WO2020194813A1 - 微生物検査キット、微生物検査方法及び微生物検査装置 - Google Patents

微生物検査キット、微生物検査方法及び微生物検査装置 Download PDF

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WO2020194813A1
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syringe
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野田　英之
真子 石丸
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株式会社日立ハイテク
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Definitions

  • This disclosure relates to a microbiological test kit, a microbiological test method, and a microbiological test device.
  • a culture method has been adopted in a microbiological test for guaranteeing the sterility of a manufacturing facility or a product.
  • the culture method is a method in which a sample to which a medium is added is cultured in a thermostat for several days to 14 days, and the number of colonies of the grown bacteria is visually counted. Therefore, it takes time to obtain the inspection result, and it is necessary to wait for the inspection result until the product is shipped. Against this background, it is desired to develop a microbiological test method for rapidly determining sterility.
  • the ATP method is a method capable of detecting light corresponding to one cell in principle.
  • Patent Document 1 describes that in order to remove free ATP in a sample, the sample solution is filtered and microorganisms and dead bacteria are decomposed in advance using an ATP-degrading enzyme such as apillase.
  • the ATP method including the method described in Patent Document 1
  • the inspection environment and the skill of the worker tend to affect the inspection result. Therefore, the inspection accuracy is lowered due to contamination from the inspection environment and workers, and false positives are likely to occur. It is difficult to completely prevent contamination even if aseptic technique is performed in the safety cabinet, and especially in negative / positive test such as sterility test, it clearly proves false positive or true positive. Was difficult.
  • the present disclosure provides a technique capable of easily performing a highly accurate microbiological test.
  • the microbiological test kit of the present disclosure is capable of collecting a sample, contains a first syringe having a first syringe needle, a second syringe containing an ATP extraction reagent and having a second syringe needle, and a first syringe.
  • It has a waste liquid container, a third opening, and a third sealing member fitted in the third opening, and contains a luminescent reagent that emits light in the presence of ATP, and is sealed under reduced pressure. It is characterized by including a light emission measuring container.
  • microbiological test kit of the present disclosure a highly accurate microbiological test can be easily carried out. Issues, configurations and effects other than those described above will be clarified by the description of the following embodiments.
  • the microorganism test kit according to the first embodiment includes a reaction bottle 1 (reaction container), a waste liquid bottle 8 (waste liquid container), a luminescence measurement container 12, a sampling syringe 22 (first syringe), and a reagent filling, as described later.
  • a syringe 15 (second to fifth syringes) is provided.
  • FIG. 1 is a schematic view showing a reaction bottle 1 of the microorganism test kit according to the first embodiment.
  • the reaction bottle 1 (reaction vessel) has a sealing cap 2 (first sealing member), a nozzle 4, a filter 5, a nozzle cap 6, and a fitting portion 7.
  • the reaction bottle 1 has an opening 3 (first opening) at one end, and a sealing cap 2 is fitted in the opening 3.
  • a sealing cap 2 for example, septum can be used, and the materials thereof include, for example, natural rubber, butyl rubber, PTFE (Polyethylene blueotherylene) / natural rubber, PTFE / butyl rubber, silicon / silicon rubber, PTFE / silicon, PTFE / silicon. / PTFE, polyethylene, byton, etc. can be mentioned. With such a material, nozzles (syringe needles) of various syringes, which will be described later, can penetrate the sealing cap 2.
  • the end opposite to the opening 3 is tapered toward the tip, and the nozzle 4 is connected to the tip.
  • a fitting portion 7 is provided at the boundary between the reaction bottle 1 and the nozzle 4.
  • the nozzle cap 6 covers the nozzle 4 so as to seal the reaction bottle 1 by fitting with the fitting portion 7.
  • the nozzle cap 6 is removable and is provided to the user with the nozzle cap 6 attached.
  • the material of the reaction bottle 1 and the nozzle cap 6 can be, for example, a resin material such as polypropylene, polyethylene, polystyrene, etc., and the reaction bottle 1 can be manufactured by injection molding.
  • the material of the nozzle 4 can be made of metal such as stainless steel (SUS304), but may be made of resin.
  • the outer diameter of the nozzle 4 can be, for example, 0.3 to 0.9 mm ⁇ , and the inner diameter can be, for example, 0.07 to 0.6 mm.
  • the length of the nozzle 4 can be, for example, 13 to 38 mm.
  • the tip of the nozzle 4 may be cut diagonally.
  • the filter 5 is arranged inside the reaction bottle 1 so as to partition the opening 3 and the nozzle 4 into two spaces.
  • the position of the filter 5 is such that a sufficient amount of sample can be introduced between the opening 3 and the filter 5.
  • the filter 5 may be any as long as it can capture the microorganism to be inspected, and for example, a membrane filter can be used.
  • a membrane filter can be used.
  • the material of the filter 5 include cellulose mixed ester, PTFE, PVDF (Polyvinylidene Fluoride), polycarbonate and the like.
  • the pore size of the filter 5 can be appropriately selected according to the size of the microorganism to be inspected and various conditions of the microorganism inspection, and can be, for example, 0.20 ⁇ m or more.
  • examples of the filter 5 include a membrane filter having a pore size of 0.22 ⁇ m or 0.45 ⁇ m.
  • Reagent 10 is introduced in advance between the opening 3 and the filter 5.
  • FIG. 1 shows a case where the reagent 10 is liquid, it may be powder.
  • an ATP scavenging reagent such as a medium component or an ATP degrading enzyme may be contained alone, or a mixture thereof may be contained. Further, the reagent 10 may contain components other than the medium component and the ATP scavenging reagent.
  • the medium may be, for example, soybean casein digest medium, thioglycolic acid medium, R2A medium, standard medium, Sabouraud-dextrose medium, Mosel intestinal bacterial enrichment bouillon medium, depending on the microorganism to be tested and various conditions of the microbiological test.
  • McConkey medium Lapaport basiliadis salmonella enrichment medium, selenite cystine medium, tetrathionate medium, Lapaport medium, lactose bouillon medium, Mueller hinton medium and the like can be used.
  • the sample When performing the microbiological test, the sample is introduced into the space between the opening 3 and the filter 5. As shown in FIG. 1, the reaction bottle 1 may be printed or engraved with a scale indicating the volume of the introduced sample, whereby the liquid amount of the sample can be easily grasped.
  • reagent 10 When reagent 10 is a liquid, a zero scale is set on the liquid surface.
  • the scale is adjusted so that the liquid level becomes zero when a predetermined amount of solvent is added.
  • a plurality of volumes such as 1 mL specification, 10 mL specification, 50 mL specification, and 100 mL specification may be included in the microbiological test kit. Thereby, the user can select the capacity of the reaction bottle 1 according to the sample used for the microbiological test.
  • the reaction bottle 1 shown in FIG. 1 has a 50 mL specification.
  • the inside of the reaction bottle 1 may be depressurized.
  • the sealing cap 2 and the nozzle cap 6 are fitted in a reduced pressure environment, so that the inside of the reaction bottle 1 is sealed in a reduced pressure state.
  • the inside of the reaction bottle 1 becomes atmospheric pressure.
  • FIG. 2 is a schematic view showing a waste liquid bottle 8 (waste liquid container) of the microorganism test kit according to the present embodiment.
  • the waste liquid bottle 8 has a sealing cap 9 (second sealing member) fitted in the opening 11 (second opening), and the inside is decompressed and sealed. There is.
  • the sealing cap 9 is fitted into the opening 11 under a reduced pressure environment.
  • a septum can be used as the sealing cap 9, and the material thereof is as described above.
  • the nozzle 4 of the reaction bottle 1 can be passed through the sealing cap 9, whereby the pressure gradient (pressure difference) between the pressure inside the reaction bottle 1 and the pressure inside the waste liquid bottle 8 causes the inside of the reaction bottle 1 to pass through.
  • the liquid can be filtered by the filter 5 and collected in the waste liquid bottle 8. Therefore, the pressure inside the waste liquid bottle 8 may be reduced to such an extent that the liquid in the reaction bottle 1 can be discharged.
  • the reaction bottle 1 is opened to the atmosphere by removing the nozzle cap 6, so that the initial pressure inside the waste liquid bottle 8 is set lower than the atmospheric pressure.
  • the filter of the liquid in the reaction bottle 1 is used. Filtering by 5 is carried out under a constant pressure of 1 atm (atmospheric pressure).
  • FIG. 3 is a schematic view showing a light emission measuring container 12 of the microorganism test kit according to the present embodiment.
  • the light emission measuring container 12 has a sealing cap 13 (third sealing member) fitted in the opening 14 (third opening), and the inside is decompressed and sealed. ing.
  • the sealing cap 13 is fitted into the opening 14 under a reduced pressure environment.
  • the pressure inside the luminescence measuring container 12 can be set in the same manner as the pressure inside the waste liquid bottle 8 described above.
  • a septum can be used as the sealing cap 13, and the material thereof is as described above.
  • the luminescence reagent 20 is introduced in advance into the luminescence measurement container 12.
  • the luminescent reagent 20 is a reagent that emits light when mixed with ATP, and for example, a reagent containing luciferase and luciferin can be used.
  • the luciferase may be introduced into the luminescent reagent 20, and the luciferin may be mixed with the ATP extraction reagent of the reagent-filled syringe 15 described later.
  • FIG. 4A is a schematic view showing a sampling syringe 22 (first syringe) of the microorganism test kit according to the present embodiment.
  • the sampling syringe 22 is a syringe capable of collecting a sample, and has a piston 23, a nozzle 24 (first syringe needle), and a nozzle cap 25.
  • the sampling syringe 22 can collect a sample up to 100 mL.
  • the nozzle 24 is provided to the user in a state of being covered with the nozzle cap 25.
  • the nozzle cap 25 is removable and is provided to the user with the nozzle cap 25 attached.
  • FIG. 4B is a schematic view showing a reagent-filled syringe 15 (second to fifth syringes) of the microorganism test kit according to the present embodiment.
  • the reagent-filled syringe 15 has a piston 17, a nozzle 18 (second to fifth syringe needles), and a nozzle cap 19.
  • the reagent-filled syringe 15 is filled with the ATP test reagent 30 for the amount of liquid required for one test.
  • the ATP test reagent 30 include an ATP extraction reagent, an ATP scavenging reagent, a solvent, a cleaning reagent, and the like.
  • the reagent-filled syringe 15 is provided to the user in a state of being introduced into the reagent-filled syringe 15 in advance for each type of ATP test reagent 30.
  • the microbiological test kit of the present embodiment has at least a reagent-filled syringe 15 (second syringe) containing an ATP extraction reagent.
  • an aqueous solution containing a surfactant such as benzalkonium chloride or benzethonium chloride, trichloroacetic acid (TCA), Tris buffer, ethanol, a lytic enzyme having protease activity, lysozyme, or the like can be used.
  • a surfactant such as benzalkonium chloride or benzethonium chloride, trichloroacetic acid (TCA), Tris buffer, ethanol, a lytic enzyme having protease activity, lysozyme, or the like
  • TCA trichloroacetic acid
  • the reagent-filled syringe 15 (third syringe) containing the ATP scavenging reagent may be included in the microbiological test kit.
  • the reagent-filled syringe 15 (fourth syringe) containing the solvent of the reagent 10 may be included in the microbiological test kit.
  • the solvent of the reagent 10 for example, a buffer solution usually used for a medium can be used.
  • the reagent-filled syringe 15 (fifth syringe) containing the cleaning reagent may or may not be included in the microbiological test kit.
  • the washing reagent is used to wash the reaction bottle 1 and remove free ATP and ATP derived from dead bacteria (ATP other than ATP derived from live bacteria) in the sample.
  • the cleaning reagent include a buffer solution having a pH adjusted to about 7 to 9 (for example, peptone solution, phosphate buffered saline, etc.), and a buffer containing a surfactant that does not decompose microorganisms (for example, sodium lauryl sulfate).
  • a solution, a buffer solution containing an enzyme such as a protease, or the like can be used.
  • the nozzle 18 is provided to the user in a state of being covered with the nozzle cap 19.
