CN106566532B - 两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物及其应用。本发明的发光物通过在典型的聚集诱导发光特性(AIE)的疏水性单元上连接亲水性单元制备而成，该发光物可用于特异性选择细胞质区染色、用于制备特异性选择细胞质区染色的染色剂、用于细胞成像、用于追踪肿瘤细胞、用于制备追踪肿瘤细胞的肿瘤细胞追踪器或用于制备核磁共振成像造影剂。

Description

两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物及其应用
技术领域
本发明涉及荧光材料技术领域，具体涉及一种两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物及其应用。
背景技术
近年来，已经发现一系列螺旋状分子在溶液中不发光，但通过聚合形成后会被诱导发出强光，这种聚集诱导发光(aggregation-induced eimission,AIE)的现象与传统荧光素表现出的聚集荧光淬灭效应是完全相反的。利用这个新效应，AIE发光材料可以在许多高科技领域进行应用，如化学传感器、生物探头、免疫标记、刺激反应材料和固态发射器等[Chem.Commun.2001,18,1740；J.Mater.Chem.,2001,11,2974；Chem.Soc.Rev.,2011,40,5361；Adv.Funct.Mater.,2012,22,771；Chem.Commun.,2011,47,7323；Adv.HealthcareMater.,2013,2,500；Acc.Chem.Res.,2013,46,2441；Chem.Commun.2013,49,11335；Biomaterials 2008,29,1345；US 8,029,767；US 2013/0029325；CN103175768]。四苯乙烯(tetraphenylethene,TPE)和六苯基硅杂环戊二烯(hexaphenylsiole,HPS)是原型AIE分子，其具有易合成、固态情况下的高量子产率以及高化学稳定性和光稳定性等优势，但是其疏水性质极大地限制了在生物领域的应用，为了降低其疏水性或提高其亲水性，在其结构中引入了带电的功能基团。例如，带有两个或四个铵基的TPE在水性溶液中发光较弱，但加入带阴电荷的生物分子就变成强发光体，如加入小牛胸腺DNA和牛血清白蛋白(BSA)[Chem.Commun.,2006,3705；Chem.–Eur.J.,2008,14,6428.]。该阴离子TPE衍生物将磺酸基团带入进BSA的主体折叠结构的疏水腔内，由于分子内旋转的限制(restriction ofintramolecular rotation,RIR)使得发光增强。当通过引入表面活性剂(如十二烷基硫酸钠SDS)使得BSA不折叠时，则不再发光[J.Phys.Chem.B,2007,111,11817]。Tang和他的共同工作者们报道了包含有TPE配基的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)的聚合物[Chem.Commun.,2009,4974]，通过荧光技术，TPE标记的PNIPAM链可以用于跟踪温度引起的聚合物的构象变化。另一方面，很少有研究和报道两亲性的AIE分子。在结构上，两亲性分子为表面活性剂以及通常既含有疏水结构单元又含有亲水结构单元的有机化合物。大部分两亲性分子的疏水尾为支链、直链或芳族烃链，同时亲水头不带电荷、负电荷和正电荷，有时分别被称为非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂。因此，两亲性分子由水不溶性配基和水溶性配基构成。在水性溶液中，两亲性分子形成聚合物，如胶体和胶团等，其中疏水尾聚集形成核心，亲水头集中于表面并与周围的水环境相接触。聚合物的形状和大小主要取决于两亲性分子的结构以及分子的亲水性和疏水性的平衡关系。两亲性分子广泛存在于我们的日常生活物品，包括清洁剂、织物柔软剂、乳剂、绘画颜料、墨水和化妆品等，以及存在于生物利用方面，如蛋白提取、细胞质膜、给药等等。两亲性和AIE特性的结合可以产生一系列新的荧光分子用于化学和生物应用方面。
发明内容
本发明的目的是提供一种两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物及其应用，解决现有技术中的具有聚集诱导发光特性的发光物为疏水性的发光物而导致应用受限的问题。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物，包含具有聚集诱导/增强发光特性的疏水性单元，在具有聚集诱导/增强发光特性的疏水单元上连接有亲水性单元，所述发光物的结构式选自以下I、II、III、IV、V和VI中的任一种；
其中，表示具有聚集诱导/增强发光特性的疏水性单元；
表示亲水性单元；
在本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物中，所述发光物可溶于水，且所述发光物形成的水溶液的浓度≥临界胶束浓度时可形成胶束。
在本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物中，所述具有聚集诱导/增强发光特性的疏水性单元包括至少一第一主体结构，所述主体结构选自包含有下述任一结构的基团：
其中，R和R(X)分别表示与所述具有聚集诱导/增强发光特性的疏水性单元相连接的亲水性单元。
在本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物中，所述亲水性单元分别选自含有OH、铵盐、氨基、硫醇、乙基乙二醇、磺酸盐、磷酸盐和羧酸盐中至少一种的基团。
在本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物中，所述具有聚集诱导/增强发光特性的疏水性单元包含有结构为的基团，所述亲水性单元包含有乙基乙二醇基团；具体地，所述发光物包含有下述结构式P1/6、P2/6和P3/6中任一结构式的基团：其中n、m、o和p分别表示2～3000的自然数，
