CN103529017A - 一种酶响应性自聚集发光分子及其在监测酶活性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶响应性自聚集发光分子及其在监测酶活性中的应用,该酶响应性自聚集发光分子由水解酶的作用底物分子连接聚集诱导发光分子构成,其在水解酶的作用下水解后会聚集诱导发光,将其掺入活细胞或者含有相应水解酶的细胞外反应体系中,通过荧光显微技术对荧光信号的监测可以反映水解酶活性水平,本发明尤其可以用于细胞内水解酶活性水平的长时间的时空监测。
Description
技术领域
本发明涉及酶活性监测技术领域,尤其涉及一种酶响应性自聚集发光分子及其在监测酶活性中的应用。
背景技术
任何一个细胞都由动态的脂质体、蛋白质、核酸和糖类等结构功能精确可调、且结构有序的大分子和小分子构成。它们的复杂性和多样性远远超出了我们现有的认知范围。但是众所周知,细胞的状态直接反映着生物体的状态,因此人类必须要想尽各种各样的办法来认识和了解无处不在的生物体,包括我们人类自己。认识了解细胞内分子间或分子组装体间的相互作用是我们认知细胞的一种方法,这不仅有利于我们了解生命现象,同时也有利于我们更好的诊断和纠正自己。配合着快速发展的计算机模拟技术,之前的报道借助体外模型展示了多肽聚集体、纳米胶和响应型水凝胶,对我们认识和理解活细胞内的组装过程提供了非常有价值的信息。尽管如此,以上的信息,仍无法清晰地展示给我们细胞内相互作用过程。
最近,借助酶响应水凝胶,高远等人建立了一个最小的模型来研究细胞内的组装。将发色团连至水凝胶前驱体后,实现了水凝胶细胞内组装时空分布的可视化。尽管这一工作揭示了小分子在活细胞中组装的可能性,但是它仍无法帮助我们直接地认识生物化学过程,例如细胞内反应的时空可视。
细胞中很多多肽或蛋白的反应过程在生命演绎中扮演着至关重要的角色。例如近乎三分之一的细胞多肽功能都是被磷酸化和去磷酸化调节。传统的经典生物化学方法只能简单的揭示整体的细胞内磷酸化活性水平,但是无法给出磷酸蛋白活性的细节数据,更无法给出细胞内磷酸蛋白活性的任何时空信息。实际上,细胞内的多肽或蛋白酶多种多样,至今我们还没有也无法认知任何一种细胞内的酶活性水平的时空分布。
荧光显微技术或许是最适合研究细胞内分子过程的时空动力学的方法。借助传统的荧光分子和荧光显微技术,我们成功观察到很多有趣的细胞现象。但是要实现细胞内生化过程的时空观察,传统荧光分子却显示了其弊端—聚集诱导发光淬灭和光淬灭现象。例如在借助绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)融合蛋白方法全面观察酿酒酵母中蛋白位置的过程中,常会出现蛋白的错误定位,原因就是在于大的GFP端(27kD)的存在。但由于这是发光分子固有的属性,人们不得不付出很多的努力去找到上述问题的解决办法。
2001年,唐本忠教授等报道了(Chem.Commun.2001,1740)一种与聚集诱导荧光淬灭(Aggregation caused quenching,ACQ)完全不同的光物理现象—聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)效应:一类具有螺旋桨状的分子在溶液状态下不发射荧光,而在聚集态下材料的荧光强度增强,而且聚集程度越高荧光越强。随后,很多聚集诱导发光分子及其合成技术被报道公开。聚集诱导发光分子的出现为生物成像带来了曙光。这类分子的发光是源于单个的无辐射发色团的聚集所导致的结构受限。发光强度与聚集的程度相关,相同的条件下,聚集越严重发光越强。与传统的聚集诱导淬灭分子比较,具有诱导发光分子展现了多个优点,包括高的发光效率、大的stokes位移以及抗淬灭。最重要的是,由于它们小分子的结构,使它们能够自由扩散进入细胞,而且很容易根据需要进行裁剪。因此它们是一类新颖适合于细胞时空分布观察的发光分子。
