BR112017017249B1 - sistema, dispositivos e métodos utilizando um coletor de luz esférico integrante - Google Patents

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Abstract

SISTEMA, DISPOSITIVOS E MÉTODOS UTILIZANDO UM COLETOR DE LUZ ESFÉRICO INTEGRANTE. Um sistema para medir uma amostra compreendendo: um coletor de luz esférico integrante (12) para coleta de luz e conter a amostra; uma fonte de luz (24) para introduzir luz no coletor de luz esférico integrante (12), em que a fonte de luz (24) é operável para produzir luz com uma modulação conhecida, de preferência, usando um gerador de sinal (26); um detector (22) para detectar luz dispersa no coletor de luz esférico integrante (12) e gerar um sinal indicativo da luz dispersa e um amplificador de bloqueio (28) operável usando a modulação de luz conhecida e o sinal gerado pelo detector (22) para fornecer uma saída para análise.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere a um dispositivo para a medição de, pelo menos, uma propriedade de uma amostra, por exemplo, uma amostra biológica, tal como bactérias, utilizando luz.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Espectrofotômetros clássicos podem ser utilizados para determinar as propriedades óticas de bactérias usando absorção ou dispersão. Os espectrofotômetros de absorção podem ser usados para medir a absorvância relativa de uma amostra. A absorvância é medida por comparação da intensidade de luz que entra em uma amostra com a intensidade da luz que sai da amostra. Uma queda na intensidade de luz indica uma quantidade de luz que foi absorvida. Isto pode ser apresentado como um número arbitrário, tipicamente uma densidade ótica. Isto pode conduzir a uma contagem precisa do número de células presentes numa amostra.
[003] Os espectrofotômetros dispersantes geralmente compreendem uma fonte de luz intensa, como um laser ou uma fonte incandescente muito brilhante, e um monocromador. A Luz incide sobre uma amostra e espalha-se em diferentes ângulos. Detectores colocados em intervalos discretos em torno de uma câmara recolhe a luz dispersa. Coletores de luz na região lateral da dispersão pode ser usada para obter informação sobre a granularidade e luz recolhida na região de dispersão para a frente pode ser usada para obter informação sobre o tamanho das partículas. A intensidade global da luz dispersa dá uma leitura da turbidez e uma indicação do número de partículas presentes. Nos espectrofotômetros dispersantes para mediçãode bactérias, o comprimento de onda da fonte de luz é 600 nm. Este comprimento de onda é o mais disperso e absorvido pelo menos um número de materiais orgânicos, tais como o DNA, proteínas, citocromos.
[004] Os citômetros de fluxo também podem determinar propriedades de uma amostra de interesse. Quando uma bainha de fluxo de líquido de índice combinado flui através de um tubo estreito, o líquido atua para reduzir o lúmen do tubo forçando as células no líquido a passar através do tubo individualmente. Isso facilita a contagem das células. A incidência de luz laser sobre o tubo estreito é dispersa como células individuais passando através de dados secundários e de dispersão para a frente pode ser gravado para se obter informação sobre o tamanho e granularidade das células em estudo. Milhares de células pode passar através do feixe e ser medida deste modo, em poucos segundos e em muito pouco líquido. Enquanto citômetros são úteis em algumas aplicações, eles são máquinas sofisticadas que exigem extensa formação de um operador. A operação segura também exige uma entrada regular de reagentes e isso contribui para em curso os custos de funcionamento. A interpretação dos dados produzidos também pode ser um desafio.
[005] Outro método para medir a concentração de partículas em suspensão num líquido ou gás é nefelometria. Nefelometria pode ser configurada para usar integrando esferas. Numa tal configuração, a luz é incidente sobre uma amostra e pode ser dispersa por partículas na amostra antes de entrar na esfera de integração. A luz dispersa é então refletida e difundida dentro da esfera de integração antes que seja detectada a uma porta de saída da esfera. A luz não difundida passa diretamente através da esfera e não é recolhida.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] De acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcionado um dispositivo que compreende um coletor de luz esfera integrante para coleta de luz é adaptado para conter uma amostra no seu volume interno em utilização. Um suporte de amostras pode ser proporcionado para segurar uma amostra no interior do coletor de luz esférico integrante. Tipicamente, a amostra compreende um fluido. De preferência, um detector é fornecido sobre uma superfície interna do coletor de luz esférico integrante. Um defletor pode ser posicionado sobre o detector para impedir sua iluminação direta e assegurar que só a luz refletida e dispersa seja incidente sobre ela.
[007] Ao fornecer um suporte de amostras que localiza uma amostra no interior de uma esfera de integração, podem ser tomadas medições altamente sensíveis. Isto é porque a cavidade esférica oca da esfera de integração funciona como uma difusão de luz e face de recolha. Luz no interior da cavidade é refletida várias vezes fora da superfície interna para produzir uma distribuição uniforme de luz por todo o interior da cavidade. Uma vez que a amostra está localizada no interior da cavidade esférica oca, feixes de luz podem passar através dela múltiplas vezes.
[008] O suporte de amostras pode compreender um volume interno da esfera de integração. Neste caso, o volume interno é inundado com a amostra e cumpre uma dupla função, ou seja, para conter a amostra e para agir de forma a difundir e recolher luz. A amostra pode preencher substancialmente o interior da esfera de integração.
[009] O coletor de luz esfera integrante compreende uma porta de entrada para permitir que a luz entre no coletor de luz esférico integrante e uma porta de saída para permitir que a luz não dispersa do feixe incidente saia do coletor de luz esférico integrante.
[0010] O suporte de amostras pode ser adaptado para conter uma amostra substancialmente centralmente no interior do coletor de luz esférico integrante. A amostra pode estar dentro de um porta-amostras que se estende ao longo de um diâmetro da esfera de integração.
