CN114835638B - 具有双端基修饰位点的aie分子、多模块探针及其制备方法和应用 - Google Patents

具有双端基修饰位点的aie分子、多模块探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种具有双端基修饰位点的AIE分子、多模块探针及其制备方法和应用，所述具有双端基修饰位点的AIE分子具有如式I所示的结构：
Figure DDA0003533259280000011
本发明进一步通过控制AIE分子与多肽AB的投料比以制备得到单边修饰的AIE‑AB探针；并通过调控AIE分子与多肽A的反应投料比先制备得到出单边修饰的AIE‑A，再将AIE‑A与多肽B进一步反应以制备得到双边修饰的A‑AIE‑B探针。本发明还提供了两个组成相同排列方式不同的具有癌细胞杀伤能力的多模块探针，结果发现双边修饰的A‑AIE‑B探针具有更高的癌细胞选择性，而探针AIE‑AB具有更高的毒性。

Description

具有双端基修饰位点的AIE分子、多模块探针及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及有机化学合成技术领域，具体涉及一种具有双端基修饰位点的AIE分子及利用其制备得到的不同排列方式的多模块探针，尤其涉及一种组成相同排列方式不同的多模块探针及其制备方法。
背景技术
由于肿瘤疾病正在严重威胁着人类健康，高效的肿瘤药物探针的开发和改良任重道远。普通药物实现肿瘤治疗通常需要经历血液循环、肿瘤富集、组织穿透、细胞内化、药物释放等多个过程，由于生物体的复杂微环境，传统的诊疗制剂面临着肿瘤组织中的富集不足、细胞内化效率低、亚细胞器定位能力弱等问题，从而严重影响了药效的发挥。因此，为了克服肿瘤诊疗中的多重障碍，修饰诊疗制剂使其具备一系列功能以对抗生物体复杂的微环境至关重要。模块化策略就是通过在药物分子上修饰多个功能模块比如细胞选择性模块、细胞膜穿透模块、细胞器靶向模块等以构建出一种或几种多功能探针的策略，从而实现较好的治疗效果。
现有的模块化探针的开发策略主要有两种：a，开发新模块或优化模块功能，比如通过学习酶和蛋白相互作用的机制，把蛋白中与酶作用的那段序列识别出来后再人工合成，然后借助现有功能肽导入到细胞，随后与酶产生竞争反应，以实现调节细胞行为的目的。b，将多个功能模块通过共价键连接成一个分子，以达到改良治疗效果的目的。例如，细胞选择性多肽常被修饰到药物分子上以用于提升肿瘤细胞选择性；细胞膜穿透性多肽常用来增加治疗药物探针的肿瘤细胞内化效率；治疗性多肽常被修饰到药物分子上以用于促进线粒体功能紊乱从而提升治疗效果。然而，通过上述方法修饰改性后的模块化探针中，临近模块间的相互作用是否会影响各模块功能的发挥一直被研究者忽略，且一直是多模块探针设计时需重点考虑的问题。因此，开发具有双修饰位点同时具备治疗效果的荧光分子来以促进模块化探针的研究和发展成为本领域亟待解决的技术难题。
发明内容
为了改善上述技术问题，本发明提供一种式I所示结构的化合物：
Figure BDA0003533259260000021
根据本发明的实施方案，式I所示结构的化合物为具有双端基修饰位点的AIE分子。
本发明还提供如式Ⅰ所示结构的化合物的制备方法，包括将化合物4与叠氮化钠反应，制备得到上述如式Ⅰ所示结构的化合物；
所述化合物4具有如下结构：
Figure BDA0003533259260000031
根据本发明的实施方案，所述叠氮化钠与化合物4的质量比为(1～2)：1，示例性为1:1、1.5:1、2:1。
根据本发明的实施方案，所述制备方法可以在溶剂如有机溶剂的存在下进行。例如，所述的有机溶剂可以选自乙腈。
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括待反应结束后，从反应后的混合物中分离得到固体产物的步骤。例如，通过旋干溶剂得到固体产物。进一步地，所述制备方法还包括对所述产物进行纯化的步骤。例如，所述纯化可以采用柱层析色谱柱分离。优选地，所述柱层析色谱柱分离的洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝(40～60):1(v/v)，示例性为40:1、50:1、60:1。
