CN104655618A - 一种检测体液中碱性磷酸酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测体液中碱性磷酸酶的方法。所述方法以三磷酸腺苷(ATP)作为碱性磷酸酶(ALP)的催化底物，该三磷酸腺苷在碱性磷酸酶的催化下转化为腺苷，由于在有三磷酸腺苷提供能量的情况下，荧光素酶可以催化荧光素发光，并且发光强度和ATP的含量成正比。样品中ALP酶越多，消耗的ATP越多，导致生物发光的改变量越大。因此通过测量该生物发学的发光强度的改变量可计算出碱性磷酸酶的含量。通过本发明的方法能检测到10^-15M的碱性磷酸酶，与传统方法相比，该方法灵敏度高、抗干扰能力强，操作简单，检测仪器携带方便，适合临床诊断的分析方法；除以上优势外，还可以大大缩短检测时间和降低检测成本。

Description

一种检测体液中碱性磷酸酶的方法

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种检测体液中碱性磷酸酶的方法，尤其涉及一种基于生物发光定量检测碱性磷酸酶的方法。

背景技术

碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)，也称碱性磷酸酯酶，是一类可以在碱性条件下催化磷酸酯键水解的酶。常见的碱性磷酸酶包括肠道碱性磷酸酶、非组织特异性碱性磷酸酶和胎盘碱性磷酸酶。通常情况下，干细胞和结肠癌细胞中碱性磷酸酶的活性会显著升高，被当作结肠癌细胞分化程度定性和定量的指标。此外，血清中碱性磷酸酯酶的升高，被称作高碱性磷酸酶血症，被认为和恶性胆管阻塞、原发性胆管硬化、原发性硬化胆管炎、肝淋巴瘤和肝肉瘤等肝胆疾病密切相关。因此快速、灵敏地检测体液中的碱性磷酸酶具有重要的意义。

目前检测体液中的ALP酶主要的方法是基于酶的显色反应，其中对硝基苯磷酸二钠(pNPP)是一种常用的磷酸酶显色底物，在碱性条件下，可在碱性磷酸酶作用下生成对硝基苯酚。对硝基苯酚在碱性条件下，呈黄色产物，可以在400-415nm检测吸光度。产物黄色越深，说明碱性磷酸酶检活性越高，反之则酶活性越低。据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。目前基于该原理已经有相关的商业化试剂盒。但该方法受到多种因素的限制，例如体液中有很多物质会干扰酶和底物之间的反应，造成该试剂盒的使用受到一定的限制。另外罗氏P800全自动生化分析仪及配套生化试剂盒和CL-7300型全自动生化分析仪顺序注射荧光法也用来测定体液中的ALP含量，但这两种方法除价格昂贵，造成分析成本比较高外，仪器较大不易携带，不能满足临床和个性化诊断的需要。

因此开发一种成本低，抗干扰能力强，灵敏度高的适合床边诊断的分析方法和相关的小型化检测设备对体液中的碱性磷酸酶的检测具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测体液中碱性磷酸酶的方法，特别是一种基于生物发光定量检测碱性磷酸酶的方法。本发明的方法具有灵敏度高、抗干扰能力强，检测仪器携带方便，适用范围广，操作简单，适合临床诊断的分析方法；同时还可以大大缩短检测时间和降低检测成本。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种检测体液中碱性磷酸酶的方法，该方法采用生物发光法对体液样本中的碱性磷酸酶含量进行检测。

本发明的检测体液中碱性磷酸酶的方法是以三磷酸腺苷作为碱性磷酸酶的底物进行催化反应，根据反应得到的生物发光值的改变量计算碱性磷酸酶的含量。

本发明通过以三磷酸腺苷(ATP)作为碱性磷酸酶的底物，由于碱性磷酸酶可以高效地催化三磷酸腺苷转化为腺苷，从而抑制了基于三磷酸腺苷的生物发光反应，因此碱性磷酸酶的含量越高，其消耗的三磷酸腺苷就越多，生物发光的改变量就越大，从而得出生物发光的改变量和碱性磷酸酶的含量成正相关，进而计算得出样本中碱性磷酸酶的含量。