  • the nozzle cap 19 is removable and is provided to the user with the nozzle cap 19 attached.
  • the reagent-filled syringe 15 may be provided to the user in a state of being housed in the syringe case 16, which can prevent the piston 17 from being suddenly pushed before use and the ATP test reagent 30 from leaking.
  • the materials of the reaction bottle 1, the nozzle cap 6, the waste liquid bottle 8, the luminescence measuring container 12, the reagent filling syringe 15, the sampling syringe 22, the pistons 17 and 23, and the nozzle caps 19 and 25 are resins such as polypropylene, polyethylene, and polystyrene. It can be a material, which can be manufactured by injection molding. Since the materials and sizes of the nozzles 18 and 24 can be the same as those of the nozzle 4 of the reaction bottle 1, the description thereof will be omitted.
  • the reaction bottle 1, the waste liquid bottle 8, the luminescence measuring container 12, the reagent filling syringe 15, and the sampling syringe 22 may all be provided to the user in a sterilized state.
  • the sterilization method include high-pressure steam sterilization, boiling disinfection, distribution steam sterilization, ethylene oxide gas sterilization (EOG sterilization), radiation sterilization (gamma ray sterilization), and ultraviolet sterilization.
  • EOG sterilization or gamma sterilization can be adopted.
  • the reaction bottle 1, the luminescence measurement container 12, and the reagent-filled syringe 15 may be sterilized again after filling the reagent 10, the luminescent reagent 20, and the ATP test reagent 30. Since the luminescent reagent 20 and the ATP scavenging reagent generally contain an enzyme, EOG sterilization can be adopted as the sterilization method for the luminescence measuring container 12 and the reagent-filled syringe 15. Further, the sterility can be further ensured by using the reagent 10 contained in the reaction bottle 1 and the ATP test reagent 30 contained in the reagent-filled syringe 15 that have been sterilized by filtration.
  • the microbiological test kit of the present embodiment may include one reaction bottle 1, one waste liquid bottle 8, a luminescence measurement container 12, a reagent-filled syringe 15, and a sampling syringe 22, and a plurality of each may be included. It may be. When a plurality of each are included, those having different volumes may be included, or those having the same volume may be included.
  • FIGS. 5A to 5I are diagrams showing a microorganism inspection method using the microorganism inspection kit according to the present embodiment
  • FIG. 6 is a flowchart showing the microorganism inspection method according to the present embodiment. In this embodiment, a method in which the user manually performs a microbiological test will be described.
  • the microbial control standard for pharmaceutical water is managed as a treatment standard value based on the permissible amount of microorganisms contained in water based on the pharmacopoeia of each country. According to the Japanese Pharmacopoeia, maintenance of the pharmaceutical water production line is required when the amount of normal water exceeds 100 CFU / mL, purified water exceeds 10 CFU / mL, and injection water exceeds 10 CFU / 100 mL.
  • the treatment standard values in the US Pharmacopeia are 500 CFU / mL for drinking water, 100 CFU / mL for purified water, and 10 CFU / 100 mL for injection water, and the treatment standard values in the European Pharmacopoeia are 100 CFU / mL for purified water and highly purified. Water is defined as 10 CFU / 100 mL and water for injection is defined as 10 CFU / 100 mL.
  • one microbiological test kit is used for each sample 102, using three samples of normal water, purified water and water for injection. To do.
  • One microbiological test kit includes a reaction bottle 1 prefilled with 10 mL of R2A liquid medium 101, a sampling syringe 22 (first syringe), a 200 mL capacity waste liquid bottle 8a, and a 10 mL capacity waste liquid bottle 8b, as described later.
  • a reagent-filled syringe 15a (third syringe) containing the ATP scavenging reagent 301 and a reagent-filled syringe 15b (second syringe) containing the ATP extraction reagent 302 are included. Further, in the microbial test kit for normal water and purified water, the capacity of the reaction bottle 1 is 1 mL, and in the microbial test kit for injection water, the capacity of the reaction bottle 1 is 100 mL.
  • the user collects a certain amount of sample 102 using the sampling syringe 22 (step S1).
  • sample 102 in the case of normal water and purified water, 1 mL each is collected, and in the case of injection water, 100 mL is collected.
  • the user penetrates the nozzle 24 (first syringe needle) of the sampling syringe 22 through the sealing cap 2 of the reaction bottle 1 and introduces the sample 102 into the reaction bottle 1 (step). S2).
  • the inside of the reaction bottle 1 is not depressurized and the pressure is atmospheric pressure, the user pushes the piston 23 to introduce the sample 102 into the reaction bottle 1.
  • the reaction bottle 1 is depressurized, the sample 102 is sucked by the pressure difference between the pressure inside the sampling syringe 22 and the pressure inside the reaction bottle 1 and introduced into the reaction bottle 1.
  • the sealing cap 2 is a septum formed of the above material, even if the nozzle 24 is penetrated and then the nozzle 24 is pulled out, the through hole is closed by the elastic force, so that the reaction bottle 1 can be used. It can be kept sealed.
  • the user removes the nozzle 24 of the sampling syringe 22 from the sealing cap 2 and puts the reaction bottle 1 containing the mixed solution 103 of the sample 102 and the R2A liquid medium 101 into the incubator 40 (constant temperature). It is introduced into a tank) and cultured for a certain period of time (step S3).
  • the temperature of the incubator 40 can be, for example, 25 to 37 ° C.
  • step S4 After culturing in the incubator 40 for a certain period of time, the user takes out the reaction bottle 1 from the incubator 40 (step S4).
  • the user removes the nozzle cap 6 from the reaction bottle 1 (step S5), thereby opening the inside of the reaction bottle 1 to the atmosphere, and opening the nozzle 4 to the sealing cap 9a of the waste liquid bottle 8a.
  • the nozzle 4 communicates with the inside of the decompressed waste liquid bottle 8a in a closed state, a pressure gradient is created between the nozzle 4 and the reaction bottle 1 opened to the atmosphere.
  • the mixed liquid 103 passes through the filter 5 and is filtered, and moves to the waste liquid bottle 8a (step S6).
  • the filter 5 captures the microorganism 104 (live bacteria) such as bacteria and fungi (mold, yeast) contained in the sample 102.
  • the free ATP contained in the mixed solution 103 and the ATP derived from dead bacteria basically flow to the waste liquid bottle 8a, but are slightly captured by the filter 5.
  • the user removes the nozzle 4 from the sealing cap 9a and seals the nozzle 18a (third syringe needle) of the reagent-filled syringe 15a filled with the ATP erasing reagent 301 into the reaction bottle 1. It penetrates through the cap 2 and pushes the piston 17a to inject it into the reaction bottle 1 (step S7). Further, the user attaches the nozzle cap 6 to the reaction bottle 1 (step S8).
  • the user removes the nozzle 18a of the reagent-filled syringe 15a from the sealing cap 2, introduces the reaction bottle 1 into the incubator 40, and takes about 30 minutes after injecting the ATP erasing reagent 301.
  • the erasing reaction is carried out in the range of room temperature to 37 ° C. (step S9). At this time, the reaction may be carried out in a stationary state or may be carried out while shaking. Further, the reaction bottle 1 may be installed in a temperature-controlled space such as a heat block to react, or may be left at room temperature, not limited to the incubator 40.
  • the user takes out the reaction bottle 1 from the incubator 40, removes the nozzle cap 6 of the reaction bottle 1, and penetrates the nozzle 4 through the sealing cap 9b of the waste liquid bottle 8b.
  • the ATP scavenging reagent 301 is moved to the waste liquid bottle 8b (step S10). At this time, since the inside of the waste liquid bottle 8b is depressurized, the ATP scavenging reagent 301 is sucked due to the pressure difference from the inside of the reaction bottle 1.
  • the ATP scavenging reagent 301 is introduced into the reaction bottle 1 to decompose and remove the free ATP trapped in the filter 5 and the ATP derived from dead bacteria, thereby improving the accuracy of the microbiological test. Can be improved further.
  • the user removes the nozzle 4 from the sealing cap 9b of the waste liquid bottle 8b, and the nozzle 18b (second syringe needle) of the reagent-filled syringe 15b filled with the ATP extraction reagent 302. Is penetrated through the sealing cap 2 of the reaction bottle 1, the piston 17b is pushed, and the ATP extraction reagent 302 is injected into the reaction bottle 1 (step S11).
  • the reaction is carried out at room temperature for about 1 minute to crush and lyse the viable bacteria captured in the filter 5, and the released ATP is dispersed in the ATP extraction reagent 302, and the ATP extract 105 Is obtained (step S12).
  • the user pulls out the nozzle 18b of the reagent-filled syringe 15b from the sealing cap 2, passes the nozzle 4 of the reaction bottle 1 through the sealing cap 13 of the luminescence measurement container 12, and ATP.
  • the extract 105 is moved to the light emission measuring container 12 (step S13).
  • the ATP extract 105 is sucked, passes through the filter 5, and is introduced into the luminescence measurement container 12.
  • bioluminescence occurs.
  • the user installs the luminescence measuring container 12 in which the ATP extract 105 is introduced in the luminescence measuring device 35.
  • the detector 36 of the luminescence measuring device 35 measures the amount of light generated by the luminescence reaction between the luminescent reagent 20 and the viable cell-derived ATP (step S14).
  • the luminescence measuring device 35 may be any device that can detect the luminescence amount of the luminescent reagent 20, and for example, a luminometer or the like can be used.
  • a photomultiplier tube is used, and luminescence measurement can be performed by a photon counting method that digitally processes the signal of the photomultiplier tube.
  • the light emission measuring device 35 may include a display unit (not shown) for displaying the result of light emission measurement.
  • FIG. 7 is a graph showing an example of the photon counting time course obtained by the detector 36 of the light emission measuring device 35.
  • the ATP amount can be calculated by integrating the light emission amount for a certain period of time in the photon counting time course, or by normalizing the average value of the light emission amount as RLU (Relative Light Unit). The user can determine that the microorganism was present when the amount of ATP exceeds a certain threshold.
  • RLU Relative Light Unit
  • microbiological test using the microbiological test kit of the present embodiment can also be carried out in a clean bench or a safety cabinet. As a result, false positives can be prevented more reliably, and the accuracy of the test can be improved.
  • the microbiological test kit of the present embodiment is vacuum-sealed with a sealed reaction bottle 1 having a filter 5 inside, a sampling syringe 22 capable of collecting a sample, a waste liquid bottle 8 sealed under reduced pressure, and a waste liquid bottle 8 sealed under reduced pressure.
  • a luminescence measuring container 12 containing a luminescent reagent 20 and a reagent-filled syringe 15 containing an ATP test reagent 30 are provided.
  • microorganism test kit Since the microorganism test kit according to the second embodiment is the same as that of the first embodiment, the description thereof will be omitted.
  • steps S3 and S4 shown in FIG. 6 are not carried out.
  • steps S3 and S4 shown in FIG. 6 are not carried out.
  • the reagent 10 may not be contained in the reaction bottle 1. Thereby, the cost of the reagent 10 can be reduced.
  • the sample since the sample is not cultured, it is necessary to detect a very small amount of viable cell-derived ATP. Therefore, in the microbial test method of the present embodiment, in order to remove free ATP and ATP derived from dead bacteria (ATP other than ATP derived from live bacteria) in the sample from the reaction bottle 1, a cleaning reagent is used as the ATP test reagent 30.
  • the reaction bottle 1 may be washed using the filled reagent-filled syringe 15 (fifth syringe).
  • Cleaning of the reaction bottle 1 with the cleaning reagent is performed, for example, between steps S6 and S7 (before the ATP erasing reaction) shown in FIG. 6 or between steps S10 and S11 (after the ATP erasing reaction) with the ATP erasing reagent. It can be carried out in a similar manner. As described above, by washing ATP other than ATP derived from live bacteria, the reliability of the microbial test can be further improved.
  • the reagent 10 contained in the reaction bottle 1 is liquid
  • the reagent 10 contained in the reaction bottle 1 is a powdered medium
  • a buffer solution usually used for a medium can be used as the solvent of the reagent 10.