[0011] O suporte de amostras pode ser adaptado para conter uma cuvete, por exemplo uma cuvete comprimento padrão 10mm, no qual uma amostra pode ser carregada. Mais especificamente, o suporte pode ser adaptado para segurar um cuvete de dimensões 45 milímetros x 10 milímetros x 10 milímetros (pegada quadrado).
[0012] O suporte de amostras pode ser um fluxo através do suporte para permitir que uma amostra a fluir através do coletor de luz esférico integrante.
[0013] De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado um sistema para analisar uma amostra, que compreende: um coletor de luz esférico integrante para recolha de luz e que contém a amostra; uma fonte de luz para a introdução de luz na coletor de luz esférico integrante; um gerador de sinal para gerar um sinal de controle para fazer com que a fonte de luz para emitir luz modulada; um detector para detectar a luz dispersa no coletor de luz esférico integrante e gerando um sinal indicativo da luz dispersa, e um amplificador lock-in operável para utilizar um sinal a partir do gerador de sinal indicativo da modulação de luz e o sinal gerado pelo detector de fornecer uma saída para análise.
[0014] A fonte de luz pode compreender um laser ou um LED. A fonte de luz pode ser localizada no coletor de luz esférico integrante. A fonte de luz pode ser localizada externa ao coletor de luz esférico integrante. A fonte de luz pode ter um comprimento de onda na faixa de 590 nm a 650 nm, por exemplo, 635nm. A fonte de luz pode ter um comprimento de onda na faixa de 620 nm a 750 nm, por exemplo, 635nm.
[0015] De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção proporciona-se um dispositivo que compreende um coletor de luz esfera integrante para a coleta de luz e contendo uma amostra, e pelo menos uma fonte de luz e, pelo menos, um detector, de acordo com uma superfície interna do coletor de luz esférico integrante. O coletor de luz esférico integrante pode incluir um suporte de amostra para a amostra contendo dentro do seu volume interno. O suporte de amostras pode ser adaptado para conter uma amostra substancialmente centralmente no interior do coletor de luz esférico integrante. O suporte de amostras pode ser um fluxo através do suporte de amostras para permitir que uma amostra flua através do coletor de luz esférico integrante. O suporte de amostras pode ser adaptado para conter uma cuvete de amostra. O coletor de luz esférico integrante pode ter uma porta de saída para permitir que a luz não difundida para sair do coletor de luz esférico integrante. Podem ser proporcionados meios de supressão de feixe não dispersa.
[0016] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um dispositivo que compreende um coletor de luz esfera integrante para a recolha de luz e para conter uma amostra, e uma ponta de pipeta, em que o coletor de luz esférico integrante está numa extremidade da ponta da pipeta e a ponta da pipeta está disposta de modo a extrair um fluido de amostra para o coletor de luz esférico integrante.
[0017] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para a monitorização de sensibilidade aos medicamentos de uma amostra biológica, compreendendo o método: introdução da amostra biológica em um coletor de luz esférico integrante; a introdução de um medicamento para a amostra biológica; a introdução de luz para o coletor de luz esférico integrante, de modo que a luz passa através e é dispersa pela amostra; detectar a luz dispersa no coletor de luz esférico integrante; repetir os passos de emissores e detectando como uma função de tempo e analisando a luz detectada para determinar a susceptibilidade de drogas. A amostra pode compreender uma espécie ou cepa de bactérias / fungos. Analisando a luz captada pode envolver o estabelecimento do nível de droga que mata ou inibe o crescimento de um determinado organismo. O método pode envolver a monitorização de uma amostra biológica undosed ao mesmo tempo que a amostra de drogado.
[0018] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para contagem de células, o método compreendendo: a introdução de uma amostra para um coletor de luz esférico integrante; emitir luz no coletor de luz esférico integrante, de modo que a luz passa através e é dispersa pela amostra; detectar a luz dispersa no coletor de luz esférico integrante; e analisar a luz detectada para determinar o número de células.
[0019] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um método para determinar um estado celular de uma cultura bacteriana, o método compreendendo: a introdução de uma amostra de cultura bacteriana em um coletor de luz esférico integrante; emissores de luz no coletor de luz esférico integrante, de modo que a luz passa através e é dispersa pela amostra; detectar a luz dispersa no coletor de luz esférico integrante; e analisando a luz detectada para determinar o número de células, em que alterações na luz detectada como uma função do tempo são indicativos de uma mudança no estado celular.
[0020] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para a monitoração de um material biológico, o método compreendendo: introduzir uma amostra biológica em um coletor de luz esférico integrante; emitir luz no coletor de luz esférico integrante, de modo que a luz passa através e é dispersa pela amostra; detectar a luz dispersa no coletor de luz esférico integrante; e analisar a luz detectada, em que alterações na luz captada como uma função do tempo são indicativos de uma mudança no material biológico. A mudança no material biológico pode ser uma mudança no estado celular.
[0021] O material biológico pode incluir um agente patogênico e a mudança no material biológico pode ser uma alteração em um nível de concentração ou do agente patogênico, desse modo indicando que o crescimento do patógeno.
