CN117721004A - 微生物检查试剂盒、微生物检查方法及微生物检查装置 - Google Patents

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石丸真子
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Abstract

提供一种能够容易地实施高精度的微生物检查的技术。本公开的微生物检查试剂盒的特征在于，具备：第一注射器，其能够采集样本且具有第一注射器针；第二注射器，其容纳ATP提取试剂且具有第二注射器针；密闭的反应容器，其具有第一开口部、嵌合于所述第一开口部的第一密封构件、喷嘴、覆盖所述喷嘴的喷嘴盖和以将所述第一开口部与所述喷嘴之间分隔的方式配置的过滤器；减压密闭的废液容器，其具有第二开口部和嵌合于所述第二开口部的第二密封构件；和减压密闭的发光测量容器，其具有第三开口部和嵌合于所述第三开口部的第三密封构件且容纳有在ATP的存在下发光的发光试剂。

Description

微生物检查试剂盒、微生物检查方法及微生物检查装置
本发明专利申请是申请日为2019年10月18日、进入中国国家阶段日期为2021年09月09日、国家申请号为201980093853.5(国际申请号PCT/JP2019/041136)、发明名称为“微生物检查试剂盒、微生物检查方法及微生物检查装置”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本公开涉及微生物检查试剂盒、微生物检查方法以及微生物检查装置。
背景技术
在医药品工厂、饮料工厂中，在实现了在无菌环境的制造设施内进行产品的制造。以往，在用于保证制造设施、产品的无菌性的微生物检查中，采用培养法。培养法是将添加了培养基的样本在恒温机中培养数日～14天，通过目视对生长的菌的菌落数进行计数的方法。因此，为了得到检查结果而花费时间，需要等待检查结果直到产品出货为止。基于这样的背景，期望开发迅速地进行无菌判定的微生物检查方法。
作为迅速且简便的微生物检查方法之一，有三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate，ATP)生物发光法(以下称为ATP法)。ATP法是利用萤火虫的发光反应将存在于菌体内的ATP转换为光而进行测定的方法。更具体地，将荧光素和ATP分子并入荧光素酶中，并且测量在ATP的消耗的同时氧化的荧光素(氧化荧光素)从激发态转变为基态时的发光量。此时，由于ATP 1分子的消耗对应于1个光子(photon)的生成，因此光子产生数与ATP的个数成比例。1个活菌中存在相当于1原子摩尔(amol＝10-18mol)的ATP分子来作为能量源，因此能够根据样本中的ATP的发光量来推定活菌的总数。
由于荧光素-荧光素酶反应在生物发光和化学发光中具有最优异的量子效率(ΦBL：≈0.5)，因此可以将1个细胞检测为相当于数十万个的光子。因此，ATP法是原理上能够检测相当于1个细胞的光的方法。
但是，为了高灵敏度、高精度地检测混入到样本中的极微量(数个的水平)的菌，不仅必须使发光测量装置的性能为高灵敏度，还必须防止存在于环境中的ATP、菌、人所保有的微生物、吸附ATP的灰尘等的污染。另外，一般而言，由于在样本中混杂有来自死菌的ATP、游离ATP，因此在将样本直接用于发光测量的情况下，无法估计准确的活菌数。
在专利文献1中，记载了为了除去样本中的游离ATP，使用样本液的过滤、三磷酸酰胺双磷酸酶等ATP分解酶预先分解微生物、死菌。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2016/147313号
发明内容
发明所要解决的课题
然而，包括专利文献1中记载的方法在内，ATP法通常反应操作繁杂，检查环境、作业者的技能容易影响检查结果。因此，容易受到来自检查环境、作业者的污染而降低检查精度，成为假阳性。即使在安全柜内实施无菌操作，也难以完全防止污染，特别是在无菌试验那样的阴性/阳性判定检查中，难以明确地证明是假阳性还是真阳性。
因此，本公开提供一种能够容易地实施高精度微生物检查的技术。
用于解决课题的手段
本公开的微生物检查试剂盒的特征在于，具备：
第一注射器，其能够采集样本且具有第一注射器针；
第二注射器，其容纳ATP提取试剂且具有第二注射器针；
密闭的反应容器，其具有第一开口部、嵌合于所述第一开口部的第一密封构件、喷嘴、覆盖所述喷嘴的喷嘴盖和以将所述第一开口部与所述喷嘴之间分隔的方式配置的过滤器；
减压密闭的废液容器，其具有第二开口部和嵌合于所述第二开口部的第二密封构件；和
减压密闭的发光测量容器，其具有第三开口部和嵌合于所述第三开口部的第三密封构件，且容纳在ATP的存在下发光的发光试剂。
根据本说明书的记述、附图，与本公开相关的进一步的特征将变得清楚。另外，本公开的方式通过要素以及多种要素的组合以及以后的详细的记述和所附的权利要求书的方式来实现。