在本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物中，所述发光物在追踪细胞中的应用、在制备细胞追踪器中的应用、在制备用于追踪细胞的探针中的应用或在监测细胞内药物释放过程中的应用。
在本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物中，所述亲水性单元包含至少一第二主体结构，所述第二主体结构选自包含有下述任一结构的基团：
其中R1、R2、R3、R4和R5分别选自包含有H、烷基、不饱合烷基、异烷基、环烷基、异环烷基、芳烃基、异芳烃基、以及CnH2n+1、C10H7、C12H9、OC6H5、OC10H7、OC12H9、CnH2nCOOH、CnH2nNCS、CnH2nN3、CnH2nNH2、CnH2nSH、CnH2nCl、CnH2nBr、CnH2nI中的至少一种的基团，n为自然数；
X-为反荷离子，X-选自于I-、Cl-、Br-、PF6 -、ClO4 -、BF4 -、BPh4 -、CH3PhSO3 -。
在本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物中，所述具有聚集诱导/增强发光特性的疏水性单元包含有结构为的基团，所述亲水性单元包含有结构为的基团，其中R1为丙烷基，X-为Br-；具体地，所述发光物包含有下述结构式TPE-MEM的基团：
在本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物中，所述发光物在特异性选择细胞膜染色中的应用、在制备特异性选择细胞膜染色剂中的应用、在制备特异性选择细胞膜染色的探针中的应用、在制备光敏剂中的应用以及在制备光线疗法药物中的应用或在制备用于治疗癌症的光线疗法药物中的应用。
在本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物中，所述发光物可以与金属离子复合，所述金属离子选自La3+、Pr3+、Nd3+、Pm3+、Sm3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、Ce3+、Dy3+、Ho3+、Er3+、Tm3+、Yb3+和Lu3+中的至少一种。
在本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物中，所述金属离子为Gd3+，所述具有聚集诱导/增强发光特性的疏水性单元包含有结构为的基团，所述亲水性单元包含有乙基乙二醇基团；具体地，所述发光物包含有下述结构式TPE-2Gd的基团：
在本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物中，在本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物中，所述发光物在特异性选择细胞质区染色中的应用，在制备特异性选择细胞质区染色的染色剂中的应用、在细胞成像中的应用、在追踪肿瘤细胞中的应用、在制备追踪肿瘤细胞的肿瘤细胞追踪器中的应用或在制备核磁共振成像造影剂中的应用。
本发明还详细说明了上述两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物在追踪细胞中的应用、在制备细胞追踪器中的应用、在制备用于追踪细胞的探针中的应用、在监测细胞内药物释放过程中的应用、在特异性选择细胞膜染色中的应用、在制备特异性选择细胞膜染色剂中的应用、在制备特异性选择细胞膜染色的探针中的应用、在制备光敏剂中的应用、在制备光线疗法药物中的应用或在制备用于治疗癌症的光线疗法药物中的应用、在特异性选择细胞质区染色中的应用，在制备特异性选择细胞质区染色的染色剂中的应用、在细胞成像中的应用、在追踪肿瘤细胞中的应用、在制备追踪肿瘤细胞的肿瘤细胞追踪器中的应用或在制备核磁共振成像造影剂中的应用。
实施本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物及其应用，具有以下有益效果：本发明的发光物通过在典型的聚集诱导发光特性(AIE)的疏水性单元上连接亲水性单元制备而成，该发光物可用于特异性选择细胞质区染色、用于制备特异性选择细胞质区染色的染色剂、用于细胞成像、用于追踪肿瘤细胞、用于制备追踪肿瘤细胞的肿瘤细胞追踪器或用于制备核磁共振成像造影剂。具体地，本发明合成了新型的双模式核磁共振成像(MRI)造影剂(TPE-2Gd)，包含有疏水性四苯乙烯单元和亲水性的二乙烯三胺五乙酸-钆复合物，具有磁性且可以荧光成像，实验结果显示其是一种理想的MRI造影剂，具有用于诊断的长循环寿命以及用于机体清除的足够短的短循环寿命。
附图说明
图1为本发明实施例1中P1/6、P2/6和P3/6发光物的合成路线图；
图2为本发明实施例2中TPE-MEM发光物的合成路线图；
图3为本发明实施例3中TPE-2Gd发光物的合成路线图；
图4A为P1/6发光物(0.25mg/mL)在不同含水量的THF/H2O混合液中由365nm波长的紫外光照射的照片；
图4B为P1/6发光物(0.25mg/mL)在不同己烷含量的THF/己烷混合液中由365nm波长的紫外光照射的照片；
图4C为P1/6、P2/6和P3/6发光物分别在不同组成的THF/H2O混合液中的相对强度与不同组成的THF/H2O混合液中含水量之间的相关曲线图；其中，发光物浓度为0.25mg/mL，激发波长(nm):320(P1/6)、335(P2/6)以及350(P3/6)；
图4D为P1/6、P2/6和P3/6发光物分别在不同组成的THF/己烷混合液中的相对强度与不同组成的THF/己烷混合液中己烷含量之间的相关曲线图；其中，发光物浓度为0.25mg/mL，激发波长(nm):320(P1/6)、335(P2/6)以及350(P3/6)；
图5A为不同浓度的P1/6发光物的水溶液(0.002-2mg/mL)由365nm波长的紫外光照射的照片；
图5B为不同浓度的P1/6发光物的水溶液的PL光谱图；
图5C为P1/6、P2/6和P3/6发光物的I/I0值与对应在水中的浓度之间的相关曲线图；
图6为利用CCK8实验分析P1/6发光物对HepG2细胞的24小时的细胞毒性的相关图；
图7为不同浓度的P1/6发光物对活的HepG2细胞染色12小时的成像图；