[0022] O material biológico pode incluir um micróbio e a mudança no material biológico pode ser uma alteração em um nível ou concentração do micróbio, indicando, assim, o crescimento do referido microorganismo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0023] Vários aspectos da invenção serão agora descritos por meio apenas de exemplo, e com referência aos desenhos anexos, dos quais:
[0024] A Figura 1 é a representação esquemática de um coletor de luz esférico integrante para a medição das propriedades óticas de uma amostra, e, em particular, de uma amostra biológica;
[0025] A Figura 2 é um diagrama de blocos de um sistema de detecção e de análise para utilização com o coletor de luz esférico integrante da Figura 1;
[0026] As Figuras 3 (a) e (b) mostram várias partes de um primeiro exemplo do coletor de luz esférico integrante e o suporte de amostra;
[0027] As Figuras 4 (a) a (c) mostram várias partes de um segundo exemplo do coletor de luz esférico integrante e o suporte de amostra;
[0028] As Figuras 5 (a) a (c) mostram várias partes de um terceiro exemplo do coletor de luz esférico integrante e o suporte de amostra;
[0029] A Figura 6 é uma representação esquemática de um quarto exemplo do coletor de luz esférico integrante;
[0030] A Figura 7 é um gráfico da saída do detector, como uma função do tempo para duas amostras de E. coli, um com um medicamento e um sem;
[0031] A Figura 8 é um gráfico da saída do detector, como uma função do tempo para duas amostras de S. marcescens, um com um medicamento e um sem;
[0032] A Figura 9 é um gráfico da saída do detector, como uma função do tempo para duas amostras de S. epidermidis, um com um medicamento e um sem;
[0033] A Figura 10 é uma vista de cima de um coletor de luz esférico integrante com fontes de luz internas;
[0034] A Figura 11 é uma vista em perspectiva de uma metade inferior do coletor de luz esférico integrante da Figura 10;
[0035] A Figura 12 é um gráfico logarítmico de espalhamento intensidade como uma função do tempo para diferentes diluições da amostra;
[0036] A Figura 13 é um gráfico logarítmico de espalhamento intensidade como uma função do tempo para uma única amostra em que Mu é mostrado;
[0037] A Figura 14 é um gráfico do inverso da Mu como uma função de por divisão de bactérias, e
[0038] A Figura 15 é um gráfico do "número de divisões até positividade" vs número de células numa amostra a um ponto de início de medição.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0039] A Figura 1 mostra um coletor de luz esférico integrante 10. O coletor 10 tem uma esfera 12 e uma amostra 14 de suporte de integração para conter uma amostra no interior da esfera de integração 12. No exemplo mostrado na Figura 1, o suporte de amostra 14 está adaptado para conter um cuvete de amostra 16 no interior da esfera 12.
[0040] A esfera de integração 12 tem uma cavidade esférica oca, uma porta de entrada 18 e uma porta de saída 20. A porta de entrada 18 e porta de saída 20 definem os pontos finais de um percurso óptico através da cavidade esférica oca. As portas de entrada e de saída 18 e 20, respectivamente, estão posicionadas em lados opostos da cavidade esférica. Uma superfície interna da cavidade esférica oca é difusiva e, assim, capaz de refletir e difundir a luz. Em alguns casos, um revestimento de alumínio ou de prata fina é aplicado a uma superfície interior da esfera e coberto com uma camada de tinta de óxido de titânio II. Estas camadas refletem de volta qualquer radiação laser que foi dispersa pela amostra e difundir qualquer luz que foi dispersa pela amostra e atinge a face interior da esfera, respectivamente.
[0041] O suporte de amostra 14 e o cuvete de amostra 16 são posicionados, de modo que na utilização da amostra se estende ao longo de substancialmente todo o diâmetro da esfera de integração 12. Isto ajuda a maximizar o volume da amostra que possa interagir com a luz refletida e difundida de circulação no interior da esfera.
[0042] Na superfície interna de um fotodetector 22, é fornecido, por exemplo, um fotodíodo. Isto é usado para medir a intensidade da luz no interior da cavidade, como uma função do tempo. Um deflector é posicionado sobre o fotodíodo para evitar a sua iluminação direta e assegurar que só a luz refletida seja dispersa e incidente sobre ela, aumentando assim, a qualidade do sinal.
[0043] A luz entra na cavidade esférica oca da esfera de integração 12, através do ponto de entrada 18. A cavidade oca atua como uma difusão de luz e face de coleta. Luz no interior da cavidade é refletida várias vezes fora da superfície interna da cavidade oca para produzir uma distribuição uniforme de luz por todo o interior da cavidade. luz não difundida sai da cavidade oca através do orifício de saída 20 para um feixe de despejo. A luz dispersa é medida pelo fotodetector 22. Uma vez que a amostra está localizada no interior da cavidade esférica oca, feixes de luz pode passar através dela múltiplas vezes. Isto resulta em medições altamente sensíveis.
[0044] A Figura 2 mostra um sistema de detecção e de análise para utilização com o coletor da Figura 1. Na porta de entrada 18 do coletor está uma fonte de luz 24, por exemplo, um laser de comprimento de onda 635 nm (embora qualquer luz vermelha na faixa de 620-750nm comprimento de onda possa ser utilizada), para a entrada de luz para a esfera de integração 12. O laser 24 está ligado a um gerador de sinal 26, que é adaptado para controlar uma frequência de modulação e a fase da saída do laser. O fotodiodo 22 está ligado a um amplificador lock-in 28. Uma entrada do amplificador 28 está ligada ao gerador de sinal 26. Uma saída do amplificador 28 está ligada a um osciloscópio digital 30. O amplificador de bloqueio 28 de fase usa detecção sensível de destacar um componente do sinal a uma frequência de referência específico e fase, neste caso, a frequência de modulação que é definido pelo gerador de sinal. Os sinais de ruído, em que não sejam a frequência de referência de frequências, são rejeitados e não afetam a medição. Uma saída do osciloscópio digital 30 é alimentado para um monitor de computador 32.
[0045] O gerador de sinal 26 está preparado para modular a frequência da fonte de laser 24. Como um exemplo de saída, o laser pode ser modulado a uma frequência de 10 kHz com uma fase de + 169°, e uma amplitude de pico-a-pico de 200m V. O sinal detectado é filtrado pelo amplificador de bloqueio 28. O amplificador de bloqueio 28 filtra o sinal detectado a partir do fotodíodo 22. O amplificador de bloqueio 28 sincroniza o sinal detectado com a modulação aplicada da fonte de luz 24 para proporcionar um sistema de amortecimento que elimina ruídos indesejados, por exemplo, fundo ruído elétrico ou luminoso. O sinal filtrado é enviado para o osciloscópio digital 30 a ser gravado. O sinal gravado pode ser exibido na tela do computador 32.
