検出装置は、利用の一態様において、反応槽の複数の反応セルに核酸試料を保持し、送液部は、試薬として、核酸試料の一部の配列に相補的な配列を含むプライマー、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ：Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）又はこれらの類似体、ＤＮＡポリメラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼのいずれか一つ含む溶液を送液し、反応槽の反応セル内で、核酸試料に前記プライマーをハイブリダイズさせ、少なくとも１種の前記ｄＮＴＰ又はこれらの類似体と前記ＤＮＡポリメラーゼを用いた相補鎖伸長反応の進行により生成するピロリン酸をアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）に変換し、ＡＴＰとルシフェリン、ルシフェラーゼとの反応により生成する生物発光を、光検出部の光検出素子で検出する。

本発明によると、生物発光反応を行う複数の反応セルと反応セルから生じる生物発光を検出する検出素子を１対１で垂直方向で対応するように、密着して配置しているので、複雑な光学系を使用せずに、簡便に高感度化が達成できる。その際、反応槽と検出素子が密着することにより問題となる静電誘導によるノイズは、反応槽と検出素子の間に光透過性導電膜を配置することで除去できる。さらに、複数の反応セルと試薬注入を行う試薬送液部を１対１で垂直方向に対応するように配置してあり、反応セルへの一括同時試薬注入を上部垂直方向から行い、反応セルからの生物発光検出を下部垂直方向から行うことにより、大きな受光立体角を確保し、小型で高感度な装置を実現できる。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。

図１は、本発明による発光検出装置の一例の全体構成を示す説明図であり、図１（ａ）は平面図、図１（ｂ）は略断面図である。この発光検出装置は、装置中央に、上下方向（図中のＺ方向）及び回転方向（図中のθ方向）に移動可能なθＺステージ１５が位置し、その周囲に反応槽１７及び洗浄槽１８，１９，２０が９０゜間隔に配置されている。θＺステージ１５は、上部に９０゜間隔で放射方向に延びる４つの腕を有し、各腕にはそれぞれディスペンサ１１，１２，１３，１４が固定されている。反応槽１７はそれぞれ試料が入った複数の反応セルを備え、各反応セル内の試料はディスペンサ１１，１２，１３，１４から添加される反応試薬との間で発光反応を起こす。複数の試料から発生した発光は、反応槽１７の下方に密着して配置された検出部１６の光センサアレイによって個別に検出される。図１に示した装置は、９６試料を同時に測定できる構成になっており、また、ピロシーケンシング法とＳＮＰｓ解析法の両方に対応可能な装置構造になっている。

ピロシーケンシング法の場合には、４個のディスペンサ１１，１２，１３，１４に異なった試薬（ｄＮＴＰ）をセットし、θＺステージ１５を回転、上下動して、光センサアレイ及び電流電圧変換増幅アンプを組み込んだ検出部１６の上部に配置された反応槽１７内に試薬を順番に吐出し、測定を行う。反応槽１７内への試薬吐出後、ディスペンサ１１，１２，１３，１４は、洗浄及び乾燥防止のために、洗浄槽１８，１９，２０中に先端を浸漬し待機している。洗浄槽１８，１９，２０には洗浄液供給タンクから常に洗浄液が流入しており、あふれた洗浄水は廃液タンク２１に流れ込むようになっている。洗浄液供給タンクは廃液タンク２１の背後に位置し、図１（ｂ）には現れてない。

ＳＮＰｓ解析法の場合には、反応試薬の注入は１回だけであるので、各々のディスペンサに同一試薬をセットしておき、Ｚステージを上下して検出器上部の反応セル内に試薬を順次吐出し、測定を行う。その際、洗浄槽１８，１９，２０の位置にも反応槽及び検出部を取り付ければ、最大３８４サンプルを同時に解析することが可能になる。

