JP2018510333A - 積分球集光器を用いるシステム、デバイス及び方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、光を集めるとともに試料を収容する積分球集光器（１２）と、この積分球集光器（１２）内に光を導入する光源（２４）であって、好ましくは信号発生器（２６）を用いることにより、既知の光変調を有する光を出力するように作用しうる当該光源と、前記積分球集光器（１２）内の散乱光を検出し、この散乱光を表す信号を発生する検出器（２２）と、前記既知の光変調及び前記検出器（２２）により発生された前記信号を用いて分析用の出力を生じるように動作しうるロックイン増幅器（２８）とを具える試料測定システムを提供する。

Description

本発明は、光を用いて、試料、例えば、生物（生体）試料の少なくとも１つの特性、例えば、細菌（バクテリア）を測定するデバイスに関するものである。
吸収作用又は散乱作用を用いて細菌の光学特性を決定するには、伝統的な分光光度計を用いることができる。試料の相対吸光度を測定するには、吸光分光光度計を用いることができる。吸光度は、試料に入射される光の光度と試料から出射される光の光度とを比較することにより測定される。光度が低下することは、ある光量が吸収されたことを表す。このことは、任意の数値、代表的には光学濃度として表すことができる。これにより試料中に存在する細胞の数の正確な計数値を導出することができる。
散乱分光光度計は通常、レーザ又は極めて明るい白熱光源のような強力光源及びモノクロメータを有している。光は試料に入射され、種々の角度で散乱する。試料室を囲んで個別の間隔で配置した検出器が散乱光を収集する。側方散乱領域における収集光は粒度に関する情報を得るのに用いることができ、前方散乱領域における収集光は粒子の寸法に関する情報を得るのに用いることができる。散乱光の全体的強度によれば、濁度の測定値や、存在する粒子の数の指示値が得られる。細菌を測定する散乱分光光度計では、光源の代表的な波長は６００nmである。この波長は、ＤＮＡ、タンパク質、シトクロムのような種々の有機物質により最も多く散乱されるとともに最も少なく吸収されるものである。
フローサイトメータによっても目的とする試料の特性を決定することができる。屈折率適合液体のシースフローが細いチューブを通って流れると、この液体によりチューブの内径を低減させてこの液体中の細胞が個別にチューブを通って流れるようにする。このことにより細胞の計数を容易にする。研究中の細胞の寸法及び粒度に関する情報が得られるように側方及び前方散乱データを記録しうる。このようにして数秒で且つ極めて少ない液体で数千の細胞をビーム中に通して測定するようにしうる。サイトメータはある分野では有効であるが、これらのサイトメータは、オペレータの大々的な訓練を必要とする高性能の機器である。安全な操作には試薬を規則的に入力する必要もあり、このことにより継続するランニングコストに影響を及ぼす。得られたデータの解釈も難しくなる。
液体又は気体中の懸濁粒子の濃度を測定する他の方法は比濁法である。比濁計は積分球を用いるように構成しうる。このような構成では、光を試料に入射させ、この光が積分球に入射される前に試料中の粒子により散乱されるようにしうる。次いで、この散乱された光は積分球の出口ポートで検出される前にこの積分球の内部で反射されるとともに拡散される。拡散されない光は積分球をまっすぐ通過して収集されない。
本発明の１つの態様によれば、光を収集するための積分球集光器を具え、使用に際しこの積分球集光器の内部容積内に試料を収容するようになっているデバイスを提供する。積分球集光器内に試料を保持するために試料ホルダを設けることができる。代表的には試料を流体で構成する。積分球集光器の内面上には検出器を設ける。この検出器の上方にはバッフルを配置してこの検出器が直接照射されないようするとともに、散乱光及び反射光のみが確実にこの検出器に入射されるようにすることができる。
試料を積分球内に配置する試料ホルダを設けることにより、測定を高感度にすることができる。その理由は、積分球の中空の球状空洞が光拡散及び収集室として作用する為である。この空洞内の光はその内面から複数回反射して、光がこの空洞の内部全体に亘って均一に分布させるようにする。試料は中空の球状空洞内に位置する為、光のビームはこの試料を複数回通過しうる。
試料ホルダは積分球の内部容積を含むようにすることができる。この場合、内部容積が試料で満たされ、２つの目的を、すなわち試料を収容する目的と、光を拡散及び収集する目的とを満足させる。試料は積分球の内部をほぼ満たすようにすることができる。
積分球集光器は、光をこの積分球集光器に入射させるための入口ポートと、入射ビームの非散乱光をこの積分球集光器から出射させる出口ポートとを有するようにする。
試料ホルダは、積分球集光器内のほぼ中央に試料を保持するように適合させることができる。試料は、積分球の直径に沿って延在する試料ホルダ内に位置させることができる。
試料ホルダは、キュベット、例えば、標準の１０mm長のキュベットを保持し、このキュベット内に試料を装填しうるように適合させることができる。より具体的には、この試料ホルダを、４５mm×１０mm×１０mm（方形の占有スペース）の寸法のキュベットを保持するように適合させることができる。
試料ホルダは、試料が積分球集光器を通って流れるようにするための貫流式ホルダとすることができる。
本発明の他の態様によれば、光を集めるとともに試料を収容する積分球集光器と、この積分球集光器内に光を導入する光源と、この光源が変調光を出力するようにする制御信号を発生する信号発生器と、積分球集光器内の散乱光を検出するとともにこの散乱光を表す信号を発生する検出器と、光変調を表す信号発生器からの信号及びこの検出器により発生される信号を用いて分析用の出力を生ぜしめるように動作しうるロックイン増幅器とを具える試料分析システムを提供する。
