CN117740752A - 一种基于微孔过滤的微生物检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生化检测分析技术领域，特别涉及一种基于微孔过滤的微生物的检测方法，包括：将待检液通过孔板过滤富集处理；在所述孔板内加入具有标记物质的培养液进行微生物培养，经预设时长后对所述孔板内的物质进行拉曼检测，得到拉曼检测结果；基于所述拉曼检测结果确定所述待检液中的微生物含量。本申请提供的方法解决了现有技术中由于部分采样导致的漏检问题，耗时短，并且提高了该方法的检测效率和灵敏度。
Description
技术领域
本申请涉及生化检测分析技术领域，特别涉及一种基于微孔过滤的微生物的检测方法。
背景技术
医疗或生物研发领域中，通常需对器械进行消毒灭菌，以确保医疗安全和实验准确性，因此我们需要对消毒灭菌后的医疗器械进行残留微生物检测，如在内镜检查后，需对内镜进行微生物残留检测，现有的微生物检测方案中，一般包括采样、接种、培养等步骤，其中采样步骤仅能够采样部分缓冲液检测，可能导致漏检，并且整个步骤耗时长，灵敏度较低，检测效率较低；此外，在现有技术中检测苛养菌时，需要将苛养菌置于CO2或微需氧的环境，同时在培养基中添加特殊因子或者其他营养成分，才能够保证苛养菌的存活和繁殖，因此采用现有技术中的检测方法难以及时检出苛养菌，并且耗费时间长。因此急需一种新的检测方法来解决以上问题。
发明内容
针对现有技术的上述问题，本申请提供一种基于微孔过滤的微生物检测方法，能够有效避免漏检，耗时较短，同时可提高检测效率和灵敏度，且及时检出苛养菌。具体技术方案如下：
一方面，本申请提供一种基于微孔过滤的微生物检测方法，包括：
将待检液通过孔板过滤富集处理；
在所述孔板内加入具有标记物质的培养液进行微生物培养，经预设时长后对所述孔板内的物质进行拉曼检测，得到拉曼检测结果；
基于所述拉曼检测结果确定所述待检液中的微生物含量。
具体地，所述基于所述拉曼检测结果确定所述待检液中的微生物含量包括：
基于所述拉曼检测结果中的C-D峰确定所述微生物含量，所述C-D峰的波长位置为2040-2300cm-1。
具体地，所述将待检液通过孔板过滤富集处理包括：
将待检液加入特定滤膜孔径的孔板中，反复抽滤清洗，使得微生物截留在孔板的滤膜上。
具体地，所述孔板的特定滤膜孔径为0.1-0.5μm。
具体地，对所述孔板内的物质进行拉曼检测之前，所述方法还包括：
对所述孔板内培养了预设时长的物质进行清洗，以去除培养液。
具体地，在所述孔板内加入具有标记物质的培养液进行微生物培养的温度为25-40℃。
具体地，所述预设时长为24-48h。
具体地，所述标记物质占所述培养液的体积百分浓度的10-50％。
具体地，所述标记物质为重水。
另一方面，本申请提供了一种基于微孔过滤的微生物检测方法用于检测内镜消毒后冲洗液中残留细菌微生物。
基于上述技术方案，本申请具有以下有益效果：
本申请提供的方法利用孔板对待检液进行富集处理，解决了现有技术中由于部分采样导致的漏检问题，同时将微生物在具有标记物质的培养液中培养，使得标记物质能够进入微生物中，再对具有标记的微生物进行拉曼检测来得到具有特征峰的拉曼图谱，该方法能够在短时间内得到待检液中微生物的含量，且提高了检测效率以及该方法的灵敏度，还使得苛养菌能够及时检出。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1为本申请实施例提供的检测方法流程图。
图2为本实施例1得到的拉曼光谱图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
对于以下定义的术语，除非在权利要求书或本说明书中的其他地方给出一个不同的定义，否则应当应用这些定义。所有数值无论是否被明确指示，在此均被定义为由术语“约”修饰。术语“约”大体上是指一个数值范围，本领域的普通技术人员将该数值范围视为等同于所陈述的值以产生实质上相同的性质、功能、结果等。由一个低值和一个高值指示的一个数值范围被定义为包括该数值范围内包括的所有数值以及该数值范围内包括的所有子范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
一方面，本申请提供一种基于微孔过滤的微生物检测方法，请参考图1，包括S1-S3：
S1：将待检液通过孔板过滤富集处理；
具体地，所述待检液是通过对消毒后医疗器械进行冲洗得到的冲洗液。