优选地，所述式I化合物的合成路线如下：
Figure BDA0003533259260000032
根据本发明的实施方案，所述化合物4由如下方法制备得到，包括：将化合物3和1,6-二碘丁烷进行反应，得到所述化合物4；
所述化合物3具有如下结构：
Figure BDA0003533259260000041
根据本发明的一个实施方式，上述反应可以在溶剂如有机溶剂的存在下进行。例如，所述的有机溶剂可以选自乙腈。
根据本发明的实施方案，所述化合物3与1,6-二碘丁烷的反应比为(400～600)mg:1mL，示例性为400mg:1mL、500mg:1mL、600mg:1mL。
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括待反应结束后，从反应后的混合物中分离得到固体产物的步骤。例如，通过旋干溶剂得到固体产物。进一步地，所述制备方法还包括对所述产物进行纯化的步骤。例如，所述纯化可以采用柱层析色谱柱分离。优选地，所述柱层析色谱柱分离的洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝(40～60):1(v/v)，示例性为40:1、50:1、60:1。
优选地，所述化合物4的合成路线如下：
Figure BDA0003533259260000042
根据本发明的实施方案，所述化合物3由如下方法制备得到，包括：将化合物2和乙烯基吡啶进行反应，得到所述化合物3；
所述化合物2具有如下结构：
Figure BDA0003533259260000051
根据本发明的一个实施方式，上述反应可以在溶剂如有机溶剂的存在下进行。例如，所述的有机溶剂可以选自N-甲基吡咯烷酮。
根据本发明的实施方案，所述四苯基乙烯、乙烯基吡啶的反应中，优选加入碱和催化剂。
优选地，所述催化剂的用量为四苯基乙烯质量的20～40％，示例性为20％、30％、40％。
示例性地，所述催化剂例如可以为乙酸钯、三邻甲苯基膦和二氯化钯中的至少一种。优选为乙酸钯、三邻甲苯基膦两种。
根据本发明一个示例性地实施方案，所述催化剂中，乙酸钯、三邻甲苯基膦的质量比为(1～2)：1，示例性为1:1、1.5:1、2:1。
优选地，所述碱的用量为四苯基乙烯质量的40～60％，示例性为40％、50％、60％。
优选地，所述碱选自碳酸钾、叔丁醇钠、叔丁醇钾、磷酸钾、醋酸钠中的一种、两种或更多种。
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括待反应结束后，从反应后的混合物中分离得到固体产物的步骤。例如，通过加水抽滤得到固体产物。进一步地，所述制备方法还包括对所述产物进行纯化的步骤。例如，所述纯化可以采用柱层析色谱柱分离。优选地，所述柱层析色谱柱分离的洗脱液为二氯甲烷/甲醇＝(40～60):1(v/v)，示例性为40:1、50:1、60:1。
优选地，所述化合物3的合成路线如下：
Figure BDA0003533259260000061
根据本发明的实施方案，所述化合物2由如下方法制备得到，包括：将化合物1与金属进行反应，得到化合物2；
所述化合物1具有如下结构：
Figure BDA0003533259260000062
优选地，所述化合物1与金属的反应质量比为(1～2)：1，示例性为1:1、1.5:1、2:1。
优选地，所述金属为锌、铁、铝和锰中的一种或多种。
优选地，所述反应在催化剂作用下进行。优选地，所述二苯甲酮与催化剂的反应比为(0.5～2)g:1mL，示例性为0.5g:1mL、1g:1mL、2g:1mL。例如，所述催化剂选自四氯化钛。
根据本发明的一个实施方式，上述反应可以在溶剂如有机溶剂的存在下进行。例如，所述的有机溶剂可以选自四氢呋喃。