图8为200μg/mL浓度的P2/6和P3/6发光物对活的HepG2细胞染色24小时的成像图；
图9为长期追踪由150μg/mL的P1/6发光物染色24小时后的第一代至第五代的HepG2细胞的成像图；
图10为TPE-MEM(40μM)在水中的UV和PL光谱图，激发波长为405nm；
图11A为TPE-MEM在含有不同含量的THF(fTHF)的THF/DMSO混合溶剂中的PL光谱图，其中TPE-MEM浓度为25μM，激发波长为405nm；
图11B为TPE-MEM在625nm的PL强度与THF/DMSO混合溶剂中的fTHF之间的相关曲线图，其中TPE-MEM浓度为25μM；内部的插图为TPE-MEM分别在DMSO溶剂和THF/DMSO混合溶剂(fTHF＝99％)中由365nm波长的紫外光照射的照片；
图12A为TPE-MEM在600nm的PL强度与浓度之间的相关曲线图；内部的插图为不同浓度的TPE-MEM由365nm波长的紫外光照射的照片；
图13A为透射电子显微镜(TEM)测定的TPE-MEM(100μM)在水性溶液中的粒径照片；
图13B为电动电势粒度分析仪测定的不同浓度的TPE-MEM的粒径曲线图；内部的插图为由电动电势粒度分析仪测定的TPE-MEM(100μM)在水性溶液中的粒径分布图；
图14为MTT法测定的TPE-MEM对HeLa细胞增殖的影响的分析图；细胞暴露于不同浓度的TPE-MEM6小时；
图15A为TPE-MEM(5μM，λex＝405nm和λem＝550±70nm)对HeLa细胞染色的激光扫描共聚焦显微镜成像图；
图15B为CellMaskTM深红色细胞膜染色剂(C10046，5μg/mL，λex＝633nm和λem＝685±55nm)对HeLa细胞染色的激光扫描共聚焦显微镜成像图；
图15C为图15B相对应的明视野成像图；
图15D为图15A-15C的合并成像图，图15A与图15B的重叠系数计算为72％；
图16为随着扫描时间的增加过程中TPE-MEM(实线圆)荧光发射的信号损失(％)的变化曲线图；内部的插图分别为在325.7s连续扫描以前和连续扫描以后的由TPE-MEM(5μM)染色的活的HeLa细胞的荧光成像图，λex＝405nm和λem＝550±50nm；
图17A为存在有TPE-MEM(10μM)的H2DCFDA(1μM)在房间灯光照射下的PL光谱图，激发波长为488nm；
图17B为照射时间分别对含有TPE-MEM的溶液、含有H2DCFDA的溶液或者TPE-MEM和H2DCFDA二者均含有的溶液在535nm的PL强度的影响的曲线图；
图18中的A-D照片为在照射前TPE-MEM和PI染色的HeLa细胞的共聚焦成像图；E-H照片为在照射后TPE-MEM和PI染色的HeLa细胞的共聚焦成像图；I-L照片为在照射后仅用PI染色的HeLa细胞的共聚焦成像图；C、G和K照片分别为A、E、I相对应的明视野的成像图；D、H和L分别是A/B/C的合并成像图、E/F/G的合并成像图和I/J/K的合并成像图；[TPE-MEM]＝5μM；[PI]＝3μM；Channel I:λex＝405nm，λem＝550±50nm；Channel II:λex＝560nm，λem＝620±65nm；
图19为通过MTT法测定房间灯光照射TPE-MEM以及未照射TPE-MEM分别对HeLa细胞增殖的影响的对比图；
图20A为TPE-2Gd在不同含水量(fw)的THF/H2O混合溶液中由365nm的紫外光照射的照片；
图20B为TPE-2Gd在不同含水量(fw)的THF/H2O混合溶液中的发射光谱图，浓度为100μM，激发波长为330nm；
图20C为不同浓度TPE-2Gd(1μM and 100μM)的相对PL强度(I/I0)与THF/H2O混合溶液中的含水量之间的相关曲线图；
图21A为不同浓度的TPE-2Gd水溶液在紫外光照射下的照片；
图21B为不同浓度的TPE-2Gd水溶液的发射光谱图，激发波长为330nm；
图21C为TPE-2Gd的PL强度与在水中的浓度之间的相关曲线图，TPE-2Gd的临界胶团浓度(CMC)为70μM；
图22A为TPE-2Gd(100μM)在水中的透射电子显微镜成像图；
图22B为TPE-2Gd(100μM)在水中的粒径分析图；
图23A为TPE-2Gd染色的HeLa细胞的荧光成像图，[TPE-2Gd]＝30μM；
图23B为TPE-2Gd染色之后的PI染色的HeLa细胞的荧光成像图，[TPE-2Gd]＝30μM；
图23C为图23A与图23B的合并成像图，[TPE-2Gd]＝30μM；
图23D为HeLa细胞的明视野成像图，[TPE-2Gd]＝30μM；
图24为通过MTT法测定的TPE-2Gd对HeLa细胞的细胞增殖情况的分析图，细胞暴露于不同浓度的TPE-2Gd 4小时，更换新鲜的培养基后继续培养24小时；
图25为不同Gd3+浓度的TPE-2Gd和商用对照品的T1-加权核磁共振图谱(MR)，样品由生理盐水进行稀释；
图26为不同Gd3+浓度的TPE-2Gd和商用对照品的水质子纵向弛豫速率(1/T1)的曲线图，根据方程式：1/T1＝1/T1,0+R1×[CGd]，弛豫速度R1,TPE-2Gd＝3.36±0.10mM-1·s-1；R1,magnevist＝3.70±0.02mM-1·s-1；
图27为分别给小鼠静脉注射含有G d3+离子浓度为0.1mmol/kg的TPE-2Gd和后的冠状的T1-加权核磁共振(MR)成像图；
图28A为心脏的T1-加权成像的定量分析图；
图28B为肝的T1-加权成像的定量分析图；
图29为分别给小鼠的肝内静脉注射含有G d3+离子浓度为0.1mmol/kg的TPE-2Gd和后的轴向的T1-加权核磁共振(MR)成像图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物及其应用作进一步说明：
在2001年由Tang发现了聚集诱导发光(aggregation-induced eimission,AIE)现象，目前AIE现象因其在有机发光二极管(OLEDs)、化学传感器、生物传感器以及体内外的生物成像剂等方面的潜在应用已经成为世界上最热研究领域之一，但大部分AIE分子都是由芳环构成，因此AIE分子呈疏水性，不溶于水性介质。另一方面，很少有报道关于水溶性AIE分子或两亲性AIE分子。从这方面考虑，本发明设计合成了一些水溶性和两亲性AIE分子，开发了它们的潜在生物应用。