合成具有生物相容性和靶向酶响应性的聚集诱导发光分子,这类分子可分散于溶液中,并自由扩散进入细胞,这些不发光的分子在到达酶响应位点后发生反应,并诱导分子的聚集和结构的受限和荧光的发出。细胞内的酶反应过程多是可逆的,因此相应位点的酶活性水平直接影响分子的聚集,而细胞内的荧光强度直接反映出相应位点的酶活性水平。这种可同时应用于单细胞位点和酶反应过程时空监控的技术方法目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶响应性自聚集发光分子及其在监测酶活性中的应用,这种酶响应性自聚集发光分子在水解酶的作用下水解后会聚集诱导发光,避免了传统发光分子的聚集诱导发光淬灭和光淬灭现象,适合水解酶活性水平的长时间时空监测;而且其生物相容性强,可以自由扩散进入细胞,实现细胞内水解酶活性水平的时空监测。
本发明的技术方案包括以下内容:
在第一方面,本发明提供一种酶响应性自聚集发光分子,其由水解酶的作用底物分子连接聚集诱导发光分子构成。
水解酶是催化水解反应的一类酶的总称,也可以说它们是一类特殊的转移酶,用水作为被转移基团的受体。本发明对细胞内的各种蛋白酶或多肽酶及其它影响生命过程的水解酶类普遍适用。水解酶的典型但非限定性的实例包括磷酸酶、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶或泛素羧基末端水解酶等,其中磷酸酶可以包括酸性磷酸酶和碱性磷酸酶;本发明优选磷酸酶,更优选碱性磷酸酶。
在本发明的具体实施例中,示出了碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、酪氨酸蛋白磷酸酶1B(Protein Tyrosine Phosphatase1B,PTP1B)和蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase2A,PP2A)的例子。
本发明对底物分子不作特别限定,与特定的水解酶对应的底物分子可以是多肽、蛋白、寡糖或核苷酸等。多肽和蛋白质可以是任意具有水解酶响应位点和特定氨基酸序列的修饰或未修饰的形式,可以是天然的或者人工合成的。本发明的多肽类底物分子是对多个氨基酸经过氨基羧基的缩合而成的产物,分子量一般认为在4000以下,主要由碳、氢与氧三种元素所组成,另含有少数硫、磷和硒等元素,广布自然界。寡糖,又称低聚糖,一般是指含有2-10个糖苷键聚合而成的化合物,按照糖苷键的类型可以是N-糖苷键或O-糖苷键型。作为底物分子,本发明优选多肽,并且特别优选YpYY肽序列,其中Y代表酪氨酸、p代表磷酸基团。
在本发明的具体实施例中,示出了多肽类型的底物分子:YpYY、DADEpYL和TPE-RRREEEpTEEEAA,其中p代表磷酸基团,其它字母代表通常意义上的氨基酸单字母表示法对应的氨基酸。这些序列均具有磷酸基团,当该磷酸基团在水解酶的作用下水解失去时,酶响应性自聚集发光分子会聚集诱导发光。
聚集诱导发光分子是指在分离情况下不发光,而在聚集状态下诱导发出荧光现象的分子,目前已经由很多类型的这类分子报道,比如中国发明专利申请公布号CN102153748A、CN102279270A、CN102250015A、CN102313726A、CN102702096A、CN103194213A、CN103194215A和CN102219723A均公开了相应的聚集诱导发光分子,理论上说这些类型的聚集诱导发光分子都能应用于本发明。虽然如此,本发明特别优选的聚集诱导发光分子是四苯基乙烯(Tetraphenylethylene,TPE)及其衍生物或噻咯(silole)类,最优选的是TPE。