光源はレーザ又はＬＥＤを有するようにしうる。この光源は積分球集光器内に位置させることができる。この光源は積分球集光器の外部に位置させることもできる。この光源は５９０nm〜６５０nmの範囲内の波長、例えば、６３５nmの波長を有するようにしうる。この光源は６２０nm〜７５０nmの範囲内の波長、例えば、６３５nmの波長を有するようにしうる。
本発明の更に他の態様によれば、光を集めるとともに試料を収容する積分球集光器と、この積分球集光器の内面上の少なくとも１つの光源及び少なくとも１つの検出器とを具えているデバイスを提供する。積分球集光器は試料ホルダを有し、この試料ホルダはその内部容積内に試料を収容するようにしうる。この試料ホルダは積分球集光器内のほぼ中央に試料を保持するように適合させることができる。この試料ホルダは、試料が積分球集光器を通って流れるようにするための貫流式試料ホルダとすることができる。この試料ホルダは、試料キュベットを保持するように適合させることができる。積分球集光器は、非散乱光をこの積分球集光器から出射させる出口ポートを有するようにしうる。又、非散乱ビーム抑圧手段を設けることができる。
本発明の更に他の態様によれば、光を収集するとともに試料を収容する積分球集光器とピペットチップとを具えるデバイスであって、積分球集光器はピペットチップの一端にあり、このピペットチップは、試料の流体を積分球集光器内に引き込むように配置されているデバイスを提供する。
本発明の更に他の態様によれば、生物試料を積分球集光器内に導入するステップと、薬剤（ドラッグ）を積分球集光器内に導入するステップと、光を積分球集光器内に導入して光が試料を通過するとともにこの試料により散乱されるようにするステップと、積分球集光器内の散乱光を検出するステップと、照射及び検出を行うステップを時間の関数として繰返すステップと、検出された光を分析して薬剤感受性を決定するステップとを具える生物試料の薬剤感受性監視（モニタリング）方法を提供する。試料は細菌／真菌の種又は菌株を有するようにしうる。捕捉された光を分析するステップは、所定の生物の増殖を止める又は抑制する薬剤のレベルを確立するステップを有するようにしうる。この方法には、非投与の生物試料を薬剤試料と同時に監視するステップを含めることができる。
本発明の更に他の態様によれば、試料を積分球集光器内に導入するステップと、積分球集光器内に光を放出して、光がこの試料を通過するとともにこの試料により散乱するようにするステップと、積分球集光器内の散乱光を検出するステップと、検出された光を分析して細胞数を決定するようにするステップとを具える細胞計数方法を提供する。
本発明の更に他の態様によれば、細菌培養物試料を積分球集光器内に導入するステップと、積分球集光器内に光を放出して、光がこの試料を通過するとともにこの試料により散乱するようにするステップと、積分球集光器内で散乱した光を検出するステップと、検出された光を分析し、この検出された光の、時間の関数としての変化が細胞状態の変化を表すようにするステップとを具える細菌培養物の細胞状態決定方法を提供する。
本発明の更に他の態様によれば、生物試料を積分球集光器内に導入するステップと、積分球集光器内に光を放出し、光がこの試料を通過するとともにこの試料により散乱されるようにするステップと、積分球集光器内の散乱光を検出するステップと、検出された光を分析して、捕捉された光の、時間の関数としての変化が生物物質の変化を表すようにするステップとを具える生物物質監視方法を提供する。
生物物質は病原菌を含んでおり、生物物質の変化が病原菌のレベル又は濃度の変化であり、これにより病原菌の増殖を表すようにすることができる。
生物物質は微生物を含んでおり、生物物質の変化が微生物のレベル又は濃度の変化であり、これにより前記微生物の増殖を表すようにすることができる。
図１は、試料、特に生物試料の光学特性を測定する積分球集光器を示す線図である。 図２は、図１の積分球集光器とともに用いる検出兼分析システムを示すブロック線図である。 図３（ａ）は、第１の例の積分球集光器及び試料ホルダの種々の部分を示す線図である。図３（ｂ）は、第１の例の積分球集光器及び試料ホルダの他の種々の部分を示す線図である。 図４（ａ）は、第２の例の積分球集光器及び試料ホルダの種々の部分を示す線図である。図４（ｂ）は、第２の例の積分球集光器及び試料ホルダの他の種々の部分を示す線図である。図４（ｃ）は、第２の例の積分球集光器及び試料ホルダの更に他の種々の部分を示す線図である。 図５（ａ）は、第３の例の積分球集光器及び試料ホルダの種々の部分を示す線図である。 図５（ｂ）は、第３の例の積分球集光器及び試料ホルダの他の種々の部分を示す線図である。 図５（ｃ）は、第３の例の積分球集光器及び試料ホルダの更に他の種々の部分を示す線図である。 図６は、第４の例の積分球集光器を示す線図である。 図７は、２種類の大腸菌試料、すなわち薬剤を含む大腸菌試料及び薬剤を含まない大腸菌試料に対する検出器の出力を時間の関数として示すグラフ線図である。 図８は、２種類のS.マルセッセンス（marcescens）（霊菌）試料、すなわち薬剤を含むS.マルセッセンス試料及び薬剤を含まないS.マルセッセンス試料に対する検出器の出力を時間の関数として示すグラフ線図である。 図９は、２種類のS.エピデルミディス（epidermidis ）（表皮ブドウ球菌）試料、すなわち薬剤を含むS.エピデルミディス試料及び薬剤を含まないS.エピデルミディス試料に対する検出器の出力を時間の関数として示すグラフ線図である。 図１０は、内部光源を有する積分球集光器を示す頂面図である。 図１１は、図１０の積分球集光器の下半分を示す斜視図である。 図１２は、種々の試料の希釈化に対し時間の関数として散乱強度を示す対数グラフ線図である。 図１３は、単一の試料に対し時間の関数として散乱強度を、Muを表示して示す対数グラフ線図である。 図１４は、Muの逆数を細菌の１区画（division）当たりの関数として示すグラフ線図である。 図１５は、“陽性（positivity）までの区画数”対測定開始時点での細胞数を示すグラフ線図である。