以下实施例仅是本发明的说明性的示例，而不是限制性的。
实施例1：合成非离子两亲性的发光物P1/6、P2/6和P3/6并对其进行应用方面的实验研究
(1)合成(n、m、o和p分别表示2～3000的自然数)
如图1所示，合成发光物P1/6所用的试剂的供给比例如下，第六化合物6、第一化合物1、CuBr和PMDETA之间的浓度比[6]/[1]/[CuBr]/[PMDETA]为1/4/4/4，合成发光物P2/6和P3/6的试剂的供给比例使用浓度的比例与发光物P1/6不同之处是第六化合物6分别与第二化合物2和第三化合物3的浓度比为[6]/[2]/[3]＝1/1/0.5。室温下，在装有30mLDMF、CuBr(172mg,1.2mmol)和5.3mL PMDETA(1.2mmol)的50mL的Schlenk瓶中，第六化合物6(1.05mg,0.3mmol)和第一化合物1(430mg,1.2mmol)进行链接反应，进行搅拌36小时后，用水(300mL)将反应混合物稀释，用二氯甲烷对该水溶液提取四次，将所有有机相混合在一起，进一步由浓盐水冲洗六次，并通过Na2SO4干燥。溶剂蒸发后，残留物浓缩至～20mL，在乙醚(300mL)中沉淀3次，过滤沉淀物并用过量的乙醚冲洗得到相应的产物。
发光物P1/6，产率82％，Mw 3200；Mw/Mn 1.03；IR(KBr),ν(cm-1):3435,2885,1641,1466,1346,1281,1244,1111,953,841,756,700,623,581,523；1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.46(2H,s,苯三唑triazole-H),7.62(4H,d,J＝8.0Hz,苯三唑triazole-Ar-H),7.17-6.99(34H,m,Ar-H),4.56(4H,t,J＝4.8Hz,CH2-triazole苯三唑),3.85(4H,t,J＝4.8Hz,CH2CH2-triazole苯三唑),3.53–3.46(300H,m,OCH2)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):145.86,143.15,143.02,142.63,140.77,140.19,131.20,130.70,130.65,128.97,127.86,127.82,126.62,124.50,121.72,72.36,69.90,69.73,69.64,68.67,60.23,49.58。
发光物P2/6，产率81％，Mw 34700；Mw/Mn 1.39；IR(KBr),ν(cm-1):3416,2880,1639,1466,1352,1281,1250,1113,951,845,770,704,675,527；1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.41(2H,s,triazole-H),7.57(4H,t,J＝8.0Hz,苯三唑triazole-Ar-H),7.14-6.99(14H,m,Ar-H),4.50(4H,m,CH2-triazole苯三唑),3.80(4H,t,J＝4.8Hz,OCH2CH2-triazole苯三唑),3.60–3.39(300H,m,OCH2)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):145.87,145.86,143.06,142.65,140.42,131.26,130.77,129.03,127.93,126.77,124.52,121.76,72.37,69.92,69.74,69.53,68.69.60.25,49.60。
发光物P3/6，产率88％，Mw 27,600；Mw/Mn 1.39；IR(KBr),ν(cm-1):3439,3136,2873,1639,1463,1350,1286,1249,1109,954,840,663,530；1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.41(4H,s,苯三唑triazole-H),7.61(8H,d,J＝8.0Hz,苯三唑triazole-Ar-H),7.07(8H,d,J＝8.0Hz,Ar-H),4.49(8H,s,CH2-triazole苯三唑),3.79(8H,s,OCH2CH2-triazole苯三唑),3.64–3.40(600H,m,OCH2)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):145.85,142.53,140.21,131.42,129.24,124.66,121.79,72.36,69.68,68.68,60.23,49.59。
(2)应用研究：
通过叠氮-炔的环加成作用合成带有不同链数聚乙二醇(PEG)的非离子的水溶性的四苯乙烯(TPE)-功能化的聚乙二醇(PEG)发光物(P1/6、P2/6和P3/6)，将疏水性的TPE变成亲水分子。这些发光物显示出较好的热稳定性，参见表1，其中P1/6、P2/6和P3/6的Td分别为351.6℃、342.2℃和352.1℃。如图4A-4D所示，这些合成后的聚合物是水溶性和两亲性的，在THF/水溶剂系统和THF/己烷溶剂系统中均显示出AIE特性。在大量水溶液中，这些聚合物超过临界胶团浓度(CMC)时形成胶束聚合物。如图5A、5B和5C所示，通过利用这些聚合物聚集状态时自身荧光发光的性质得到P1/6、P2/6和P3/6的CMC分别为0.09mM、0.12mM和0.20mM，粒径分别约为100nm。所有结果表明，这些聚合物的胶束由在内侧的非极性的TPE头和指向水性介质的亲水性的PEG链组成。这些聚合物在CMC以下，则单独溶于介质中且不发光，当增加浓度至CMC以上时，这些聚合物开始形成胶束，TPE部分聚集在疏水内部，显示出较强的荧光发光。因此，由于分子内旋转的限制(restriction of intramolecularrotation,RIR)对胶束化的影响，这些聚合物变得可以发光。