本发明中，所述三磷酸腺苷的浓度为1nM-100μM，优选为50μM。

本发明中，所述的检测体液中碱性磷酸酶的方法包括以下步骤：

(1)将三磷酸腺苷与碱性磷酸酶混合，震荡反应15-30min；

(2)向步骤(1)的混合液中加入生物发光试剂，用三磷酸腺苷检测仪测量生物发光值，根据所述的生物发光值的改变量计算碱性磷酸酶的含量。

本发明的步骤(1)中，所述碱性磷酸酶将三磷酸腺苷催化降解为腺苷。

本发明的步骤(2)中，所述生物发光试剂包括荧光素和荧光素酶及相关的Mg²⁺和缓冲溶液。

本发明中的生物发光试剂为现有市售产品，不作特别限定。

优选地，步骤(2)的混合液中，在三磷酸腺苷提供能量的情况下，荧光素酶催化荧光素发光，并且发光强度和ATP的含量成正比。

本发明中，步骤(1)所述震荡反应的温度为20-37℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、37℃。

本发明中，所述方法包括在步骤(1)之前，进行碱性磷酸酶的富集。

优选地，所述富集为利用免疫磁珠进行富集。

本发明采用免疫磁珠富集碱性磷酸酶，可以从复杂的样品中将碱性磷酸酶提取出来，特异性地捕获到碱性磷酸酶，避免样品中的基质干扰，提高了检测的灵敏度和准确性。

本发明中，所述免疫磁珠为超顺纳米磁珠；优选为粒径在100-2200nm的超顺纳米磁珠，例如可以是100nm、200nm、300nm、500nm、600nm、800nm、1000nm、1200nm、1500nm、1600nm、1800nm、2000nm、2200nm。

优选地，所述免疫磁珠为具有70-90emu/g的比饱和磁化强度的免疫磁珠，例如比饱和磁化强度可以是70emu/g、72emu/g、75emu/g、78emu/g、80emu/g、82emu/g、85emu/g、88emu/g或90emu/g。

作为优选的技术方案，本发明所述的检测体液中碱性磷酸酶的方法包括以下步骤：

(1)采用比饱和磁化强度为70-90emu/g，粒径在100-2200的超顺纳米磁珠，通过共价偶联的方式将识别碱性磷酸酶的抗体偶联在超顺纳米磁珠的表面，制备成超顺纳米免疫磁珠；

(2)将步骤(1)得到的免疫磁珠探针置于待测分析液中，形成抗原-抗体免疫磁珠复合物；

(3)将步骤(2)得到的复合物在室温下涡流震荡反应20min，然后进行磁分离，从而实现碱性磷酸酶的富集，得到免疫磁珠-碱性磷酸酶复合物；

(4)向步骤(3)得到的免疫磁珠-碱性磷酸酶复合物中加入三磷酸腺苷溶液中，20-37℃震荡反应15-30min；

(5)向步骤(4)的混合液中加入生物发光试剂，用三磷酸腺苷检测仪测量生物发光值，根据所述的生物发光值的改变量计算碱性磷酸酶的含量。

图1示出了本发明检测体液中碱性磷酸酶的原理，该检测原理具体如下：

本发明以三磷酸腺苷(ATP)作为碱性磷酸酶的底物，由于碱性磷酸酶可以高效地催化三磷酸腺苷转化为腺苷，从而抑制了“三磷酸腺苷-荧光素-荧光素酶”生物发光反应(在三磷酸腺苷提供能量的条件下，荧光素酶可以催化荧光素转化成氧化型荧光素，在此过程中会发生生物发光反应，而生物发光值的改变量与ATP的含量成一定的线性关系)，因此碱性磷酸酶的含量越高，其消耗的三磷酸腺苷就越多，生物发光值的改变量就越大，从而得出生物发光值的改变量和碱性磷酸酶的含量成正相关，进而计算得出样本中碱性磷酸酶的含量；另外，本发明通过免疫磁珠的富集，可以将碱性磷酸酶从复杂的样品中特异性地捕获并富集，有效去除了非特异性吸附的杂质和其他干扰，提高了检测的灵敏度和准确性。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