図１は、散乱光の積分集光器（integrating collector ）１０を示す。この集光器１０は積分球１２と、この積分球１２内に試料を保持するための試料ホルダ１４とを有する。図１に示す例では、試料ホルダ１４は積分球１２内に試料キュベット１６を保持するようになっている。
積分球１２は、中空の球状空洞と、入口ポート１８と、出口ポート２０とを有している。これらの入口ポート１８及び出口ポート２０は中空の球状空洞を通る光路の端点を規定する。これらの入口ポート１８及び出口ポート２０はそれぞれ球状空洞の対向する側に配置されている。中空の球状空洞の内面は拡散性であり、従って、光を反射及び拡散することができる。ある場合には、積分球の内面に薄肉のアルミニウ又は銀の被膜を被着し、これに酸化チタンIIの塗料を被覆する。これらの層は、試料により散乱された如何なるレーザ放射をも反射させるとともに、試料により散乱された如何なる光をも拡散させて積分球の内面にそれぞれ到達するようにする。
試料ホルダ１４及び試料キュベット１６は、使用に際し試料が積分球１２のほぼ全直径に亘って延在するように配置されている。このことは、積分球内で循環する反射光及び拡散光と接触する試料の体積を最大にするのに役立つ。
積分球の内面上には、光検出器２２、例えば、フォトダイオードが設けられている。このフォトダイオード（光検出器）は、空洞内の光の強度を時間の関数として測定するのに用いられる。このフォトダイオードの上方にはバッフルが配置されて、このフォトダイオードが直接照射されるのを防止するとともに、このフォトダイオードに散乱光及び反射光のみが入射され、これにより信号の質を高めるようにする。
光は入口ポート１８を通って積分球１２の中空の球状空洞に入る。この中空の球状空洞は光の拡散及び収集室として作用する。この中空の球状空洞内の光はこの中空の球状空洞の内面で複数回反射して、この空洞の内部全体に亘って均一の光分布を生ぜしめる。散乱されない光は、出口ポート２０を通ってこの中空の球状空洞からビームダンプに導出される。散乱された光は光検出器２２により検出される。試料は中空の球状空洞内に位置している為、光のビームはこの試料を複数回通過しうる。これにより測定を高感度にする。
図２は、図１の集光器と共に用いられる検出兼分析システムを示す。集光器の入口ポート１８には、光を積分球１２に入力させるために、光源２４、例えば、（６２０〜７５０nm内の如何なる赤色光をも用いることができるが）６３５nm波長のレーザを配置する。レーザ（光源）２４は、レーザ出力の変調周波数及び位相を制御するようにした信号発生器２６に接続されている。フォトダイオード２２はロックイン増幅器２８に接続されている。この増幅器２８の入力端は信号発生器２６に接続されている。この増幅器２８の出力端はデジタルオシロスコープ３０に接続されている。ロックイン増幅器２８は位相敏感検波を用いて、特定の基準周波数及び位相で、この場合信号発生器により設定された変調周波数で信号の成分を選出する。基準周波数以外の周波数における雑音信号は除去されて測定に影響しないようにする。デジタルオシロスコープ３０からの出力はコンピュータディスプレイ３２に供給される。
信号発生器２６は、レーザ光源２４の出力周波数を変調するように配置されている。一例としては、＋１６９°の位相及び２００ｍＶのピーク‐ピーク振幅とした１０ｋHzの周波数でレーザを変調するようにしうる。検出された信号はロックイン増幅器２８により濾波される。このロックイン増幅器２８はフォトダイオード２２からの検出信号を濾波する。このロックイン増幅器２８は検出信号を光源２４に与えられる変調と同期させて、不所望な雑音、例えば、バックグラウンド電気又は光（luminous）雑音を排除する減衰システムを提供するようにする。濾波された信号はデジタルオシロスコープ３０に送信されて記録される。記録された信号はコンピュータディスプレイ３２で表示することができる。
生のデータはデジタルオシロスコープにより収集される。代表的には、３０秒の実験当り、約１６，０００個のデータ要素が収集される。データはプロセッサ中の計算スイートに転送され、この計算スイートによりデータ要素のアベレージ（mean、median、mode）及び標準偏差を返送する。標準偏差が（データのノルムからのずれを表す）しきい値よりも上である場合には、このデータは廃棄される。それぞれの実験の平均（mean）を選択する。実験は３〜８９回技術的に繰返して行い、これらを収集して表にする。これらのアベレージの平均からの標準誤差を計算し、データと一緒にエラーバーとしてグラフ化する。データがグラフ化されると、標準のゴンペルツのような関数がデータに適応されて、接種サイズのような実験の将来の結果を推定する。
使用に際しては、試料を試料キュベット１６内に入れて試料ホルダ１４内に配置し、これにより試料を中空の空洞の内部に保持するようにする。光源２４からの入射光は入口ポート１８を通って空洞に入る。試料は、入射光がこの試料に入射されるように配置する。入射光は試料により散乱させることができる。その後、散乱光は空洞の内面により複数回反射される。中空の空洞は積分球として作用し、この積分球内の反射光を積分すなわち積算する。拡散光の合計をフォトダイオード２２によりサンプリングする。このサンプリングは時間の関数として行う。非散乱光は空洞を通って直進し、ビームダンプ又はバッフルにより吸収される。