図２は、図１の一部を示す詳細図であり、ディスペンサ１１、反応槽１７、及び光センサアレイ２３の関係を示す断面図である。ディスペンサ１１は、厚さ１０ｍｍ×縦８０ｍｍ×横１２０ｍｍのアクリル板の厚さ方向中央に、縦方向１２本、横方向１本の直径０．８ｍｍの流路２４を加工し、アクリル板に垂直に流量制御用のキャピラリ２５を９６本垂直に差し込んで接着して作製している。キャピラリ２５には、内径２５μｍ×外径３６０μｍ×長さ２０ｍｍのフューズドシリカキャピラリを使用した。ディスペンサ１１は上部に反応試薬槽２６を備え、反応試薬槽２６の１ヶ所から供給する反応試薬を定圧加圧送液法によって９６本のキャピラリ２５の先端から均等に吐出することができる。

図３は、ディスペンサのアクリル板に設けた流路２４とキャピラリ２５の接続部分の拡大図である。流路２４は、アクリル板に、一方の端部から他方の端部に貫通する貫通穴を加工し、その後、両端部の開口をプラグで塞いで形成した。横方向１本の流路は、両端をネジ３０ａ，３０ｂで塞ぐ構造とし、空気抜きの機能を持たせた。キャピラリ２５は、流路２４に連通するように形成されたアクリル板底面の穴に先端を挿入し、接着剤でアクリル板に固定した。

図１及び図２に示した反応槽１７は、微少量（１〜１０μＬ）用に９ｍｍピッチで８×１２列に直径２ｍｍの反応セル用穴２７を９６ヶ所に設けた黒色石英ガラス板と、鏡面に仕上げた透明な石英ガラス板２８を熱融着により張り合わせて作製したものである。石英ガラス板２８の下面にはＩＴＯ又はＳｎＯ₂からなる透明導電膜を蒸着してある。透明導電膜は接地される。

光センサアレイ２３は、反応槽１７を用いて９６サンプルを同時測定できるように、光検出素子（浜松ホトニクス製フォトダイオードS1133-01）２９を９ｍｍピッチで８×１２列に配置したものである。本発明では、レンズ等を使用した複雑な光学系を使用せず、簡便な方式で集光効率を高めるために、光検出素子２９を反応槽１７に可能な限り近づけて受光角を大きくする密着型とし、部品数低減と光軸調整不要な簡単な構造で高集光効率を達成した。光センサアレイ２３は、反応槽１７の下面に密着して配置される。各光検出素子２９の出力は、電流電圧変換増幅アンプ（BURR BROWN製OPA129UB）及び１０ＧΩの抵抗を用いて、１×１０¹⁰に増幅し、２段目のオペアンプ（ANALOG DEVICES製OP07）を用いてトータルゲイン４．５×１０¹¹に増幅した。

図４は、光センサアレイ２３中の８×１２列、９６個の光検出素子２９と、それに接続されるアンプ基板３０の接続状態を示す図である。反応槽１７中の９ｍｍピッチの反応セル２７に１対１に対応できるように、アンプ基板３０は幅と厚さ方向の寸法が９ｍｍに収まるように製作した。１列８個の光検出素子２９からの検出信号を１枚のアンプ基板３０で受け持つようにし、合計１２枚のアンプ基板を用いた。

反応セル２７は内径２ｍｍ、深さ３ｍｍで、使用する反応溶液の体積が約４μＬであるので、石英ガラス板２８から反応溶液の液面まで長さは約１．５ｍｍである。本発明で使用した光検出素子２９（浜松ホトニクス製S1133-01）の受光面は２．４×２．６ｍｍである。本実施の形態の条件下での受光効率の計算値を図５に示す。本条件下では、反応溶液の底面から受光面までの距離は１．４ｍｍであり、約７％の受光効率である（この値は実験値から計算した値とほぼ同じであった）。本装置構成によると、レンズ等を使用した複雑な光学系を必要とすることなく、密着方式という簡便な方式で受光立体角を大きくし（高集光効率）、部品数低減と光軸調整不要な簡単な構造を実現できることが分かる。

図２には、専用の反応槽１７を用いた装置例を示したが、反応槽として、市販されている通常のマイクロタイタープレートを用いてもよい。その場合には、クロストーク防止用の仕切りを兼ねたセルホルダを使用するとよい。

図６は、反応槽として市販のマイクロタイタープレートを用いた場合の反応槽の部分の分解組立図である。なお、図６には、マイクロタイタープレートの各反応セル（ウェル）に試薬を供給するディスペンサ１１も合わせて図示した。また、図７は、マイクロタイタープレート４１、セルホルダ４３、導電性光透過板４５を組み合わせた状態の断面図である。