  • the microbiological test method of the third embodiment is different from the microbiological test method of the first embodiment in that it further includes a step of dissolving the powdery reagent 10 in a solvent.
  • the user introduces the solvent into the reaction bottle 1 from a reagent-filled syringe (not shown) containing the solvent and homogenizes it. To obtain a liquid medium, leave it at room temperature or stir to dissolve it for about 5 to 30 minutes. After that, each step shown in FIG. 6 is carried out.
  • the culture of the sample (steps S3 and S4) may be omitted as in the second embodiment.
  • the reagent 10 contained in the reaction bottle 1 is a powdered medium. This enables longer-term storage as compared with the case of a liquid medium.
  • FIG. 8 is a schematic view showing the configuration of the microorganism inspection device 400 according to the fourth embodiment.
  • the microbe test device 400 of the present embodiment is an automated device including the microbe test kit of the first embodiment.
  • the microbiological inspection apparatus 400 is arranged in the upper stage installation table 41 (first installation table), the middle stage installation table 42 (second installation table), and the lower stage.
  • An installation table 43 (third installation table) is provided.
  • the installation table 41 can be arbitrarily moved in the Z direction by the actuator 44 (first driving means).
  • Syringe holders 48a to 48c are arranged along the Y direction on the installation table 41.
  • the syringe holder 48a holds the sampling syringe 22 (first syringe)
  • the syringe holder 48b holds the reagent-filled syringe 15a (third syringe)
  • the syringe holder 48c holds the reagent-filled syringe 15b (second syringe). Hold the syringe).
  • an actuator 45a (second driving means) for driving the piston 23 of the sampling syringe 22
  • an actuator 45b (second driving means) for driving the piston 17a of the reagent filling syringe 15a, and a reagent.
  • An actuator 45c (second driving means) for driving the piston 17b of the filling syringe 15b is installed along the Y direction.
  • the installation table 42 can be arbitrarily moved in the Y direction and the Z direction by the actuators 46 and 47 (first driving means).
  • the installation table 42 is provided with a reaction bottle holder 50 for holding the reaction bottle 1.
  • the reaction bottle holder 50 may have a heater (not shown) for adjusting the temperature inside the reaction bottle 1.
  • the container containing the sample 102 is placed on the installation table 42 at a position where the sample 102 can be collected by the sampling syringe 22.
  • the device 57 is provided.
  • the luminescence measuring device 57 is installed at the bottom of the luminescence measuring container holder 53 so that the luminescence from the luminescence measuring container 12 can be detected.
  • the light-shielding case 54 is installed so as to cover the light-emitting measurement container 12 after setting the light-emitting measurement container 12 in the light-emitting measurement container holder 53 when measuring light emission.
  • a slit 55 through which the nozzle 4 of the reaction bottle 1 can pass is provided on the ceiling of the light-shielding case 54.
  • the microbiological test apparatus 400 has a cap attachment / detachment mechanism (not shown) for attaching / detaching the nozzle cap 6 of the reaction bottle 1, the nozzle caps of the reagent-filled syringes 15a and 15b, and the nozzle cap 25 of the sampling syringe 22. Good.
  • the microorganism inspection device 400 is connected to the control device 100 (control unit) wirelessly or by wire.
  • the control device 100 is, for example, a computer terminal such as a personal computer, a tablet, or a smartphone, and is programmed to control the driving of each configuration of the microbiological test device 400 to automatically perform each step of FIG.
  • the control device 100 includes a calculation unit, a storage unit, a display unit, and the like.
  • the calculation unit obtains the amount of light emitted from the detection signal received from the light emission measuring device 57, and calculates the amount of ATP in the sample 102 based on the amount of light emitted.
  • the calculation unit compares the calculated luminescence amount or ATP amount with a predetermined threshold value, and determines whether it is positive (the presence of bacteria in the sample) or negative (there is no bacteria in the sample).
  • the storage unit stores various data such as a predetermined threshold value of the amount of light emitted or the amount of ATP.
  • the display unit displays the calculated luminescence amount and ATP amount, a positive or negative determination result, and the like.
  • the microbiological test apparatus 400 may be installed in a clean bench or a safety cabinet. As a result, false positives can be prevented more reliably, and the accuracy of the test can be improved.
  • the microbiological inspection method of the present embodiment is the same as the method shown in FIG. 6, but is the first in that the microbiological inspection is carried out by automatically controlling the operation of each configuration of the microbiological inspection apparatus 400 by the control device 100. It is different from the embodiment of 1.
  • the microorganism inspection method of the present embodiment will be described along with each step shown in FIG.
  • step S1 the control device 100 drives the actuator 46 to move the sample container (not shown) placed on the installation table 42 below the sampling syringe 22.
  • the control device 100 drives the actuator 44 downward to immerse the nozzle 24 in the sample 102, and drives the actuator 45a to move the piston 23 to collect a predetermined amount of the sample 102 in the sampling syringe 22. To do.
  • the actuator 44 is driven upward to retract the sampling syringe 22 from the sample container.
  • step S2 the control device 100 drives the actuator 46 to move the reaction bottle 1 below the sampling syringe 22.
  • the control device 100 drives the actuator 44 downward to penetrate the nozzle 24 through the sealing cap 2 of the reaction bottle 1.
  • the control device 100 drives the actuator 45a to push the piston 23 and introduces the sample 102 into the reaction bottle 1.
  • the sample 102 is sucked by the pressure difference between the sampling syringe 22 and the reaction bottle 1 and introduced into the reaction bottle 1.
  • step S3 the control device 100 drives the actuator 44 upward to remove the nozzle 24 from the sealing cap 2. After that, the control device 100 adjusts the temperature of the reaction bottle holder 50 to, for example, 25 to 37 ° C., and incubates for a certain period of time.
  • control device 100 After culturing for a certain period of time, the control device 100 stops the temperature control by the reaction bottle holder 50 instead of step S4.
  • step S5 the control device 100 drives a cap attachment / detachment mechanism (not shown) to remove the nozzle cap 6 from the reaction bottle 1.
  • step S6 the control device 100 drives the actuator 47 downward to penetrate the nozzle 4 through the sealing cap 9a of the waste liquid bottle 8a.
  • the nozzle 4 communicates with the inside of the decompressed waste liquid bottle 8a in a closed state, a pressure gradient is created between the nozzle 4 and the reaction bottle 1 opened to the atmosphere.
  • the mixed solution of the sample 102 and the reagent 10 passes through the filter 5, is filtered, and moves to the waste liquid bottle 8a.
  • the filter 5 captures microorganisms such as bacteria and fungi (mold, yeast) contained in the sample 102.
  • step S7 the control device 100 drives the actuator 47 upward, removes the nozzle 4 from the sealing cap 9a of the waste liquid bottle 8a, drives the actuator 46 in the Y direction, and drives the reaction bottle 1 into the reagent-filled syringe 15a.
  • the actuator 44 is driven downward to penetrate the nozzle 18a of the reagent-filled syringe 15a through the sealing cap 2.
  • the actuator 45b is driven to push the piston 17a of the reagent filling syringe 15a, and a predetermined amount of ATP scavenging reagent 301 is injected into the reaction bottle 1.
  • step S8 the control device 100 drives the cap attachment / detachment mechanism to attach the nozzle cap 6 to the reaction bottle 1.
  • step S9 the control device 100 drives the actuator 44 upward to remove the nozzle 18a of the reagent-filled syringe 15a from the sealing cap 2.
  • the temperature of the reaction bottle holder 50 is adjusted, and the erasing reaction is carried out in the range of room temperature to 37 ° C. for 30 minutes after injecting the ATP erasing reagent 301, for example.
  • step S10 after the ATP erasing reaction for 30 minutes, the control device 100 drives the cap attachment / detachment mechanism to remove the nozzle cap 6 of the reaction bottle 1, and drives the actuator 47 downward to seal the nozzle 4 to the waste liquid bottle 8b. It penetrates through the stop cap 9b. As a result, the ATP scavenging reagent 301 is moved to the waste liquid bottle 8b.
  • step S11 the control device 100 drives the actuator 47 upward to remove the nozzle 4 from the sealing cap 9b of the waste liquid bottle 8b.
  • the actuator 46 is driven to move the reaction bottle 1 below the reagent-filled syringe 15b, and the actuator 47 is driven downward to allow the nozzle 18b of the reagent-filled syringe 15b to penetrate the sealing cap 2 to penetrate the actuator.
  • the 45c is driven downward to push the piston 17b. As a result, a predetermined amount of ATP extraction reagent 302 is injected into the reaction bottle 1.
  • step S12 after injecting the ATP extraction reagent 302, the reaction was carried out at room temperature for about 1 minute, so that the viable bacteria captured by the filter 5 were crushed and lysed, and the released ATP was dispersed in the ATP extraction reagent 302. , ATP extract 105 is obtained.
  • step S13 the control device 100 drives the actuator 47 downward to penetrate the nozzle 4 through the sealing cap 13 of the light emission measuring container 12.
  • the light-shielding case 54 is in a state of covering the light emission measuring container 12 and the light emitting measurement container holder 53, and the nozzle 4 passes through the slit 55.
  • the ATP extract 105 moves to the luminescence measuring container 12.
  • the control device 100 causes the light emission measuring device 57 to start the light emission measurement.
  • the ATP extract 105 comes into contact with the luminescent reagent 20 previously introduced into the luminescence measuring container 12, bioluminescence occurs.
  • the luminescence measuring device 57 detects the luminescence of the luminescent reagent 20 and outputs the detection signal to the control device 100.
  • the control device 100 calculates the amount of light emitted based on the received detection signal, and calculates the amount of ATP in the sample 102. Further, the control device 100 compares the calculated luminescence amount or ATP amount with a predetermined threshold value stored in advance in the storage unit, and is positive (bacteria are present in the sample) or negative (bacteria in the sample). Does not exist). The judgment result may be output to a display unit or the like.
  • the installation table 41 is moved by the actuator 44, and the installation table 42 is moved by the actuators 46 and 47.
  • the reaction bottle 1, the sampling syringe 22, and the reagent-filled syringes 15a and 15b are used. If the relative positions of the waste liquid bottles 9a and 9b and the light emission measuring container 9 can be changed, the present invention is not limited to this.
  • the installation table 42 on which the reaction bottle 1 is installed may be fixed so that the installation tables 41 and 43 can move. Further, the installation tables 41 and 43 may be fixed so that only the installation table 42 moves in the vertical direction and the horizontal direction.
  • the microorganism inspection device 400 of the present embodiment has a configuration in which the microorganism inspection using the microorganism inspection kit according to the first embodiment is automated. This makes it possible to carry out a highly reliable microbiological test more easily and more quickly.
  • FIG. 9 is a schematic view showing the configuration of the microorganism inspection device 500 according to the fifth embodiment.
  • the microbiological test apparatus 500 of the present embodiment is different from the fourth embodiment in that a plurality of microbiological test kits are arranged in the X direction.
  • each configuration of the microorganism inspection kit is arranged in the X direction.
  • the actuators 45a to 45c, the syringe holders 48a to 48c, the reaction bottle holder 50, the waste liquid bottle holders 51a and 51b, and the luminescence measurement container holder 53 are also arranged three by three in the X direction, but the actuators are located in the front. Only 45a, the syringe holder 48a, the reaction bottle holder 50 and the waste liquid bottle holder 51a are shown.
  • the microorganism test device 500 of the present embodiment is an device that automates the microbiological test using the microbiological test kit according to the first embodiment, and can simultaneously carry out the microbiological test on a plurality of samples 102. it can. As a result, highly reliable microbiological tests can be performed more easily and more quickly, and the throughput of microbiological tests can be improved.
  • the microorganism inspection apparatus that automatically performs the microorganism inspection method according to the first embodiment has been described, but as a modification, for example, the second embodiment or the third embodiment has been described.
  • the microorganism inspection method according to the above may be automatically carried out.