任何能够将底物分子与聚集诱导发光分子连接而形成酶响应性自聚集发光分子的方法均可适用本发明,只要能够实现本发明的目的即可。虽然如此,本发明的酶响应性自聚集发光分子是由水解酶的作用底物分子与聚集诱导发光分子通过酰胺反应或点击(Click)反应生成的。点击反应是指,通过小的基本单元(如氨基酸或单糖等)的不断拼接,快速可靠地完成形形色色分子(如蛋白质或多糖等)的化学合成,是一类速度快、产率高的化学反应类型,典型的有:环加成反应、亲核开环反应、非醇醛的羰基化学以及碳碳多键的加成反应等,目前广泛应用于光电功能分子材料中。通过酰胺反应或点击反应将多肽与聚集诱导发光分子连接,同时实现了发光分子生物相容性的提高、特异性酶响应性和酶活性荧光标记三种功能。本发明提供的酶响应性自聚集发光分子在特定水解酶的作用下水解,继而发生聚集,从而诱导发光,通过荧光显微技术对荧光信号的监测来反映水解酶活性水平。
在第二方面,本发明提供一种监测酶活性水平的方法,所述方法为:将上述酶响应性自聚集发光分子掺入活细胞或者含有相应水解酶的细胞外反应体系中,通过荧光显微技术对荧光信号的监测来反映水解酶活性水平。
本发明提供的酶响应性自聚集发光分子的生物相容性优异,可以很容易地进入细胞中,在酶反应活性位点被水解而聚集发出荧光,从而能够通过荧光显微技术对荧光信号的监测来反映水解酶活性水平在时间和空间两个维度上的分布情况。
因此本发明的一个特别方案是:将所述的酶响应性自聚集发光分子掺入活细胞中,通过荧光显微技术对荧光信号的监测来反映细胞内水解酶活性水平的时空分布,即细胞内水解酶活性水平随时间的变化和水解酶在细胞内的空间分布。
荧光显微技术是目前非常成熟的研究蛋白质、核酸等生物大分子的定性和定位的工具,借助于荧光显微镜进行荧光成像而实现。
在本发明的具体实施例中,研究了特定酶响应性自聚集发光分子在大鼠原代成骨细胞、人Hela细胞和MCF-7(Michigan Cancer Foundation-7)细胞中实现酶活性时空分布情况的监测。可以推论本发明提供的监测酶活性水平的方法可以广泛应用于各种细胞内水解酶活性的监测,而不局限于这几种。
细胞外反应体系是一种比较成熟的研究系统,它通过对细胞内生化反应的模拟,实现细胞外合成生物大分子(比如多肽)等等多种生化过程的研究。本发明毫无疑问也可以适用于细胞外反应体系,因为在适合的细胞外反应体系中酶的活性并不丧失,而且可以精确调控,聚集诱导发光显现依然存在。
各种酶均有相应的抑制剂,如果使用特定的抑制剂处理这种酶能够显著抑制酶的活性,水解酶也不例外。已经论述水解酶的活性水平可以通过上述酶响应性自聚集发光分子进行监测,因此本发明也可以用于研究特定抑制剂对水解酶的抑制作用。
因此,本发明特别提供一个技术方案是:在掺入所述的酶响应性自聚集发光分子之前或者之后,向活细胞或者含有相应水解酶的细胞外反应体系中掺入相应水解酶的抑制剂,通过荧光显微技术对荧光信号的监测来反映抑制剂对相应水解酶的活性抑制。
本发明中,所述抑制剂可以针对相应水解酶的药物分子。这样就可以应用于药物筛选中。例如,在筛选酪氨酸磷酸酶抑制剂时,将磷酸酶与待筛选分子先行共同孵育足够长的时间,然后再加入修饰了自聚集荧光基团的底物,抑制能力强的分子能够显著降低磷酸酶的水解活性,无抑制能力的分子则不会对原磷酸酶活性造成影响,因此,我们可以通过水解反应之后产物分子的聚集产生的荧光信号的强弱来判断抑制剂的作用效果。
在第三方面,本发明提供所述的酶响应性自聚集发光分子在监测水解酶活性中的应用。
本发明中,所述的酶响应性自聚集发光分子结合荧光显微技术对荧光信号的监测来反映水解酶活性水平。
作为优选方案,本发明通过活细胞成像实现细胞内水解酶活性水平的时空监测。
作为优选方案,本发明在活细胞或者含有相应水解酶的细胞外反应体系中进行药物筛选。
本发明的有益效果为:
