JP4833022B2 - Atp量測定方法 - Google Patents
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Description
以下、本発明に係る細胞のATP量測定方法を図面に則して更に詳しく説明する。
本発明によれば、ATP量測定方法は、
(a)サンプル中の細胞をメンブランフィルタに捕獲する工程と、
(b)上記工程(a)で細胞が捕獲されたメンブランフィルタを測定容器内に入れる工程と、
(c)上記工程(b)でメンブランフィルタが入れられた測定容器内に抽出試薬を注入してメンブランフィルタに捕獲された細胞のATPを抽出する工程と、
(d)上記工程(c)で抽出試薬が注入された後で測定容器内に発光試薬を注入して生物化学発光反応を起こす工程と、
(e)上記工程(d)によって測定容器内での生物化学発光反応により発生した該測定容器内からの光を、測定容器内にメンブランフィルタが入っている状態で発光検出器で検出する工程と、
を有する。
次に、本発明にて用いることのできるATP量測定器の一実施例について説明する。図1は、本実施例のATP測定器1の全体構成を示し、図2〜図4にその詳細を示す。
次に、本発明にて用いることのできる濾過器の一実施例について更に詳しく説明する。
上述のように、本実施例では、ATP量測定方法は、
(A)サンプル中の細胞をメンブランフィルタに捕獲する工程と、
(B)前記メンブランフィルタを、上方が開口した皿状の容器内に載置する工程と、
(C)前記容器内に抽出試薬を注入し、前記メンブランフィルタに捕獲された細胞のアデノシン3リン酸を抽出する工程と、
(D)前記容器内に発光試薬を注入し、生物化学発光反応を起こす工程と、
(E)前記工程(D)により発生した光を、前記容器の開口部に対面して配置した光電子増倍管で検出する工程と、
を有する。
次に、本発明の効果を示す実験例について説明する。
サンプル:
純水に大腸菌を添加し、1個/ml、5個/ml、10個/ml、50個/ml、100個/mlの大腸菌懸濁液サンプルとした。尚、大腸菌数の測定は、一般的なコロニー計測法により行った。
本実施例に従うATP量測定器1としてATPアナライザ(AF−100:東亜ディーケーケー株式会社)を使用した。
(1)本実施例に従う濾過器301に、セルロースアセテートで作製された直径25mm、孔径0.45μmのメンブランフィルタ(AF−2F2:東亜ディーケーケー株式会社)をセットし、各サンプル50mlを吸引濾過した。
(2)濾過後のメンブランフィルタを外し、専用測定容器200にメンブランフィルタを移した。
(3)上記専用測定容器200を上記ATPアナライザにセットし、微生物用ATP抽出試薬(AF−2K1:東亜ディーケーケー株式会社)を200μl注入し、30秒間攪拌(振盪)して、大腸菌からATPを抽出した。上記抽出試薬は、陽イオン界面活性剤を含有する。
(4)発光試薬(AF−2L1:東亜ディーケーケー株式会社)を100μl注入し、上記ATPアナライザの遮光扉(閉鎖部材)14を閉めて、ATP濃度を測定した。上記発光試薬は、ルシフェリン及びルシフェラーゼを含有する。尚、本実験例では、抽出試薬の注入、発光試薬の注入は、ディスペンサを用いた手作業にて行った。
(5)濾過及び測定を2000[lx]の太陽光が照射された状態で行った場合と、本発明に従って遮光装置(遮光ボックス)に濾過器及びATPアナライザを入れて濾過及び測定を10[lx]以下に遮光した状態で行った場合とで、測定値の差を調べた。
表1及び図9に、本発明に従って遮光した場合としない場合とのATP濃度の測定結果を示した。
301 濾過器
400 遮光ボックス
Claims (6)
- (a)サンプル中の細胞をメンブランフィルタに捕獲する工程と、(b)細胞が捕獲された前記メンブランフィルタを測定容器内に入れる工程と、(c)前記メンブランフィルタが入れられた測定容器内に抽出試薬を注入して前記メンブランフィルタに捕獲された細胞のATPを抽出する工程と、(d)前記抽出試薬が注入された後で前記測定容器内に発光試薬を注入して生物化学発光反応を起こす工程と、(e)前記測定容器内での生物化学発光反応により発生した光を発光検出器で検出する工程と、を有するATP量測定方法において、
前記工程(a)〜(e)を、前記工程(e)において検出される生物化学発光反応に基づくサンプル由来の光に対するメンブランフィルタの発する燐光の影響を測定精度上許容し得る範囲に抑制するような遮光状態で行い、
前記工程(a)において使用する前記メンブランフィルタは、前記工程(a)において使用するまで、前記工程(e)において検出される生物化学発光反応に基づくサンプル由来の光に対するメンブランフィルタの発する燐光の影響を測定精度上許容し得る範囲に抑制するのに十分な時間、前記遮光状態に維持されていることを特徴とするATP量測定方法。 - 前記工程(a)において使用する前記メンブランフィルタは、前記工程(a)において使用するまで、前記メンブランフィルタを前記遮光状態に維持する梱包状態にあることを特徴とする請求項1に記載のATP量測定方法。
- 前記工程(a)〜(e)を、前記遮光状態を達成可能な遮光性のクリーンベンチ又はグローブボックス内で行うことを特徴とする請求項1又は2に記載のATP量測定方法。
- 前記遮光は、波長が200nm以上1000nm以下の光に対して行うことを特徴とする請求項1〜3のいずれかの項に記載のATP量測定方法。
- 前記遮光状態における照度は10[lx]以下であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかの項に記載のATP量測定方法。
- 前記工程(e)を、実質的に完全な暗黒な状態で行うことを特徴とする請求項1〜5のいずれかの項に記載のATP量測定方法。
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