一些实施例中，所述待检液是通过对消毒后内镜进行冲洗得到的冲洗液。
一些实施例中，所述待检液的制备过程是将冲洗液从消毒后内镜活检入口注入，活检口出口收集相应冲洗液，即得待检液。
一些实施例中，所述孔板的材质可以为PET膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚丙烯/聚乙烯膜、聚四氟乙烯膜，所述孔板的孔洞的形状可以为圆孔、方孔、矩形孔、椭圆形孔、六角形孔等，本申请在此不做具体限定，所述孔板的孔数可以为6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔等，可以基于实际需求设定，不以上述示例为限。
具体地，所述将待检液通过孔板过滤富集处理包括：
将待检液加入特定滤膜孔径的孔板中，反复抽滤清洗，使得微生物截留在孔板的滤膜上。本申请将待检液通过孔板过滤富集处理，使得检测方法的检测时间减短，避免漏检问题的产生。
具体地，所述将待检液加入特定滤膜孔径的孔板中，其中，所述在孔板中的各个孔内加入一定体积的待检液。
一些实施例中，所述在孔板中的各个孔内加入一定体积的待检液，优选的，所述孔板中各个孔内的待检液的体积为300μL。
一些实施例中，所述孔板的特定滤膜孔径为0.1-0.5μm；具体地，预设孔径的上限值可以为0.5μm，0.48μm，0.46μm等，预设孔径的下限值可以为0.10μm，0.12μm，0.22μm，0.32μm等，可以理解地，预设孔径可以为上述范围内的任意点值，不以上述示例为限。优选的，所述孔板的特定滤膜孔径为0.22μm，本申请使用特定滤膜孔径的孔板富集待检液中的微生物，避免了孔径过大导致微生物难以富集的问题，同时避免了现有技术中由于部分采样导致的漏检问题。
S2：在所述孔板内加入具有标记物质的培养液进行微生物培养，经预设时长后对所述孔板内的物质进行拉曼检测，得到拉曼检测结果；
具体地，所述将标记物质引入微生物的方式可以为体内标记。
在一些实施例中，所述体内标记可以为荧光标记或同位素标记。
在一些实施例中，所述荧光标记可以为但不限于15N/14N标记等，所述同位素标记可以为但不限于重水标记等。
具体地，所述标记物质可以为荧光物质或重水。
在一些实施例中，所述荧光物质可以为量子点、异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明等。
具体地，所述标记物质为重水，所述培养液为重水和培养基的混合物，优选的，所述培养基为LB培养基。本申请利用重水和水的同位素特性，将重水导入活体微生物中，无需微生物的大量繁殖即可检测微生物含量，极大的减少了检测时间。
一些实施例中，所述在孔板内加入具有标记物质的培养液进行微生物培养，还包括：将所述在孔板内加入具有标记物质的培养液后，在所述孔板上加上盖板，再进行微生物培养。在所述孔板上加上盖板是为了防止培养液的水分蒸发。
一些实施例中，所述在孔板内加入具有标记物质的培养液进行微生物培养，所述培养液在孔板的各个孔内加入的体积为300μL。
一些实施例中，在所述孔板内加入具有标记物质的培养液进行微生物培养的温度为25-40℃。具体地，培养的温度的上限值可以为40℃，39℃，38℃等，培养的温度的下限值可以为25℃，26℃，27℃，28℃等，可以理解地，预设孔径可以为上述范围内的任意点值，不以上述示例为限。优选的，所述培养的温度为37℃。本申请限定培养的温度为25-40℃，避免了温度过高会导致微生物的蛋白质、核酸遭到破坏，从而导致微生物死亡，使得后续的标记物质无法进行死亡的微生物中，造成漏检，进一步提高了本申请检测方法的灵敏度。
在一些实施例中，所述经预设时长后对所述孔板内的物质进行拉曼检测，得到拉曼检测结果的具体步骤为：所述经预设时长后对所述各个孔板内的物质进行拉曼检测，得到拉曼检测结果。
一些实施例中，所述预设时长为24-48h。具体地，预设时长的上限值可以为48h，47h，46h等，预设时长的下限值可以为24h，25h，26h等，可以理解地，预设时长可以为上述范围内的任一点值，在此不做枚举。优选的，所述预设时长为24h。本申请限定预设时长为24-48h，由于预设时长过短，在微生物培养过程中，标记物质并未完全进入微生物中，或者进入量较少，导致在后续的拉曼检测中，C-D峰的信号过弱，无法完全检测到微生物的含量，降低了方法灵敏度，而预设时长过长，在微生物培养过程中，标记物质虽然完全进入微生物中，但整个检测过程耗费时间较长，检测效率降低。