(1)本发明的方法能检测到10^-15M的碱性磷酸酶，与传统方法相比，具有抗干扰能力强、灵敏度高、简便、检测快速等优点；

(2)本发明的方法可以借助于市场上便携式的三磷酸腺苷检测仪进行检测，大大降低了成本，并且操作更简单，适用范围更广；

(3)本发明的方法可用于临床样品中的碱性磷酸酶快速、灵敏地检测，而且可以大大降低检测费用和检测成本。

附图说明

图1是本发明检测体液中碱性磷酸酶的原理图。

图2是本发明的碱性磷酸酶浓度与生物发光强度改变量的关系图。

图3是本发明中三磷酸腺苷浓度和生物发光值之间的线性关系图。

图4是本发明的碱性磷酸酶含量与生物发光强度的改变量之间的关系图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明采用基于商业化的ATP便携式的检测仪器，通过在其系统中嵌入相关的软件，并输入相关的信号转换公式(生物发光值和待检物浓度之间的关系)，直接可以从改进的ATP检测仪上读出目标物含量的数据，为即时诊断和方便操作提供了条件。

实施例中所用的试剂仪器设备来源：

(1)便携式的ATP检测仪购自西安天隆科技有限公司；

(2)磁分离架：上海奥润微纳新材料科技有限公司；

(3)大粒径的超顺纳米磁珠(100-2200nm)由德国默克公司提供；

(4)识别碱性磷酸酶的抗体购自Abcam公司；

(5)生物发光试剂(荧光素、荧光素酶、相关的Mg²⁺和相关的缓冲溶液)购自Sigma公司。

实施例1

利用生物发光法对血清中的碱性磷酸酶含量进行检测

(1)用纯水将正常人的血清稀释10倍，然后分别往血清中添加一系列不同浓度的碱性磷酸酶，使得其最终的浓度分别为7.5×10^-2，3.75×10^-2，7.5×10^-3，3.75×10^-3，7.5×10^-4，3.75×10^-4，7.5×10^-5，3.75×10^-5，7.5×10^-6，3.75×10⁷和1.85×10^-7。

(2)取1000μL血清样品，向其加入100μL的三磷酸腺苷溶液重悬，在37℃反应30min；再加入50μL的生物发光试剂(荧光素和荧光素酶)，用便携式的ATP检测仪测量生物发光值。

以碱性磷酸酶的浓度为横坐标，生物发光强度的变化值为纵坐标，构建标准曲线，血清中未知的碱性磷酸酶的含量可以通过标准曲线实现检测，通过图2可以看出，该生物发光法可以实现对碱性磷酸酶含量的定量检测。

实施例2

三磷酸腺苷浓度和生物发光值之间的线性关系

将三磷酸腺苷溶液用Tris-HCl分别稀释成浓度为0、0.01、0.1、0.5、1、10、20、50和100μM，分别取不同浓度三磷酸腺苷各50μL，然后加入含有荧光素酶与荧光素的生物发光试剂50μL，混合均匀后迅速使用便携式ATP检测仪测定生物发光值。根据发光值和ATP浓度之间的关系构建标准曲线。三磷酸腺苷浓度和生物发光值之间的线性关系如图3所示，从图3可以看出，随着ATP浓度的提高，生物发光值变大，具有良好的线性关系。

实施例3

碱性磷酸酶的含量和生物发光值改变量之间的关系

将碱性磷酸酶用水稀释成浓度为0,1.5×10^-5，3×10^-5，1.5×10^-4，3×10^-4和1.5×10^-3U/mL，然后各取100μL碱性磷酸酶稀释液，随后加入50μL浓度为50μM的ATP溶液混合均匀，在37℃恒温箱中反应45min，最后加入50μL生物发光试剂混匀，通过便携式ATP检测仪对生物发光值进行检测。从图4可以看出，该方法可以检测到1.5×10^-5U/mL的碱性磷酸酶。