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Abstract

高精度の微生物検査を容易に実施可能な技術を提供する。本開示の微生物検査キットは、検体を採取可能であり、第１のシリンジ針を有する第１のシリンジと、ＡＴＰ抽出試薬が収容され、第２のシリンジ針を有する第２のシリンジと、第１の開口部と、前記第１の開口部に嵌合された第１の封止部材と、ノズルと、前記ノズルを覆うノズルキャップと、前記第１の開口部及び前記ノズルの間を仕切るように配置されたフィルタと、を有し、密閉された反応容器と、第２の開口部と、前記第２の開口部に嵌合された第２の封止部材と、を有し、減圧密閉された廃液容器と、第３の開口部と、前記第３の開口部に嵌合された第３の封止部材と、を有し、ＡＴＰの存在下で発光する発光試薬が収容され、減圧密閉された発光計測容器と、を備えることを特徴とする。

Description

微生物検査キット、微生物検査方法及び微生物検査装置
　本開示は、微生物検査キット、微生物検査方法及び微生物検査装置に関する。
　医薬品工場や飲料工場では、無菌環境を実現した製造施設内において製品の製造が行われる。従来、製造施設や製品の無菌性を保証するための微生物検査において、培養法が採用されている。培養法は、培地を添加した検体を恒温機中にて数日～１４日間培養し、生育した菌のコロニー数を目視で計数する方法である。そのため、検査結果を得るのに時間がかかり、製品を出荷するまで検査結果を待つ必要がある。このような背景から、無菌判定を迅速に行う微生物検査方法の開発が望まれている。
　迅速かつ簡便な微生物検査方法の１つに、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＴＰ）生物発光法（以下、ＡＴＰ法という）がある。ＡＴＰ法は、ホタルの発光反応を利用して、菌体内に存在するＡＴＰを光に変換して測定する方法である。より具体的には、ルシフェラーゼにルシフェリンとＡＴＰ分子とを取り込ませ、ＡＴＰの消費とともに酸化されたルシフェリン（オキシルシフェリン）が励起状態から基底状態に遷移するときの発光量を計測する。このとき、ＡＴＰ１分子の消費が１フォトン（光子）の生成に対応するため、光子発生数がＡＴＰの個数に比例する。１個の生菌中にはエネルギー源として１アトモル（ａｍｏｌ＝１０－１８ｍｏｌ）相当のＡＴＰ分子が存在するため、検体中のＡＴＰによる発光量から、生菌の総数を推定することができる。
　ルシフェリン－ルシフェラーゼ反応は生物発光及び化学発光のうちで最も優れた量子効率（ΦＢＬ：≒０．５）であることから、細胞１個を数十万個相当のフォトンとして検出できる。したがって、ＡＴＰ法は、細胞１個相当の光を検出することが原理的に可能な方法である。
　しかしながら、検体に混入した極微量（数個レベル）の菌を高感度、高精度で検出するためには、発光計測装置の性能を高感度とするだけではなく、環境中に存在するＡＴＰや菌、ヒトが保有している微生物、ＡＴＰを吸着した塵などのコンタミネーションを防止しなければならない。また、一般に、検体には死菌由来のＡＴＰや遊離ＡＴＰが混在しているため、検体をそのまま発光計測に用いた場合には、正確な生菌数を見積もることができない。
　特許文献１には、検体中の遊離ＡＴＰを除去するために、検体液のろ過や、アピラーゼなどのＡＴＰ分解酵素を用いて微生物や死菌を予め分解することが記載されている。
国際公開第２０１６／１４７３１３号
　しかしながら、特許文献１に記載の方法を含め、ＡＴＰ法は一般に反応操作が煩雑であり、検査環境や作業者のスキルが検査結果に影響しやすい。したがって、検査環境や作業者からのコンタミネーションを受けて検査精度が低下し、偽陽性となりやすい。たとえ、安全キャビネット内において無菌操作を実施してもコンタミネーションを完全に防ぐことは困難であり、特に、無菌試験のような陰性／陽性判定検査では、偽陽性か真陽性かを明確に証明することが困難であった。
　そこで、本開示は、高精度の微生物検査を容易に実施可能な技術を提供する。
　本開示の微生物検査キットは、検体を採取可能であり、第１のシリンジ針を有する第１のシリンジと、ＡＴＰ抽出試薬が収容され、第２のシリンジ針を有する第２のシリンジと、第１の開口部と、前記第１の開口部に嵌合された第１の封止部材と、ノズルと、前記ノズルを覆うノズルキャップと、前記第１の開口部及び前記ノズルの間を仕切るように配置されたフィルタと、を有し、密閉された反応容器と、第２の開口部と、前記第２の開口部に嵌合された第２の封止部材と、を有し、減圧密閉された廃液容器と、第３の開口部と、前記第３の開口部に嵌合された第３の封止部材と、を有し、ＡＴＰの存在下で発光する発光試薬が収容され、減圧密閉された発光計測容器と、を備えることを特徴とする。
　本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
　本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではない。
　本開示の微生物検査キットによれば、高精度の微生物検査を容易に実施することができる。
　上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
第１の実施形態に係る微生物検査キットの反応ボトルを示す模式図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットの廃液ボトルを示す模式図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットの発光計測容器を示す模式図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットのサンプリングシリンジを示す模式図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットの試薬充填シリンジを示す模式図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査方法を示す図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査方法を示す図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査方法を示す図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査方法を示す図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査方法を示す図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査方法を示す図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査方法を示す図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査方法を示す図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査方法を示す図である。 第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査方法の一例を示すフローチャートである。 フォトンカウンティングタイムコースを示す図である。 第４の実施形態に係る微生物検査装置の構成を示す模式図である。 第５の実施形態に係る微生物検査装置の構成を示す模式図である。
　以下、添付図面を参照して本開示の実施形態について説明する。ただし、各実施形態は本開示を実現するための一例に過ぎず、本開示を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
［第１の実施形態］
＜微生物検査キット＞
　第１の実施形態に係る微生物検査キットは、後述するように、反応ボトル１（反応容器）、廃液ボトル８（廃液容器）、発光計測容器１２、サンプリングシリンジ２２（第１のシリンジ）、試薬充填シリンジ１５（第２～第５のシリンジ）を備える。
　図１は、第１の実施形態に係る微生物検査キットの反応ボトル１を示す模式図である。図１に示すように、反応ボトル１（反応容器）は、封止キャップ２（第１の封止部材）、ノズル４、フィルタ５、ノズルキャップ６、フィッティング部７を有する。
　反応ボトル１は、一端に開口部３（第１の開口部）を有し、開口部３には封止キャップ２が嵌合されている。封止キャップ２としては、例えばセプタムを用いることができ、その材質としては、例えば天然ゴム、ブチルゴム、ＰＴＦＥ（Ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）／天然ゴム、ＰＴＦＥ／ブチルゴム、シリコン／シリコンゴム、ＰＴＦＥ／シリコン、ＰＴＦＥ／シリコン／ＰＴＦＥ、ポリエチレン、バイトンなどが挙げられる。このような材質であることにより、封止キャップ２には、後述する各種シリンジのノズル（シリンジ針）が貫通することができる。
　反応ボトル１は、開口部３と反対側の端部が先端に向かって先細り、先端にはノズル４が接続されている。反応ボトル１とノズル４との境界には、フィッティング部７が設けられる。ノズルキャップ６は、フィッティング部７と嵌合することにより、反応ボトル１を密閉するようにノズル４を覆う。ノズルキャップ６は着脱可能であり、ユーザーには、ノズルキャップ６が取り付けられた状態で提供される。
　反応ボトル１及びノズルキャップ６の材質は、例えばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン等の樹脂材とすることができ、射出成形により反応ボトル１を製造することができる。ノズル４の材質は、ステンレス材（ＳＵＳ３０４）などの金属製とすることができるが、樹脂製であっても良い。ノズル４の外径は、例えば０．３～０．９ｍｍΦとすることができ、内径は例えば０．０７～０．６ｍｍとすることができる。ノズル４の長さは例えば１３～３８ｍｍとすることができる。ノズル４の先端は、斜めにカットされていてもよい。
　フィルタ５は、開口部３とノズル４との間を２つの空間に仕切るように、反応ボトル１の内部に配置される。フィルタ５の位置は、開口部３とフィルタ５との間に十分な量の検体を導入できるような位置である。
　フィルタ５としては、検査対象の微生物を捕捉可能なものであればよく、例えばメンブレンフィルタを用いることができる。フィルタ５の材質としては、例えばセルロース混合エステル、ＰＴＦＥ、ＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ　Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ポリカーボネートなどが挙げられる。
　フィルタ５の孔径は、検査対象の微生物のサイズや、微生物検査の諸条件に応じて適宜選択することができ、例えば０．２０μｍ以上とすることができる。具体的には、フィルタ５として、孔径が０．２２μｍや０．４５μｍ等のメンブレンフィルタが挙げられる。
　開口部３とフィルタ５との間には、試薬１０が予め導入されている。図１においては、試薬１０が液状である場合を示しているが、粉末であっても良い。試薬１０として、培地成分又はＡＴＰ分解酵素などのＡＴＰ消去試薬が単独で収容されていてもよいし、これらの混合物が収容されていてもよい。また、試薬１０には、培地成分やＡＴＰ消去試薬以外の成分が含有されていてもよい。
　培地としては、検査対象の微生物や微生物検査の諸条件に応じて、例えばソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地、チオグリコール酸培地、Ｒ２Ａ培地、標準培地、サブロー・ブドウ糖培地、モーゼル腸内細菌増菌ブイヨン培地、マッコンキー培地、ラパポート・バシリアジス・サルモネラ増菌培地、セレナイト・シスチン培地、テトラチオネート培地、ラパポート培地、乳糖ブイヨン培地、ミューラーヒントン培地などを用いることができる。
　微生物検査の実施時に、検体は、開口部３とフィルタ５との間の空間に導入される。図１に示すように、反応ボトル１には、導入された検体の容量を示す目盛が印字又は刻印されていてもよく、これにより検体の液量を容易に把握することができる。試薬１０が液体である場合、その液面にゼロの目盛が合わせられる。試薬１０が粉末である場合は、所定量の溶媒が添加された際の液面がゼロとなるように目盛が合わせられる。