本发明通过将水解酶的作用底物分子与聚集诱导发光分子连接生成酶响应性自聚集发光分子,其在水解酶的作用下水解后,生成的产物分子水溶性降低,在自聚集发光荧光基团的作用下组装成一定的纳米结构,并可以被激发出一定波长的荧光以用来成像,因此便将酶促反应与荧光的有无和强弱联系起来,结合荧光显微技术,可以很方便的对活细胞内这种生化酶促反应过程进行实时监控。因此,本发明避免了传统发光分子的聚集诱导发光淬灭和光淬灭现象,适合水解酶活性水平的长时间时空监测;而且其生物相容性强,可以自由扩散进入细胞,实现细胞内水解酶活性水平的时空监测,可应用于药物筛选领域。
附图说明
图1显示酶响应性自聚集发光分子四苯基乙烯-三酪氨酸磷酸(TPE-YpYY)应用于大鼠原代成骨细胞碱性磷酸酶活性标记和时空监测示意图,其中a显示TPE-YpYY及其去磷酸化形式的化学结构式,b显示TPE-YpYY去磷酸化后发生聚集诱导发光。
图2显示TPE-YpYY离子阱质谱(a)、TPE-YYY离子阱质谱(b);TPE-YpYY高效液相色谱(d)、TPE-YYY高效液相色谱(e);和TPE-YpYY在体外经碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)处理前后的高效液相色谱(f)、荧光光谱以及荧光光学照片(c)。
图3显示TPE-YpYY的噻唑蓝法测定大鼠原代成骨细胞的细胞活力测试结果图(A);经钒酸纳处理前后碱性磷酸酶对TPE-YpYY作用前后的荧光光谱(B);说明合成TPE-YpYY具有良好的生物相容性,并能根据荧光的强度说明抑制剂对磷酸酶的抑制作用。
图4显示钒酸钠原位抑制实验的共聚焦显微照片,包括:经20μM/mLTPE-YpYY处理1小时后的大鼠成骨细胞(T);未经任何处理的对比组(C);经20μM/mL TPE-YpYY处理1小时后,换培养基为100μM钒酸钠作用半小时后的成骨细胞(T-V);100μM的钒酸钠处理半小时后,再20μM/mL TPE-YpYY作用1小时后的成骨细胞(V-T);BF表示普通明场照片,FL表示荧光场照片。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解,以下实施例仅为本发明的优选实施例,以便于更好地理解本发明,因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换或改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所用的实验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂厂商购买得到的。本发明中所使用的激光共聚焦显微镜(Nikon Ti Eclipse,日本)为普通型号,附带可以保持恒温恒湿的载物台,非常适合进行活细胞的观察,本仪器具有高普适性,易于操作。
实施例1
首先,本实施例描述自聚集发光分子四苯基乙烯羧酸衍生物的合成,路线如下:
(I)I,I,2-triphenyl-2-Gv-methoxyphenyl)ethene的制备:3.68g,20mmol二苯甲酮加入到洁净的三颈圆底烧瓶中,然后加入19.3g、100mmol锌粉。烧瓶被抽真空,并充入干燥氮气,如此反复三次。之后,向烧瓶内注入200mL无水四氢呋喃,0℃滴加6.8mL、60mmol四氯化钛,回流过夜反应后加入10%碳酸钾溶液(13.8g碳酸钾溶于125mL水)终止反应。相分层后,用盐水洗有机相两次并于无水硫酸镁上干燥,而后过滤并浓缩。所得粗产品经硅胶柱纯化,由石油醚和乙醚(20:1,v/v)洗脱得白色固体,产率为42%。离子阱质谱分析得目标产物分子量为362.3(M-),与预计的362.5相符合。
(2)Methyl2-[4-(1,2,2-triphenyl-1-ethenyl)-phenyloxy]acetate的制备:3.63g、10mmol上一步的产品加入双颈圆底烧瓶中,溶于干燥100mL二氯甲烷。然后烧瓶冷却到-20℃,缓慢加入2mL三溴化硼,恢复至室温并静置4h。将烧瓶中的混液混入饱和碳酸钠溶液,相分离后用无水硫酸镁干燥有机相,浓缩后得粗产品。粗产品可用硅胶柱进一步精制,由石油醚和乙醚(10:1,v/v)洗脱。产品收率为82%。