根据本发明的实施方案，所述反应可以在20℃至100℃温度下进行。
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括待反应结束后分离得到粗产物的步骤。例如，用萃取剂萃取反应后的混合物，收集滤液，旋干溶剂得到所述粗产物。优选地，所述萃取剂可以为二氯甲烷/水混合溶剂。进一步地，所述制备方法还包括对所述粗产物进行纯化得到化合物2的步骤。例如，所述纯化可以采用柱层析色谱柱分离，得到化合物2。优选地，所述柱层析色谱柱分离的洗脱液为石油醚/乙酸乙酯＝(40～60):1(v/v)，示例性为40:1、50:1、60:1。
优选地，所述化合物2的合成路线如下：
Figure BDA0003533259260000071
根据本发明的实施方案，所述如式Ⅰ所示结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：
S101，由化合物1，四氯化钛和锌粉以四氢呋喃为溶剂合成化合物2；所述化合物2的结构式如下：
Figure BDA0003533259260000072
S102，由化合物2、乙烯基吡啶以碳酸钾为碱，乙酸钯，三邻甲苯基膦为催化剂，以N-甲基吡咯烷酮为溶剂合成化合物3；所述化合物3的结构式如下：
Figure BDA0003533259260000073
S103，由化合物3，1，6-二碘丁烷以乙腈为溶剂合成化合物4；所述化合物4的结构式如下：
S104，由化合物4，叠氮化钠以乙腈为溶剂合成最终产物式I化合物，通过柱色谱分离纯化得到纯净的最终产物式I化合物；
式I化合物的反应路线如图1所示。
本发明还提供如式I所示结构的化合物在制备荧光探针中的应用。
本发明还提供一种式Ⅱ或式Ⅲ所示结构的化合物：
Figure BDA0003533259260000081
本发明还提供上述式Ⅱ或式Ⅲ所示结构的化合物的制备方法，包括：
将式I所示结构的化合物与多肽A、多肽B反应，制备得到式Ⅱ所示结构的化合物；
所述多肽A的结构为：
Figure BDA0003533259260000082
多肽B的结构为：
Figure BDA0003533259260000091
或将式I所示结构的化合物与多肽AB反应，制备得到式Ⅲ所示结构的化合物；
所述多肽AB的结构为：
Figure BDA0003533259260000092
根据本发明的实施方案，所述式I所示结构的化合物与多肽AB的摩尔比为(4～6):1，示例性为4:1、5:1、6:1。
根据本发明的实施方案，所述式I所示结构的化合物与多肽A的摩尔比为(4～6):1，示例性为4:1、5:1、6:1。
根据本发明的实施方案，所述式I所示结构的化合物与多肽B的摩尔比为(0.5～2):1，示例性为0.5:1、1:1、2:1。
根据本发明的实施方案，所述反应可以为通过叠氮-炔基的click反应。
根据本发明的实施方案，所述反应可以在溶剂中进行，所述溶剂选自DMSO、水中的一种或两种；优选为DMSO和水的混合溶剂。
根据本发明的实施方案，所述混合溶剂中，DMSO、水的混合体积比为(0.5～2):1，示例性为0.5:1、1:1、2:1。
根据本发明的实施方案，所述反应可以在催化剂存在下进行。例如，在抗坏血酸钠和溴化亚铜的催化作用下进行。
优选地，所述式I所示结构的化合物与抗坏血酸钠的质量比为(10～30):1，示例性为10:1、20:1、25:1、30:1。
优选地，所述式I所示结构的化合物与溴化亚铜的质量比为(40～60):1，示例性为40:1、50:1、60:1。
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括待反应结束后，对反应产物进行纯化的步骤。例如，所述纯化可以采用HPLC法分离。优选采用反向高效液相色谱梯度洗脱分离。
根据本发明的实施方案，所述式Ⅱ或式Ⅲ所示结构的化合物的制备方法，包括如下步骤：
方案一：