[0046] Os dados brutos são recolhidos pelo osciloscópio digital. Tipicamente cerca de 16.000 pontos de dados são recolhidos para cada segundo experimento 30. Os dados são exportados para um pacote de cálculo em um processador que retorna as médias (média, mediana, modo) e o desvio padrão de pontos de dados. Se o desvio padrão está acima de um limiar (indicando aberrações da norma nos dados) os dados são descartados. A média de cada experiência é seleccionado. Os experimentos têm entre 3 e 89 repetições técnicos, os quais são recolhidos e tabelados. O erro padrão da média dessas médias é calculada e visualizada graficamente como barras de erro juntamente com os dados. Uma vez que os dados são representados graficamente, uma função, tal como um padrão de Gompertz, é ajustada aos dados, a fim de estimar resultados futuros de experimentos, tal como inóculos tamanhos.
[0047] Em utilização, uma amostra é colocada no interior da cuvete da amostra 16 e posicionado no suporte de amostra 14, a qual mantém a amostra no interior da cavidade oca. A luz recebida a partir da fonte 24, entra na cavidade através da abertura de entrada 18. A amostra é posicionada de tal modo que o feixe de luz de entrada é incidente sobre a amostra. A luz de entrada pode ser dispersa pela amostra. A luz dispersa é então refletida, várias vezes, pela superfície interna da cavidade. A cavidade oca actua como uma esfera de integração e integra ou adiciona-se a luz refletida no interior da esfera. A soma da luz difusa é amostrada pelo fotodiodo 22. Isto é feito como uma função do tempo. A luz não difundida desloca diretamente através da cavidade e é absorvida por um depósito de feixe ou um defletor.
[0048] Devido à geometria e propriedades dispersivas da superfície interna da cavidade oca da esfera de integração de luz refletida 12 é incidente sobre a amostra a partir de todas as direcções. Com uma amostra presente no interior da cavidade oca, a distribuição da luz detectada pelo fotodetector 22 mudará dependente das propriedades ópticas da amostra.
[0049] Várias concretizações diferentes da esfera de integração 12 com a sua disposição das amostras interna irão agora ser descritas.
[0050] A Figura 3 (a) mostra duas partes que formam a parte esférica de um coletor. A Figura 3 (a) (i) mostra uma parte superior do coletor com um hemisfério superior. A parte superior do coletor tem uma porta de amostragem para receber um porta-amostras. A Figura 3 (a) (ii) mostra uma parte inferior do coletor que tem uma base e um hemisfério inferior. Nesta parte, uma porta é fornecida para a realização de um fotodiodo. Este está posicionado atrás de uma placa deflectora, de modo que a luz só dispersos ou refletida é transmitida ao fotodíodo. A Figura 3 (b) mostra duas partes de um porta-amostras para a inserção na porta da amostra da Figura 3 (a) (i). O suporte de amostras tem uma tampa e um corpo para conter a amostra, e, em particular, neste caso, uma célula de amostra. Quando montado o corpo de amostra é projetado para manter a amostra no centro do coletor. A tampa e o corpo se conectam para formar um suporte de amostras. A esfera de integração é formada ligando os hemisférios superior e inferior da Figura 3 (a). Uma amostra é carregada para dentro do suporte da amostra, que é então carregado na porta da amostra do coletor. O suporte de amostras contém a amostra no centro do coletor. A tampa do porta-amostras completa a esfera do coletor.
[0051] As Figuras 4 (a), 4 (b) e 4 (c) mostram partes de um outro exemplo do coletor. A Figura 4 (a) mostra uma metade inferior de um coletor. A metade inferior é um hemisfério modificado para conter parte de uma porta da amostra. A Figura 4 (b) mostra a metade superior do coletor. A Figura 4 (c) mostra um porta-amostras. O suporte de amostras tem uma superfície curva que completa o interior do coletor quando montado. Em utilização, as duas metades do coletor estão ligados entre si deixando uma porta da amostra aberta. O suporte de amostras da Figura 4 (c) é então inserido na porta da amostra, o que completa a esfera de integração e localiza a amostra numa posição central no interior da esfera.
[0052] As Figuras 5 (a), 5 (b) e 5 (c) mostram partes de ainda outro exemplo do coletor. Neste caso, o coletor é formado a partir de blocos de material com cavidades escavadas. A Figura 5 (a) mostra um bloco inferior. O bloco inferior tem uma cavidade hemisférica oca formada no mesmo, e um local de amostra localizada na base da cavidade. O bloco inferior é adaptado para abrigar um laser. A Figura 5 (b) mostra o bloco superior. O bloco superior tem uma cavidade hemisférica oca formada nele. A Figura 5 (c) mostra um invólucro de laser para a ligação ao bloco inferior. Em utilização, a amostra é carregada para o local da amostra. O bloco superior é, em seguida, ligado, completando assim uma cavidade esférica oca. O invólucro do laser é removido do bloco inferior somente para a manutenção do laser.
[0053] Em todos os exemplos descritos com referência às Figuras 3 a 5, o suporte de amostra é concebido para minimizar a interferência com a luz que circula na esfera. Por exemplo, o suporte de amostras pode ser feito de um material substancialmente transparente ao comprimento de onda de funcionamento.