クロストーク防止用の仕切りを兼ねたセルホルダ４３は、遮光性の材料からなる板状部材であり、マイクロタイタープレート４１の各反応セル４２に対応する位置に穴４４が設けられている。セルホルダ４３は、セルホルダの各穴４４に反応セル４２の下方突出部が入るようにして、マイクロタイタープレート４１に下方から押し込まれる。導電性光透過板４５は、一方の面にＩＴＯ又はＳｎＯ₂からなる透明導電膜を蒸着したガラス板であり、セルホルダ４３の下面に接触配置される。導電性光透過板４５の下には、図４に図示した光センサアレイ及びアンプ基板が設置される。光センサアレイ中のそれぞれの光検出素子には、その直上に位置する反応セルから発生する発光のみが入射し、他の反応セルから発生する発光は遮光性のセルホルダ４３によって遮断されるため入射しない。

次に、微量反応溶液を使用する場合に問題となる乾燥防止のための開閉式蓋について説明する。本発明では、反応槽１７あるいは反応槽として用いるマイクロタイタープレートの上に、各反応セルの開口部を開閉できる蓋を設ける。

図８は、マイクロタイタープレートの上に開閉式の蓋を設けた例を示す概略図であり、図８（ａ）は概略平面図、図８（ｂ）はその概略側断面図である。なお、セルホルダは図示を省略してある。本例の開閉式蓋は、マイクロタイタープレート４１の上部及び側部を覆う固定蓋５１と、その上を往復移動可能な移動蓋５２から構成される。固定蓋５１は、マイクロタイタープレート４１の各反応セルに対応する位置に反応試薬添加用の穴５１ａ（８×１２＝９６個）を有する。移動蓋５２は、固定蓋５１の穴５１ａと同じ配置に反応セルの数だけ穴５２ａを有し、アクチュエータ５３によって矢印方向に往復移動可能になっている。図は、移動蓋５２の穴５２ａと固定蓋５１の穴５１ａとが一致しないように移動蓋５２が位置づけられ、各反応セル４２が密閉されている状態を示している。このように反応セルを密閉状態に保つことで反応セル内の溶液の蒸発を防ぐことができる。反応セルに試薬を供給する時は、アクチュエータ５３によって移動蓋５２を、移動蓋５２の穴５２ａが固定蓋５１の穴５１ａと一致するように移動し、穴５１ａと５２ａが重なってできた開口部にディスペンサのキャピラリを挿入して試薬の注入を行う。

図９は、図１に示した装置に開閉蓋を設けた例を示す図であり、図２に対応する図である。図９（a）は反応試薬を注入する前の状態を示しており、図９（ｂ）は反応試薬注入時の状態を示している。

反応槽１７は、上部に移動式の開閉式蓋６１を有する。開閉式蓋６１には、反応槽１７内の反応セル２７と同じ９ｍｍピッチで同程度の窓用穴３６（直径：約２ｍｍ）が形成されている。開閉式蓋６１はアクチュエータ６３によって図の左右方向に移動可能になっている。反応試薬注入前の状態では、図９（ａ）に示すように、ディスペンサ１１に取り付けられた流量制御用キャピラリ２５は、反応槽１７の上部に位置しており、反応セル２７の中心と開閉式蓋６１の窓用穴６１ａの中心はずれている。すなわち、開閉式蓋６１は閉じた状態にあり、反応槽１７内の反応セル２７は、開閉式蓋６１により密閉された状態になる。従って、反応セル２７内の溶液の蒸発が防止される。

反応試薬注入時には、図９（ｂ）に示すように、開閉式蓋６１がアクチュエータ６３によって約３ｍｍ横方向にずらされ、反応セル２７の中心と窓用穴６１ａの中心が一致することにより、反応セル２７の上部が開放される。その後、ディスペンサ１１が下降し、流量制御用キャピラリ２５の先端が反応セル２７中に浸漬し、反応試薬槽２６から反応試薬が注入される。反応終了後、ディスペンサ１１は上昇し、開閉式蓋６１が約３ｍｍ横方向にずれて密閉状態となる。