S201，将多肽A与式I所示结构的化合物加入到DMSO和水的混合溶液中，加入抗坏血酸钠和溴化亚铜，搅拌反应得到中间产物AIE-A；
S202，将多肽B与中间产物AIE-A加入到DMSO和水的混合溶液中，再加入抗坏血酸钠和溴化亚铜，搅拌反应得到式Ⅱ所示结构的化合物；其中，多肽A的结构为：
Figure BDA0003533259260000101
多肽B的结构为：
Figure BDA0003533259260000102
方案二：将多肽AB与式I所示结构的化合物加入到DMSO和水的混合溶液中，加入抗坏血酸钠和溴化亚铜，搅拌反应得到式Ⅲ所示结构的化合物；
多肽AB的结构为：
Figure BDA0003533259260000103
本发明通过选择具有良好的癌细胞选择性摄取和线粒体干扰能力的多肽序列RGDGPLGVRGRKKRKVRRR(多肽A)和序列HLAHLAHHLAHLAH(多肽B)，通过将多肽A与多肽B分别修饰于AIE分子两端，通过多肽A与多肽B的协同作用可以极大地增加探针对癌细胞的选择性和杀伤能力，同时减少药物分子对正常细胞的损害。
本发明还提供如式Ⅱ或式Ⅲ所示结构的化合物作为荧光探针的应用。优选地，所述荧光探针具有线粒体靶向效果和高效的活性氧产生能力，能够用于肿瘤细胞特异性靶向治疗。本发明还提供上述式Ⅱ或式Ⅲ所示结构的化合物在检测整合素(αvβ3)中的应用。
本发明还提供一种荧光探针，其含有如式Ⅱ或式Ⅲ所示结构的化合物。
本发明还提供上述荧光探针检测整合素的方法，该方法包括将整合素或含有整合素的待测目标物，与所述荧光探针混合。
根据本发明的实施方案，该方法还包括将含有整合素或含有整合素的待测目标物的待测试样品与所述荧光探针混合后，测定混合液的发光强度，计算得到整合素的浓度。其中，所述荧光探针在待测试样品中的浓度为0.005-2mM，示例性为1mM。
优选地，所述待测目标物的浓度通过代入待测目标物的浓度依赖型标准曲线计算得到。
根据本发明的实施方案，所述方法还包括配制所述荧光探针的溶液和整合素或含有整合素的待测目标物的溶液。
根据本发明的实施方案，所述方法具体包括以下步骤：
1)将如式Ⅱ或式Ⅲ所示结构的化合物溶于DMSO/水的混合溶剂中，得到所述荧光探针的溶液；
2)配制不同浓度的整合素或含有整合素的待测目标物的溶液；
3)绘制整合素或含有整合素的待测目标物的浓度依赖型标准曲线；
优选地，所述整合素的浓度依赖型标准曲线绘制的步骤如下：取荧光探针溶液，以其中一组溶液为空白样，向其余各组溶液中分别加入已知浓度的整合素溶液或含整合素的待测目标物的溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，加入待测目标物溶液后的各组混合液的荧光强度y为纵坐标，待测目标物溶液浓度x为横坐标，做出整合素或含整合素的待测目标物的浓度依赖型标准曲线；
4)检测整合素或含整合素的待测目标物的浓度；
优选地，所述待测目标物的浓度具体通过以下步骤测得：取荧光探针溶液和未知浓度的整合素溶液或含整合素的待测目标物的溶液混合，孵育，测定混合液的发光强度，代入步骤3)绘制的整合素的浓度依赖型标准曲线，得出整合素的浓度。
根据本发明的实施方案，步骤2)中所述整合素或含整合素的待测目标物溶液由整合素或含整合素的待测目标物与缓冲溶液混合得到；
优选地，所述缓冲溶液可以选自pH值为7～11的缓冲溶液；例如，所述缓冲溶液可以选自HEPES水溶液、MES缓冲溶液、Tris-HCl缓冲液、NaOH-H3BO3缓冲液、NaCO3-NaHCO3缓冲液、磷酸盐缓冲液等；
根据本发明示例性的实施方案，所述缓冲溶液选自pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；
根据本发明示例性的实施方案，所述整合素溶液由整合素与PBS溶液混合得到；所述整合素的浓度大于0且小于等于40μg/mL，优选为1-40μg/mL。
根据本发明的实施方案，步骤4)中所述孵育的温度可以选自30～50℃，优选地，所述孵育的温度选自35～40℃，根据本发明示例性的实施方案，所述孵育的温度为37℃；