積分球１２の中空空洞の内面の幾何学的形状及び散乱特性により、反射光はあらゆる方向から試料に入射される。中空空洞内に試料を存在させた場合、光検出器２２により検出される光の分布は試料の光学特性に応じて変化する。
次に、内部に試料が配置された集積球１２の異なる種々の実施例につき説明する。
図３（ａ）は、集光器の球状部分を構成する２部分を示す。図３（ａ）（ｉ）は、上部の半球体を有する集光器の上部を示す。この集光器の上部は、試料ホルダを収容するための試料ポートを有する。図３（ａ）（ii）は、基部と下部の半球体とを有する集光器の下部を示す。この下部では、フォトダイオードを保持するポートが設けられている。このポートはバッフルの後方に配置されている為、散乱光又は反射光のみがフォトダイオードに伝達される。図３（ｂ）は、図３（ａ）（ｉ）の試料ポート内に挿入するための試料ホルダの２部分を示す。試料ホルダは、蓋と、試料を保持するための本体、この場合特に試料キュベットとを有する。試料を保持するための本体は、組立時に集光器の中央に試料を保持するように設計されている。蓋と、試料を保持するための本体とは、試料ホルダを形成するように連結する。積分球は、図３（ａ）の上部及び下部の半球体を連結することにより形成される。試料は試料ホルダ内に装填され、次いでこの試料ホルダが集光器の試料ポート内に装填される。試料ホルダは試料を集光器の中央部に保持する。試料ホルダの蓋が集光器の球体を完成させる。
図４（ａ）、４（ｂ）及び４（ｃ）は、他の例の集光器の部分を示す。図４（ａ）は集光器の下半部を示す。この下半部は、試料ポートの一部分を収容するように変更した半球体である。図４（ｂ）は集光器の上半部を示す。図４（ｃ）は試料ホルダを示す。この試料ホルダは、組立時に集光器の内面を完成させる曲面を有する。使用に際しては、試料ポートを開放させた状態で集光器の２つの半部を互いに連結する。次いで、図４（ｃ）の試料ホルダを試料ポート内に挿入し、これにより積分球を完成させるとともに試料をこの積分球内の中央位置に配置する。
図５（ａ）、５（ｂ）及び５（ｃ）は、更に他の例の集光器の部分を示す。この場合、集光器は、中空空洞を有する材料のブロックから形成されている。図５（ａ）は下側ブロックを示す。この下側ブロックは、これに形成された中空の半球空洞と、この空洞の底部に位置する試料部位とを有する。この下側ブロックは、レーザを収容するように適合されている。図５（ｂ）は上側ブロックを示している。この上側ブロックは、これに形成された中空の半球空洞を有している。図５（ｃ）は、下側ブロックに連結するためのレーザケーシングを示す。使用に際しては、試料が試料部位に装填される。次いで、上側ブロックが取付けられ、これにより中空の球状空洞を完成させる。レーザケーシングは、レーザを保守するためにのみ取外される。
図３〜５につき説明した全ての例では、試料ホルダは積分球内で循環する光との干渉を最小にするように設計されている。例えば、試料ホルダは動作波長でほぼ透過性となる材料から形成しうる。
図６は、球状集光器を収容するピペット状デバイスを示す。この球状集光器は上述した積分球１２である。このデバイスはピペットチップ３４及び集光器１２を有する。ピペットチップ３４は使い捨てとしうる。前述したように、集光器の壁部内にはフォトダイオード２２がある。球状集光器の内部は試料室として作用する。使用に際しては、試料がピペット機構によりピペットチップ３４を通して引き上げられる。この試料は試料室内に引き込まれ、球状集光器の内部が試料で満たされる。試料を球状集光器の内部に存在させた時点で、レーザを動作させることができる。次いで、試料により散乱され集光器により反射された光が、壁部内に埋め込まれたフォトダイオードにより検出される。読取りを行った後に、汚染されたデバイスを廃棄することができる。
本発明のデバイスは、細菌の薬剤感受性を決定するのに用いることができる。この決定は、一組の濃度の薬剤に対してある時間に亘って行なう。この決定を行うために、細菌種を測定し、これらを臨床的に有意なレベルまで希釈又は濃縮する。細菌が感受しうる薬剤の量を、ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）よりも大きい濃度で添加する。投与した培養物を、許容された条件の下で、薬剤を除外した場合と同様に処理された他の培養物と並行して増殖する。薬剤に対して用いる希釈剤（ＰＢＳ又は水）を、投与した培養物内の薬剤と同じ量（容積）で添加する。予め決定した時点で、培養物をインキュベータから取出し、１mlのキュベットにおいて積分球集光器内で測定する。投与した培養物と自由増殖する培養物との間に統計的に相違がある第１の時点は陽性までの時間（time to positivity；ＴＴＰ）と称される。試験により、本発明のシステムは市販の他の如何なる薬剤感受性装置よりも早いＴＴＰを有することを実証した。
種々の薬剤感受性実験を行った。これらの実験のために、図３の集光器を用いた。使用したオシロスコープは、生のデータを解釈するためにピコスコープ（登録商標）を有するピコスコープ４２２６とした。使用した光源は、６３５nmの特定の出力波長を有する変調ダイオードレーザとした。（レートリミッティングステージ（rate limiting stage ）である）オシロスコープに対する走査速度は約２００Hzである。測定を１ミリ秒（１ｋHz）毎に行うように設定する。しかし、使用するプロセッサによってデータの平均量が３０秒の実験当り約１６００個のデータポイントに制限された。その結果、１秒又は約２００Hz当り０．０１８７５の測定が行われた。オシロスコープからのデータはデータ処理用ソフトウェア（例えば、Excel （登録商標）、Ｒ、SPSS、MATLAB）内に取り込み、３０秒の走査による約１６００個のデータポイントの平均を計算する。標準偏差及び標準誤差の双方又は何れか一方を計算して、走査中の信号の安定性を示すのに用いるようにすることができる。