[0054] A Figura 6 mostra um dispositivo de pipeta, como que incorpora um coletor esférico. O coletor esférico é uma esfera de integração 12, como descrito acima. O dispositivo tem uma ponta de pipeta 34 e um coletor 12. A ponta de pipeta 34 é descartável. Tal como anteriormente, na parede do coletor é um fotodíodo 22. O interior dos actos de coletor esféricas como uma câmara de amostras. Em utilização, uma amostra é retirada para cima através da ponta de pipeta 34 por um mecanismo de pipeta. A amostra é aspirada para a câmara da amostra, de modo que o interior do coletor esférica é inundada com a amostra. Uma vez que a amostra está presente no interior do coletor esférica, um laser pode ser activado. Luz dispersa pela amostra, e reflecte-se no coletor é então detectado pelo fotodíodo 22 embutido na parede. Depois de uma leitura é feita, o dispositivo contaminado pode ser eliminado.
[0055] O dispositivo da invenção pode ser utilizado para determinar a susceptibilidade a drogas bacterianas. Isto é feito ao longo do tempo com uma concentração conjunto de droga. Para fazer isso, as espécies bacterianas são medidas e diluiu-se ou concentrou-se a um nível clinicamente significativo. A quantidade de medicamento que as bactérias são susceptíveis a é adicionado a uma concentração maior do que a MIC aceite (concentração inibitória mínima). A cultura doseada é crescida em condições aceites em paralelo com uma outra cultura que foi tratada de forma idêntica com a exclusão do fármaco. O diluente utilizado para o fármaco (PBS ou água) é adicionado no mesmo volume que o fármaco na cultura doseados. Em pontos de tempo predeterminados, as culturas são removidas da incubadora e medido no coletor integrado em cuvetes de 1 ml. O primeiro ponto de tempo em que existe uma diferença estatisticamente significativa entre a doseados e as culturas de crescimento livres é declarado o tempo de positividade (TTP). Os testes demonstraram que o sistema da invenção tem uma TTP mais rapidamente do que qualquer outro aparelho de sensibilidade aos medicamentos no mercado.
[0056] Vários experimentos de susceptibilidade a fármaco foram realizados. Para estes, foi utilizado o coletor da Figura 3. O osciloscópio foi utilizado um PicoScope 4226 com software PicoScope para traduzir os dados brutos. A fonte de luz usada foi um laser de diodo com um comprimento de onda modulada de saída bem definido de 635nm. As velocidades de varrimento para o osciloscópio (que é a fase limitante da velocidade) são cerca de 200Hz. Ele é ajustado para ter uma medição de cada milissegundo (1 kHz). No entanto, o processador utilizado limitados a quantidade média de dados para cerca de 1.600 pontos de dados por 30 segundo experimento. Isso funciona em 0.01875 medições por segundo ou em torno de 200Hz. Os dados do osciloscópio são importados para manuseio de dados de software (por exemplo, excel, R, SPSS, Matlab) e a média dos -1600 pontos de dados a partir da segunda verificação 30 é calculado. O desvio padrão e / ou erro padrão pode ser calculada e utilizada para mostrar a estabilidade do sinal durante a verificação.
[0057] A Figura 7 é um gráfico da saída do detector (em mV) em função do tempo para duas amostras de E. coli, um com um medicamento e um sem, a partir de três experimentos separados em que triplicata de cada amostra foram executados (n = 9). As barras de erro são mais e menos um erro padrão da média. A linha azul indica a amostra em que 20 ug / ml de ciprofloxacina foi adicionada antes da inoculação com as bactérias. As bactérias foram adicionadas a níveis abaixo do limite de detecção de um UV- 1601 espectrofotómetro de UV-Vis Shimadzu e depois quantificada por contagem de UFC como entre 300-700 células / ml em todos os experimentos. A linha vermelha indica que a amostra que não tinha fármaco adicionado e foi deixada a crescer normalmente com o mesmo número de bactérias adicionadas no mesmo ponto de tempo. As culturas foram incubadas a 37 ° C com agitação a 210 RPM medeia entre a colheita e a amostragem foi limitado a entre 3-5 minutos para prender qualquer perda de calor a partir das amostras de forma a afectar grandemente não seus tempos de crescimento. Os testes estatísticos (teste T e Qui quadrado) indicam o ponto de tempo de 30 minutos para ser primeiro ponto em que há uma diferença significativa entre as duas amostras. Portanto, a 30 minutos é o tempo de detecção.
Figure img0001
Tabela 2: Qui quadrado e o teste t resultados para todos os pontos de tempo na Figura 7.
[0058] A Figura 8 é um gráfico de saída do detector (em mV) em função do tempo para duas amostras de S. macresens, um com um medicamento e uma sem, a partir de três experimentos separados em que triplicata de cada amostra foram executados (n = 9). As barras de erro são erro padrão da média. A linha azul indica a amostra em que 20 μg / ml de ciprofloxacina foi adicionada antes da inoculação com as bactérias. As bactérias foram adicionadas a níveis abaixo do limite de detecção de um espectrofotômetro UV-1601 de UV-Vis Shimadzu e depois quantificada por contagem de UFC como entre 300-700 células / ml em todos os experimentos. A linha vermelha indica a amostra que não tinha fármaco adicionado e foi deixada a crescer normalmente com o mesmo número de bactérias adicionadas no mesmo ponto de tempo. As culturas foram incubadas a 37 ° C com agitação a 210 RPM medeia entre a colheita e a amostragem foi limitado a entre 3 - 5 minutos para prender qualquer perda de calor a partir das amostras de forma a afectar grandemente não seus tempos de crescimento. Os testes estatísticos (t-teste e qui- quadrado) indicam o ponto de tempo de 30 minutos para ser primeiro ponto em que há uma diferença significativa entre as duas amostras. Portanto, a 30 minutos é o tempo de detecção.
Figure img0002
Tabela 3: Resultados de Qui quadrado e o teste t para todos os pontos de tempo na Figura 8.