本说明书的记述只不过是典型的例示，在任何意义上都不限定本公开的权利要求书或应用例。
发明效果
根据本公开的微生物检查试剂盒，能够容易地实施高精度的微生物检查。
上述以外的课题、构成以及效果通过以下的实施方式的说明而变得明确。
附图说明
图1是表示第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的反应瓶的示意图。
图2是表示第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的废液瓶的示意图。
图3是表示第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的发光测量容器的示意图。
图4A是表示第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的取样注射器的示意图。
图4B是表示第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的试剂填充注射器的示意图。
图5A是表示使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查方法的图。
图5B是表示使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查方法的图。
图5C是表示使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查方法的图。
图5D是表示使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查方法的图。
图5E是表示使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查方法的图。
图5F是表示使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查方法的图。
图5G是表示使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查方法的图。
图5H是表示使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查方法的图。
图5I是表示使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查方法的图。
图6是表示使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查方法的一例的流程图。
图7是表示光子计数时间进程的图。
图8是表示第四实施方式涉及的微生物检查装置的构成的示意图。
图9是表示第五实施方式涉及的微生物检查装置的构成的示意图。
具体实施方式
以下，参照附图对本公开的实施方式进行说明。但是，应该注意的是，各实施方式只不过是用于实现本公开的一个例子，并不限定本公开。另外，对各图中共同的构成标注相同的参照编号。
[第一实施方式]
<微生物检查试剂盒>
如后所述，第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒具备反应瓶1(反应容器)、废液瓶8(废液容器)、发光测量容器12、取样注射器22(第一注射器)、试剂填充注射器15(第二至第五注射器)。
图1是表示第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的反应瓶1的示意图。如图1所示，反应瓶1(反应容器)具有密封盖2(第一密封构件)、喷嘴4、过滤器5、喷嘴盖6、适配部7。
反应瓶1在一端具有开口部3(第一开口部)，在开口部3嵌合有密封盖2。作为密封盖2，例如可以使用隔膜，作为其材质，例如可以举出天然橡胶、丁基橡胶、PTFE(Polytetrafluoroethylene：聚四氟乙烯)/天然橡胶、PTFE/丁基橡胶、有机硅(シリコン)/有机硅橡胶、PTFE/有机硅、PTFE/有机硅/PTFE、聚乙烯、氟橡胶(バイトン)等。通过为这样的材质，后述的各种注射器的喷嘴(注射器针)能够贯通密封盖2。
反应瓶1的与开口部3相反的一侧的端部朝向前端而前端变细，在前端连接有喷嘴4。在反应瓶1与喷嘴4的边界设置有适配部7。喷嘴盖6通过与适配部7嵌合，以密闭反应瓶1的方式覆盖喷嘴4。喷嘴盖6能够装卸，以安装有喷嘴盖6的状态提供给用户。
反应瓶1和喷嘴盖6的材质例如可以为聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯等树脂材料，可以通过注射成型来制造反应瓶1。喷嘴4的材质可以是不锈钢材料(SUS304)等金属制，但也可以是树脂制。喷嘴4的外径例如可以为0.3～0.9mmΦ，内径例如可以为0.07～0.6mm。喷嘴4的长度例如可以为13～38mm。喷嘴4的前端也可以被倾斜地切割。
过滤器5以将开口部3与喷嘴4之间分隔为2个空间的方式配置于反应瓶1的内部。过滤器5的位置是能够向开口部3与过滤器5之间导入足够量的样本的位置。