図７は、２種類の大腸菌試料、すなわち薬剤を含む大腸菌試料及び薬剤を含まない大腸菌試料に対し、各試料を３度実行した別々の３度の実験（ｎ＝９）から得られた検出器の出力（ｍＶで表す）を時間の関数として示すグラフ線図である。エラーバーは平均値からの１つの±標準誤差である。ブルーライン（薬剤を含む大腸菌の合成）は細菌接種前にシプロフロキサシンを２０μｇ／ml添加した試料を示す。細菌は、島津製ＵＶ‐１６０１ ＵＶ‐Ｖis 分光光度計の検出限界よりも下のレベルで添加し、その後全ての実験に亘って３００〜７００細胞／mlとしてＣＦＵ計数により量子化した。レッドライン（薬剤を含まない大腸菌の合成）は試薬が添加されておらず、同じ時点で同じ数の細菌を添加して正常に増殖することができた試料を示す。培養物は、サンプリングとサンプリングとの間を３〜５分に制限して２１０ＲＰＭで振動を行って３７℃で増殖し、試料からの如何なる熱損失をも回避してこれらの増殖時間に著しい悪影響を及ぼさないようにした。統計的検定（Ｔ‐test（Ｔ検定）及びＣhi2 （カイ二乗検定））は、３０分の時点が、２つの試料間で著しい相違がある第１の時点であることを示している。従って、３０分が検出時間である。
図８は、２種類のS.マルセッセンス試料、すなわち薬剤を含むS.マルセッセンス試料及び薬剤を含まないS.マルセッセンス試料に対し、各試料を３度実行した別々の３度の実験（ｎ＝９）から得られた検出器の出力（ｍＶで表す）を時間の関数として示すグラフ線図である。エラーバーは平均値からの標準誤差である。ブルーライン（薬剤を含むS.マルセッセンスの合成）は細菌接種前にシプロフロキサシンを２０μｇ／ml添加した試料を示す。細菌は、島津製ＵＶ‐１６０１ ＵＶ‐Ｖis 分光光度計の検出限界よりも下のレベルで添加し、その後全ての実験に亘って３００〜７００細胞／mlとしてＣＦＵ計数により量子化した。レッドライン（薬剤を含まないS.マルセッセンスの合成）は試薬が添加されておらず、同じ時点で同じ数の細菌を添加して正常に増殖することができた試料を示す。培養物は、サンプリングとサンプリングとの間を３〜５分に制限して２１０ＲＰＭで振動を行って３７℃で増殖し、試料からの如何なる熱損失をも回避してこれらの増殖時間に著しい悪影響を及ぼさないようにした。統計的検定（Ｔ‐test及びＣhi2 ）は、３０分の時点が、２つの試料間で著しい相違がある第１の時点であることを示している。従って、３０分が検出時間である。
図９は、２種類のS.エピデルミディス試料、すなわち薬剤を含むS.エピデルミディス試料及び薬剤を含まないS.エピデルミディス試料に対し、各試料を３度実行した別々の３度の実験（ｎ＝９）から得られた検出器の出力を時間の関数として示すグラフ線図である。エラーバーは平均値からの標準誤差である。ブルーライン（薬剤を含むS.エピデルミディスの合成）は細菌接種前にシプロフロキサシンを２０μｇ／ml添加した試料を示す。細菌は、島津製ＵＶ‐１６０１ ＵＶ‐Ｖis 分光光度計の検出限界よりも下のレベルで添加し、その後全ての実験に亘って３００〜７００細胞／mlとしてＣＦＵ計数により量子化した。レッドライン（薬剤を含まないS.エピデルミディスの合成）は試薬が添加されておらず、同じ時点で同じ数の細菌を添加して正常に増殖することができた試料を示す。培養物は、サンプリングとサンプリングとの間を３〜５分に制限して２１０ＲＰＭで振動を行って３７℃で増殖し、試料からの如何なる熱損失をも回避してこれらの増殖時間に著しい悪影響を及ぼさないようにした。統計的検定（Ｔ‐test及びＣhi2 ）は、３０分の時点が、２つの試料間で著しい相違がある第１の時点であることを示している。従って、３０分が検出時間である。
図７〜９は、シプロフロキサシンを投与した試料と正常に増殖された試料との間の大きな差が３０分に存在することを示している。３０分の検出時間は既知の技術の検出時間に関して著しく改善するものである。
上述した実験は、臨床研究室にとって多くの試料を同時に試験しうるように拡張させることができる。細菌の増殖が疑われた培養物（例えば、敗血症からの血液試料）は、（現在病院で行われるように）単に血液のインキュベータチューブ内に装填する必要があるだけであり、これには有効性が疑われる薬剤が添加される、すなわち、総計で例えば２０個のチューブの各チューブに１つの薬剤が添加されるとともに１つのコントロールには薬剤が添加されない。この場合、これらは全て、コントロールに比べて細菌の増殖を抑制するのにどの薬剤が有効であるかが明らかとなるまで試料を１５〜３０分毎にＳＬＩＣにより取出して分析する現在の標準的な手順のように増殖される。
上述した実験では、容積が一定の試料容器、すなわち試料キュベット内に試料が保持される。本発明は一定流量のシステムにおいて用いることができることが理解されるであろう。例えば、流動キュベットを、供給チューブ及び排出チューブが取付けられた球状集光器内に配置することができる。細菌培養物は重力ポンピングにより加熱貯蔵部から流動キュベットに通し、測定が常に行われるようにしうる。
流れに基づくシステムの場合、充分な試料を確実に取出しうるように流速を制御する必要がある。流速は、
流速＝(１/４)×π×(パイプラインの直径)2 ×速度
速度＝サンプリングレート×ビームボリューム
を用いて制御する必要がある。
上述したオシロスコープ及びプロセッサを用い、測定周波数を２００Hzとし、フローパイプラインの直径を１０mmとし、ビームボリュームを３０3 とした場合、フローシステムでは、流速を約４７０ml／秒（１秒当り約０．５リットル）に制限する必要がある。より高速なプロセッサはこのシステムをかなり高速化する。