[0059] A Figura 9 é um gráfico da saída do detector, como uma função do tempo para duas amostras de S. epidermidis, um com um medicamento e uma sem, a partir de três experimentos separados em que triplicata de cada amostra foram executados (n = 9). As barras de erro são erro padrão da média. A linha azul indica a amostra em que 20 μg / ml de ciprofloxacina foi adicionada antes da inoculação com as bactérias. As bactérias foram adicionadas a níveis abaixo do limite de detecção de um UV-1601 espectrofotómetro de UV-Vis Shimadzu e depois quantificada por contagem de UFC como entre 300-700 células / ml em todos os experimentos. A linha vermelha indica a amostra que não tinha fármaco adicionado e foi deixada a crescer normalmente com o mesmo número de bactérias adicionadas no mesmo ponto de tempo. As culturas foram incubadas a 37 ° C com agitação a 210 RPM medeia entre a colheita e a amostragem foi limitado a entre 3 - 5 minutos para prender qualquer perda de calor a partir das amostras de forma a afectar grandemente não seus tempos de crescimento. Os testes estatísticos (teste T e Qui quadrado) indicam o ponto de tempo de 30 minutos para ser primeiro ponto em que há uma diferença significativa entre as duas amostras. Portanto, a 30 minutos é o tempo de detecção.
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Tabela 4: Resultados de Qui quadrado e o teste t para todos os pontos de tempo da Figura 9.
[0060] As Figuras 7 a 9 indicam que em 30 minutos, não existe uma diferença significativa entre a amostra doseada com a ciprofloxacina e a uma deixada a crescer normalmente. Um tempo de detecção de 30 minutos é uma melhoria significativa sobre os tempos de detecção de tecnologia conhecida.
[0061] Os experimentos descritos acima podem ser estendidos para um laboratório clínico para permitir que muitas amostras a serem testadas simultaneamente. As culturas com crescimento bacteriano suspeita (amostras de sangue de sépsis por exemplo) precisam simplesmente serem carregadas para dentro de tubos incubadora de sangue (tal como, é feito agora em hospitais) e ter suspeitado drogas eficazes adicionado, um de cada tubo num total de, por exemplo, 20 tubos e mais um controle com nenhum fármaco. Tratar-se em seguida ser cultivada como é o procedimento padrão atual com amostras retiradas e analisadas por SLIC a cada 15 - 30 minutos, até que seja evidente que os fármacos sejam eficazes para retardar o crescimento das bactérias em relação ao controle.
[0062] Nos experimentos acima descritos, a amostra é colocada dentro de um recipiente de amostra de volume constante, ou seja, um curvete de amostra. Será apreciado que a invenção possa ser utilizada em um sistema de fluxo constante. Por exemplo, um curvete de fluxo pode ser colocado no coletor esférico com alimentação e drenagem de tubos ligados. Uma cultura bacteriana pode ser passada através do cuvete por bombeamento de gravidade a partir de um reservatório aquecido e as medições tomadas constantemente.
[0063] Para um sistema com base de fluxo, a razão de fluxo tem de ser controlada para assegurar que as amostras suficientes podem ser tomadas. A taxa de fluxo pode ser determinada usando: Taxa de fluxo = M X π X (diâmetro do tubo)2 X velocidade Velocidade = taxa de amostragem X volume de feixe
[0064] Usando o osciloscópio e processador descrito acima, com a frequência de medida de 200 Hz, um diâmetro do fluxo de tubo de 10 mm e um volume de feixe de 30 mm3, um sistema de fluxo exigiria a taxa de fluxo para ser limitada a -470 ml / s (cerca de metade de um litro por segundo). Um processador mais rápido iria acelerar este sistema consideravelmente.
[0065] As curvas de crescimento em tempo real podem ser obtidas utilizando o dispositivo da invenção. Neste caso, o dispositivo seria colocado em uma incubadora com um vaso de cultura estática ou fluir no seu interior. Os dados seriam coletados ao longo do tempo, de modo que uma amostra possa ser medida para a turbidez em qualquer ponto de tempo necessário. De fato, as medições podem ser tomadas várias vezes por minuto, ou de forma contínua.
[0066] A Figura 10 mostra uma outra concretização da invenção. Neste caso, o dispositivo é adaptado para executar medições de fluorescência utilizando, pelo menos, uma fonte de luz e, pelo menos, um detector montado no interior da esfera de integração, a pelo menos uma fonte de luz sendo operável para emitir luz de pelo menos um comprimento de onda adequado para a estimulação de fluorescência e o detector de pelo menos ser operados para detectar a fluorescência emitida. Para medições de fluorescência, a totalidade da amostra tem de ser iluminada e não há necessidade de uma porta de saída de luz. Para garantir que apenas a fluorescência seja detectada, uma combinação de um fotodiodo e uma blindagem / filtro ótico pode ser utilizado como o detector. Os escudos podem ser moldados a partir de plásticos de qualidade ótica em uma banda de passagem de comprimento de onda específico.
[0067] A Figura 10 mostra duas fontes de luz 36, neste caso de LEDs, e dois detectores de luz associados 38, neste caso os fotodiodos, são fornecidos numa superfície interna de um coletor de luz esférico integrante. A fonte (s) de luz 36 emite num comprimento de onda combinado para o comprimento de onda de absorção (s) do material (s) de interesse. Os fotodiodos 38 tem sensibilidade de pico na gama de emissão de fluorescência esperado.