实施例4

利用免疫磁富集-生物发光法对血清中的碱性磷酸酶含量进行检测

(1)免疫磁珠的制备：将500μL 10mg/mL的纳米磁珠先悬浮于去离子水中，然后加入40μL浓度为10mg/mL的EDC溶液和80μL10mg/mL的NHS溶液，在室温下震荡活化反应半小时，然后磁分离，去掉上清液，加入2mL的PBS缓冲溶液(pH＝7.4，0.01M)悬浮。加入0.2mg抗体到上述的悬浮溶液中，在涡流震荡器上反应2h，然后加入2mL 3％的BSA溶液封闭，反应0.5h，然后磁分离，去掉上清，加入1000μL的PBST溶液，重悬，在涡流震荡器反应2-3min,再磁分离，去掉上清液。该步骤重复2次，最后用包含有0.01％BSA的PBS溶液重悬，得到免疫磁珠，并在4度冰箱保存。

(2)用纯水将正常人的血清稀释10倍，然后分别往血清中添加一系列不同浓度的ALP，使得其最终的浓度分别为7.5×10^-2，3.75×10^-2，7.5×10^-3，3.75×10^-3，7.5×10^-4，3.75×10^-4，7.5×10^-5，3.75×10^-5，7.5×10^-6，3.75×10⁷和1.85×10^-7。然后用100μL步骤(1)的免疫磁珠(1mg/mL)和1000μL血清样品混合反应20min，然后磁分离，用PBST缓冲溶液洗涤3次，然后加入100μL的ATP溶液重悬，在37度反应30min,最后加入50μL的生物发光试剂(荧光素和荧光素酶)，用便携式的ATP检测仪测量生物发光值，经检测，该方法可以检测到1.5×10^-5U/mL的碱性磷酸酶。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种检测体液中碱性磷酸酶的方法，其特征在于，采用生物发光法对体液样本中的碱性磷酸酶含量进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是以三磷酸腺苷作为碱性磷酸酶的底物进行催化反应，根据反应得到的生物发光值的改变量计算碱性磷酸酶的含量；

优选地，所述三磷酸腺苷的浓度为1nM-100μM，优选为50μM。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将三磷酸腺苷与碱性磷酸酶混合，震荡反应15-30min；

(2)向步骤(1)的混合液中加入生物发光试剂，用三磷酸腺苷检测仪测量生物发光值，根据所述的生物发光值的改变量计算碱性磷酸酶的含量。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述碱性磷酸酶将三磷酸腺苷催化降解为腺苷；

优选地，步骤(2)中，所述生物发光试剂包括荧光素和荧光素酶及相关的Mg²⁺和缓冲溶液；

优选地，步骤(2)的混合液中，在三磷酸腺苷提供能量的情况下，荧光素酶催化荧光素发光，并且发光强度和ATP的含量成正比。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述震荡反应的温度为20-37℃。

6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括在步骤(1)之前，进行碱性磷酸酶的富集；

优选地，所述富集为利用免疫磁珠进行富集。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠为超顺纳米磁珠；优选为粒径在100-2200nm的超顺纳米磁珠；

优选地，所述免疫磁珠为具有70-90emu/g的比饱和磁化强度的免疫磁珠。

8.根据权利要求3-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)采用比饱和磁化强度为70-90emu/g，粒径在100-2200nm的超顺纳米磁珠，通过共价偶联的方式将识别碱性磷酸酶的抗体偶联在超顺纳米磁珠的表面，制备成超顺纳米免疫磁珠；

(2)将步骤(1)得到的免疫磁珠置于待测分析液中，形成抗原-抗体免疫磁珠复合物；

(3)将步骤(2)得到的复合物在室温下涡流震荡反应20min，然后进行磁分离，从而实现碱性磷酸酶的富集，得到免疫磁珠-碱性磷酸酶复合物；

(4)向步骤(3)得到的免疫磁珠-碱性磷酸酶复合物中加入三磷酸腺苷溶液中，20-37℃震荡反应15-30min；

(5)向步骤(4)的混合液中加入生物发光试剂，用三磷酸腺苷检测仪测量生物发光值，根据所述的生物发光值的改变量计算碱性磷酸酶的含量。