ディスペンサ１１中の反応試薬の送液（注入）は、定圧加圧管２２（図１参照）を介してディスペンサ１１内を一定圧力に加圧して送液を行う定圧加圧送液法により行う。図１において、定圧加圧管２２は、電磁弁２２ａを介して図示しない高圧ボンベやコンプレッサ等の圧力源に接続されている。空気加圧送液法は定圧状態で流路系内に粘性流を発生させ、送液する方法である。そのため、使用する微小細管以外の部分の圧損が無視できるように微小細管の内径及び長さを設定すれば、加える圧力及び時間を制御することにより容易にサブμＬ以下の溶液を送液できる。本発明では、微小細管としてディスペンサ１１に取り付けた流量制御用キャピラリ２５を用いている。その際の送液量は、次のHagen-Poiseuilleの式に従う。

Ｑ＝ΔＰ・π・ｒ⁴・ｔ/(8μＬ)

ここで、ΔＰ：加えた圧力、r：微小細管の内径、t：圧力を加えた時間、μ：溶液の粘性、L：微小細管の長さ、Ｑ：ｔにおける送液量である。

測定に使用する反応液の体積は４．０μＬであるため、注入量を０．１μＬ以下にして反応溶液の体積変化の影響を低減する必要がある。本実施の形態では、反応試薬槽と流量制御用キャピラリとの結合に使用する内径０．８ｍｍの流路圧損の無視、大気圧程度（２気圧以下）の低圧力使用、加圧時間２秒以下、及び送液量０．１μＬ以下、の条件を満たすために、内径２５μｍ、長さ２０ｍｍの流量制御用キャピラリ２５を使用した。本条件下での加圧圧力と加圧時間との関係を図１０に示す。圧力範囲０．５〜２．０×１０⁵Ｐａで使用すれば、０．１μＬ以下の微小量の送液が定圧加圧時間２秒以下で行うことができる。注入量は１．０μＬ以上の個別再現性は、注入量を重さで計量可能であるが、注入量が０．１μＬ以下である場合には計量できない。そこで、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系の生物発光系（信号ピーク形状を整えるためにＡＴＰ分解酵素であるアピラーゼを加えてある）を応用して同時再現性を測定した。連続測定回数は２０回である。測定は反応液に一定時間間隔（１分間隔）で試薬を注入し、発光強度の再現性を求めた。連続微小量注入のデータを図１１に示す。反応液の体積は４．０μＬで、試薬注入量は（ａ）０．０１μＬ、（ｂ）０．０２μＬ、（ｃ）０．０５μＬ、である。その結果を表１に示す。微少量（０．０１−０．０５μＬ）の注入量再現性は３〜５％と良好であった。

本発明では反応槽と検出素子が密着し、高倍率のアンプを使用しているため、ディスペンサ１１の上下駆動の際に静電誘導によるノイズ（微小擬電流）を生じる問題がある。このノイズを除去するために、反応槽１７の下部に取り付けてある石英ガラス板２８の下面にＩＴＯ又はＳｎＯ₂からなる透明導電膜をコーティングしてある。透明導電膜は接地してある。本発明で使用した光透過性導電膜をコーティングした石英ガラス板の性能は、波長４５０〜６００ｎｍにおいて透過率９０％以上、面積抵抗１０００〜１５００Ωである。

図１２は、光透過性導電膜をコーティングした石英ガラス板のノイズ除去効果を示す図である。通常の石英ガラス板を使用した場合には、図１２（ａ）に示すようにディスペンサ１１の上下駆動に伴い大きな擬似信号６５，６６が発生するが、光透過性導電膜をコーティングした石英ガラス板を使用した場合には、図１２（ｂ）に示すように擬似信号は全く無かった。

図１３は、本発明による発光検出装置の他の例を示す模式図である。これまで説明した装置例は、反応セルが２次元配置された反応槽を備える例であった。ここに説明する装置例は、反応セルが１次元的に配列された反応槽を用いるものである。図１３は、４サンプル同時測定装置の外観を示している。また、図１４は、密着型光センサと定圧加圧送液法を用いたディスペンサの構造を示す断面模式図である。