本発明のデバイスを用いることにより実時間の増殖曲線を収集することができる。この場合、内部に固定的な又は流動する培養容器を入れたインキュベータ内に本発明のデバイスを配置する。データは時間とともに収集される為、必要とする如何なる時点でも試料を濁度に対して測定することができる。実際に、測定は１分間に複数回又は連続して行うことができる。
図１０は、本発明の他の実施例を示す。この場合、本発明のデバイスは、少なくとも１つの光源と、積分球内に装着した少なくとも１つの検出器とを用いて蛍光測定を実行するようにしたものであり、この少なくとも１つの光源は蛍光を活性化させるのに適した少なくとも１つの波長の光を放出するように作用しうるものであり、少なくとも１つの検出器は放出された蛍光を検出するように作用しうるものである。蛍光測定の場合、試料全体を照射する必要があり、光出口ポートは必要としない。蛍光のみが検出されるようにするのを確実にするために、フォトダイオードと光学的な遮蔽体／フィルタとの組合せを検出器として用いることができる。遮蔽体は、特定の波長帯域での光学品質プラスチックから型成形することができる。
図１０は、２つの光源３６、この場合ＬＥＤを示しており、これらに関連する２つの光検出器３８、この場合フォトダイオードが積分球の集光器の内面上に設けられている。光源３６は目的とする材料の吸収波長に一致する波長で発光する。フォトダイオード３８は予期される蛍光発光範囲にピークの感度を有している。
図１１は、例えば３Ｄ印刷技術を用いる物理的な３Ｄデバイスを形成するのに用いうる球体の下側半部の３Ｄレンダリングを示す。ＬＥＤにより放出される光の波長は、目的とする材料の蛍光を活性化するように選択する。
蛍光測定を行った。使用した波長は、青色の４３０±３０nm及び緑色の５２５±１５nmとした。ＬＥＤは（他のパワー入力を必要としない）信号発生器により直接駆動し、１０ｋHzの周波数及び２００ｍＶのピーク‐ピーク振幅で発振させた。慣例のフォトダイオード遮蔽体と、予期した発光範囲でピークの感度を有するフォトダイオードとにより蛍光信号の干渉が検出された。背景照明対環境照明に対する蛍光測定の分化は、慣例の着色遮蔽体と、ＬＥＤ及びフォトダイオードが積分球の内面上に収容されているという事実とにより対処される。本例では、一方のフォトダイオードに対して用いる遮蔽体は緑色（５２５±１５nm）とし、他方のフォトダイオードに対して用いる遮蔽体は赤色（６３０±１８nm）とした。これらの遮蔽体は、脂質に富んだ環境に曝された場合に染色ニールレッドからの蛍光を検出しうるように選択した。
図１０及び１１の積分球は内部のみの光源を有するように示してあるが、これらを図１の構成と組合せて、内部及び外部の光源を用いるようにしうる。好ましくは、内部光源を上述したように蛍光測定に対し用いる。又、外部光源を上述したように他の光の測定に対して用いる。
本発明は種々の用途を有する。例えば、人間／動物／食料の試料又は点滴のような医療機器における病原菌の早期の増殖を確立するのに本発明を用いることができる。又、微生物学／腫瘍学／菌類学のための化学療法研究における細胞濃度の微小変化を検出するのにも本発明を用いることができる。
他の例としては、本発明を単なる細胞の集計のために用いることができる。試料における細胞数を数えることは、一般的な微生物学的な課題であり、本発明はこの課題を簡単化、迅速化及び容易化するとともに、オペレータが特定の媒体におけるこれら試料自体の細胞のデータベースを構築して、媒体中の急激な汚染又は僅かな色変化のような試料中の僅かな変化を急速に検出しうるようにする。本発明を用いることにより、試料中の細菌の数を１mL当り約１０個の微生物の下限値まで正確に決定しうる。
本発明は、細胞数が極めて類似している培養物を互いに充分良好に区別しうる。特に、本発明は、細菌／真菌の種又は菌株の迅速な薬剤感受性試験により、所定の生物の増殖を止める又は抑制する薬剤のレベルを確立するようにする。例えば、薬剤感受性の調査中に、ある静菌濃度の抗生物質をある培養物に投与し、他の培養物を（図７〜９につき上述したように）自然に再現させる場合に、早期に細胞数が僅かに変化することを検出しうる。
本発明は、細菌培養物の細胞状態を決定するのにも有効となりうる。その理由は、ある微生物が異なる状況下でこれらの微生物の形態を変え、細菌の異なる寸法及び形状が光を異なるように散乱させる為である。同様に、ＭＩＣ（最小発育阻止濃度；菌株の所定の細菌種の増殖を抑止する所定の培養物の最少量）／ＭＢＣ（最小殺菌濃度；試料中の菌株の所定の細菌種の現存細胞を全て殺す所定の薬剤の最少量）のブレークポイント分析を行って、微生物菌株が特定の抗生物質か又は抗生物質の組合せに応答するか否かを表す点を確立するようにしうる。
更に他の適用分野では、不透明でない媒体における微生物の増殖を追跡するようにしうる。この追跡は、低い方の検出限界（１mL当り１０個よりも少ない微生物）から１mL当り約１０9 個の微生物の範囲内で時間の関数として行うことができる。この追跡は、明確な時間間隔で自動的に行うか、又はオペレータの裁量で手動的に行うか、或いはこれらの双方を組合せて行うことができる。
取得後のデータ分析を用いて微生物試料の増殖速度、すなわち細菌を分割させるのに要する時間を決定することができる。又、ある分析（例えば、薬剤感受性の分析）でも、細菌の数を推定しうる。この推定は自動分析を用いて行い、従って、ユーザが分析に入力することなく、統計的な計算を行うことができる。
一例として、図１２にマイコバクテリア・スメグマチスから得られた増殖曲線を示す。この図１２では、異なる曲線が異なる希釈度を表している。円は生のデータ点を表す。実線はフィットしたゴンペルツ関数を表す。Ｙ軸は底を２とした対数で散乱強度の値を表している。図１３は、フィットしたゴンペルツ関数の一例である。Muは、曲線の最も急峻な部分における勾配である。陽性までの時間（ＴＴＰ）は、この勾配のラインがＸ軸と交差する個所となる。Muは、細菌の増殖速度を計算するのに用いられる。ＴＴＰは、細菌の数を計算するのに用いられる。