　反応ボトル１の容量として、例えば１ｍＬ仕様、１０ｍＬ仕様、５０ｍＬ仕様、１００ｍＬ仕様など、複数の容量のものが微生物検査キットに含まれていてもよい。これにより、微生物検査に用いる検体に応じて、ユーザーが反応ボトル１の容量を選択することができる。図１に示す反応ボトル１は、５０ｍＬ仕様である。
　反応ボトル１の内部は、減圧されていてもよい。この場合、減圧環境下で封止キャップ２とノズルキャップ６が嵌合されることにより、反応ボトル１の内部が減圧された状態で密閉される。ノズルキャップ６を取り外すことで、反応ボトル１の内部は大気圧となる。
　図２は、本実施形態に係る微生物検査キットの廃液ボトル８（廃液容器）を示す模式図である。図２に示すように、廃液ボトル８は、開口部１１（第２の開口部）に封止キャップ９（第２の封止部材）が嵌合されており、内部が減圧され、密閉されている。廃液ボトル８の製造時には、減圧環境下で開口部１１に封止キャップ９が嵌合される。封止キャップ９として例えばセプタムを用いることができ、その材質は上述の通りである。
　封止キャップ９には、反応ボトル１のノズル４を貫通させることができ、これにより、反応ボトル１内部の圧力と廃液ボトル８内部の圧力との圧力勾配（圧力差）によって、反応ボトル１内部の液体をフィルタ５によりろ過し、廃液ボトル８に回収することができる。したがって、廃液ボトル８内部の圧力は、反応ボトル１内の液体を排出可能な程度に減圧されていればよい。なお、反応ボトル１内部の液体の排出時には、ノズルキャップ６が取り外されることにより反応ボトル１が大気開放されるため、廃液ボトル８内部の初期圧力は、大気圧よりも低く設定される。ここで、例えば廃液ボトル８内部の初期圧力を０気圧と仮定し、一定の圧力を保って反応ボトル１中の液体が廃液ボトル８に排出されることとすると、反応ボトル１内の液体のフィルタ５によるろ過は、１気圧（大気圧）の一定圧力下で実施される。
　図３は、本実施形態に係る微生物検査キットの発光計測容器１２を示す模式図である。図３に示すように、発光計測容器１２は、開口部１４（第３の開口部）に封止キャップ１３（第３の封止部材）が嵌合され、内部が減圧されており、密閉されている。発光計測容器１２の製造時には、減圧環境下で開口部１４に封止キャップ１３が嵌合される。発光計測容器１２内部の圧力については、上述の廃液ボトル８内部の圧力と同様に設定することができる。封止キャップ１３として例えばセプタムを用いることができ、その材質は上述の通りである。
　発光計測容器１２には、予め発光試薬２０が導入されている。発光試薬２０は、ＡＴＰと混合されることにより発光する試薬であり、例えばルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む試薬を用いることができる。なお、ルシフェラーゼは発光試薬２０に導入され、ルシフェリンは後述する試薬充填シリンジ１５のＡＴＰ抽出試薬に混合されていてもよい。
　図４Ａは、本実施形態に係る微生物検査キットのサンプリングシリンジ２２（第１のシリンジ）を示す模式図である。図４Ａに示すように、サンプリングシリンジ２２は、検体を採取可能なシリンジであり、ピストン２３、ノズル２４（第１のシリンジ針）及びノズルキャップ２５を有する。図４Ａに示す例においては、サンプリングシリンジ２２は、最大１００ｍＬまで検体を採取できる。
　ノズル２４は、ノズルキャップ２５に覆われた状態でユーザーに提供される。ノズルキャップ２５は着脱可能であり、ユーザーには、ノズルキャップ２５が取り付けられた状態で提供される。
　図４Ｂは、本実施形態に係る微生物検査キットの試薬充填シリンジ１５（第２～第５のシリンジ）を示す模式図である。図４Ｂに示すように、試薬充填シリンジ１５は、ピストン１７、ノズル１８（第２～第５のシリンジ針）及びノズルキャップ１９を有する。
　試薬充填シリンジ１５には、１回の検査に必要とされる液量分のＡＴＰ検査試薬３０が充填されている。ＡＴＰ検査試薬３０の例としては、例えばＡＴＰ抽出試薬、ＡＴＰ消去試薬、溶媒、洗浄試薬などが挙げられる。試薬充填シリンジ１５は、ＡＴＰ検査試薬３０の種類ごとに、予め試薬充填シリンジ１５に導入された状態でユーザーに提供される。なお、本実施形態の微生物検査キットは、少なくともＡＴＰ抽出試薬が収容された試薬充填シリンジ１５（第２のシリンジ）を有する。
　ＡＴＰ抽出試薬としては、例えば塩化ベンザルコニウムや塩化ベンゼトニウムなどの界面活性剤、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、トリス緩衝液、エタノール、プロテアーゼ活性を有する溶菌酵素又はリゾチーム等を含む水溶液を用いることができる。
　反応ボトル１中の試薬１０にＡＴＰ消去試薬が含まれていない場合には、ＡＴＰ消去試薬が収容された試薬充填シリンジ１５（第３のシリンジ）が微生物検査キットに含まれていてもよい。
　また、試薬１０が粉末状である場合には、試薬１０の溶媒が収容された試薬充填シリンジ１５（第４のシリンジ）が微生物検査キットに含まれていてもよい。試薬１０の溶媒としては、例えば、培地に通常用いられる緩衝液などを用いることができる。
　さらに、洗浄試薬が収容された試薬充填シリンジ１５（第５のシリンジ）についても、微生物検査キットに含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。洗浄試薬は、反応ボトル１を洗浄し、検体中の遊離ＡＴＰや死菌由来のＡＴＰ（生菌由来のＡＴＰ以外のＡＴＰ）を除去するために用いられる。洗浄試薬としては、例えば、ｐＨが７～９程度に調整された緩衝液（例えばペプトン溶液、リン酸緩衝生理食塩水など）、微生物を分解しない界面活性剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）を含む緩衝液、プロテアーゼなどの酵素を含む緩衝液などを用いることができる。
　ノズル１８は、ノズルキャップ１９に覆われた状態でユーザーに提供される。ノズルキャップ１９は着脱可能であり、ユーザーには、ノズルキャップ１９が取り付けられた状態で提供される。
　試薬充填シリンジ１５は、シリンジケース１６に収納された状態でユーザーに提供されてもよく、これによりピストン１７が使用前に不意に押されてＡＴＰ検査試薬３０が漏れることを防止することができる。
　反応ボトル１、ノズルキャップ６、廃液ボトル８、発光計測容器１２、試薬充填シリンジ１５、サンプリングシリンジ２２、ピストン１７及び２３、並びにノズルキャップ１９及び２５の材質は、例えばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン等の樹脂材とすることができ、これらは射出成形により製造することができる。ノズル１８及び２４の材質やサイズは、反応ボトル１のノズル４と同様とすることができるため、説明を省略する。
　反応ボトル１、廃液ボトル８、発光計測容器１２、試薬充填シリンジ１５及びサンプリングシリンジ２２は、全て滅菌された状態でユーザーに提供されてもよい。これにより、偽陽性を防止し、検体中の菌の検出精度を向上することができる。滅菌方法としては、例えば高圧蒸気滅菌、煮沸消毒、流通蒸気消毒、酸化エチレンガス滅菌（ＥＯＧ滅菌）、放射線滅菌（ガンマ線滅菌）、紫外線滅菌などが挙げられる。材質の劣化を防止するためには、ＥＯＧ滅菌又はガンマ線滅菌を採用することができる。
　反応ボトル１、発光計測容器１２、試薬充填シリンジ１５は、試薬１０、発光試薬２０、ＡＴＰ検査試薬３０を充填後、再度、滅菌処理されてもよい。一般に発光試薬２０やＡＴＰ消去試薬は酵素を含むので、発光計測容器１２及び試薬充填シリンジ１５の滅菌法としてはＥＯＧ滅菌を採用することができる。さらに、反応ボトル１に収容される試薬１０や、試薬充填シリンジ１５に収容されるＡＴＰ検査試薬３０も、ろ過滅菌したものを使用することで、無菌性をより担保できる。
　なお、本実施形態の微生物検査キットには、反応ボトル１、廃液ボトル８、発光計測容器１２、試薬充填シリンジ１５及びサンプリングシリンジ２２がそれぞれ１つずつ含まれていてもよいし、それぞれ複数個含まれていてもよい。それぞれ複数個含まれる場合は、異なる容積のものが含まれていてもよいし、同じ容積のものが含まれていてもよい。
＜微生物検査方法＞
　図５Ａ～５Ｉは、本実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査方法を示す図であり、図６は、本実施形態に係る微生物検査方法を示すフローチャートである。なお、本実施形態においては、ユーザーがマニュアルで微生物検査を行う方法について説明する。
　製薬用水の微生物管理基準は、各国の薬局方に基づいて、水に含まれる微生物量の許容量で処置基準値として管理されている。日本薬局方においては、常水は１００ＣＦＵ／ｍＬ、精製水は１０ＣＦＵ／ｍＬ、注射用水は１０ＣＦＵ／１００ｍＬを超えたときに、製薬用水製造ラインのメンテナンスが必要となる。米国薬局方における処置基準値は、飲料水が５００ＣＦＵ／ｍＬ、精製水が１００ＣＦＵ／ｍＬ、注射用水が１０ＣＦＵ／１００ｍＬであり、欧州薬局方における処置基準値は、精製水が１００ＣＦＵ／ｍＬ、高度精製水が１０ＣＦＵ／１００ｍＬ、注射用水が１０ＣＦＵ／１００ｍＬと定められている。
　そこで、以下においては、日本薬局方の検査に準拠した製薬用水の微生物検査を行うため、常水、精製水及び注射用水の３つを検体１０２として、各検体１０２に１つの微生物検査キットを使用する。１つの微生物検査キットには、後述するように１０ｍＬのＲ２Ａ液体培地１０１が予め充填された反応ボトル１、サンプリングシリンジ２２（第１のシリンジ）、２００ｍＬ容量の廃液ボトル８ａ、１０ｍＬ容量の廃液ボトル８ｂ、ＡＴＰ消去試薬３０１を収容する試薬充填シリンジ１５ａ（第３のシリンジ）及びＡＴＰ抽出試薬３０２を収容する試薬充填シリンジ１５ｂ（第２のシリンジ）が含まれることとする。また、常水用及び精製水用の微生物検査キットにおいては、反応ボトル１の容量は１ｍＬとし、注射用水用の微生物検査キットにおいては、反応ボトル１の容量は１００ｍＬとする。
　まず、ユーザーは、サンプリングシリンジ２２を用いて、一定量の検体１０２を採取する（ステップＳ１）。ここで、常水の場合及び精製水の場合は、それぞれ１ｍＬ採取し、注射用水の場合は、１００ｍＬ採取する。
　次に、図５Ａに示すように、ユーザーは、サンプリングシリンジ２２のノズル２４（第１のシリンジ針）を反応ボトル１の封止キャップ２に貫通させ、検体１０２を反応ボトル１に導入する（ステップＳ２）。このとき、反応ボトル１内部が減圧されておらず大気圧である場合は、ユーザーがピストン２３を押して検体１０２を反応ボトル１に導入する。反応ボトル１が減圧されている場合は、サンプリングシリンジ２２内部の圧力と反応ボトル１内部の圧力との圧力差により検体１０２が吸引され、反応ボトル１に導入される。
　なお、封止キャップ２が上記の材質で形成されたセプタムであることにより、ノズル２４を貫通させ、その後ノズル２４を抜いたとしても、貫通穴が弾性力により塞がれるため、反応ボトル１が密閉された状態を保つことができる。
　次に、図５Ｂに示すように、ユーザーは、サンプリングシリンジ２２のノズル２４を封止キャップ２から抜き、検体１０２とＲ２Ａ液体培地１０１との混合液１０３を収容する反応ボトル１をインキュベータ４０（恒温槽）に導入して、一定時間培養を行う（ステップＳ３）。インキュベータ４０の温度は、例えば２５～３７℃とすることができる。
　インキュベータ４０で一定時間培養後、ユーザーは、反応ボトル１をインキュベータ４０の中から取り出す（ステップＳ４）。
　次に、図５Ｃに示すように、ユーザーは、反応ボトル１からノズルキャップ６を外し（ステップＳ５）、これにより反応ボトル１内を大気開放して、ノズル４を廃液ボトル８ａの封止キャップ９ａに貫通させる。ノズル４が減圧された廃液ボトル８ａの内部と密閉状態で連絡するとき、大気開放された反応ボトル１との間に圧力勾配が生み出される。これによって、混合液１０３は、フィルタ５を通過してろ過され、廃液ボトル８ａへ移動する（ステップＳ６）。このとき、フィルタ５は、検体１０２に含まれていた細菌、真菌（カビ、酵母）などの微生物１０４（生菌）を捕捉する。なお、混合液１０３に含まれる遊離ＡＴＰ及び死菌由来のＡＴＰは、基本的には廃液ボトル８ａへ流れるが、わずかにフィルタ５に捕捉される。
　図５Ｄに示すように、ユーザーは、ノズル４を封止キャップ９ａから抜き、ＡＴＰ消去試薬３０１が充填されている試薬充填シリンジ１５ａのノズル１８ａ（第３のシリンジ針）を反応ボトル１の封止キャップ２に貫通させ、ピストン１７ａを押して反応ボトル１に注入する（ステップＳ７）。また、ユーザーは、ノズルキャップ６を反応ボトル１に取付ける（ステップＳ８）。