本装置は、４サンプル用ディスペンサ７１、４つの反応セル７２を有する反応槽７３、及び４サンプル用検出部７４から構成されている。反応セル７２には試料溶液８３が入っている。ディスペンサ７１は４つの反応試薬槽７５を有しているため、基質（ｄＮＴＰ）を装着でき、ピロシーケンシングが測定可能な構成になっている。ディスペンサ７１の下部に各反応セル７２に対応した位置に４本づつ、合計１６本の流量制御用キャピラリ７６を接着してある。ディスペンサ７１は、反応セル７２の上部に位置しており、ディスペンサ７１を上下に駆動して、反応セル７２に反応試薬の注入を行う。１つの反応試薬槽の反応試薬８２は、定圧加圧管８１から加圧することによって４つの反応セル７２に同時に供給することができ、また、４つの反応試薬槽の反応試薬のうち必要な試薬を必要なときに供給することができる。反応槽７３の下部の石英ガラス板７８の下面には静電ノイズ対策のために透明導電膜をコートしてある。検出部７４は各反応セルに対応して４個の光検出素子（浜松ホトニクス製フォトダイオードS1133-01）７９を備える。本装置をＳＮＰｓ測定用に使用する場合には、４つの反応試薬槽７５のうちの１つを使用すればよい。

図１５は、本発明の装置でＤＮＡ塩基配列解析を行う反応の概要を示す図である。本反応の原理は、ＤＮＡに相補鎖結合したプライマーの伸長反応時に生成する１個のピロリン酸（ＰＰｉ）をルシフェリン／ルシフェラーゼ系の生物発光反応で検出するものである。以下に、図１５を用いて反応スキームを説明する。

測定対象の塩基部位９１を有するターゲットＤＮＡ９２に伸長反応用プライマー９３をハイブリダイズさせる。ターゲットＤＮＡ９２と伸長反応用プライマー９３がハイブリダイズした状態にＤＮＡポリメラーゼ９４を用いて伸長反応を行う。その際、基質であるｄＮＴＰ９５を１種類づつ、順次加えていくと、伸長反応が起きた場合のみ、ｄＮＴＰ９５からｄＮＭＰ９６とＰＰｉ９７が生じる。この図の例では、基質がｄＴＴＰの場合である。伸長反応により生じたＰＰｉ９７は、ＡＰＳ（アデノシン５’―ホスホスルフェイト）９８存在下でＡＴＰスルフリラーゼ９９により、ＳＯ₄ ^2-（硫酸イオン）１００を生じて、ＡＴＰ１０１に変換される。ＡＴＰスルフリラーゼ９９により変換されたＡＴＰ１０１は、Ｏ₂（酸素）１０２存在下でルシフェラーゼ１０３によるルシフェリン１０４の酸化反応に使用され、光（ｈν）１０５を発する。その際、ＣＯ₂（炭酸ガス）１０６が生じると共に、ＡＴＰ１０１はＰＰｉ９７とＡＭＰ１０７に、ルシフェリン１０４はオキシルシフェリン１０８に変換される。ルシフェリン／ルシフェラーゼ系の生物発光に伴い生じたＰＰｉ９７は、再度ＡＰＳ９８存在下でＡＴＰスルフリラーゼ９９により、ＡＴＰ１０１に変換され、発光反応が繰り返し起こり、発光は持続する。ピロシーケンシング法は、本反応においてｄＮＴＰを順番に繰り返し加え、発光の有無を検出しながら１個づつ塩基配列を決定していく方法（Afshin,Aら、Analytical Biochemistry 280 (2000) 103-110 及びZhou,Gら、Electrophoresis 22(2001) 3497-3504参照）であり、本発明の装置を用いて容易に行うことができる。

図１６は、本発明の装置でＳＮＰｓ測定を高感度に行う反応の概要を示す図である。本反応の原理は、ＤＮＡに相補鎖結合したプライマーの伸長反応時に生成する多数のピロリン酸（ＰＰｉ）をルシフェリン／ルシフェラーゼ系の生物発光反応で同時に検出するものである。以下に、図１６を用いて反応スキームを説明する。