[0068] A Figura 11 mostra uma representação em 3D da metade inferior de uma esfera que pode ser usado para produzir um dispositivo 3D físico utilizando, por exemplo, técnicas de impressão em 3D. O comprimento de onda de luz emitida pelos LEDs é selecionado para estimular a fluorescência de um material de interesse. As medições de fluorescência foram tomadas. Os comprimentos de onda utilizados eram azuis-430 ± 30 nm e verde-525 ± 15 nm. Os LEDs foram accionados directamente a partir do gerador de sinal (nenhuma outra entrada de energia necessária) e oscilou em 10 kHz e 200 mV amplitude de pico a pico. A interferência de sinal de fluorescência foi detectada através de escudos de fotodíodo personalizados e fotodiodos que têm sensibilidade de pico na gama de emissão esperado (s). Diferenciação das medições de fluorescência contra fundo contra a iluminação do ambiente são tratados por uma combinação dos escudos coloridos costume eo fato de que os LEDs e fotodiodos estão alojados na face interna da esfera de integração. Neste exemplo, o escudo usado em um fotodiodo era verde (525 ± 15 nm) e, por outro fotodiodo o escudo foi utilizado vermelho (630 ± 18 nm).
[0069] Estes escudos foram selecionados para permitir a detecção da produção de fluorescência do corante Vermelho do Nilo, quando ele é exposto a um ambiente rico em lipídeos.
[0070] Embora as esferas de integração das Figuras 10 e 11 sejam mostradas apenas com fontes de luz internas, elas podem ser combinadas com o arranjo da Figura 1, de modo que as fontes internas e externas possam ser utilizadas. De preferência, as fontes internas são usadas para medições de fluorescência, tal como descrito acima. De preferência, a fonte externa é utilizada para outras medições óticas, como descrito acima.
[0071] A presente invenção tem inúmeras aplicações. Por exemplo, a invenção pode ser usada para estabelecer o crescimento inicial de agentes patogénicos em amostras de humano / animal / alimentares ou em dispositivos médicos, tais como gotas. Ele também pode ser utilizado para detectar alterações mínimas nas concentrações celulares em estudos de quimioterapia para microbiologia / oncologia / ou micologia para detectar impurezas em água ou outros fluidos.
[0072] Como outro exemplo, a invenção pode ser utilizada para a contagem de células simples. Enumerar o número de células numa amostra é uma tarefa microbiológica comum e a invenção faz com que seja simples, rápido e fácil, e com a possibilidade de um operador ser capaz de construir uma base de dados das suas próprias células em um meio em particular, para permitir a detecção rápida de pequenas alterações em uma amostra, tal como uma contaminação florescente ou uma pequena alteração de cor no meio. Usando o invento, o número de bactérias numa amostra pode ser determinado com precisão para baixo para um limite inferior de ~10 micróbios por ml.
[0073] A invenção é suficientemente sensível para ser capaz de diferenciar entre as culturas com os números de células muito semelhantes. Em particular, a invenção permite rapidamente testar a sensibilidade das espécies ou cepas de bactérias / fungos para estabelecer o nível de fármaco que irá matar ou inibir o crescimento de um determinado organismo. Por exemplo, pequenas mudanças no número de células no início de estudos de susceptibilidade a fármacos podem ser detectadas, onde uma cultura foi doseada com uma concentração de um antibiótico bacteriostático e um outro é permitida para replicar naturalmente (como demonstrado acima com referência às Figuras 7 a 9).
[0074] A invenção pode também ser útil para determinar o estado de células de uma cultura bacteriana. Isso ocorre porque alguns micróbios mudar suas morfologias em circunstâncias diferentes, e diferentes tamanhos e formas de bactérias dispersam a luz de forma diferente. Igualmente, MIC (concentração inibitória mínima - a menor quantidade de um dado fármaco que irá inibir o crescimento de uma determinada espécie da cepa bacteriana) MBC (concentração bactericida / mínimo - a menor quantidade de um dado fámaco que matará todas as células presentes de uma dada espécie de bactérias da estirpe em análise de uma amostra) ponto de interrupção pode ser feito para estabelecer o ponto no qual uma estirpe microbiana é ou não está a responder a um antibiótico ou a combinação de antibióticos em particular.
[0075] Em ainda outro aplicação, o crescimento de micróbios em um meio não-opaco pode ser rastreado. Isto pode ser feito num intervalo desde o limite inferior de detecção (<10 micróbios por IML) para ~ 109 micróbios por ml como uma função do tempo. Isto pode ser automático, a intervalos de tempo distintos ou com o manual, à discrição do operador, ou uma combinação dos dois.
[0076] Utilizando a análise de dados pós-aquisição a taxa de crescimento de amostras microbianas pode ser determinada, isto é, o tempo que leva para as bactérias se dividir. Além disso, em certos ensaios (por exemplo, susceptibilidade a drogas) o número de bactérias pode ser estimada. Isto é feito usando uma análise automatizada e assim pode proporcionar computação sistemática sem intervenção do utilizador para a análise.
[0077] Como um exemplo, a Figura 12 mostra curvas de crescimento de M. smegmatis. Na Figura 12, as diferentes curvas representam diferentes diluições. Os círculos representam os pontos de dados brutos. A linha sólida representa a função de gompertz equipada. O eixo Y representa o log de base 2 do valor de intensidade de dispersão. A Figura 13 é um exemplo de uma função de gompertz montado. Mu é o gradiente na parte mais íngreme da curva. Tempo de positividade (TTP) é onde esta linha intercepta o eixo dos x. Mu é usado para calcular a taxa de crescimento da bactéria. TTP é usada para calcular o número de bactérias.
[0078] A Figura 14 mostra a relação entre uma sobre Mu (a parte mais íngreme da função de gompertz) e o tempo que leva para as bactérias para dividir. Isto permite a conversão entre o valor Mu a partir da curva de gompertz e uma estimativa do tempo que leva as bactérias para dividir. A relação entre Mu e o Tempo por geração / divisão pode ser expressa como: Estimativa de tempo por divisão = -1,37578 / Mu * 1,1912
[0079] Assim, medindo Mu, uma estimativa do tempo por divisão pode ser estimada.
[0080] Utilizando a equação acima, pode ser demonstrado que: Número de divisão até positividade = TTP / Estimativa de tempo por divisão.