为了研究P1/6对活细胞的影响，利用CCK8进行了细胞毒性分析。WST-8([2-(2-methoxy-4-nitropheny)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliun,monosodium salt]，[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-双磺苯基)-2H-四氮唑，谷氨酸钠盐]通过细胞内的脱氢酶转变为甲瓒，其与活细胞的数量成正比。如图6所示，P1/6的细胞毒性在P1/6暴露于HepG2细胞24h后呈剂量依赖性。浓度为50、75、100、125μg/mL所对应的细胞存活率分别为99.93％、98.1％、95.82％和92.94％，在浓度达到150μg/mL时，细胞存活率依然保持超过86％。所有数据表明P1/6具有用于活细胞成像的较好生物相容性。
表1：P1/6、P2/6和P3/6的分子量以及热学性能
作为药物载体用于临床应用方面，PEG是生物可相容的且适用于传递有机染色剂至细胞内。纯染色剂TPE因其高度疏水性无法透入进细胞内区域(未显示数据)。由于具有AIE性质的较佳的光学特性，使用TPE-功能化的PEG聚合物对贴壁型HepG2细胞染色作为生物探针。两亲性聚合物在水性溶液中倾向于形成纳米聚合物，其可以通过内吞作用促进细胞摄取。如图7所示，当HepG2细胞由P1/6染色12h时，从胞质区会发光。随着P1/6浓度的增加，荧光变得更强，表明内吞作用的效率取决于P1/6在培养基中的剂量。如图8所示，尽管细胞与高浓度的P2/6和P3/6进行培养更长的时间，但与P1/6相比发光要弱得多。这种差异归因于TPE与PEG之间的比例。
为了长时间监测细胞形态，生产商已经尽力改善染色后的负载时间。例如，商业细胞追踪器，CellTrackerTM蓝色CMAC(7-Amino-4-Chloromethylcoumarin，7-氨基-4-氯甲基香豆素)和蓝色CMHC(4-chloromethyl-7-hydroxycoumarin，4-氯甲基-7-羟基香豆素)由氯甲基官能团功能化。当追踪器的探针进入细胞内时，探针可以与蛋白质和多肽上的硫醇进行反应，但是根据协议染色剂在染色后仅可以照亮细胞大约24小时。如图9所示，作为第一代，活的HepG2细胞暴露于P1/6聚合物24小时，发出强光。由于在细胞内生物大分子PEG会锁住荧光团，细胞内的P1/6被传递至子细胞内。尽管增生代的增加使得荧光变弱，但是探针还是能够追踪至第五代。因此，P1/6可用作长期活细胞追踪器，是潜在的替代方式。因此，该荧光聚合物可应用于监测细胞内药物释放。
实施例2：合成阳离子两亲性的发光物TPE-MEM并对其进行应用方面的实验研究
(1)合成
如图2所示，在氮气环境下，1-(3-三甲基胺基丙烷基)-4-甲基吡啶二溴化物(1-(3-trimethylammoniopropyl)-4-methylpyridinium dibromide)(0.5g,1.4mmol)和第三化合物3(1.5016g,2.8mmol)的溶液在无水乙醇中回流反应，加入三滴哌啶进行催化，冷却至室温后，在减压条件下蒸发溶剂，通过硅胶柱色谱法对残留物进行纯化，使用二氯甲烷和甲醇(2：1v/v)的混合溶剂作为洗脱剂，得到黄色产物TPE-MEM(0.72g,59％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4,δ):8.948(d,2H,J＝6.8Hz),8.213-8.190(m,2H),7.946(6,1H,J＝16Hz),7.737-7.717(m,2H),7.576(d,2H,J＝8Hz),7.430-7.331(m,3H),7.061-6.843(m,14H),6.605-6.570(m,2H),4.698(t,2H,J＝15.2Hz),3.797(t,2H,J＝14.8Hz),3.644(t,2H,J＝16.4Hz),3.240(s,9H),2.663-2.581(m,2H),1.693-1.619(m,2H),1.421-1.262(m,6H),0.871(t,3H,J＝14.4Hz)；13C NMR(100MHz,CDCl3,δ):157.362,157.260,153.875,143.411,143.306,143.250,143.227,143.198,141.993,140.990,140.597,138.760,136.680,135.055,133.295,131.619,131.584,131.140,130.482,128.135,126.902,126.855,126.798,126.683,126.281,125.676,125.507,125.457,125.216,125.115,123.440,121.585,112.874,112.700,66.856,61.787,55.965,52.066,30.728,30.716,28.311,24.791,24.216,21.625,12.399；HRMS(MALDI-TOF)m/z:计算值,791.3571[M-Br-]+；测定值,791.3570[M-Br-]+。
(2)应用研究
细胞膜为细胞的保护屏障，对于细胞的完整性、生长和死亡至关重要。迫切需要在活细胞和濒死细胞内对细胞膜成像的发光物。在本实施例中提供一种新的两亲性以四苯乙烯为基础的吡啶盐(tetraphenylethene-based pyridinium salt,TPE-MEM)，具有显著的聚集诱导发光(AIE)特性，并用于选择性细胞膜染色。该高产率的发光物的荧光探针(TPE-MEM)通过下述反应合成，包括不对称McMurry反应、Suzuki耦合反应以及带双电荷的吡啶盐和己氧基四苯乙烯苯甲醛(hexyloxytetraphenylethene benzaldehyde)之间的缩合反应。由于双电荷特性，TPE-MEM在非极性溶剂中具有较差的溶解性，如在THF和DCM非极性溶剂中，但在极性溶剂中可溶，如在水、DMF、DMSO和甲醇中可溶。