測定対象の塩基部位１１１を有するターゲットＤＮＡ１１２に伸長反応用プライマー１１３をハイブリダイズさせる。ターゲットＤＮＡ１１２の測定対象の塩基部位１１１と伸長反応用プライマー１１３の３’末端塩基１１４が相補的な結合を形成している状態でＤＮＡポリメラーゼ１１５を用いて伸長反応を行う。その際、基質であるｄＮＴＰ１１６を４種類同時に加えると、伸長反応用プライマー１１３の３’末端塩基１１４からｎ個の塩基伸長反応１１７が起こる。その際、ｄＮＴＰ１１６からｄＮＭＰ１１８とＰＰｉ１１９が生じる。この図の例では、伸長反応用プライマー１１３の３’末端塩基１１４がＴの場合にｎ個の塩基伸長反応が起こる。伸長反応により生じたｎ個のＰＰｉ１１９は、ＡＰＳ１２０存在下でＡＴＰスルフリラーゼ１２１により、ＳＯ₄ ^2-（硫酸イオン）１２２を生じて、ＡＴＰ１２３に変換される。ＡＴＰスルフリラーゼ１２１により変換されたＡＴＰ１２３は、Ｏ₂（酸素）１２４存在下でルシフェラーゼ１２５によるルシフェリン１２６の酸化反応に使用され、光（ｈν）１２７を発する。その際，ＣＯ₂（炭酸ガス）１２８が生じると共に、ＡＴＰ１２３はＰＰｉ１１９とＡＭＰ１２９に、ルシフェリン１２６はオキシルシフェリン１３０に変換される。ルシフェリン／ルシフェラーゼ系の生物発光に伴い生じたＰＰｉ１１９は、再度ＡＰＳ１２０存在下でＡＴＰスルフリラーゼ１２１により、ＡＴＰ１２３に変換され、発光反応が繰り返し起こり、発光は持続する。本方式は、ピロシーケンシング法と比較してｎ倍の感度が得られる。

図１６で説明した通常のプライマー伸長反応では、伸長反応の有無を伸長反応プライマーの３’末端の塩基で選択しているので、ミスマッチによる伸長反応が起き易いので、人工ミスマッチプライマーを用いたプライマー伸長法を用いると高感度でかつ高精度なデータが得られる。その原理を図１７を用いて説明する。

伸長反応プライマーの末端塩基種による相補鎖伸長反応の進行有無を正確にするために、人工ミスマッチプライマー１３１の３’末端から５’末端方向に３番目の塩基配列１３２にターゲットＤＮＡ１３３の塩基配列と相補的でない塩基種を導入してある。ターゲットＤＮＡ１３３の測定対象の塩基部位１３４と人工ミスマッチプライマー１３１の３’末端１３５が相補的である場合には、図中の矢印方向に伸長反応が起き、多数のＰＰＩ１３６を生じて発光１３７が起こる。ターゲットＤＮＡ１３３の測定対象の塩基部位１３４と人工ミスマッチプライマー１３９の３’末端１４０が相補的でない場合には、人工ミスマッチプライマー１３９の３’末端１４０は不安定となり、ターゲットＤＮＡ１３３から遊離してミスマッチ伸長反応はほとんど起こらず、発光しない（Zhou,Gら、Nucleic Acids Research 29 (2001) e93参照）。また、ＳＮＰｓ測定を高精度で行う場合には、サンプルＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）の両方の鎖について測定を行えば良い。さらに、ターゲットＤＮＡとなるワイルトタイプ（野生型）とミュータント（変異型）に対応した伸長プライマーを使用すれば、さらに精度を上げることができる。
以下、本発明の装置でＳＮＰｓ測定を行う方法を説明する。

ＳＮＰｓ測定にはＤＮＡサンプルとして以下に示すＤＮＡサンプル（p53-wild type及びP53-mutant）、及びジェノタイピング用プライマー（wild type用及びmutant用）を使用した。配列中の変異部位は下線で示している。尚、ジェノタイピング用プライマーは３’末端から３番目の塩基の種類がターゲットＤＮＡの塩基配列と相補的でない塩基を有する人工ミスマッチプライマーを使用した。