　次に、図５Ｅに示すように、ユーザーは、試薬充填シリンジ１５ａのノズル１８ａを封止キャップ２から抜き、反応ボトル１をインキュベータ４０に導入して、ＡＴＰ消去試薬３０１の注入後約３０分間、室温～３７℃の範囲で消去反応させる（ステップＳ９）。なお、このとき、静置した状態で反応させてもよいし、振とうさせながら反応させてもよい。また、インキュベータ４０に限らず、ヒートブロックなどの温調された空間に反応ボトル１を設置して反応させてもよいし、室温放置であってもかまわない。
　３０分間のＡＴＰ消去反応後、図５Ｆに示すように、ユーザーは、反応ボトル１をインキュベータ４０から取り出して反応ボトル１のノズルキャップ６を外し、ノズル４を廃液ボトル８ｂの封止キャップ９ｂに貫通させ、ＡＴＰ消去試薬３０１を廃液ボトル８ｂに移動させる（ステップＳ１０）。このとき、廃液ボトル８ｂの内部は減圧されているため、反応ボトル１の内部との圧力差により、ＡＴＰ消去試薬３０１が吸引される。
　このように、検体１０２のろ過及びＡＴＰ消去試薬３０１の廃棄のために、異なる２つの廃液ボトル８ａ及び８ｂを使用することにより、封止キャップ９ａ及び９ｂに付着した菌や環境中に浮遊していたＡＴＰからのノズル４への汚染を防止することができる。なお、１つの廃液ボトル８を繰り返し使用する場合は、ノズル４が封止キャップ９を貫通する位置を異ならせることで、汚染を防止することができる。
　図５Ｄ～５Ｆに示したように、ＡＴＰ消去試薬３０１を反応ボトル１に導入し、フィルタ５に捕捉された遊離ＡＴＰ及び死菌由来のＡＴＰを分解し、除去することで、微生物検査の精度をより向上することができる。
　次に、図５Ｇに示すように、ユーザーは、ノズル４を廃液ボトル８ｂの封止キャップ９ｂから抜き、ＡＴＰ抽出試薬３０２が充填されている試薬充填シリンジ１５ｂのノズル１８ｂ（第２のシリンジ針）を反応ボトル１の封止キャップ２に貫通させ、ピストン１７ｂを押し、ＡＴＰ抽出試薬３０２を反応ボトル１に注入する（ステップＳ１１）。
　ＡＴＰ抽出試薬３０２を注入後、室温で約１分反応させることで、フィルタ５に捕捉された生菌が破砕、溶菌されて放出されたＡＴＰがＡＴＰ抽出試薬３０２中に分散し、ＡＴＰ抽出液１０５が得られる（ステップＳ１２）。
　次に、図５Ｈに示すように、ユーザーは、試薬充填シリンジ１５ｂのノズル１８ｂを封止キャップ２から抜き、反応ボトル１のノズル４を発光計測容器１２の封止キャップ１３に貫通させて、ＡＴＰ抽出液１０５を発光計測容器１２に移動する（ステップＳ１３）。このとき、発光計測容器１２の内部は減圧されているため、ＡＴＰ抽出液１０５が吸引されてフィルタ５を通過して発光計測容器１２に導入される。ＡＴＰ抽出液１０５が発光計測容器１２に予め導入されている発光試薬２０と接触すると、生物発光が生じる。
　図５Ｉに示すように、ユーザーは、ＡＴＰ抽出液１０５が導入された発光計測容器１２を発光計測装置３５に設置する。発光計測装置３５の検出器３６は、発光試薬２０と生菌由来のＡＴＰとの発光反応により生じた光の量を計測する（ステップＳ１４）。発光計測装置３５としては、発光試薬２０の発光量を検出することができる装置であればよく、例えばルミノメータなどを用いることができる。検出器３６としては、例えば光電子増倍管が用いられ、光電子増倍管の信号をデジタル処理するフォトンカウンティング法により発光計測を実施することができる。発光計測装置３５は、発光計測の結果を表示する表示部（図示せず）を備えていてもよい。
　図７は、発光計測装置３５の検出器３６で得られたフォトンカウンティングタイムコースの一例を示すグラフである。ＡＴＰ量は、フォトンカウンティングタイムコースの一定時間の発光量を積算するか、あるいは発光量の平均値をＲＬＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｌｉｇｈｔ　Ｕｎｉｔ）として規格化することにより算出することができる。ユーザーは、ＡＴＰ量がある閾値を超えた際に、微生物が存在したと判断することができる。
　なお、本実施形態の微生物検査キットを用いた微生物検査は、クリーンベンチや、安全キャビネット内で実施することもできる。これにより、偽陽性をより確実に防止することができ、検査の精度を向上することができる。
＜技術的効果＞
　以上のように、本実施形態の微生物検査キットは、内部にフィルタ５を有する密閉された反応ボトル１と、検体を採取可能なサンプリングシリンジ２２と、減圧密閉された廃液ボトル８と、減圧密閉され、発光試薬２０が収容される発光計測容器１２と、ＡＴＰ検査試薬３０が収容される試薬充填シリンジ１５と、を備える。このような構成を有することにより、ＡＴＰ法による微生物検査において無菌操作を容易に実施することができる。したがって、高精度の微生物検査を容易に実施することができる。
［第２の実施形態］
　第１の実施形態においては、反応ボトル１に検体を導入した後、培養を行ってから生菌由来のＡＴＰを抽出し、発光計測を行う微生物検査方法について説明したが、第２の実施形態においては、反応ボトル１に検体を導入した後、培養を行わずに生菌由来のＡＴＰを抽出する点で、第１の実施形態と異なっている。
＜微生物検査キット＞
　第２の実施形態に係る微生物検査キットは、第１の実施形態と同様であるため説明を省略する。
＜微生物検査方法＞
　第２の実施形態の微生物検査方法においては、第１の実施形態と異なり、図６に示すステップＳ３及びＳ４（図５Ｂ）を実施しない。このように、検体の培養を省略することで、検体中の微量の生菌に由来するＡＴＰの検出を迅速に行うことができる。
　なお、本実施形態においては検体の培養を実施しないため、反応ボトル１には、試薬１０が収容されていなくてもよい。これにより、試薬１０のコストを削減することができる。
　また、本実施形態においては検体の培養を実施しないため、極微量の生菌由来のＡＴＰを検出する必要がある。したがって、本実施形態の微生物検査方法は、検体中の遊離ＡＴＰや死菌由来のＡＴＰ（生菌由来のＡＴＰ以外のＡＴＰ）を反応ボトル１から除去するために、ＡＴＰ検査試薬３０として洗浄試薬が充填された試薬充填シリンジ１５（第５のシリンジ）を使用して、反応ボトル１を洗浄する工程を有していてもよい。
　洗浄試薬による反応ボトル１の洗浄は、例えば、図６に示すステップＳ６とＳ７の間（ＡＴＰ消去反応前）、あるいはステップＳ１０とＳ１１の間（ＡＴＰ消去反応後）において、ＡＴＰ消去試薬の場合と同様の方法で実施することができる。このように、生菌由来のＡＴＰ以外のＡＴＰを洗浄することにより、微生物検査の信頼性をより向上することができる。
＜技術的効果＞
　以上のように、本実施形態においては、第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査方法において、検体中の微生物の培養を省略するため、より迅速に高い信頼性の微生物検査を実施することができる。
［第３の実施形態］
＜微生物検査キット＞
　第１の実施形態においては、反応ボトル１に収容される試薬１０が液状である場合について説明した。第３の実施形態に係る微生物検査キットは、反応ボトル１に収容される試薬１０が粉末状の培地であり、ＡＴＰ検査試薬３０として、試薬１０の溶媒が収容される試薬充填シリンジ１５（第４のシリンジ）をさらに備える点で、第１の実施形態と異なっている。試薬１０の溶媒としては、例えば、培地に通常用いられる緩衝液などを用いることができる。
＜微生物検査方法＞
　第３の実施形態の微生物検査方法は、粉末状の試薬１０を溶媒に溶解する工程をさらに備える点で、第１の実施形態に係る微生物検査方法と異なっている。具体的には、本実施形態においては、図６に示すステップＳ１の前に、ユーザーが、溶媒が収容された試薬充填シリンジ（図示せず）から反応ボトル１に溶媒を導入し、均一化されるまで、５～３０分程度、室温で放置又は攪拌して溶解させ、液体培地を得る。その後は、図６に示す各ステップを実施する。
　なお、本実施形態においても第２の実施形態と同様に、検体の培養（ステップＳ３及びＳ４）を省略してもよい。
＜技術的効果＞
　以上のように、本実施形態においては、反応ボトル１に収容される試薬１０が粉末状の培地である。これにより、液体培地の場合と比較して、より長期的な保存が可能となる。
［第４の実施形態］
　第１～第３の実施形態においては、ユーザーが微生物検査キットを用いてマニュアルで微生物検査を行う方法について説明したが、本実施形態においては、微生物検査キットの各構成の駆動手段を備える微生物検査装置により、自動で微生物検査が行われる。
＜微生物検査装置＞
　図８は、第４の実施形態に係る微生物検査装置４００の構成を示す模式図である。本実施形態の微生物検査装置４００は、第１の実施形態の微生物検査キットを備える自動化装置である。
　図８に示すように、微生物検査装置４００は、上段に配置される設置テーブル４１（第１の設置テーブル）、中段に配置される設置テーブル４２（第２の設置テーブル）、下段に配置される設置テーブル４３（第３の設置テーブル）を備える。
　設置テーブル４１は、アクチュエータ４４（第１の駆動手段）によりＺ方向に任意に移動可能である。設置テーブル４１には、シリンジホルダ４８ａ～４８ｃがＹ方向に沿って配置されている。シリンジホルダ４８ａは、サンプリングシリンジ２２（第１のシリンジ）を保持し、シリンジホルダ４８ｂは、試薬充填シリンジ１５ａ（第３のシリンジ）を保持し、シリンジホルダ４８ｃは、試薬充填シリンジ１５ｂ（第２のシリンジ）を保持する。
　さらに、設置テーブル４１上には、サンプリングシリンジ２２のピストン２３を駆動するアクチュエータ４５ａ（第２の駆動手段）、試薬充填シリンジ１５ａのピストン１７ａを駆動するアクチュエータ４５ｂ（第２の駆動手段）、及び試薬充填シリンジ１５ｂのピストン１７ｂを駆動するアクチュエータ４５ｃ（第２の駆動手段）がＹ方向に沿って設置されている。
　設置テーブル４２は、アクチュエータ４６及び４７（第１の駆動手段）によりＹ方向及びＺ方向に任意に移動可能である。設置テーブル４２には、反応ボトル１が保持される反応ボトルホルダ５０が設けられる。反応ボトルホルダ５０は、反応ボトル１の内部を温度調整するヒーター（図示せず）を有していてもよい。また、図示は省略しているが、検体１０２を収容した容器は、設置テーブル４２上においてサンプリングシリンジ２２により検体１０２を採取可能な位置に載置される。
　設置テーブル４３には、廃液ボトル８ａが保持される廃液ボトルホルダ５１ａ、廃液ボトル８ｂが保持される廃液ボトルホルダ５１ｂ、発光計測容器１２が保持される発光計測容器ホルダ５３、遮光ケース５４、発光計測装置５７が設けられる。発光計測装置５７は、発光計測容器１２からの発光を検出可能なように、発光計測容器ホルダ５３の底部に設置される。遮光ケース５４は、発光計測を行う際に、発光計測容器ホルダ５３に発光計測容器１２をセットした後、これらを覆うように設置される。遮光ケース５４の天井部には、反応ボトル１のノズル４が通過可能なスリット５５が設けられている。
　微生物検査装置４００は、反応ボトル１のノズルキャップ６、試薬充填シリンジ１５ａ及び１５ｂのノズルキャップ、サンプリングシリンジ２２のノズルキャップ２５を着脱するためのキャップ着脱機構（図示せず）を有していてもよい。
　微生物検査装置４００は、無線又は有線により制御装置１００（制御部）に接続される。制御装置１００は、例えばパーソナルコンピュータ、タブレット、スマートフォンなどのコンピュータ端末であり、微生物検査装置４００の各構成の駆動を制御して、図６の各ステップを自動で実施させるようにプログラムされている。
　図示は省略しているが、制御装置１００は、演算部、記憶部、表示部などを備える。演算部は、発光計測装置５７から受信した検出信号から発光量を求め、発光量に基づいて検体１０２中のＡＴＰ量を算出する。また、演算部は、算出した発光量又はＡＴＰ量と所定の閾値とを比較して、陽性（検体中に菌が存在する）か陰性（検体中に菌が存在しない）かの判定を行う。記憶部は、発光量又はＡＴＰ量の所定の閾値などの各種データを記憶する。表示部は、算出された発光量及びＡＴＰ量、陽性か陰性かの判定結果などを表示する。
　微生物検査装置４００は、クリーンベンチや、安全キャビネット内に設置されてもよい。これにより、偽陽性をより確実に防止することができ、検査の精度を向上することができる。
＜微生物検査方法＞