作为过滤器5，只要是能够捕捉检查对象的微生物的过滤器即可，例如能够使用膜过滤器。作为过滤器5的材质，例如可举出纤维素混合酯、PTFE、聚偏氟乙烯(PVDF，Polyvinylidene Fluoride)、聚碳酸酯等。
过滤器5的孔径能够根据检查对象的微生物的尺寸、微生物检查的各条件适当选择，例如能够设为0.20μm以上。具体而言，作为过滤器5，可举出孔径为0.22μm、0.45μm等的膜过滤器。
在开口部3与过滤器5之间预先导入试剂10。在图1中，示出了试剂10为液态的情况，但也可以是粉末。作为试剂10，可以单独容纳培养基成分或ATP分解酶等ATP消除试剂，也可以容纳它们的混合物。另外，试剂10中也可以含有培养基成分、ATP消除试剂以外的成分。
作为培养基，根据作为检查对象的微生物、微生物检查的各条件，例如可以使用大豆-酪蛋白-消化物培养基、巯基乙酸培养基、R2A培养基、标准培养基、沙氏-葡萄糖培养基、玉米肠内细菌增菌肉汤培养基、McConkey培养基、RV沙门增菌培养基、亚烯酸盐胱氨酸培养基、四硫酸盐培养基、拉帕波特培养基、乳糖肉汤培养基、Mueller Hinton培养基等。
在实施微生物检查时，样本被导入开口部3与过滤器5之间的空间。如图1所示，也可以在反应瓶1上印刷或刻印有表示所导入的样本的容量的刻度，由此能够容易地掌握样本的液量。在试剂10为液体的情况下，在其液面上对准零的刻度。在试剂10为粉末的情况下，以添加了规定量的溶剂时的液面为零的方式对准刻度。
作为反应瓶1的容量，微生物检查试剂盒中可以包含例如1mL规格、10mL规格、50mL规格、100mL规格等多种容量的反应瓶。由此，用户能够根据微生物检查所使用的样本来选择反应瓶1的容量。图1所示的反应瓶1为50mL规格。
反应瓶1的内部也可以被减压。在该情况下，通过在减压环境下嵌合密封盖2和喷嘴盖6，反应瓶1的内部在减压的状态下被密闭。通过拆下喷嘴盖6，反应瓶1的内部成为大气压。
图2是表示本实施方式的微生物检查试剂盒的废液瓶8(废液容器)的示意图。如图2所示，废液瓶8在开口部11(第二开口部)嵌合有密封盖9(第二密封构件)，内部被减压、密闭。在制造废液瓶8时，在减压环境下将密封盖9嵌合于开口部11。作为密封盖9，例如能够使用隔膜，其材质如上所述。
能够使反应瓶1的喷嘴4贯通密封盖9，由此，能够利用反应瓶1内部的压力与废液瓶8内部的压力的压力梯度(压力差)，利用过滤器5对反应瓶1内部的液体进行过滤，并回收至废液瓶8。因此，废液瓶8内部的压力只要减压至能够排出反应瓶1内的液体的程度即可。需要说明的是，在排出反应瓶1内部的液体时，通过拆下喷嘴盖6而使反应瓶1向大气开放，因此废液瓶8内部的初始压力设定得比大气压低。在此，例如将废液瓶8内部的初始压力假定为0个大气压，若保持一定的压力将反应瓶1中的液体排出到废液瓶8，则反应瓶1内的液体的利用过滤器5的过滤在1个大气压(大气压)的一定压力下实施。
图3是表示本实施方式涉及的微生物检查试剂盒的发光测量容器12的示意图。如图3所示，发光测量容器12在开口部14(第三开口部)嵌合有密封盖13(第三密封构件)，内部被减压而密闭。在制造发光测量容器12时，在减压环境下将密封盖13嵌合于开口部14。关于发光测量容器12内部的压力，能够与上述的废液瓶8内部的压力同样地设定。作为密封盖13，例如能够使用隔膜，其材质如上所述。
发光测量容器12中预先导入有发光试剂20。发光试剂20是通过与ATP混合而发光的试剂，例如可以使用含有荧光素酶和荧光素的试剂。需要说明的是，也可以将荧光素酶导入发光试剂20，将荧光素与后述的试剂填充注射器15的ATP提取试剂混合。
图4A是表示本实施方式涉及的微生物检查试剂盒的取样注射器22(第一注射器)的示意图。如图4A所示，取样注射器22是能够采集样本的注射器，具有活塞23、喷嘴24(第一注射器针)以及喷嘴盖25。在图4A所示的例子中，取样注射器22能够采集到最大100mL的样本。
喷嘴24以被喷嘴盖25覆盖的状态被提供给用户。喷嘴盖25能够装卸，以安装有喷嘴盖25的状态提供给用户。
图4B是表示本实施方式涉及的微生物检查试剂盒的试剂填充注射器15(第二至第五注射器)的示意图。如图4B所示，试剂填充注射器15具有活塞17、喷嘴18(第二～第五注射器针)以及喷嘴盖19。
在试剂填充注射器15中填充有1次检查所需的液量的ATP检查试剂30。作为ATP检查试剂30的例子，例如可举出ATP提取试剂、ATP消除试剂、溶剂、清洗试剂等。试剂填充注射器15按照ATP检查试剂30的每个种类，以预先导入试剂填充注射器15的状态提供给用户。需要说明的是，本实施方式的微生物检查试剂盒具有至少容纳有ATP提取试剂的试剂填充注射器15(第二注射器)。
作为ATP提取试剂，例如可以使用包含苯扎氯铵、苄索氯铵等表面活性剂、三氯乙酸(TCA)、Tris缓冲液、乙醇、具有蛋白酶活性的溶菌酵素或溶菌酶等的水溶液。