所述孵育的时间可以选自1～10min，优选地，所述孵育的时间选自20～40min；根据本发明示例性的实施方案，所述孵育的时间为30min；
优选地，所述荧光探针溶液和不同浓度的整合素溶液的浓度和体积可以按任意比例混合。
本发明还提供了一种试剂盒，其包含上述荧光探针。
本发明还提供了一种生物传感器，其包含上述荧光探针。
本发明还提供上述荧光探针、试剂盒和/或生物传感器在检测整合素中的用途。
本发明的有益效果:
现有的模块化探针没有完全克服生物体的复杂环境从而走向临床应用，而且模块的邻位相互作用和排布方式也一直被忽略。有鉴于此，本发明在现有模块化探针开发策略的基础上探究排布方式对多模块探针细胞内性能的影响，以开发组成相同但排列方式不同的多模块探针。并通过对比不同排列方式的探针的细胞内性能以探究反应出模块的功能是否受到邻位模块的影响。同时双端基修饰位点的反应活性往往直接影响目标分子的合成产率，只有端基修饰基团选择合适，才能通过控制反应投料比来控制目标产物的生成，以防止副产物的生成。具体而言：
(1)本发明合成的AIE分子具有位于近红外区的荧光发射，具有位于近红外区的荧光发射和高效的活性氧产生能力(图5)等优点。
(2)本发明双端基修饰位点的AIE分子可以通过控制反应投料比和反应时间，以使多肽仅在AIE分子其中的一端修饰而另一端裸露，从而防止副产物的生成。
(3)本发明的多模块探针A-AIE-B对整合素具有良好的亲和力，具有肿瘤细胞特异性靶向的潜力和良好的生物安全性(图11，图14)，而AIE-AB探针具有较高的螺旋(图13)，因而显示出良好的癌细胞杀伤效果(图15)。且本发明的探针A-AIE-B对肿瘤细胞选择性更高，而探针AIE-AB的细胞毒性更大。因而可以通过调节模块的排列方式以得到不同功能需求的多模块探针。
附图说明
图1是具有双端基修饰位点的AIE分子的制备流程图。
图2为具有双端基修饰位点的AIE分子的核磁氢谱表征。
图3是具有双端基修饰位点的AIE分子的核磁碳谱表征。
图4是具有双端基修饰位点的AIE分子的质谱表征。
图5为具有双端基修饰位点的AIE分子的活性氧产生能力。
图6是AIE-AB的制备流程图。
图7为AIE-AB的质谱表征图。
图8是AIE-A的制备流程图。
图9为A-AIE-B的制备流程图。
图10为A-AIE-B的质谱表征图。
图11中(A)、(B)分别是双边修饰的多模块探针A-AIE-B与整合素结合后的荧光变化曲线和亲和力定量化。
图12中(A)、(B)分别是单边修饰的多模块探针AIE-AB与整合素结合后的荧光变化曲线和亲和力定量化。
图13是不同排列方式的多模块探针的圆二色谱表征。
图14中(A)、(B)分别是无光照条件下探针AIE-AB和A-AIE-B的细胞毒性。
图15中(A)、(B)分别是光照条件下探针AIE-AB和A-AIE-B的细胞毒性。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
本发明以下实施例中，多肽A、多肽B、多肽AB均购买于吉尔生化(上海)有限公司。
实施例1
参照图1，一种双修饰位点的AIE分子合成方法，包括以下步骤：
步骤S101，称取二苯甲酮2g，四氯化钛2mL和锌粉2g溶解在100mL四氢呋喃中，70度搅拌冷凝回流24h，反应结束后用二氯甲烷/水(体积比为1：1)混合溶剂萃取，收集有机相用旋转蒸发仪旋干溶剂，粗产物用硅胶柱以石油醚/乙酸乙酯＝50/1为洗脱剂纯化得到四苯基乙烯，收率为34.3％(其中：收率＝(实际产量/理论产量)*100％)；
步骤S102，称取四苯基乙烯1g，乙酸钯200mg，碳酸钾500mg，三邻甲苯基膦100mg，1mL乙烯基吡啶溶解在100mL N-甲基吡咯烷酮中搅拌冷凝回流24h，反应结束后冷却加300mL水后抽滤得到固体粗产物，粗产物用硅胶柱以二氯甲烷/乙酸乙酯＝50/1为洗脱剂得到TPE-Py，收率为79.4％；