53-wild type
5'-CTTTC TTGCG GAGAT TCTCT TCCTC TGTGC GCCGG TCTCT CCCAG GACAG GCACA AACAC GCACC TCAAA GCTGT TCCGT CCCAG TAGAT TACCA-3'
ｐ53-mutant
5'-CTTTC TTGCG GAGAT TCTCT TCCTC TGTGC GCCGG TCTCT CCCAG GACAG GCACT AACAC GCACC TCAAA GCTGT TCCGT CCCAG TAGAT TACCA-3'
ジェノタイピング用プライマー（wild type用）
5'-AACAGCTTTGAGGTGCGTGATT-3'
ジェノタイピング用プライマー（mutant用）
5'-AACAGCTTTGAGGTGCGTGATA-3'

本発明で使用した反応試薬の種類及び試薬組成を表２に示す。尚、ここで使用した試薬濃度や反応溶液の分割は、測定法の一例であり、装置構成及びサンプルＤＮＡに応じて適宜変更できる。

基質溶液Ａ中には測定対象の中間物質と同一のピロリン酸が混在しており、測定の妨害となる。そのため、測定前にピロフォスファターゼ分解処理を行い混在するピロリン酸を分解除去し、ピロフォスファターゼを遠心ろ過（ミリポア、分画分子量；１００００）で取り除いてろ液を使用した。但し、混在するピロリン酸は個体間や保存状態で大きくばらつくため、測定の前に混在するピロリン酸の量が一定レベル（1fmol）以下であることを確認して使用した。

ＤＮＡサンプル（10-100fmol/μL）と１．５倍量のジェノタイピング用プライマーをアニーリングバッファー中（10 mM Tris-acetate buffer、pH7.75、2 mM magnesium acetate）でハイブリダイゼイション（94℃、20s → 65℃、120s → r.t.）を行い、ＤＮＡサンプル溶液を得た。

ＳＮＰｓ測定は、反応セル中の反応溶液（4μL）に基質溶液Ａ（１μL）とＤＮＡサンプル溶液（50fmol、１μL）を加えて反応させ、約１０秒後にディスペンサを用いて基質溶液Ｂ（0.１μL）を加えて発光反応を開始させ測定した。光センサの出力は自作の電流・電圧変換増幅器を介して、DAQ board （National Instruments製PCI-MIO-16XE-10）で測定した。信号計測はLabVIEW 6i（National Instruments製）を用いて行った。得られたデータを図１８に示す。

図１８の横軸は反応時間、縦軸は発光反応により得られた電圧値を示している。その結果、変異部位の配列が相補的なp53-wild typeのターゲットＤＮＡとwild type用ジェノタイピング用プライマーの測定データ１５１、及びP53-mutantのターゲットＤＮＡとmutant用ジェノタイピング用プライマーの測定データ１５２は、信号が得られたが、変異部位の配列が相補的でないp53-wild typeのターゲットＤＮＡとmutant用ジェノタイピング用プライマーの測定データ１５３、及びP53-mutantのターゲットＤＮＡとwild type用ジェノタイピング用プライマーの測定データ１５４では、ミスマッチ伸長反応はほとんどなく信号は得られなかった。また、ホモタイプであるp53-wild typeターゲットＤＮＡとP53-mutantターゲットＤＮＡが１：１で混在したＤＮＡサンプルとwild type用ジェノタイピング用プライマーの測定データ１５５、及びp53-wild typeターゲットＤＮＡとP53-mutantターゲットＤＮＡが１：１で混在したＤＮＡサンプルとmutant用ジェノタイピング用プライマーの測定データ１５６は、ヘテロサンプルである測定データ１５３，１５４のほぼ半分の値を示した。