在反应瓶1中的试剂10中不包含ATP消除试剂的情况下，容纳有ATP消除试剂的试剂填充注射器15(第三注射器)也可以包含在微生物检查试剂盒中。
另外，在试剂10为粉末状的情况下，容纳有试剂10的溶剂的试剂填充注射器15(第四注射器)也可以包含在微生物检查试剂盒中。作为试剂10的溶剂，例如可以使用培养基中通常使用的缓冲液等。
此外，关于容纳有清洗试剂的试剂填充注射器15(第五注射器)，也可以包含在微生物检查试剂盒中，也可以不包含在微生物检查试剂盒中。清洗试剂用于清洗反应瓶1，除去样本中的游离ATP、来自死菌的ATP(来自活菌的ATP以外的ATP)。作为清洗试剂，例如可以使用pH被调整为7～9左右的缓冲液(例如蛋白胨溶液、磷酸缓冲生理盐水等)、含有不分解微生物的表面活性剂(例如月桂基硫酸钠等)的缓冲液、含有蛋白酶等酶的缓冲液等。
喷嘴18以被喷嘴盖19覆盖的状态被提供给用户。喷嘴盖19能够装卸，以安装有喷嘴盖19的状态提供给用户。
试剂填充注射器15也可以以容纳于注射器壳体16的状态提供给用户，由此能够防止活塞17在使用前被意外按压而ATP检查试剂30泄漏。
反应瓶1、喷嘴盖6、废液瓶8、发光测量容器12、试剂填充注射器15、取样注射器22、活塞17和23以及喷嘴盖19和25的材质例如可以为聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯等树脂材料，它们可以通过注射成型来制造。喷嘴18以及24的材质、尺寸能够与反应瓶1的喷嘴4相同，因此省略说明。
反应瓶1、废液瓶8、发光测量容器12、试剂填充注射器15以及取样注射器22也可以全部以灭菌的状态提供给用户。由此，能够防止假阳性，提高样本中的菌的检测精度。作为灭菌方法，例如可举出高压蒸汽灭菌、煮沸灭菌、流通蒸汽灭菌、环氧乙烷气体灭菌(EOG灭菌)、放射线灭菌(γ射线灭菌)、紫外线灭菌等。为了防止材质的劣化，可以采用EOG灭菌或γ射线灭菌。
反应瓶1、发光测量容器12、试剂填充注射器15也可以在填充试剂10、发光试剂20、ATP检查试剂30后，再次进行灭菌处理。通常，发光试剂20、ATP消除试剂包含酶，因此作为发光测量容器12以及试剂填充注射器15的灭菌法，能够采用EOG灭菌。进而，容纳于反应瓶1的试剂10、容纳于试剂填充注射器15的ATP检查试剂30也使用进行了过滤灭菌的试剂，从而能够进一步确保无菌性。
需要说明的是，在本实施方式的微生物检查试剂盒中，反应瓶1、废液瓶8、发光测量容器12、试剂填充注射器15及取样注射器22可以分别各包含1个，也可以分别包含多个。在分别包含多个的情况下，可以包含不同容积的部件，也可以包含相同容积的部件。
<微生物检查方法>
图5A～5I是表示使用了本实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查方法的图，图6是表示本实施方式涉及的微生物检查方法的流程图。另外，在本实施方式中，对用户手动进行微生物检查的方法进行说明。
制药用水的微生物管理基准基于各国的药典，以水中所含的微生物量的允许量作为处置基准值来进行管理。在日本药典中，当正常水超过100CFU/mL、纯化水超过10CFU/mL、注射用水超过10CFU/100mL时，需要进行制药用水生产线的维护。关于美国药典中的处置基准值，饮用水为500CFU/mL，纯化水为100CFU/mL，注射用水为10CFU/100mL，欧洲药典中的处置基准值规定纯化水为100CFU/mL，高度纯化水为10CFU/100mL，注射用水为10CFU/100mL。
因此，下文中，为了进行以日本药典的检查为基准的制药用水的微生物检查，将正常水、纯化水和注射用水这3种作为样本102，对各样本102使用1个微生物检查试剂盒。1个微生物检查试剂盒中，如后所述，包含预先填充有10mL的R2A液体培养基101的反应瓶1、取样注射器22(第一注射器)、200mL容量的废液瓶8a、10mL容量的废液瓶8b、容纳ATP消除试剂301的试剂填充注射器15a(第三注射器)及容纳ATP提取试剂302的试剂填充注射器15b(第二注射器)。另外，在正常水用及纯化水用的微生物检查试剂盒中，将反应瓶1的容量设为1mL，在注射用水用的微生物检查试剂盒中，将反应瓶1的容量设为100mL。
首先，用户使用取样注射器22采集一定量的样本102(步骤S1)。在此，在正常水的情况和纯化水的情况下，分别采集1mL，在注射用水的情况下，采集100mL。
接着，如图5A所示，用户使取样注射器22的喷嘴24(第一注射器针)贯通反应瓶1的密封盖2，将样本102导入反应瓶1(步骤S2)。此时，在反应瓶1内部未被减压而为大气压的情况下，用户按压活塞23而将样本102导入反应瓶1。在反应瓶1被减压的情况下，利用取样注射器22内部的压力与反应瓶1内部的压力的压力差吸引样本102，并导入反应瓶1。
需要说明的是，密封盖2是由上述材质形成的隔膜，由此，即使使喷嘴24贯通，之后拔出喷嘴24，由于贯通孔被弹性力堵塞，因此也能够保持反应瓶1被密闭的状态。