(3)2-[4-(1,2,2-triphenyl-1-ethenyl)-phenyloxy]acetic acid的制备:2.00g、4.6mmol上一步产品溶于150mL四氢呋喃/水(7:1,v/v),然后缓慢加入1.2g、50mmol氢氧化锂,搅拌过夜。旋蒸去除四氢呋喃,用30mL二氯甲烷萃取3次。水相层由饱和氯化铵中和,并用40mL乙醚萃取3次,之后无水硫酸钠除水,浓缩得到四苯基乙烯((tetraphenylethenes,TPE)羧酸衍生物成品,收率为81%。
其次,本实施例通过包括如下步骤的对大鼠原代成骨细胞内的碱性磷酸酶活性进行活细胞成像。
(1)合成底物序列为:TPE-YpYY。所用带保护的氨基酸以及所用催化剂N,N-二异丙基乙胺(N,N-Diisopropylethylamine,DIEA)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium3-oxidhexafluorophosphate,HATU)、4-(二甲氨基)吡啶(4-(Dimethylamino)pyridine,DMAP)、N,N′-二环己基碳二亚胺(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide,DCC)和六氢吡啶(perpyridine)均由Novabiochem购入,合成用Acid Clear树脂由PeptideInternational购入,N,N-二甲基甲酰胺(Dimethylformamide,DMF)和二氯甲烷(Dichloromethane,DCM)由Fisher购入。首先,树脂被DMF溶胀10-60分钟。与此同时,将100mg-1000mg第一个酪氨酸溶于无水DCM中,然后加入10mg-250mg DCC,冰浴搅拌1-30分钟至产生白色沉淀。将多余DCM通过旋转蒸发仪蒸出,并用1-10mL DMF溶解,加入溶胀后的树脂中反应10-60min。之后用DMF和DCM洗净树脂,将20%六氢吡啶DMF溶液加入树脂进行脱保护,洗干净后方可进行下一个氨基酸的合成,将下一个氨基酸和50-500μL DIEA以及50-500mg HATU溶于DMF,加入上一步中的树脂反应10-60分钟,然后洗净,脱保护,再洗净,再上下一个氨基酸,如此反复直至所有序列包括自聚集发光荧光分子在内全部合成完毕。
(2)合成完毕后,用95%TFA溶液将所得底物分子从树脂上切离,收集TFA溶液并用乙醚将多肽沉淀,5000-10000rpm离心10min收集沉淀并干燥,得粗品。然后,粗品被50%乙腈溶解,进行高效液相色谱分离确定合成纯度和洗脱时间(图2d、e),用离子阱质谱确定得到底物分子质量(图2a、b),然后用制备型高效液相色谱得到底物分子的纯品,最后冻干,分装并冻存于-80℃。在体外经过碱性磷酸酶在37℃处理30min之后的荧光谱图以及液相图(图2c、f),说明合成的分子可以作为或细胞内碱性磷酸酶成像的底物探针。
(3)所得底物分子用噻唑蓝法测定了大鼠原代成骨细胞的细胞活力。将分子TPE-YpYY溶于改良Eagle低糖细胞培养基(Dulbecco's modification of Eagle'smedium,DMEM)配制成1-100μM不同的浓度,配以钒酸钠进行不同的处理,每孔100μL加入于接种96孔板后过夜的大鼠原代成骨细胞,培养24h,然后弃去培养基并每孔100μL加入含有0.5mg/mL噻唑蓝的无血清DMEM培养基37度处理4小时,之后弃去培养基,每孔加入100μL DMSO溶解生成的紫色甲瓒,最后与酶标仪读取570nm处的紫外吸收,对比对照组的吸光度,计算出每种处理对应的细胞活力(图3A,左)。