图10显示了TPE-MEM在水性溶液(40μM)中的紫外(UV)和光致发光(PL)光谱。TPE-MEM的吸收最大波长落在395nm。为了方便生物应用，使用405nm作为激发波长进行PL测定。水性溶液的光激发诱导在590nm发黄光，表示发生了185nm的大量位移，这是由扩展共轭作用以及从电子供体TPE配基至电子受体吡啶单元的分子内电荷转移(intramolecularcharge transfer,ICT)造成的。
如图11A和11B所示，TPE-MEM显示出明显相反的AIE性质，这是由于其强极性的性质导致的。TPE-MEM(25μM)的DMSO溶液发光较弱，而在含量99％的THF中，在625nm发光变强。考虑到TPE-MEM的分子结构，推测两亲性TPE-MEM分子在高浓度情况下可以形成胶团。得益于AIE的性质，TPE-MEM的临界胶团浓度(CMC)可以利用其自身的荧光强度进行测定。如图12所示，TPE-MEM的浓度在CMC以下时是分子溶解，因此不产生荧光；在0.01mM以上，PL强度急剧增强；PL强度与染色剂浓度之间的相关曲线产生两条线，两条线的交叉点确定CMC为0.02mM。如图13A和13B所示，通过透射电子显微镜和电动电势粒度分析仪也证实了在高染色剂浓度中纳米聚合物的形成以及CMC值。含水胶束的有效直径为77.4nm，随着脱水有效直径缩减到40nm。当TPE-MEM在CMC以下是分子溶解的时候，不能检测到微粒；当在CMC(0.02mM)以上时，可以观察到微粒。由PL测定的曲折点与CMC值相同。此外，纳米聚合物的粒径既适合于体外细胞摄取和体内循环，又适合于生物分布。
在细胞成像以前，利用MTT比色法在HeLa细胞内可以测定TPE-MEM的细胞活性和细胞毒性。在37℃条件下，在黑暗的CO2培养器内细胞暴露于不同浓度(0、2.5μM、5μM、10μM、20μM)的TPE-MEM 6小时，然后在培养器的新鲜的培养基内再培养18小时进行细胞增殖。如图14所示，结果显示在黑暗中TPE-MEM的浓度即使达到20μM也一般没有细胞毒性。然后正如预期的，对TPE-MEM用于选择性的细胞膜染色进行评估。如图15A-15D所示，使用CellMaskTMDeep Red细胞膜染色剂(C10046)进行的联合染色实验表明从TPE-MEM观察到的荧光是来自于活的HeLa细胞的细胞膜，其中该细胞膜染色剂是一种商业上可获得的细胞膜成像剂。通过使用共聚焦显微镜(CLSM LSM7；Carl Zeiss,Germany)的软件，测定图15A和图15B之间的重叠系数为72％。重叠系数相当高，这是由于薄层细胞膜结构以及两种染色剂之间的竞争抑制。与C10046相比，TPE-MEM显示出较少的内在化作用，且对细胞膜的成像表现出较好的成像分辨率。更甚地，通过TPE-MEM还可以清楚地看到细胞微绒毛。除了复合染色实验，还进行了Z型CLSM扫描(Z-stack CLSM scanning)。
细胞膜是在膜的界面上显示较大负电位的细胞器，在该细胞器上磷脂双分子层主要由薄的两亲性磷脂双分子层构成。因此，细胞膜目标生物染色剂通常需要符合是两亲性的和阳离子的。协调平衡分子的疏水性和亲水性以满足细胞膜的两亲性，这对于设计新的细胞膜生物染色剂至关重要。TPE-MEM具有两亲性和带正荷的特性，因此将其可以作为极佳的生物染色剂，用于特异性染色活细胞的细胞膜。两亲性的TPE-MEM自发排列在磷脂双层，以便使疏水尾部区域在与周围极性液体相隔离的双层内以及亲水头部区域被静电吸引至负电荷的磷酸盐。如静电作用力和范德瓦尔斯相互作用力(van der Waals interactions)等导致特异性目标染色。
对于细胞成像染色剂，耐光性是最重要的标准之一。用于特异性细胞染色的一些AIE染色剂都是高耐光性的。螺旋状分子结构和其聚合形成过程可以阻止氧气扩散进入AIE微粒内，氧气进入AIE微粒内会氧化荧光团以及使其PL发光变白。如图16所示，在活细胞内得到了相似的耐光性结果。根据初始荧光强度标准化荧光强度。如图16所示，总照射时间5分钟(30次扫描)，TPE-MEM的信号损失少于40％。从0s至325.7s的时间，信号损失和成像亮度发生轻微下降，这是由于染色剂的扩散以及细胞的移动。
如图16所示，在CLSM时间过程中系列扫描中可以看到气泡。明显地，细胞绒毛收缩并消失，然后基于激光扫描，细胞膨胀并泄露，可见细胞质膜变得不连续且是渗漏的。这种现象强烈表明细胞死亡是由激光扫描导致的，这就激发了人们后续研究的原因。在π-共轭体系中具有正电荷的吩噻嗪(phenothiazinium)基分子广泛用于活性氧(ROS)生成和光线疗法。与吩噻嗪相比，TPE-MEM在π-共轭体系中也具有正电荷，这有可能会使得光诱导ROS生成，导致细胞死亡。
为了证实上述假设，使用商用ROS荧光探针H2DCFDA进行ROS检测。当通过已存在的ROS氧化H2DCFDA时，可以检测到在535nm(λex＝488nm)发射强荧光。出人意外地，正常的白色房间灯光(LED灯泡，3W)照射到TPE-MEM溶液时足够产生ROS。含有H2DCFDA的PBS溶液、含有TPE-MEM的PBS溶液以及同时含有H2DCFDA和TPE-MEM的PBS溶液的PL光谱都是在相同的房间灯光照射得到的。记录样品不同照射时间的PL光谱(图17A，λex＝488nm)以及535nm的峰值强度与照射时间之间的相关曲线(图17B)。在图17A中，当溶液中同时存在H2DCFDA和TPE-MEM时，被氧化的H2DCFDA在535nm的特征峰出现并随着光照射增强。测定结果显示即使房间灯光照射时间超过120分钟，PL强度仍然持续增强，而紫外光照射仅几分钟之内就使荧光变白(未显示数据)。单独的H2DCFDA溶液和单独的TPE-MEM溶液由房间灯光照射后的PL强度变化轻微。观察结果表明实际上是光线照射在TPE-MEM的时候产生的ROS，导致细胞受损和死亡。
然而，细胞死亡的病理学仍然无法解释。细胞膜的完整性是最重要形态学特征之一，用于区分细胞凋亡和细胞坏死。在细胞坏死的过程中，细胞膨胀，细胞膜变得有漏洞并分裂，最终细胞与周围环境交换物质。碘化丙啶(propidium iodide,PI)是不能渗透通过细胞膜的，通常排除在活细胞之外。当细胞膜有漏洞时，PI常用于对死亡细胞的胞核染色。因此，PI开放用于在大量细胞中识别死亡细胞并在多色荧光技术中作为复染色剂。在本实例中，如图18所示，TPE-MEM加入至具有活细胞的培养基内进行标记，然后将PI引入至观察基内。如图18中的A-D所示，在光照射以前仅可以检测到来自于细胞膜上的TPE-MEM(channelI)的黄光。当照射细胞约5分钟(30scans)的时候，再照射另一个5分钟用于摄取PI，如图18中的E-H所示，在细胞内部的细胞质和细胞核内可以观察到细胞形态的变化以及来自于PI(channel II)所发的红光。在细胞核内来自于PI所发的红光是由于PI插入结合至DNA导致PI发红光，而细胞质内的红色信号有可能是细胞核裂解进入至细胞质内造成的。在没有TPE-MEM的控制实验中，在照射前(未显示数据)和照射后(图18中的I-L)都没有检测到红色信号(channel II)。所有观察结果显示细胞膜变得有漏洞，表明在存在有TPE-MEM的情况下进行光线照射会引起细胞坏死。