　本実施形態の微生物検査方法は、図６に示す方法と同様であるが、制御装置１００により微生物検査装置４００の各構成の動作を自動的に制御することによって微生物検査を実施する点で、第１の実施形態と異なっている。以下、図６に示した各ステップに沿って、本実施形態の微生物検査方法について説明する。
　ステップＳ１において、制御装置１００は、アクチュエータ４６を駆動して、設置テーブル４２上に載置された検体容器（図示せず）をサンプリングシリンジ２２の下方に移動させる。次に、制御装置１００は、アクチュエータ４４を下方に駆動してノズル２４を検体１０２に浸たし、アクチュエータ４５ａを駆動してピストン２３を動かすことにより、サンプリングシリンジ２２に所定量の検体１０２を採取する。その後、アクチュエータ４４を上方に駆動して、検体容器からサンプリングシリンジ２２を退避させる。
　ステップＳ２において、制御装置１００は、アクチュエータ４６を駆動して、反応ボトル１をサンプリングシリンジ２２の下方に移動させる。次に、制御装置１００は、アクチュエータ４４を下方に駆動して、ノズル２４を反応ボトル１の封止キャップ２に貫通させる。このとき、反応ボトル１内部が減圧されておらず大気圧である場合は、制御装置１００は、アクチュエータ４５ａを駆動してピストン２３を押し、検体１０２を反応ボトル１に導入する。反応ボトル１が減圧されている場合、検体１０２は、サンプリングシリンジ２２と反応ボトル１との圧力差により吸引され、反応ボトル１に導入される。
　次に、ステップＳ３において、制御装置１００は、アクチュエータ４４を上方に駆動して、ノズル２４を封止キャップ２から抜く。その後、制御装置１００は、反応ボトルホルダ５０の温度を例えば２５～３７℃に調整して、一定時間培養を行う。
　一定時間培養後、制御装置１００は、ステップＳ４の代わりに、反応ボトルホルダ５０による温調を停止する。
　ステップＳ５において、制御装置１００は、キャップ着脱機構（図示せず）を駆動して反応ボトル１からノズルキャップ６を外す。
　ステップＳ６において、制御装置１００は、アクチュエータ４７を下方に駆動して、ノズル４を廃液ボトル８ａの封止キャップ９ａに貫通させる。ノズル４が減圧された廃液ボトル８ａの内部と密閉状態で連絡するとき、大気開放された反応ボトル１との間に圧力勾配が生み出される。これによって、検体１０２と試薬１０との混合液は、フィルタ５を通過してろ過され、廃液ボトル８ａへ移動する。このとき、フィルタ５は、検体１０２に含まれていた細菌、真菌（カビ、酵母）などの微生物を捕捉する。
　ステップＳ７において、制御装置１００は、アクチュエータ４７を上方に駆動して、ノズル４を廃液ボトル８ａの封止キャップ９ａから抜き、アクチュエータ４６をＹ方向に駆動して反応ボトル１を試薬充填シリンジ１５ａの下方に移動させる。次に、アクチュエータ４４を下方に駆動して、試薬充填シリンジ１５ａのノズル１８ａを封止キャップ２に貫通させる。次に、アクチュエータ４５ｂを駆動して、試薬充填シリンジ１５ａのピストン１７ａを押し、所定量のＡＴＰ消去試薬３０１を反応ボトル１に注入する。
　ステップＳ８において、制御装置１００は、キャップ着脱機構を駆動してノズルキャップ６を反応ボトル１に取付ける。
　ステップＳ９において、制御装置１００は、アクチュエータ４４を上方に駆動して、試薬充填シリンジ１５ａのノズル１８ａを封止キャップ２から抜く。次に、反応ボトルホルダ５０の温度を調整して、例えばＡＴＰ消去試薬３０１の注入後３０分間、室温～３７℃の範囲で消去反応させる。
　ステップＳ１０において、３０分間のＡＴＰ消去反応後、制御装置１００は、キャップ着脱機構を駆動して反応ボトル１のノズルキャップ６を外し、アクチュエータ４７を下方に駆動してノズル４を廃液ボトル８ｂの封止キャップ９ｂに貫通させる。これにより、ＡＴＰ消去試薬３０１を廃液ボトル８ｂに移動させる。
　ステップＳ１１において、制御装置１００は、アクチュエータ４７を上方に駆動して、ノズル４を廃液ボトル８ｂの封止キャップ９ｂから抜く。次に、アクチュエータ４６を駆動して、反応ボトル１を試薬充填シリンジ１５ｂの下方に移動させ、アクチュエータ４７を下方に駆動して、試薬充填シリンジ１５ｂのノズル１８ｂを封止キャップ２に貫通させ、アクチュエータ４５ｃを下方に駆動してピストン１７ｂを押す。これにより、所定量のＡＴＰ抽出試薬３０２を反応ボトル１に注入する。
　ステップＳ１２において、ＡＴＰ抽出試薬３０２を注入後、室温で約１分反応させることで、フィルタ５に捕捉された生菌が破砕、溶菌されて放出されたＡＴＰが、ＡＴＰ抽出試薬３０２中に分散し、ＡＴＰ抽出液１０５が得られる。
　ステップＳ１３において、制御装置１００は、アクチュエータ４７を下方に駆動して、ノズル４を発光計測容器１２の封止キャップ１３に貫通させる。このとき、遮光ケース５４は発光計測容器１２及び発光計測容器ホルダ５３を覆った状態であり、ノズル４はスリット５５を通過する。これにより、ＡＴＰ抽出液１０５は、発光計測容器１２に移動する。このとき、制御装置１００は、発光計測装置５７に発光計測を開始させる。ＡＴＰ抽出液１０５が発光計測容器１２に予め導入されている発光試薬２０と接触すると、生物発光が生じる。
　ステップＳ１４において、発光計測装置５７は、発光試薬２０の発光を検出し、検出信号を制御装置１００へ出力する。制御装置１００は、受信した検出信号に基づいて、発光量を算出し、検体１０２中のＡＴＰ量を算出する。また、制御装置１００は、算出された発光量又はＡＴＰ量と、記憶部に予め記憶されている所定の閾値とを比較し、陽性（検体中に菌が存在する）か陰性（検体中に菌が存在しない）かの判定を行う。表示部などに判断結果を出力してもよい。
　なお、本実施形態においては、設置テーブル４１をアクチュエータ４４により移動させ、設置テーブル４２をアクチュエータ４６及び４７により移動させることととしたが、反応ボトル１と、サンプリングシリンジ２２、試薬充填シリンジ１５ａ及び１５ｂ、廃液ボトル９ａ及び９ｂ、発光計測容器９との相対位置を変化することができれば、これに限定されない。例えば、反応ボトル１が設置される設置テーブル４２を固定して、設置テーブル４１及び４３が移動するようにしてもよい。また、設置テーブル４１及び４３を固定して、設置テーブル４２のみが上下方向及び水平方向に移動するようにしてもよい。
＜技術的効果＞
　以上のように、本実施形態の微生物検査装置４００は、第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査を自動化した構成を有する。これにより、信頼性の高い微生物検査をより容易に、より迅速に実施することができる。
［第５の実施形態］
＜微生物検査装置＞
　図９は、第５の実施形態に係る微生物検査装置５００の構成を示す模式図である。本実施形態の微生物検査装置５００は、複数の微生物検査キットがＸ方向に配列されている点で、第４の実施形態と異なっている。
　図９に示す微生物検査装置５００においては、微生物検査キットの各構成がＸ方向に３つずつ配列されている。なお、アクチュエータ４５ａ～４５ｃ、シリンジホルダ４８ａ～４８ｃ、反応ボトルホルダ５０、廃液ボトルホルダ５１ａ及び５１ｂ、発光計測容器ホルダ５３についても、Ｘ方向に３つずつ配列されているが、正面に位置するアクチュエータ４５ａ、シリンジホルダ４８ａ、反応ボトルホルダ５０及び廃液ボトルホルダ５１ａのみを図示している。
＜技術的効果＞
　以上のように、本実施形態の微生物検査装置５００は、第１の実施形態に係る微生物検査キットを用いた微生物検査を自動化した装置であり、複数の検体１０２について同時に微生物検査を実施することができる。これにより、信頼性の高い微生物検査をより容易に、より迅速に実施することができ、かつ、微生物検査のスループットを向上することができる。
［変形例］
　本開示は、上述した実施形態に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施形態の一部を他の実施形態の構成に置き換えることができる。また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることもできる。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。
　第４及び第５の実施形態においては、第１の実施形態に係る微生物検査方法を自動で行う微生物検査装置について説明したが、変形例として、例えば、第２の実施形態又は第３の実施形態に係る微生物検査方法を自動で実施するようにしてもよい。
１…反応ボトル、２…封止キャップ、３…開口部、４…ノズル、５…フィルタ、６…ノズルキャップ、７…フィッティング部、８、８ａ、８ｂ…廃液ボトル、９、９ａ、９ｂ…封止キャップ、１０…試薬、１１…開口部、１２…発光計測容器、１３…封止キャップ、１４…開口部、１５、１５ａ、１５ｂ…試薬充填シリンジ、１６…シリンジケース、１７、１７ａ、１７ｂ…ピストン、１８、１８ａ、１８ｂ…ノズル、１９…ノズルキャップ、２０…発光試薬、２２…サンプリングシリンジ、２３…ピストン、２４…ノズル、２５…ノズルキャップ、３０…ＡＴＰ検査試薬、３５…発光計測装置、３６…検出器、４０…インキュベータ、４１～４３…設置テーブル、４４、４５ａ～４５ｃ、４６、４７…アクチュエータ、４８ａ～４８ｃ…シリンジホルダ、５０…反応ボトルホルダ、５１ａ、５１ｂ…廃液ボトルホルダ、５３…発光計測容器ホルダ、５４…遮光ケース、５５…スリット、５７…発光計測装置、１００…制御装置、１０１…Ｒ２Ａ液体培地、１０２…検体、１０３…混合液、１０４…微生物、１０５…ＡＴＰ抽出液、３０１…ＡＴＰ消去試薬、３０２…ＡＴＰ抽出試薬、４００、５００…微生物検査装置

Claims (20)

  1. 　検体を採取可能であり、第１のシリンジ針を有する第１のシリンジと、
    　ＡＴＰ抽出試薬が収容され、第２のシリンジ針を有する第２のシリンジと、
    　第１の開口部と、前記第１の開口部に嵌合された第１の封止部材と、ノズルと、前記ノズルを覆うノズルキャップと、前記第１の開口部及び前記ノズルの間を仕切るように配置されたフィルタと、を有し、密閉された反応容器と、
    　第２の開口部と、前記第２の開口部に嵌合された第２の封止部材と、を有し、減圧密閉された廃液容器と、
    　第３の開口部と、前記第３の開口部に嵌合された第３の封止部材と、を有し、ＡＴＰの存在下で発光する発光試薬が収容され、減圧密閉された発光計測容器と、を備えることを特徴とする微生物検査キット。
  2. 　前記第１の封止部材は、前記反応容器が密閉された状態を保ったまま前記第１のシリンジ針及び前記第２のシリンジ針が貫通可能であり、
    　前記第２の封止部材は、前記廃液容器が密閉された状態を保ったまま前記ノズルが貫通可能であり、
    　前記第３の封止部材は、前記発光計測容器が密閉された状態を保ったまま前記ノズルが貫通可能であることを特徴とする請求項１記載の微生物検査キット。
  3. 　ＡＴＰ消去試薬が収容され、第３のシリンジ針を有する第３のシリンジをさらに備え、
    　前記第１の封止部材は、前記反応容器が密閉された状態を保ったまま前記第３のシリンジ針が貫通可能であることを特徴とする請求項１記載の微生物検査キット。
  4. 　前記反応容器の内部が減圧されていることを特徴とする請求項１記載の微生物検査キット。
  5. 　前記フィルタの孔径が０．２０μｍ以上であることを特徴とする請求項１記載の微生物検査キット。
  6. 　前記反応容器に培地成分を含む試薬が収容されていることを特徴とする請求項１記載の微生物検査キット。
  7. 　前記試薬がＡＴＰ消去試薬をさらに含むことを特徴とする請求項６記載の微生物検査キット。
  8. 　前記試薬が液体状であることを特徴とする請求項６記載の微生物検査キット。
  9. 　前記試薬が粉末状であり、
    　前記試薬の溶媒が収容され、第４のシリンジ針を有する第４のシリンジをさらに備えることを特徴とする請求項６記載の微生物検査キット。
  10. 　洗浄試薬が収容され、第５のシリンジ針を有する第５のシリンジをさらに備えることを特徴とする請求項１記載の微生物検査キット。
  11. 　請求項１記載の微生物検査キットを準備することと、
    　前記第１のシリンジにより前記検体を採取することと、
    　前記第１のシリンジ針を前記第１の封止部材に貫通させ、前記検体を前記反応容器に導入することと、
    　前記ノズルを前記第２の封止部材に貫通させ、前記反応容器と前記廃液容器との圧力差により、前記検体を前記フィルタによりろ過し、前記検体中の微生物を捕捉することと、