,通过以上细胞活力测试,得到了确定的可以在细胞上使用的底物浓度20μM和钒酸钠浓度100μM,并在溶液体系中通过测定330nm激发的碱性磷酸酶水解产物分子TPE-YYY荧光强度验证了自聚集发光底物分子TPE-YpYY可以反映碱性磷酸酶的水解活性的强弱(图3B,右)。经过如图4中的不同处理,说明该底物分子具有进行活细胞内碱性磷酸酶实时动态成像的能力。TPE-YpYY在活细胞当中可以反应出碱性磷酸酶的空间分布,并能通过荧光反映出细胞内碱性磷酸酶的活性和抑制剂的影响。
实施例2
首先,用与实施例1相同的方法和过程合成TPE。
其次,本实施例通过包括如下步骤的对人Hela细胞内的酪氨酸蛋白磷酸酶1B(Protein Tyrosine Phosphatase1B,PTP1B)活性进行活细胞成像。
(1)合成底物序列为:TPE-TPE-DADEpYL。所用带保护的氨基酸以及所用催化剂DIEA、HATU、DMAP、DCC和六氢吡啶均由Novabiochem购入,合成用Acid Clear树脂由Peptide International购入,DMF和DCM由Fisher购入。首先,树脂被DMF溶胀10-60分钟。与此同时,将100mg-1000mg第一个亮氨酸溶于无水DCM中,然后加入10mg-250mg DCC,冰浴搅拌1-30分钟至产生白色沉淀。将多余DCM通过旋转蒸发仪蒸出,并用1-10mL DMF溶解,加入溶胀后的树脂中反应10-60min。之后用DMF和DCM洗净树脂,将20%六氢吡啶DMF溶液加入树脂进行脱保护,洗干净后方可进行下一个氨基酸的合成,将下一个氨基酸和50-500μL DIEA以及50-500mg HATU溶于DMF,加入上一步中的树脂反应10-60分钟,然后洗净,脱保护,再洗净,再上下一个氨基酸,如此反复直至所有序列包括自聚集发光荧光分子在内全部合成完毕。
(2)合成完毕后,用95%TFA溶液将所得底物分子从树脂上切离,收集TFA溶液并用乙醚将多肽沉淀,5000-10000rpm离心10min收集沉淀并干燥,得粗品。然后,粗品被50%乙腈溶解,进行高效液相色谱分离确定合成纯度和洗脱时间,用离子阱质谱确定得到底物分子质量,然后用制备型高效液相色谱得到底物分子的纯品,最后冻干,分装并冻存于-80℃。在体外经过碱性磷酸酶在37℃处理30min之后的荧光谱图以及液相图,都说明合成的分子可以作为或细胞内碱性磷酸酶成像的底物探针。
(3)所得底物分子溶于细胞培养基DMEM低糖配制成1-100μM不同的浓度,与接种后过夜的Hela细胞培养24小时,配以苏拉明钠进行不同的处理,得到了确定的可以在细胞上使用的底物浓度10μM和苏拉明钠浓度250μM。经过类似如图4中的不同处理,所得结果类似。说明该底物分子具有进行活细胞内酪氨酸蛋白磷酸酶实时动态成像的能力。
实施例3
首先,用与实施例1相同的方法和过程合成TPE。
其次,本实施例通过包括如下步骤的对MCF-7细胞内的蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase2A,PP2A)活性进行活细胞成像。
(1)合成底物序列为:TPE-RRREEEpTEEEAA。所用带保护的氨基酸以及所用催化剂DIEA、HATU、DMAP、DCC和六氢吡啶均由Novabiochem购入,合成用Acid Clear树脂由Peptide International购入,DMF和DCM由Fisher购入。首先,树脂被DMF溶胀10-60分钟。与此同时,将100mg-1000mg第一个丙氨酸溶于无水DCM中,然后加入10mg-250mg DCC,冰浴搅拌1-30分钟至产生白色沉淀。将多余DCM通过旋转蒸发仪蒸出,并用1-10mL DMF溶解,加入溶胀后的树脂中反应10-60min。之后用DMF和DCM洗净树脂,将20%六氢吡啶DMF溶液加入树脂进行脱保护,洗干净后方可进行下一个氨基酸的合成,将下一个氨基酸和50-500μL DIEA以及50-500mg HATU溶于DMF,加入上一步中的树脂反应10-60分钟,然后洗净,脱保护,再洗净,再上下一个氨基酸,如此反复直至所有序列包括自聚集发光荧光分子在内全部合成完毕。