所有结果表明TPE-MEM在房间灯光照射下促使产生ROS。TPE-MEM除了具有细胞膜选择性和极好的耐光性，TPE-MEM可潜在用作治疗癌症的光线疗法药物。为了评估利用正常房间灯光照射TPE-MEM的光线疗法对HeLa癌细胞增殖的影响，如图19所示，通过MTT法，对于房间灯光照射2小时和未照射2小时两种情况分别测定含有不同浓度的TPE-MEM的细胞存活率。通过测定的MTT值与不含有TPE-MEM且未光照的样品测得的MTT值之间的关系制备标准曲线进而计算细胞存活率。
图19的结果显示未经照射的细胞是有存活率且从0μM-10μM的细胞存活率约为90％，不含有TPE-MEM的样品经房间灯光照射后未显示毒性。然而，经房间灯光照射的TPE-MEM产生ROS，在含有10μM的TPE-MEM的细胞存活率降至47％。在含有TPE-MEM的情况下，经房间灯光照射的样品与未经房间灯光照射的样品之间得到比较大的细胞存活率差异。白色房间灯光照射是温和的，容易获得且便宜，结合产生ROS的高产率，使得光线疗法无危害性、耐光、暗毒性低。所有的优点使得TPE-MEM是一种较好的光敏剂(也可以称为感光剂)。
即使很难鉴定ROS物质以及说明ROS产生的机制，但却可以观察到ROS的产生。ROS已经显示出可以增强癌细胞的增殖，但过量的ROS水平会导致癌细胞凋亡和坏死。在本实例中，细胞膜生物染色剂(TPE-MEM)通过房间灯光照射产生过量的ROS，可以实时地可视化原位癌细胞坏死的过程。
总之，合成的具有强AIE特性的非对称的两亲性的四苯乙烯基吡啶盐(tetraphenylethene-based pyridinium salt,TPE-MEM)可用于细胞膜染色。由于阳离子和两亲性，TPE-MEM对细胞膜具有高特异性以及在活细胞内具有极佳的耐光性。令人意外的是，仅通过普通房间灯光照射下TPE-MEM就可以有效诱导产生ROS，导致细胞坏死。这些独特特征使得可以实时观察在原位的细胞坏死的过程和光线疗法的过程。因此，产生ROS和可光线疗法的结果使得本实施例的发光物可用于制备治疗癌症的新的AIE光线疗法药物。
实施例3：合成阴离子的两亲性发光物TPE-2Gd并对其进行应用方面的实验研究
(1)合成TPE-2+
如图3所示，在氮气环境下，1-(3-三甲基胺基丙烷基)-4-甲基吡啶二溴化物(1-(3-trimethylammoniopropyl)-4-methylpyridinium dibromide)(0.5g,1.4mmol)和4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯甲醛(4-(1,2,2-triphenylvinyl)benzaldehyde)(1.01g,2.8mmol)的溶液在无水甲醇中回流反应，加入三滴哌啶进行催化，冷却至室温后，在减压条件下蒸发溶剂，通过硅胶柱色谱法对残留物进行纯化，使用二氯甲烷和甲醇(2：1v/v)的混合溶剂作为洗脱剂，得到黄色产物TPE-2+(0.56g,57％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4,δ):8.913(d,2H,J＝6.8Hz),8.177(d,2H,J＝6.8Hz),7.875(d,1H,J＝16.0Hz),7.501(d,2H,J＝8.4Hz),7.352(d,1H,J＝16.4Hz),7.120-6.985(m,17H),4.678(t,2H,J＝12.4Hz),3.611(t,2H,J＝16.8Hz),3.224(s,9H),2.600(m,2H)；13C NMR(100MHz,甲醇-d4,δ):153.985,146.064,143.359,142.763,142.666,142.535,141.710,141.079,139.581,132.603,131.121,130.342,130.261,126.910,126.741,125.901,125.794,123.366,121.556,61.776,55.939,52.015,24.136；HRMS(MALDI-TOF)m/z:计算值,535.3102[M-HBr-Br-]+；测定值,537.3263[M-HBr-Br-]+。
(2)合成第五化合物5，并通过第五化合物5合成TPE-2Gd
如图3所示，将第三化合物3(163.3mg,0.2mmol)、第四化合物4(214.4mg,0.6mmol)、DCC(136.2mg,0.66mmol)和DMAP(80.6mg,0.66mmol)完全溶解于30mL的DMF中，加入3mL的三乙胺后，室温条件下，在氮气环境下对上述混合物搅拌48小时，搅拌后的混合物中加入10mL的三氟乙酸酸化30分钟，然后过滤，在己烷中沉淀3次，得到相应的需要的第五化合物5，产率92％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.45(m,2H,H of triazole苯三唑),8.05(m,2H,H of amide酰胺),7.60(m,4H；H-Ar-triazole苯三唑),7.12-7.01(m,14H；H-Ar),4.53(s,4H；CH2-triazole苯三唑),3.83(m,4H；CH2C-triazole苯三唑),3.57-3.13(m,20H；OCH2),3.02(s,20H；CH2C＝O),2.90(s,20H；NCH2)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6,δ):172.6,169.2,145.9,143.0,142.6,140.4,131.3,130.7,129.0,127.9,126.7,124.6,121.8,69.6,68.6,64.9,55.1,51.7,49.6；IR(KBr):ν＝3437.2,2954.9,1726.3,1635.6,1460.1,1396.4,1226.7,1089.8,974.1,908.5,700.2cm-1；HRMS(MALDI-TOF)m/z:计算值,1670.5896[M-4H+3Na+K]；测定值,1669.1871[M-5H+3Na+K]+；计算值,1698.5795[M-6H+6Na]；测定值,1697.1949[M-7H+6Na]+；计算值,1724.8194；[M-5H+2Na+3K]；测定值,1724.2223[M-6H+2Na+3K]+。