接着，如图5B所示，用户将取样注射器22的喷嘴24从密封盖2拔出，将容纳样本102与R2A液体培养基101的混合液103的反应瓶1导入培养箱40(恒温槽)，进行一定时间的培养(步骤S3)。培养箱40的温度例如可以设为25～37℃。
在培养器40中培养一定时间后，用户将反应瓶1从培养器40中取出(步骤S4)。
接着，如图5C所示，用户从反应瓶1卸下喷嘴盖6(步骤S5)，由此使反应瓶1内向大气开放，使喷嘴4贯通废液瓶8a的密封盖9a。在喷嘴4与减压后的废液瓶8a的内部在密闭状态下连接时，在与向大气开放的反应瓶1之间产生压力梯度。由此，混合液103通过过滤器5而被过滤，向废液瓶8a移动(步骤S6)。此时，过滤器5捕捉样本102中含有的细菌、真菌(霉菌、酵母)等微生物104(活菌)。需要说明的是，混合液103中所含的游离ATP及来自死菌的ATP基本上向废液瓶8a流动，但有极少量被过滤器5捕捉。
如图5D所示，用户将喷嘴4从密封盖9a拔出，使填充有ATP消除试剂301的试剂填充注射器15a的喷嘴18a(第三注射器针)贯通反应瓶1的密封盖2，按压活塞17a而注入反应瓶1(步骤S7)。另外，用户将喷嘴盖6安装于反应瓶1(步骤S8)。
接着，如图5E所示，用户将试剂填充注射器15a的喷嘴18a从密封盖2拔出，将反应瓶1导入培养箱40，注入ATP消除试剂301后，在室温～37℃的范围内进行消除反应约30分钟(步骤S9)。需要说明的是，此时，可以在静置的状态下进行反应，也可以一边振荡一边进行反应。另外，不限于培养箱40，也可以在加热块等调温后的空间设置反应瓶1而使其反应，也可以是室温放置。
30分钟的ATP消除反应后，如图5F所示，用户将反应瓶1从培养箱40取出，取下反应瓶1的喷嘴盖6，使喷嘴4贯通废液瓶8b的密封盖9b，使ATP消除试剂301移动到废液瓶8b(步骤S10)。此时，由于废液瓶8b的内部被减压，因此利用与反应瓶1的内部的压力差，ATP消除试剂301被吸引。
这样，为了将样本102的过滤以及ATP消除试剂301废弃，通过使用不同的2个废液瓶8a以及8b，能够防止附着于密封盖9a以及9b的菌、在环境中浮游的ATP对喷嘴4的污染。需要说明的是，在反复使用1个废液瓶8的情况下，通过使喷嘴4贯通密封盖9的位置不同，能够防止污染。
如图5D～5F所示，通过将ATP消除试剂301导入反应瓶1，将过滤器5所捕捉的游离ATP和来自死菌的ATP分解、除去，能够进一步提高微生物检查的精度。
接着，如图5G所示，用户将喷嘴4从废液瓶8b的密封盖9b拔出，使填充有ATP提取试剂302的试剂填充注射器15b的喷嘴18b(第二注射器针)贯通反应瓶1的密封盖2，按压活塞17b，将ATP提取试剂302注入反应瓶1(步骤S11)。
注入ATP提取试剂302后，在室温下反应约1分钟，由此将被过滤器5捕捉的活菌破碎、溶菌而放出的ATP分散于ATP提取试剂302中，得到ATP提取液105(步骤S12)。
接着，如图5H所示，用户将试剂填充注射器15b的喷嘴18b从密封盖2拔出，使反应瓶1的喷嘴4贯通发光测量容器12的密封盖13，将ATP提取液105移动到发光测量容器12(步骤S13)。此时，由于发光测量容器12的内部被减压，所以ATP提取液105被吸引并通过过滤器5而被导入发光测量容器12。ATP提取液105与预先导入至发光测量容器12的发光试剂20接触时，产生生物发光。
如图5I所示，用户将导入有ATP提取液105的发光测量容器12设置于发光测量装置35。发光测量装置35的检测器36测量通过发光试剂20与来源于活菌的ATP的发光反应而产生的光的量(步骤S14)。作为发光测量装置35，只要是能够检测发光试剂20的发光量的装置即可，例如能够使用光度计等。作为检测器36，例如使用光电倍增管，能够通过对光电倍增管的信号进行数字处理的光子计数法来实施发光测量。发光测量装置35也可以具备显示发光测量的结果的显示部(未图示)。
图7是表示由发光测量装置35的检测器36得到的光子计数时间进程的一例的图表。ATP量可以通过对光子计数时间进程的一定时间的发光量进行积分或者将发光量的平均值作为相对光单位(RLU，Relative Light Unit)进行标准化来计算。用户在ATP量超过某阈值时，能够判断为存在微生物。
需要说明的是，使用本实施方式的微生物检查试剂盒的微生物检查也可以在净化台、安全柜内实施。由此，能够更切实地防止假阳性，能够提高检查的精度。
<技术效果>
如上所述，本实施方式的微生物检查试剂盒具备在内部具有过滤器5的密闭的反应瓶1、能够采集样本的取样注射器22、减压密闭的废液瓶8、减压密闭且容纳发光试剂20的发光测量容器12以及容纳ATP检查试剂30的试剂填充注射器15。通过具有这样的构成，能够在基于ATP法的微生物检查中容易地实施无菌操作。因此，能够容易地实施高精度的微生物检查。
[第二实施方式]
在第一实施方式中，说明了在向反应瓶1导入样本后进行培养、然后提取来自活菌的ATP、进行发光测量的微生物检查方法，但在第二实施方式中，在向反应瓶1导入样本后，不进行培养而提取来自活菌的ATP，在这一点上与第一实施方式不同。