図１４は、１／Mu（ゴンペルツ関数の最も急峻な部分）と、細菌を分裂させるのに要する時間（hour）との間の関係を示す。これによりゴンペルツ関数から得られるMu値と細菌を分裂させるのに要する時間の推定値との間の変換を可能にするものである。Muと発生／分裂毎の時間（Time per generation/division）との間の関係は、
分裂毎の時間の推定値＝-1.37578/Mu・1.1912
として表すことができる。従って、Muを測定することにより、分裂毎の時間の推定値を評価することができる。上述した式を用いることにより、
陽性までの分裂数＝ＴＴＰ／分裂毎の時間の推定値
を表すことができる。
図１５は、“陽性までの分裂数”対ＣＦＵ（コロニー形成単位）で表した開始時に試料中にあった細胞数を表すプロット線図である。この図１５は、指数関数的増殖のみを有する、すなわち遅滞期を有さない培養物に適用される。（図１４で導出されたように）陽性までの時間を分裂毎の時間の推定値で除すると、その結果が陽性までの分裂数となる。この陽性までの分裂数がＹ軸上に表されている。このグラフは、陽性までの分裂数と開始時の細菌濃度との関係を示している。これにより、ゴンペルツ関数から得られた値を用いて開始時の細菌濃度を推定するようにしうる。
本発明を用いることにより、懸濁したコロイド粒子又は化学反応の何れかによる色変化を含む、流体におけるノルムからの如何なる変化も検出することができる。透明度がスペクトルの赤色側に向かって変化することにより、より多くの赤色光が吸収され、従って、検出パラメータが変化する。これと同じことがスペクトルの青色側に向かって達成されるが、検出パラメータは変更され、分化及び検出を異なるように可能化する。異なる色のレーザを加えることによりこの能力を高める。
当業者は、本発明から逸脱することなく上述した構成配置を変更することができることを理解しうるであろう。例えば、上述した適用分野の主たる領域は医療分析に関するものであるが、他の分野も可能である。例えば、本発明のデバイスは不透明でない液体中の如何なる粒子も検出しうる為、このデバイスは、高品質のボトル入り飲料水（ミネラルウォータ）のような流体中のほこり（dust）、砂又はちり（grid）のような、液状媒質中の如何なる粒子をも見つけるのに用いることができる。又、本発明のデバイスは輸入される果汁を監視するのに用いることもできる。その理由は、輸入される果汁は非風土病の細菌又は真菌胞子を保有していないことを証明する必要がある為である。この監視を行うために、散乱強度のしきい値をブランクとして用い、この値からの如何なる変化をも処理上の優位性のある相違として登録及び記録するようにすることができる。従って、本発明の特定の実施例の上述した説明は例示的にのみ行ったものであり、本発明をこれに限定するものではない。当業者にとって明らかなように、上述した動作に大きな変更を行うことなく僅かな変更を行いうるものである。

Claims (33)

  1. 試料を測定する試料測定システムであって、この試料測定システムが、
    光を集めるとともに試料を収容する積分球集光器と、
    この積分球集光器内に光を導入する光源であって、既知の光変調を有する光を出力するように作用しうる当該光源と、
    前記積分球集光器内の散乱光を検出し、この散乱光を表す信号を発生する検出器と、
    前記既知の光変調及び前記検出器からの前記信号を用いて試料測定を行うように動作しうるロックイン増幅器と
    を具える試料測定システム。
  2. 請求項１に記載の試料測定システムにおいて、前記光源がレーザを有している試料測定システム。
  3. 請求項１又は２に記載の試料測定システムにおいて、前記光源は５９０nm〜６５０nmの範囲内の波長、例えば、６３５nmの波長を有するようにした試料測定システム。
  4. 請求項１又は２に記載の試料測定システムにおいて、前記光源は６２０nm〜７５０nmの範囲内の波長、例えば、６３５nmの波長を有するようにした試料測定システム。
  5. 請求項１〜４の何れか一項に記載の試料測定システムにおいて、前記既知の光変調は位相及び周波数の双方又は何れか一方の変調とした試料測定システム。
  6. 請求項１〜５の何れか一項に記載の試料測定システムにおいて、この試料測定システムが、光の前記出力を変調させるための変調器又は信号発生器を有している試料測定システム。
  7. 請求項１〜６の何れか一項に記載の試料測定システムにおいて、前記積分球集光器が試料ホルダを有し、この試料ホルダはその内部容積内に試料を収容するようになっている試料測定システム。
  8. 請求項７に記載の試料測定システムにおいて、前記試料ホルダは前記積分球集光器内のほぼ中央に試料を保持するようになっている試料測定システム。
  9. 請求項７又は８に記載の試料測定システムにおいて、前記試料ホルダは、試料が前記積分球集光器を通って流れるようにするための貫流式試料ホルダとした試料測定システム。
  10. 請求項７〜９の何れか一項に記載の試料測定システムにおいて、前記試料ホルダは試料キュベットを保持するようになっている試料測定システム。
  11. 請求項１〜１０の何れか一項に記載の試料測定システムにおいて、前記積分球集光器は、非散乱光をこの積分球集光器から出射させる出口ポートを有している試料測定システム。
  12. 請求項１〜１１の何れか一項に記載の試料測定システムにおいて、この試料測定システムが非散乱ビーム抑圧手段を有している試料測定システム。
  13. 請求項１〜１２の何れか一項に記載の試料測定システムにおいて、前記検出器が前記積分球集光器の内面上に設けられている試料測定システム。