如图3所示，然后将第五化合物5(235.0mg,0.15mmol)、GdAc3(107.0mg,0.32mmol)和NaAc(131.2mg,1.6mmol)溶解于20mL的DMF中，在70℃条件下搅拌过夜后，对得到的混合物过滤，在己烷中沉淀三次，得到相应的所需化合物TPE-2Gd，产率95％。IR(KBr):ν＝3439.1,1595.1,1409.9,1330.9,1273.0,1220.6,1095.6,933.5,707.9,653.9cm-1；HRMS(MALDI-TOF)m/z:计算值,1984.5525[M+6H2O]；测定值,1984.4323[M+6H2O]。
(3)应用研究
为了达到双重功能，本实施例中合成了含有GD-二乙三胺五乙酸(Gd-diethylenetriamine pentaacetic acid，DTPA)螯合物的TPE衍生物(TPE-2Gd)，然后对其进行光物理性质的检测。紫外可见光谱显示TPE-2Gd的最大吸收波长在330nm，与亲代荧光素-TPE的最大吸收波长相似(未显示数据)。如图20A-20C所示，在330nm激发时，当THF/水溶液中含水量(fw)少于50％时，TPE-2Gd的荧光发光较弱。随着fw的增加，溶液的荧光逐渐变强，在纯水溶液中变成高强度发光，显示出明显的AIE效应。图20A的照片清楚地显示了，随着fw在THF/水溶液中逐渐增加，TPE-2Gd的荧光加强。
从图20C可以注意到，当染色剂浓度从1μM增加到100μM时，TPE-2Gd在纯水中的荧光强度增加了一倍。推测两亲性TPE-2Gd分子高浓度时可以形成胶束。由于AIE性质，TPE-2Gd的临界胶团浓度(CMC)可以利用荧光强度进行估测。当浓度低于CMC时，染色剂分子可以较好地溶解于溶液中，因此不发冷光。当染色剂浓度高于10μM，溶液发光。如图21A-21C所示，荧光强度与染色剂浓度之间的相关曲线形成两条，两条线的交叉点给出CMC为70μM，该值比十二烷基硫酸钠的值(CMC＝8.2mM)要低得多，主要是由于TPE配基的强疏水性导致的。这样低的CMC即使是在血流稀释下也可以确保在体内形成纳米聚合物。如图22A和22B所示，通过透射电子显微镜和电动电势粒度分析仪证实了在高染色剂浓度下形成纳米聚合物。含水胶束的有效直径为164.9nm，脱水后缩减为70nm。纳米聚合物的粒径适合于体外细胞摄取和体内循环以及生物分布。
由FDA批准的一种商用的Gd-基MR(Gd-based MR)造影剂是一种典型的细胞外液试剂，在细胞外区或组织间隙可快速循环。另一方面，TPE-2Gd能够以纳米聚合物的形式进入肿瘤细胞内，已通过活细胞成像进行证明。HeLa细胞由30μM的TPE-2Gd培养4小时，TPE-2Gd进入至该细胞内，通过蓝色荧光照亮细胞质区。为了进一步证实TPE-2Gd的染色区，使用PI作为复染色剂。PI是可染色固定细胞的细胞核的细胞核染色剂。如图23A-23D所示，在细胞核周围的蓝色荧光清楚地表明TPE-2Gd选择性仅对细胞质区染色。TPE-2Gd的纳米聚合物通过内吞作用的途径被内在化进入活细胞，使得TPE-2Gd可以在细胞水平上追踪肿瘤，弥补了在组织水平上追踪肿瘤的缺陷。
利用MTT法测定了TPE-2Gd在HeLa细胞内的毒性。将细胞暴露于不同浓度的TPE-2Gd(0、15μM、30μM、45μM和60μM)4小时，然后在新鲜的培养基内培养24小时，用于评估纳米聚合物对细胞增殖的内在化影响。如图24所示，当TPE-2Gd的浓度低于30μM时，通常是没有毒性的，在用染色剂处理后，约98.8％的细胞都是活的。即使浓度增加至60μM，比细胞成像实验的工作浓度高出2倍，细胞存活率仍然约有87.8％。这个结果表明TPE-2Gd是生物可相容的用于细胞成像，并有望进一步进行体内研究。
在另一方面，为了检测TPE-2Gd是否为有效的MRI造影剂，使用3.0T核磁共振成像(MRI)仪器在室温下根据Gd3+浓度测定水溶液中TPE-2Gd的纵向弛豫时间或自旋晶格(T1)。如图25所示，随着缓冲溶液中TPE-2Gd浓度的增加，混合物的信号强度(亮度)变强，与相同Gd3+浓度的相似。如图26所示，测定TPE-2Gd的弛豫效能是3.36±0.10mM-1·s-1，的弛豫效能是3.70±0.02mM-1·s-1，弛豫效能是指每单位浓度的造影剂中自旋晶格的顺磁性成分。与相比，TPE-2Gd具有高弛豫速率，表明TPE-2Gd可以加强其邻近的水质子的弛豫速率，进而导致信号强度增强。如图27、图28A、图28B和图29所示，TPE-2GD作为纳米粒子，在血液中的半衰期较长，可以用于延长肝脏和心脏MRI成像的时间窗。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物，其特征在于，所述发光物的结构式如下：
2.根据权利要求1所述的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物，其特征在于，所述发光物可溶于水，且所述发光物形成的水溶液的浓度≥临界胶束浓度时可形成胶束。
3.一种权利要求1-2任一权利要求所述的两亲性的具有聚集诱导发光特性的发光物在特异性选择细胞质区染色中的应用，在制备特异性选择细胞质区染色的染色剂中的应用、在细胞成像中的应用、在追踪肿瘤细胞中的应用、在制备追踪肿瘤细胞的肿瘤细胞追踪器中的应用或在制备核磁共振成像造影剂中的应用。
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