步骤S103，称取TPE-Py 500mg，1,6-二碘丁烷1mL，溶解在100mL乙腈中，搅拌冷凝回流24h反应结束后用旋转蒸发仪旋干溶剂得到固体粗产物，粗产物用硅胶柱以二氯甲烷/乙醇＝50/1为洗脱剂得到TPE-I，收率为58.4％；
步骤S104，称取TPE-I 300mg，叠氮化钠200mg溶解在100mL乙腈中，搅拌冷凝回流24h反应结束后用旋转蒸发仪旋干溶剂得到固体粗产物，粗产物用硅胶柱以二氯甲烷/甲醇＝50/1为洗脱剂得到AIE，收率为77.9％。
本实施例制得得到的AIE分子的氢谱表征如图2，碳谱表征如图3，质谱表征如图4。以上表征证明AIE分子制备成功。
称取1.0mol本实施例制备得到的AIE分子固体，溶解在1mL DMSO中得到1mmol/L的AIE母液；称取5.0mol活性氧检测试剂9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)溶解在1mLDMSO中得到5mmol/L的ABDA母液；取10μL上述ABDA母液加入到1mL去离子水中，再加入5μL上述AIE母液混匀，用紫外分光光度计记录ABDA在300-500nm的紫外吸收光谱，每光照30s，记录一次紫外吸收光谱。
结果如图5所示，在未加入AIE分子时，白光照射下ABDA的紫外吸收值几乎无变化；而加入AIE分子后，在白光照射下ABDA的吸收值在4min内迅速下降。由此表明：AIE分子具有优异的活性氧产生能力。
实施例2
参照图6，多模块探针AIE-AB的制备方法，包括如下步骤：
称取50mg AIE分子与多肽AB以摩尔投料比5：1加入到DMSO和水体积比为1：1的混合溶剂中，加入2mg抗坏血酸钠和1mg溴化亚铜，室温充分搅拌24h，反应结束后对反应溶液进行反向高效液相色谱梯度洗脱(方法为：将样品溶解在水溶液或乙腈中，应用到来自Teknokroma的Kromasil C18柱(10μm，250×4.6mm)上，并以2mL/min的速率洗脱，梯度从20％到100％(0.01min20％、20min 40％、25min 60％、30min 90％、50min 100％溶剂B；其中：溶剂A是水(0.1％TFA溶液)，溶剂B是乙腈(0.1％TFA溶液))，分离纯化后即得到AIE-AB，收率为27.4％。
图7为本实施例制备得到的AIE-AB的质谱表征图，图中结果表明AIE-AB分子制备成功。
实施例3
参照图8，多模块探针AIE-A的制备方法，包括如下步骤：
称取50mg AIE分子与多肽A以摩尔投料比5：1加入到DMSO和水体积比为1：1的混合溶剂中，加入2mg抗坏血酸钠和1mg溴化亚铜，室温充分搅拌24h，反应结束后对反应溶液进行反向高效液相色谱梯度洗脱(方法为：将样品溶解在水溶液或乙腈中，应用到来自Teknokroma的Kromasil C18柱(10μm，250×4.6mm)上，并以2mL/min的速率洗脱，梯度从20％到100％(0.01min 20％、20min 40％、25min 60％、30min 90％、50min 100％溶剂B；其中：溶剂A是水(0.1％TFA溶液)，溶剂B是乙腈(0.1％TFA溶液))，分离纯化后即得到AIE-A，收率为34.7％。
实施例4
多模块探针A-AIE-B的制备方法，包括如下步骤：
参照图9，将10mg实施例3制得的AIE-A与多肽B以摩尔投料比1：1加入到体积比为1：1的DMSO和水的混合溶剂中，加入2mg抗坏血酸钠和1mg溴化亚铜，并于室温下搅拌24h，反应结束后对反应溶液进行反向高效液相色谱梯度洗脱(方法为：将样品溶解在水溶液或乙腈中，应用到来自Teknokroma的Kromasil C18柱(10μm，250×4.6mm)上，并以2mL/min的速率洗脱，梯度从20％到100％(0.01min 20％、20min 40％、25min 60％、30min 90％、50min100％溶剂B；其中：溶剂A是水(0.1％TFA溶液)，溶剂B是乙腈(0.1％TFA溶液))，分离纯化后即得到A-AIE-B,收率为48.3％。
图10为本实施例制备得到的A-AIE-B的质谱表征图，图中结果表明A-AIE-B分子制备成功。