  14. 請求項１〜１３の何れか一項に記載の試料測定システムにおいて、非散乱光が前記検出器により検出されるのを阻止する手段が設けられている試料測定システム。
  15. 試料分析に使用するデバイスにおいて、このデバイスが、光を集めるとともに試料を収容する積分球集光器と、この積分球集光器の内面上の少なくとも１つの光源及び少なくとも１つの検出器とを具えている試料分析に使用するデバイス。
  16. 請求項１５に記載の試料分析に使用するデバイスにおいて、前記積分球集光器が試料ホルダを有し、この試料ホルダはその内部容積内に試料を収容するようになっている試料分析に使用するデバイス。
  17. 請求項１６に記載の試料分析に使用するデバイスにおいて、前記試料ホルダは前記積分球集光器内のほぼ中央に試料を保持するようになっている試料分析に使用するデバイス。
  18. 請求項１５又は１６に記載の試料分析に使用するデバイスにおいて、前記試料ホルダは、試料が前記積分球集光器を通って流れるようにするための貫流式試料ホルダとした試料分析に使用するデバイス。
  19. 請求項１５〜１８の何れか一項に記載の試料分析に使用するデバイスにおいて、前記試料ホルダは、試料キュベットを保持するようになっている試料分析に使用するデバイス。
  20. 請求項１５〜１９の何れか一項に記載の試料分析に使用するデバイスにおいて、前記積分球集光器は、非散乱光をこの積分球集光器から出射させる出口ポートを有している試料分析に使用するデバイス。
  21. 請求項１５〜２０の何れか一項に記載の試料分析に使用するデバイスにおいて、この試料分析に使用するデバイスが非散乱ビーム抑圧手段を有している試料分析に使用するデバイス。
  22. 光を収集するとともに試料を収容する積分球集光器とピペットチップとを具えるデバイスであって、前記積分球集光器は前記ピペットチップの一端にあり、このピペットチップは、試料の流体を前記積分球集光器内に引き込むように配置されているデバイス。
  23. 生物試料の薬剤感受性監視方法において、この方法が、
    生物試料及び薬剤を積分球集光器内に導入するステップと、
    前記積分球集光器内の薬剤投与試料に照射を行い、光がこの薬剤投与試料を通過するとともにこの薬剤投与試料により散乱されるようにするステップと、
    前記積分球集光器内の散乱光を検出するステップと、
    検出された光を分析して薬剤感受性を決定するステップと
    を具える生物試料の薬剤感受性監視方法。
  24. 請求項２３に記載の生物試料の薬剤感受性監視方法において、この方法が、前記薬剤投与試料から検出された光と、非投与基準試料から検出された光とを比較するステップを具えている生物試料の薬剤感受性監視方法。
  25. 請求項２３又は２４に記載の生物試料の薬剤感受性監視方法において、この方法が、前記照射及び検出を行うステップを時間の関数として繰返すステップを具えている生物試料の薬剤感受性監視方法。
  26. 請求項２３〜２５の何れか一項に記載の生物試料の薬剤感受性監視方法において、前記試料が細菌／真菌の種又は菌株を有している生物試料の薬剤感受性監視方法。
  27. 請求項２３〜２６の何れか一項に記載の生物試料の薬剤感受性監視方法において、捕捉された前記光を分析するステップが、所定の生物の増殖を止める又は抑制する薬剤のレベルを確立するステップを有している生物試料の薬剤感受性監視方法。
  28. 細胞計数方法であって、この方法が、
    細胞試料を積分球集光器内に導入するステップと、
    前記積分球集光器内の前記細胞試料を照射して、光がこの細胞試料を通過するとともにこの細胞試料により散乱されるようにするステップと、
    前記積分球集光器内の散乱光を検出するステップと、
    検出されたこの散乱光を分析して細胞数を決定するようにするステップと
    を具える細胞計数方法。
  29. 細菌培養物の細胞状態決定方法であって、この方法が、
    細菌培養物試料を積分球集光器内に導入するステップと、
    前記積分球集光器内の前記細胞試料を照射して、光がこの細胞試料を通過するとともにこの細胞試料により散乱するようにするステップと、
    前記積分球集光器内で散乱した前記光を検出するステップと、
    検出された前記光を分析し、この検出された光の、時間の関数としての変化が細胞状態の変化を表すようにするステップと
    を具える細菌培養物の細胞状態決定方法。
  30. 生物物質監視方法であって、この方法が、
    生物試料を積分球集光器内に導入するステップと、
    前記積分球集光器内の前記生物試料を照射して、光がこの生物試料を通過するとともにこの生物試料により散乱するようにするステップと、
    前記積分球集光器内で散乱した前記光を検出するステップと、
    検出された前記光を分析し、捕捉された前記光の、時間の関数としての変化が前記生物物質の変化を表すようにするステップと
    を具える生物物質監視方法。
  31. 請求項３０に記載の生物物質監視方法において、前記生物物質の変化を細胞状態の変化とする生物物質監視方法。
  32. 請求項３１に記載の生物物質監視方法において、前記生物物質が病原菌を含んでおり、前記生物物質の変化が前記病原菌のレベル又は濃度の変化であり、これにより前記病原菌の増殖を表すようになっている生物物質監視方法。
  33. 請求項３２に記載の生物物質監視方法において、前記生物物質が微生物を含んでおり、前記生物物質の変化が前記微生物のレベル又は濃度の変化であり、これにより前記微生物の増殖を表すようになっている生物物質監視方法。
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