一些实施例中，所述标记物质占所述培养液的体积百分浓度的10-50％。具体地，所述标记物质占所述培养液的体积百分浓度的上限值可以为50％，49％，48％，47％等，所述标记物质占所述培养液的体积百分浓度的下限值可以为10％，11％，12％，13％，14％，15％等，可以理解地，所述标记物质占所述培养液的体积百分浓度可以为上述范围内的任一点值，在此不做枚举。优选的，所述标记物质占所述培养液的体积百分浓度的40％。本申请中所述标记物质占所述培养液的体积百分浓度较少，会导致标记物质进入微生物的量较小，后续检测结果中所得到的拉曼光谱中的C-D峰较弱或无C-D峰，产生漏检问题，降低了本申请检测方法的灵敏度，所述标记物质占所述培养液的体积百分浓度较多，会导致培养液中培养基的量相应减少，微生物难以生存导致死亡，也会产生漏检问题，降低本申请检测方法的灵敏度。
具体地，对所述孔板内的物质进行拉曼检测之前，所述方法还包括：
对所述孔板内培养了预设时长的物质进行清洗，以去除培养液。本申请对所述孔板内培养了预设时长的物质进行清洗，来达到去除培养液的目的，如果不进行该步骤，培养液中残留的标记物质会在后续的拉曼检测过程中，得到具有C-D峰的拉曼光谱，进而影响本申请方法的灵敏度。
在一些实施例中，对所述孔板内培养了预设时长的物质进行清洗的方法为：对所述孔板内培养了预设时长的物质中加入不含标记物质的培养液，反复清洗抽滤，以去除培养液。
在一些实施例中，对所述孔板内培养了预设时长的物质进行清洗，以去除培养液，其中，清洗的次数不少于3次。
S3:基于所述拉曼检测结果确定所述待检液中的微生物含量。
具体地，所述基于所述拉曼检测结果确定所述待检液中的微生物含量包括：
基于所述拉曼检测结果中的C-D峰确定所述微生物含量，所述C-D峰的波长位置为2040-2300cm-1。本申请采用拉曼光谱来检测微生物含量，不仅能够降低了检测所花费的时间，还提高了检测效率。
另一方面，本申请提供了一种基于微孔过滤的微生物检测方法用于检测内镜消毒后冲洗液中残留微生物。
以下结合上述的基于微孔过滤的微生物检测方法和应用介绍本申请的具体实施例和对比例。
实施例1-6中的基于微孔过滤的微生物检测方法包括下述步骤：
S1.1：待检液的制备：使用无菌注射器抽取10mL含相应含中和剂的磷酸盐缓冲液，从消毒后的支气管镜的活检入口注入，使用15mL的无菌试管在活检口出口收集即得到待检液。
S1：将待检液加入特定滤膜孔径为0.22μm的96孔板中，所述在孔板中的各个孔内加入一定体积的待检液，所述孔板中各个孔内的待检液的体积为300μL，反复抽滤清洗，使得微生物截留在孔板的滤膜上。
S2：将所述在孔板内加入具有标记物质的培养液后，在所述孔板上加上盖板，进行微生物培养，所述培养液在孔板的各个孔内加入的体积为300μL，再对所述孔板内培养了预设时长的物质中加入不含标记物质的培养液，反复清洗抽滤，清洗的次数不少于3次，以去除培养液；经预设时长后对所述孔板内的物质进行拉曼检测，得到拉曼检测结果；
S3：之后使用拉曼光谱检测仪来检测孔板内各孔信号，基于所述拉曼检测结果中的C-D峰确定所述微生物含量，所述C-D峰的波长位置为2040-2300cm-1。
图2为本实施例1的测试结果，其中1为拉曼光谱图中的C-D峰，a，b，c，d，e为使用拉曼光谱仪来检测实施例1各个孔板内物质检测后所得到的拉曼谱图，其中a表示检测的孔板内物质含有微生物，b，c，d，e表示检测的孔板内物质不含微生物。
对比例的制备方法如下：
1)采样法：将待检液及时送检，在2小时内检测。
2)将待检液充分震荡，取0.5mL待检液分别加入2只直径为90mm无菌平皿，每个平皿分别加入已经熔化的45℃～48℃营养琼脂15mL～18mL，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，于35℃培养48小时后计数。
3)消毒后的内镜合格标准为细菌总数<20cfu/mL，则检测合格，即对比例检测方法的检出限为20cfu/mL。
实施例1-6的相关参数如下：
表1
由上述实施例和对比例可知，对比例为现有技术中检测消毒后内镜冲洗液残留微生物的方法，其检出限高达20cfu/mL，不能够检测更低的微生物含量，而在本实施例1中的检测方法，其所测量的微生物含量能低至10cfu/mL，即本申请的检出限低至10cfu/mL，由此可见，本申请的检测方法的灵敏度是现有技术的2倍，并且本申请的检测方法还解决了现有技术中由于部分采样导致的漏检问题，更提高了检测效率，所以本申请所提供的检测方法应用于内镜消毒后冲洗液残留微生物的检测具有极大的优势。