[0081] A Figura 15 é um gráfico de "Número de divisões até positividade" vs número de células que estavam na amostra no início como derivado por CFU (unidades formadoras de colônias). A Figura 15 aplica-se a culturas que só tenham crescimento exponencialmente, ou seja, elas não têm nenhuma fase lag. Quando o tempo de positividade é dividido pelo tempo estimado por divisão (como derivado na Figura 14), o resultado é o número de divisões para a positividade. Isto é representado no eixo dos y. Este gráfico mostra a relação entre o número de divisões para positividade e a concentração inicial de bactérias. Isto permite que a concentração inicial de bactérias a ser estimada utilizando os valores gerados a partir da função de gompertz.
[0082] Usando a invenção, qualquer variação da norma num fluido pode ser detectada, incluindo uma mudança de cor devido às partículas coloidais suspensas ou reacção química. Uma mudança de distância a partir de transparência para a extremidade vermelha do espectro fará com que a absorção de luz vermelha mais, de modo a mudar os parâmetros de detecção. O mesmo vale para a extremidade azul do espectro, mas, os parâmetros de detecção irão ser alterados de forma diferente, permitindo a diferenciação e detecção. Adição de diferentes laseres de cor aumenta a esta capacidade.
[0083] Um técnico versado no assunto irá apreciar que as variações dos arranjos descritos são possíveis sem se afastar da invenção. Por exemplo, embora a área principal de aplicação descrita acima refere-se a análise de médicos, outras aplicações são possíveis. Por exemplo, como o dispositivo pode detectar qualquer partícula em um líquido não opaco, que poderia ser utilizado para encontrar qualquer partícula em um meio líquido, tal como pó, areia ou cascalho em fluidos, tais como água mineral de alta qualidade. Também poderia ser usado para testar sucos de frutas que está sendo importado, como eles precisam provar que eles não estão levando as bactérias não-endêmicas ou esporos de fungos. Para fazer isso, um limiar de intensidade de dispersão pode ser usado como um branco e qualquer variação deste pode ser registado e gravado como a diferença que tem significado processo. Por conseguinte, a descrição acima de uma concretização específica é feita por meio de exemplo apenas e não para efeitos de limitações. Será evidente para o técnico versado no assunto que pequenas modificações podem ser feitas sem alterações significativas no funcionamento descrito.

Claims (15)

1. Sistema para a medição de uma amostra líquida compreendendo material biológico, caracterizado pelo fato de que compreende: um coletor de luz esférico integrante para coleta de luz e para pelo menos parcialmente conter amostra líquida, o coletor de luz esférico integrante compreendendo uma primeira parte e uma segunda parte, em que uma das primeira e segunda partes compreende uma porta de amostragem configurada para receber um suporte de amostra; um suporte de amostra para conter a amostra líquida dentro de seu volume interno, em que a inserção do suporte de amostra dentro da porta de amostragem é configurada para completar a esfera do coletor e para localizar a amostra líquida em uma posição central dentro do coletor uma fonte de luz para a introdução de luz no coletor de luz esférico integrante; um modulador ou gerador de sinal configurado para gerar uma modulação conhecida da saída de luz pela fonte de luz; um detector para detectar a luz dispersa no coletor de luz esférico integrante, e meios de supressão de feixe não dispersa e/ou uma porta de saída para permitir que a luz não dispersa saia do coletor de luz esférico integrante.
2. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de luz compreende um laser ou LED.
3. Sistema, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a fonte de luz tem um comprimento de onda na faixa de 590 nm a 650 nm.
4. Sistema, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a fonte de luz tem um comprimento de onda na faixa de 620 nm a 750 nm.
5. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a modulação de luz conhecida é uma modulação de fase e/ou de frequência.
6. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o suporte de amostras é adaptado para conter uma cuvete de amostra.
7. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o detector é fornecido sobre uma superfície interna do coletor de luz de esfera de integração.
8. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que são fornecidos meios para impedir a luz não dispersa a ser detectada pelo detector.
9. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente meios para analisar a luz modulada detectada para determinar mudanças na dita luz modulada detectada em função do tempo para determinar pelo menos um de: susceptibilidade a fármaco do material biológico; uma mudança em um número de células na amostra; uma mudança no estado celular; uma mudança no material biológico.
10. Sistema, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a mudança no material biológico é uma mudança em um nível ou concentração de um patógeno no material biológico líquido.
11. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o material biológico compreende pelo menos um de: uma espécie ou cepa de bactérias ou fungos; um micróbio.
12. Método para a monitoração de um material biológico numa amostra líquida, caracterizado pelo fato de que o método compreende: introduzir um suporte de amostras contendo a amostra líquida em um coletor de luz esférico integrante, o dito o coletor de luz esférico integrante compreendendo uma primeira parte e uma segunda parte, em que uma das primeira e segunda partes compreende uma porta de amostragem configurada para receber o suporte de amostras, e em que a inserção do suporte de amostra dentro da porta de amostragem completa a esfera do coletor e localiza a amostra líquida em uma posição central dentro do coletor; iluminar a amostra líquida no coletor de luz esférico integrante com luz tendo uma modulação conhecida, de modo que a luz passa através e é dispersa pela amostra; detectar a luz dispersa no coletor de luz esférico integrante; e analisar a luz modulada detectada para determinar alterações na luz modulada detectada em função do tempo para determinar pelo menos um de: susceptibilidade a fármaco do material biológico; uma mudança em um número de células na amostra; uma mudança no estado celular; uma mudança no material biológico.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a mudança no material biológico é uma alteração em um nível ou concentração de um agente patogênico no material biológico líquido.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que compreende monitorar a susceptibilidade a fármaco pela introdução de um fármaco dentro da amostra e pela análise da luz detectada para determinar a susceptibilidade a fármaco.
15. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o material biológico compreende pelo menos um de: uma espécie ou cepa de bactérias ou fungos; um micróbio.
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