<微生物检查试剂盒>
第二实施方式涉及的微生物检查试剂盒与第一实施方式相同，因此省略说明。
<微生物检查方法>
在第二实施方式的微生物检查方法中，与第一实施方式不同，不实施图6所示的步骤S3和S4(图5B)。这样，通过省略样本的培养，能够迅速地进行来自样本中的微量活菌的ATP的检测。
需要说明的是，在本实施方式中，由于不实施样本的培养，因此在反应瓶1中也可以不容纳试剂10。由此，能够削减试剂10的成本。
另外，在本实施方式中，由于不实施样本的培养，因此需要检测极微量的来自活菌的ATP。因此，本实施方式的微生物检查方法中，为了将样本中的游离ATP、来自死菌的ATP(来自活菌的ATP以外的ATP)从反应瓶1除去，也可以具有使用填充有清洗试剂来作为ATP检查试剂30的试剂填充注射器15(第五注射器)来清洗反应瓶1的工序。
利用清洗试剂进行的反应瓶1的清洗例如可以在图6所示的步骤S6与S7之间(ATP消除反应前)或者步骤S10与S11之间(ATP消除反应后)，利用与ATP消除试剂的情况同样的方法来实施。这样，通过清洗来自活菌的ATP以外的ATP，能够进一步提高微生物检查的可靠性。
<技术效果>
如上所述，在本实施方式中，在使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查方法中，由于省略了样本中的微生物的培养，因此能够更迅速地实施高可靠性的微生物检查。
[第三实施方式]
<微生物检查试剂盒>
在第一实施方式中，对容纳于反应瓶1的试剂10为液态的情况进行了说明。第三实施方式涉及的微生物检查试剂盒在如下方面与第一实施方式不同：容纳于反应瓶1的试剂10为粉末状的培养基，还具备容纳试剂10的溶剂的试剂填充注射器15(第四注射器)来作为ATP检查试剂30。作为试剂10的溶剂，例如可以使用培养基中通常使用的缓冲液等。
<微生物检查方法>
第三实施方式涉及的微生物检查方法在还具备将粉末状的试剂10溶解于溶剂的工序这一点上与第一实施方式涉及的微生物检查方法不同。具体而言，在本实施方式中，在图6所示的步骤S1之前，用户从容纳溶剂的试剂填充注射器(未图示)向反应瓶1导入溶剂，在室温下放置或搅拌5～30分钟左右使其溶解直至均匀化，得到液体培养基。之后，实施图6所示的各步骤。
另外，在本实施方式中也与第二实施方式同样地，可以省略样本的培养(步骤S3以及S4)。
<技术效果>
如上所述，在本实施方式中，容纳于反应瓶1的试剂10是粉末状的培养基。由此，与液体培养基的情况相比，能够进行更长期的保存。
[第四实施方式]
在第一～第三实施方式中，对用户使用微生物检查试剂盒手动地进行微生物检查的方法进行了说明，但在本实施方式中，利用具备微生物检查试剂盒的各构成的驱动单元的微生物检查装置，自动地进行微生物检查。
<微生物检查装置>
图8是表示第四实施方式涉及的微生物检查装置400的构成的示意图。本实施方式的微生物检查装置400是具备第一实施方式的微生物检查试剂盒的自动化装置。
如图8所示，微生物检查装置400具备配置于上段的设置台41(第一设置台)、配置于中段的设置台42(第二设置台)、配置于下段的设置台43(第三设置台)。
设置台41能够通过致动器44(第一驱动单元)在Z方向上任意地移动。在设置台41上沿Y方向配置有注射器支架48a～48c。注射器支架48a保持取样注射器22(第一注射器)，注射器支架48b保持试剂填充注射器15a(第三注射器)，注射器支架48c保持试剂填充注射器15b(第二注射器)。
进而，在设置台41上，沿着Y方向设置有驱动取样注射器22的活塞23的致动器45a(第二驱动单元)、驱动试剂填充注射器15a的活塞17a的致动器45b(第二驱动单元)以及驱动试剂填充注射器15b的活塞17b的致动器45c(第二驱动单元)。
设置台42能够通过致动器46和47(第一驱动单元)在Y方向和Z方向上任意地移动。在设置台42设置有保持反应瓶1的反应瓶支架50。反应瓶支架50也可以具有对反应瓶1的内部进行温度调整的加热器(未图示)。另外，虽然省略了图示，但容纳有样本102的容器在设置台42上载置在能够通过取样注射器22采集样本102的位置。
在设置台43上设置有保持废液瓶8a的废液瓶支架51a、保持废液瓶8b的废液瓶支架51b、保持发光测量容器12的发光测量容器支架53、遮光壳体54、发光测量装置57。发光测量装置57以能够检测来自发光测量容器12的发光的方式设置于发光测量容器支架53的底部。遮光壳体54以在进行发光测量时将发光测量容器12设置于发光测量容器支架53之后覆盖它们的方式设置。在遮光壳体54的顶部设置有反应瓶1的喷嘴4能够通过的狭缝55。
微生物检查装置400也可以具有用于装卸反应瓶1的喷嘴盖6、试剂填充注射器15a及15b的喷嘴盖、取样注射器22的喷嘴盖25的盖装卸机构(未图示)。
微生物检查装置400通过无线或有线的方式与控制装置100(控制部)连接。控制装置100例如是个人计算机、平板电脑、智能手机等计算机终端，被编程为控制微生物检查装置400的各构成的驱动，自动地实施图6的各步骤。