上述说明已经充分揭露了本申请的具体实施方式。需要指出的是，熟悉该领域的技术人员对本申请的具体实施方式所做的任何改动均不脱离本申请的权利要求书的范围。相应地，本申请的权利要求的范围也并不仅仅局限于前述具体实施方式。
Claims (10)
1.一种基于微孔过滤的微生物检测方法，其特征在于，包括：
将待检液通过孔板过滤富集处理；
在所述孔板内加入具有标记物质的培养液进行微生物培养，经预设时长后对所述孔板内的物质进行拉曼检测，得到拉曼检测结果；
基于所述拉曼检测结果确定所述待检液中的微生物含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基于所述拉曼检测结果确定所述待检液中的微生物含量包括：
基于所述拉曼检测结果中的C-D峰确定所述微生物含量，所述C-D峰的波长位置为2040-2300cm-1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将待检液通过孔板过滤富集处理包括：
将待检液加入特定滤膜孔径的孔板中，反复抽滤清洗，使得微生物截留在孔板的滤膜上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述孔板的特定滤膜孔径为0.1-0.5μm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述孔板内的物质进行拉曼检测之前，所述方法还包括：
对所述孔板内培养了预设时长的物质进行清洗，以去除培养液。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，在所述孔板内加入具有标记物质的培养液进行微生物培养的温度为25-40℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述预设时长为24-48h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记物质占所述培养液的体积百分浓度的10-50％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记物质为重水。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述的方法用于检测内镜消毒后冲洗液中残留微生物。
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| CN117740752A true CN117740752A (zh) | 2024-03-22 |
Family
ID=90249871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311600631.2A Pending CN117740752A (zh) | 2023-11-28 | 2023-11-28 | 一种基于微孔过滤的微生物检测方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117740752A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118392845A (zh) * | 2024-06-25 | 2024-07-26 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种用于对空气浮游微生物进行监测鉴别的复合功能多孔金属膜及检测系统、以及空气浮游微生物监测鉴别方法 |
-
2023
- 2023-11-28 CN CN202311600631.2A patent/CN117740752A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118392845A (zh) * | 2024-06-25 | 2024-07-26 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种用于对空气浮游微生物进行监测鉴别的复合功能多孔金属膜及检测系统、以及空气浮游微生物监测鉴别方法 |
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