(2)合成完毕后,用95%TFA溶液将所得底物分子从树脂上切离,收集TFA溶液并用乙醚将多肽沉淀,5000-10000rpm离心10min收集沉淀并干燥,得粗品。然后,粗品被50%乙腈溶解,进行高效液相色谱分离确定合成纯度和洗脱时间,用离子阱质谱确定得到底物分子质量,然后用制备型高效液相色谱得到底物分子的纯品,最后冻干,分装并冻存于-80℃。在体外经过碱性磷酸酶在37℃处理30min之后的荧光谱图以及液相图,都说明合成的分子可以作为或细胞内碱性磷酸酶成像的底物探针。
(3)所得底物分子溶于细胞培养基DMEM高糖配制成1-100μM不同的浓度,与接种后过夜的MCF-7细胞培养24小时,配以冈田软海绵酸(okadaic acid,OA)进行不同的处理,得到了确定的可以在细胞上使用的底物浓度13μM和冈田软海绵酸浓度20nM。经过类似如图4中的不同处理,可以得到相似的结果,说明该底物分子具有进行活细胞内蛋白磷酸酶2A实时动态成像的能力。
以上详细描述了本发明的实施方式,但是本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种酶响应性自聚集发光分子,其特征在于,其由水解酶的作用底物分子连接聚集诱导发光分子构成;
优选地,所述水解酶选自磷酸酶、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶或泛素羧基末端水解酶,优选磷酸酶,更优选碱性磷酸酶;
优选地,所述底物分子选自多肽、蛋白、寡糖或核苷酸,优选多肽,更优选YpYY肽序列,其中Y代表酪氨酸、p代表磷酸基团;
优选地,所述聚集诱导发光分子选自四苯基乙烯及其衍生物或噻咯类,优选四苯基乙烯。
2.根据权利要求1所述的酶响应性自聚集发光分子,其特征在于,所述酶响应性自聚集发光分子是由水解酶的作用底物分子与聚集诱导发光分子通过酰胺反应或点击反应生成的。
3.一种监测酶活性水平的方法,其特征在于,所述方法为:将权利要求1或2所述的酶响应性自聚集发光分子掺入活细胞或者含有相应水解酶的细胞外反应体系中,通过荧光显微技术对荧光信号的监测来反映水解酶活性水平。
4.根据权利要求3所述的监测酶活性水平的方法,其特征在于,将所述的酶响应性自聚集发光分子掺入活细胞中,通过荧光显微技术对荧光信号的监测来反映细胞内水解酶活性水平的时空分布,即细胞内水解酶活性水平随时间的变化和水解酶在细胞内的空间分布。
5.根据权利要求3或4所述的监测酶活性水平的方法,其特征在于,在掺入所述的酶响应性自聚集发光分子之前或者之后,向活细胞或者含有相应水解酶的细胞外反应体系中掺入相应水解酶的抑制剂,通过荧光显微技术对荧光信号的监测来反映抑制剂对相应水解酶的活性抑制。
6.根据权利要求5所述的监测酶活性水平的方法,其特征在于,所述抑制剂是针对相应水解酶的药物分子。
7.如权利要求1或2所述的酶响应性自聚集发光分子在监测水解酶活性中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述的酶响应性自聚集发光分子结合荧光显微技术对荧光信号的监测来反映水解酶活性水平。
9.根据权利要求7或8所述的应用,其特征在于,通过活细胞成像实现细胞内水解酶活性水平的时空监测。
10.根据权利要求7或8所述的应用,其特征在于,在活细胞或者含有相应水解酶的细胞外反应体系中进行药物筛选。
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