虽然省略了图示，但控制装置100具备运算部、存储部、显示部等。运算部根据从发光测量装置57接收到的检测信号求出发光量，基于发光量计算样本102中的ATP量。另外，运算部将计算出的发光量或ATP量与规定的阈值进行比较，进行是阳性(样本中存在菌)还是阴性(样本中不存在菌)的判定。存储部存储发光量或ATP量的规定的阈值等各种数据。显示部显示所算出的发光量及ATP量、是阳性还是阴性的判定结果等。
微生物检查装置400也可以设置在净化台、安全柜内。由此，能够更可靠地防止假阳性，能够提高检查的精度。
<微生物检查方法>
本实施方式的微生物检查方法与图6所示的方法相同，但在通过利用控制装置100自动控制微生物检查装置400的各构成的动作来实施微生物检查这一点上与第一实施方式不同。以下，按照图6所示的各步骤，对本实施方式的微生物检查方法进行说明。
在步骤S1中，控制装置100驱动致动器46，使载置于设置台42上的样本容器(未图示)移动到取样注射器22的下方。接着，控制装置100向下方驱动致动器44而将喷嘴24浸入到样本102中，驱动致动器45a而使活塞23动作，由此向取样注射器22采集规定量的样本102。之后，向上方驱动致动器44，使取样注射器22从样本容器退避。
在步骤S2中，控制装置100驱动致动器46，使反应瓶1向取样注射器22的下方移动。接着，控制装置100向下方驱动致动器44，使喷嘴24贯通反应瓶1的密封盖2。此时，在反应瓶1内部未被减压而为大气压的情况下，控制装置100驱动致动器45a而按压活塞23，将样本102导入反应瓶1。在反应瓶1被减压的情况下，样本102由于取样注射器22与反应瓶1的压力差而被吸引，并被导入反应瓶1。
接着，在步骤S3中，控制装置100向上方驱动致动器44，将喷嘴24从密封盖2拔出。之后，控制装置100将反应瓶支架50的温度调整为例如25～37℃，进行一定时间的培养。
在培养一定时间后，控制装置100停止由反应瓶支架50进行的调温，来代替步骤S4。
在步骤S5中，控制装置100驱动盖装卸机构(未图示)而将喷嘴盖6从反应瓶1卸下。
在步骤S6中，控制装置100向下方驱动致动器47，使喷嘴4贯通废液瓶8a的密封盖9a。在喷嘴4与减压后的废液瓶8a的内部在密闭状态下连接时，在与向大气开放的反应瓶1之间产生压力梯度。由此，样本102与试剂10的混合液通过过滤器5而被过滤，向废液瓶8a移动。此时，过滤器5捕捉样本102中含有的细菌、真菌(霉菌、酵母)等微生物。
在步骤S7中，控制装置100向上方驱动致动器47而将喷嘴4从废液瓶8a的密封盖9a拔出，向Y方向驱动致动器46而使反应瓶1向试剂填充注射器15a的下方移动。接着，向下方驱动致动器44而使试剂填充注射器15a的喷嘴18a贯通密封盖2。接着，驱动致动器45b而按压试剂填充注射器15a的活塞17a，将规定量的ATP消除试剂301注入反应瓶1。
在步骤S8中，控制装置100驱动盖装卸机构而将喷嘴盖6安装于反应瓶1。
在步骤S9中，控制装置100向上方驱动致动器44而将试剂填充注射器15a的喷嘴18a从密封盖2拔出。接着，调整反应瓶支架50的温度，例如在注入ATP消除试剂301后在室温～37℃的范围内进行消除反应30分钟。
在步骤S10中，在30分钟的ATP消除反应后，控制装置100驱动盖装卸机构而卸下反应瓶1的喷嘴盖6，向下方驱动致动器47而使喷嘴4贯通废液瓶8b的密封盖9b。由此，使ATP消除试剂301移动至废液瓶8b。
在步骤S11中，控制装置100向上方驱动致动器47而将喷嘴4从废液瓶8b的密封盖9b拔出。接着，驱动致动器46而使反应瓶1向试剂填充注射器15b的下方移动，将致动器47向下方驱动而使试剂填充注射器15b的喷嘴18b贯通密封盖2，将致动器45c向下方驱动而按压活塞17b。由此，将规定量的ATP提取试剂302注入反应瓶1。
在步骤S12中，注入ATP提取试剂302后，在室温下反应约1分钟，由此将被过滤器5捕捉的活菌破碎、溶菌而放出的ATP分散在ATP提取试剂302中，得到ATP提取液105。
在步骤S13中，控制装置100向下方驱动致动器47而使喷嘴4贯通发光测量容器12的密封盖13。此时，遮光壳体54为覆盖发光测量容器12及发光测量容器支架53的状态，喷嘴4通过狭缝55。由此，ATP提取液105移动至发光测量容器12。此时，控制装置100使发光测量装置57开始发光测量。ATP提取液105与预先导入至发光测量容器12的发光试剂20接触时，产生生物发光。
在步骤S14中，发光测量装置57检测发光试剂20的发光，并将检测信号输出到控制装置100。控制装置100基于接收到的检测信号，计算发光量，计算样本102中的ATP量。另外，控制装置100将计算出的发光量或ATP量与预先存储于存储部的规定的阈值进行比较，进行是阳性(在样本中存在菌)还是阴性(在样本中不存在菌)的判定。也可以向显示部等输出判断结果。