本発明による発光検出装置の一例の全体構成を示す説明図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は略断面図。ディスペンサ、反応槽及び光センサアレイの関係を示す詳細図。ディスペンサの流路とキャピラリの接続部分の拡大図。光センサアレイ中の光検出素子と、それに接続されるアンプ基板の接続状態を示す図。受光効率の計算値を示す図。反応槽として市販のマイクロタイタープレートを用いた場合の反応槽の部分の分解組立図。マイクロタイタープレート、セルホルダ、導電性光透過板を組み合わせた状態の断面図。マイクロタイタープレートの上に開閉式の蓋を設けた例を示す概略図であり、（ａ）は概略平面図、（ｂ）はその概略側断面図。図１に示した装置に開閉蓋を設けた例を示す図。加圧圧力と加圧時間との関係を示す図。定圧加圧送液法を用いて得られた連続微小量注入のデータを示す図。光透過性導電膜をコーティングした石英ガラス板のノイズ除去効果を示す図。本発明による発光検出装置の他の例を示す模式図。密着型光センサと定圧加圧送液法を用いたディスペンサの断面構造を示す図。ＤＮＡ塩基配列解析を行う反応の概要を示す図。ＳＮＰｓ測定を高感度で行う反応の概要を示す図。ＳＮＰｓ測定を高感度、高精度で行う反応の原理を示す図。本発明で得られたジェノタイピング測定結果を示す図。

符号の説明

１１…ディスペンサ、１５…θＺステージ、１６…検出部、１７…反応槽、１８，１９，２０…洗浄槽、２１…廃液タンク、２２…定圧加圧管、２３…光センサアレイ、２４…流路、２５…キャピラリ、２６…反応試薬槽、２７…反応セル、２８…石英ガラス板、２９…光検出素子、４１…マイクロタイタープレート、４３…セルホルダ、４５…導電性光透過板、５１…固定蓋、５２…移動蓋、５３…アクチュエータ、６１…開閉式蓋、６３…アクチュエータ、７１…４サンプル用ディスペンサ、７２…反応セル、７３…反応槽、７４…４サンプル用検出部、７５…反応試薬槽、７６…流量制御用キャピラリ、７８…石英ガラス板、７９…光検出素子

Claims

１次元的又は２次元的に配列された複数の反応セルを備える反応槽と、
前記反応槽の上方に位置し、下面に前記複数の反応セルと一対一に対応付けられる複数本の微小細管と前記微小細管に圧力を加圧するための圧力源とを備える送液部と、
前記送液部を前記反応槽に対して上下方向に駆動する駆動部と、
前記反応セルと一対一に対応して前記反応槽の下面に近接して配列された複数の光検出素子を有する光検出部とを有し、
前記反応槽の各反応セル内で発生する発光を前記光検出部の複数の光検出素子によって個別に検出し、
ΔＰを加えた圧力、ｒを前記微小細管の内径、ｔを圧力を加えた時間、μを溶液の粘性、Ｌを前記微小細管の長さ、Ｑを前記ｔにおける送液量とし、前記ΔＰ及び前記ｔが各々０．５〜２．０×１０^５Ｐａの範囲及び２秒以下の範囲にあるときに、前記送液源は、Ｑ＝ΔＰ・π・ｒ^４・ｔ／（８μＬ）の関係式を満たすことを特徴とする発光検出装置。
前記微小細管の一回の注入による送液量が、０．１μＬ以下であることを特徴とする請求項１に記載の発光検出装置。
前記微小細管の内径が２５μｍ程度であることを特徴とする請求項１に記載の発光検出装置。
前記送液部は流路を具備した板部材を有し、前記微小細管は前記流路に連通することを特徴とする請求項１に記載の発光検出装置。
前記微小細管は前記板部材に接着剤により固定されることを特徴とする請求項４に記載の発光検出装置。
前記流路の両端を各々ふさぐ、第１ネジと第２ネジとを有することを特徴とする請求項４に記載の発光検出装置。
前記反応槽の複数の反応セルに核酸試料を保持し、前記送液部は、試薬として、前記核酸試料の一部の配列に相補的な配列を含むプライマー、少なくとも１種のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ：Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）又はこれらの類似体、ＤＮＡポリメラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼのいずれか一つ含む溶液を送液し、前記反応槽の反応セル内で、前記核酸試料に前記プライマーをハイブリダイズさせ、少なくとも１種の前記ｄＮＴＰ又はこれらの類似体と前記ＤＮＡポリメラーゼを用いた相補鎖伸長反応の進行により生成するピロリン酸をアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）に変換し、前記ＡＴＰと前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼとの反応により生成する生物発光を、前記光検出部の光検出素子で検出することを特徴とする請求項１に記載の発光検出装置。