    　前記第２のシリンジ針を前記第１の封止部材に貫通させ、前記ＡＴＰ抽出試薬を前記反応容器に導入して、前記微生物からＡＴＰを抽出することと、
    　前記ノズルを前記第３の封止部材に貫通させ、前記反応容器と前記発光計測容器との圧力差により、前記ＡＴＰの抽出液を前記発光計測容器に導入し、前記発光試薬と接触させることと、を含むことを特徴とする微生物検査方法。
  12. 　前記微生物検査キットは、
    　ＡＴＰ消去試薬が収容され、第３のシリンジ針を有する第３のシリンジをさらに備え、
    　前記微生物検査方法は、
    　前記検体を前記フィルタによりろ過し、前記検体中の微生物を捕捉した後に、
    　前記第３のシリンジ針を前記第１の封止部材に貫通させ、前記ＡＴＰ消去試薬を前記反応容器に導入することと、
    　前記ノズルを前記第２の封止部材に貫通させ、前記反応容器と前記廃液容器との圧力差により、前記ＡＴＰ消去試薬を前記廃液容器に排出することと、をさらに含むことを特徴とする請求項１１記載の微生物検査方法。
  13. 　前記反応容器は、培地成分を含む試薬を収容し、
    　前記微生物検査方法は、
    　前記検体を前記反応容器に導入した後に、前記検体を培養することをさらに含むことを特徴とする請求項１１記載の微生物検査方法。
  14. 　前記試薬が粉末状であり、前記微生物検査キットは、前記試薬の溶媒が収容され、第４のシリンジ針を有する第４のシリンジをさらに備え、
    　前記微生物検査方法は、
    　前記検体を前記反応容器に導入する前に、前記第４のシリンジ針を前記第１の封止部材に貫通させ、前記溶媒を前記反応容器に導入することをさらに含むことを特徴とする請求項１３記載の微生物検査方法。
  15. 　前記微生物検査キットは、洗浄試薬が収容され、第５のシリンジ針を有する第５のシリンジをさらに備え、
    　前記微生物検査方法は、
    　前記検体を前記フィルタによりろ過し、前記検体中の微生物を捕捉した後に、前記第５のシリンジ針を前記第１の封止部材に貫通させ、前記洗浄試薬を前記反応容器に導入することと、
    　前記ノズルを前記第２の封止部材に貫通させ、前記反応容器と前記廃液容器との圧力差により、前記洗浄試薬を前記廃液容器に排出することと、をさらに含むことを特徴とする請求項１１記載の微生物検査方法。
  16. 　前記微生物検査キットは、洗浄試薬が収容され、第５のシリンジ針を有する第５のシリンジをさらに備え、
    　前記微生物検査方法は、
    　前記ＡＴＰ消去試薬を前記廃液容器に排出した後に、
    　前記第５のシリンジ針を前記第１の封止部材に貫通させ、前記洗浄試薬を前記反応容器に導入することと、
    　前記ノズルを前記第２の封止部材に貫通させ、前記反応容器と前記廃液容器との圧力差により、前記洗浄試薬を前記廃液容器に排出することと、をさらに含むことを特徴とする請求項１２記載の微生物検査方法。
  17. 　請求項１記載の微生物検査キットと、
    　前記反応容器と、前記第１のシリンジ、前記第２のシリンジ、前記廃液容器及び前記発光計測容器との相対位置を変化させる第１の駆動手段と、
    　前記第１のシリンジ及び前記第２のシリンジを駆動させる第２の駆動手段と、
    　前記発光計測容器からの発光を検出する発光計測装置と、
    　前記第１の駆動手段及び前記第２の駆動手段の駆動を制御する制御部と、を備えることを特徴とする微生物検査装置。
  18. 　前記制御部は、
    　前記第２の駆動手段を駆動して前記第１のシリンジにより前記検体を採取させ、
    　前記第１の駆動手段を駆動して前記第１のシリンジ針を前記第１の封止部材に貫通させ、前記第２の駆動手段を駆動して前記検体を前記反応容器に導入させ、
    　前記第１の駆動手段を駆動して前記ノズルを前記第２の封止部材に貫通させ、前記反応容器と前記廃液容器との圧力差により、前記検体を前記フィルタによりろ過し、前記検体中の微生物を捕捉させ、
    　前記第１の駆動手段を駆動して前記第２のシリンジ針を前記第１の封止部材に貫通させ、前記第２の駆動手段を駆動して前記ＡＴＰ抽出試薬を前記反応容器に導入し、前記微生物からＡＴＰを抽出させ、
    　前記第１の駆動手段を駆動して前記ノズルを前記第３の封止部材に貫通させ、前記反応容器と前記発光計測容器との圧力差により、前記ＡＴＰの抽出液を前記発光計測容器に導入し、前記発光試薬と接触させることを特徴とする請求項１７記載の微生物検査装置。
  19. 　前記微生物検査キットは、ＡＴＰ消去試薬が収容され、第３のシリンジ針を有する第３のシリンジをさらに備え、
    　前記第１の駆動手段は、さらに、前記反応容器と、前記第３のシリンジとの相対位置を変化させ、
    　前記第２の駆動手段は、さらに、前記第３のシリンジを駆動させ、
    　前記制御部は、
    　前記検体を前記フィルタによりろ過し、前記検体中の微生物を捕捉させた後に、
    　前記第１の駆動手段を駆動して前記第３のシリンジ針を前記第１の封止部材に貫通させ、前記第２の駆動手段を駆動して前記ＡＴＰ消去試薬を前記反応容器に導入させ、
    　前記第１の駆動手段を駆動して前記ノズルを前記第２の封止部材に貫通させ、前記反応容器と前記廃液容器との圧力差により、前記ＡＴＰ消去試薬を前記廃液容器に排出させることを特徴とする請求項１７記載の微生物検査装置。
  20. 　前記第１のシリンジ及び前記第２のシリンジが設置される第１の設置テーブルと、
    　前記第１の設置テーブルの下方に配置され、前記反応容器が設置される第２の設置テーブルと、
    　前記第２の設置テーブルの下方に配置され、前記廃液容器及び前記発光計測容器が載置される第３の設置テーブルと、をさらに備え、
    　前記第１の駆動手段は、前記第１の設置テーブル、前記第２の設置テーブル又は前記第３の設置テーブルのうちいずれか１以上を駆動することを特徴とする請求項１７記載の微生物検査装置。
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US17/437,232 US20220170068A1 (en) 2019-03-22 2019-10-18 Microbial test kit, microbial test method and microbial test device
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022201657A1 (ja) * 2021-03-24 2022-09-29 株式会社日立ハイテク 遠心ろ過カートリッジ及び微生物検査方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003038162A (ja) * 2001-05-22 2003-02-12 Koyo Sangyo Co Ltd 細菌検査用サンプル収集装置
JP2004528024A (ja) * 2001-02-16 2004-09-16 プロメガ　コーポレイション 改良されたａｔｐ検出法
JP2005229956A (ja) * 2004-02-23 2005-09-02 Kikkoman Corp 飲料中微生物の検出方法
JP2014008051A (ja) * 2012-07-03 2014-01-20 Hitachi Ltd ろ過分離方法及びこれに使用するろ過分離装置
JP2015155846A (ja) * 2014-02-20 2015-08-27 大日本印刷株式会社 微生物夾雑物検査用容器、微生物夾雑物検査キットおよび微生物夾雑物検査方法
JP2015181346A (ja) * 2014-03-20 2015-10-22 株式会社日立製作所 微生物計測システム、微生物計測方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19920244C2 (de) * 1999-05-03 2002-11-07 Macherey Nagel Gmbh & Co Hg Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Hemmwirkung einer Probe auf die mikrobielle Nitrifikation
US6653147B2 (en) * 2000-03-31 2003-11-25 Neogen Corporation Apparatus and method for chemiluminescent assays
EP1829958A1 (en) * 2004-11-30 2007-09-05 Dml Co., Ltd. Measuring kit for microbe in liquid sample, and relevant measuring method and measuring apparatus
JP4565017B2 (ja) * 2008-05-20 2010-10-20 株式会社日立エンジニアリング・アンド・サービス 微生物検査装置及び微生物検査用チップ
JP4985792B2 (ja) * 2010-01-27 2012-07-25 株式会社日立プラントテクノロジー 微生物検出装置用の試薬カートリッジ
KR101420094B1 (ko) * 2010-10-27 2014-07-17 (주)바이오니아 다양한 생체시료분석을 위한 전자동실시간정량증폭장비, 다양한 생체시료분석을 위한 자동정제 및 반응준비 장치, 전자동 핵산정제 및 실시간 정량 유전자증폭 방법, 전자동 핵산정제방법, 실시간정량ｐｃｒ을 이용한 병원균의 전자동 생균수검사방법, 정량면역ｐｃｒ을 이용한 전자동 항원농도획득방법 및 타겟항원에 라벨링된 부착용 타겟핵산의 정제방법
US20130309700A1 (en) * 2012-05-21 2013-11-21 Celsis International Limited Methods, devices, and systems of detecting microorganisms
JP5711279B2 (ja) * 2013-01-08 2015-04-30 株式会社日立製作所 微生物検出装置、検出方法、及びそれに用いられる試料容器
US11214823B2 (en) * 2015-12-22 2022-01-04 Canon U.S.A., Inc. Sample-to-answer system for microorganism detection featuring target enrichment, amplification and detection

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004528024A (ja) * 2001-02-16 2004-09-16 プロメガ　コーポレイション 改良されたａｔｐ検出法
JP2003038162A (ja) * 2001-05-22 2003-02-12 Koyo Sangyo Co Ltd 細菌検査用サンプル収集装置
JP2005229956A (ja) * 2004-02-23 2005-09-02 Kikkoman Corp 飲料中微生物の検出方法
JP2014008051A (ja) * 2012-07-03 2014-01-20 Hitachi Ltd ろ過分離方法及びこれに使用するろ過分離装置
JP2015155846A (ja) * 2014-02-20 2015-08-27 大日本印刷株式会社 微生物夾雑物検査用容器、微生物夾雑物検査キットおよび微生物夾雑物検査方法
JP2015181346A (ja) * 2014-03-20 2015-10-22 株式会社日立製作所 微生物計測システム、微生物計測方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3943592A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022201657A1 (ja) * 2021-03-24 2022-09-29 株式会社日立ハイテク 遠心ろ過カートリッジ及び微生物検査方法
JP7446255B2 (ja) 2021-03-24 2024-03-08 株式会社日立ハイテク 遠心ろ過カートリッジ及び微生物検査方法

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