需要说明的是，在本实施方式中，通过致动器44使设置台41移动，通过致动器46及47使设置台42移动，但只要能够使反应瓶1与取样注射器22、试剂填充注射器15a及15b、废液瓶9a及9b、发光测量容器9的相对位置变化，则并不限定于此。例如，也可以将设置有反应瓶1的设置台42固定，使设置台41和43移动。另外，也可以将设置台41和43固定，仅设置台42在上下方向和水平方向上移动。
<技术效果>
如上所述，本实施方式的微生物检查装置400具有将使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查自动化的构成。由此，能够更容易且更迅速地实施可靠性高的微生物检查。
[第五实施方式]
<微生物检查装置>
图9是表示第五实施方式涉及的微生物检查装置500的构成的示意图。本实施方式的微生物检查装置500在多个微生物检查试剂盒沿X方向排列这一点上与第四实施方式不同。
在图9所示的微生物检查装置500中，微生物检查试剂盒的各构成在X方向上各排列有3个。另外，关于致动器45a～45c、注射器支架48a～48c、反应瓶支架50、废液瓶支架51a及51b、发光测量容器支架53，也在X方向上各排列有3个，但仅图示了位于正面的致动器45a、注射器支架48a、反应瓶支架50及废液瓶支架51a。
<技术效果>
如上所述，本实施方式的微生物检查装置500是使得使用了第一实施方式涉及的微生物检查试剂盒的微生物检查自动化的装置，能够对多个样本102同时实施微生物检查。由此，能够更容易且更迅速地实施可靠性高的微生物检查，并且能够提高微生物检查的吞吐量。
[变形例]
本公开并不限定于上述的实施方式，还包括各种变形例。例如，上述的实施方式是为了易于理解地说明本公开而详细地进行了说明的实施方式，但不一定需要具备所说明的全部构成。另外，能够将某实施方式的一部分置换为其他实施方式的构成。另外，也可以在某实施方式的构成中添加其他实施方式的构成。另外，对于各实施方式的构成的一部分，也能够追加、删除或替换其他实施方式的构成的一部分。
在第四和第五实施方式中，对自动进行第一实施方式涉及的微生物检查方法的微生物检查装置进行了说明，但作为变形例，例如也可以自动实施第二实施方式或第三实施方式涉及的微生物检查方法。
符号说明
1…反应瓶，2…密封盖，3…开口部，4…喷嘴，5…过滤器，6…喷嘴盖，7…适配部，8、8a、8b…废液瓶，9、9a、9b…密封盖，10…试剂，11…开口部，12…发光测量容器，13…密封盖，14…开口部，15、15a、15b…试剂填充注射器，16…注射器壳体，17、17a、17b…活塞，18、18a、18b…喷嘴，19…喷嘴盖，20…发光试剂，22…取样注射器，23…活塞，24…喷嘴，25…喷嘴盖，30…ATP检查试剂，35…发光测量装置，36…检测器，40…培养箱，41～43…设置台，44、45a～45c、46、47…致动器，48a～48c…注射器支架，50…反应瓶支架，51a、51b…废液瓶支架，53…发光测量容器支架，54…遮光壳体，55…狭缝，57…发光测量装置，100…控制装置，101…R2A液体培养基，102…样本，103…混合液，104…微生物，105…ATP提取液，301…ATP消除试剂，302…ATP提取试剂，400、500…微生物检查装置。

Claims (7)

1.一种发光测量试剂盒，其特征在于，具备：
试样容器，其具有喷嘴，并容纳试样；以及
发光测量容器，其具有开口部和与所述开口部嵌合的密封构件，容纳与所述试样所含有的物质反应而发光的发光试剂，并被减压密闭，
所述密封构件能够在保持所述发光测量容器密闭的状态下使所述喷嘴贯通。
2.根据权利要求1所述的发光测量试剂盒，其特征在于，
所述密封构件是隔膜。
3.根据权利要求1所述的发光测量试剂盒，其特征在于，
所述发光试剂含有荧光素酶或荧光素。
4.一种发光测量装置，其特征在于，具备：
试样容器，其具有喷嘴，并容纳试样；
发光测量容器，其具有开口部和与所述开口部嵌合的密封构件，容纳与所述试样所含有的物质反应而发光的发光试剂，并被减压密闭；
驱动单元，其使所述喷嘴与所述发光测量容器的相对位置变化，并使所述喷嘴贯通所述密封构件；
控制部，其控制上述驱动单元的驱动；以及
检测器，其检测来自所述发光测量容器的发光。
5.根据权利要求4所述的发光测量装置，其特征在于，
所述发光测量容器被遮光。
6.根据权利要求4所述的发光测量装置，其特征在于，
所述控制部接收检测出来自所述发光测量容器的发光的检测信号，基于所述检测信号计算出发光量或ATP量，与阈值进行比较来进行判定，并向输出部输出。
7.一种发光测量方法，其特征在于，包括：
使设置于容纳试样的试样容器的喷嘴贯通密封构件，所述密封构件与被减压密闭了的发光测量容器的开口部嵌合，所述发光测量容器容纳与所述试样所含有的物质反应而发光的发光试剂；以及
利用所述试样容器与所述发光测量容器的压力差，将所述试样导入所述发光测量容器，并使所述试样与所述发光试剂接触。
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