实施例5
探针与整合素的亲和力检测：用DMSO/水＝1：1的混合溶剂分别溶解探针固体(AIE、AIE-AB、A-AIE-B)，得到1mM的探针母液(AIE、AIE-AB、A-AIE-B)保存在-20℃冰箱。
分别取10μL探针母液(AIE-AB、A-AIE-B)到1mL PBS溶液(50mM，pH＝7.4)中，再往PBS溶液中加不同浓度的整合素(ανβ3)(0，10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL)，在37℃下孵育0.5h，用荧光光谱仪检测记录混合溶液的荧光。
如图11，12所示，通过拟合曲线的斜率分别计算出两探针对整合素的亲和力。其中：AIE-AB探针对整合素的亲和力为0.020，A-AIE-B探针对整合素的亲和力为0.057。由此表明：A-AIE-AB探针相对AIE-AB探针具有更高的潜在肿瘤选择性。
探针的圆二色光谱检测：分别取50μL上述探针母液(AIE、AIE-AB、A-AIE-B)加入到1mL PBS溶液(50mM，pH＝7.4)/三氟乙醇＝1：1(体积比)的混合溶剂中，用圆二色谱仪检测记录混合溶液的光谱，结果如图13所示。从图中可以看出，探针AIE-AB比探针A-AIE-B在208nm和222nm处显示出更高的负吸收。由此表明：探针AIE-AB比探针A-AIE-B具有更高的α-螺旋比例，因而具有更大的癌细胞治疗潜力。
探针的生物安全性和肿瘤细胞毒性检测：在37℃烘箱中用细胞培养基(10％胎牛血清，1％青霉素，1％链霉素)培养HaLa细胞三代以上，用胰蛋白酶消化细胞后离心，弃去上清，把细胞稀释到8000-10000个/100μL再加入到96孔板中，继续培养24h，在每个孔中加入不同浓度的(0，2.5μM，5μM，10μM，15μM，20μM)探针继续培养24h，移除培养基，每个孔里再加入10μL 1mM MTT和100μL新鲜培养基，继续培养4h，吸出培养基，每个孔中再加入100μLDMSO，再在摇床上震荡10min，用酶标仪检测记录每个孔在570nm处的吸光度值，用公式(AS/A0×100％)计算出每组样品的细胞存活率。
结果如图14所示，非光照条件下，两探针的细胞存活率都在80％以上。由此表明：本发明的探针毒性均很小，具有良好的生物安全性。同时如图15所示，在200mW/cm2白光光照条件下，加入20μM的AIE-AB探针时，细胞存活率为29％，而加入20μM的A-AIE-B探针的细胞存活率为60％。由此表明：AIE-AB探针比A-AIE-B探针的具有更高的潜在肿瘤治疗效果。由此表明，探针A-AIE-B对肿瘤细胞选择性更高，而探针AIE-AB的细胞毒性更大。因而可以通过调节模块的排列方式以得到不同功能需求的多模块探针。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种式Ⅱ或式Ⅲ所示结构的化合物：
Figure QLYQS_1
式Ⅱ
Figure QLYQS_2
式Ⅲ。
2.权利要求1所述式Ⅱ或式Ⅲ所示结构的化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将式I所示结构的化合物与多肽A、多肽B反应，制备得到式Ⅱ所示结构的化合物；
所述多肽A的结构为：
Figure QLYQS_3
多肽B的结构为：
Figure QLYQS_4
；
或将式I所示结构的化合物与多肽AB反应，制备得到式Ⅲ所示结构的化合物；
所述多肽AB的结构为：
Figure QLYQS_5
；
所述式I所示结构的化合物的结构为：
Figure QLYQS_6
；
所述式I所示结构的化合物与多肽AB的摩尔比为(4～6):1；
所述式I所示结构的化合物与多肽A的摩尔比为(4～6):1；
所述式I所示结构的化合物与多肽B的摩尔比为(0 .5～2):1。
3.根据权利要求2所述的式Ⅱ或式Ⅲ所示结构的化合物的制备方法，其特征在于，所述式Ⅰ所示结构的化合物的制备方法包括将化合物4与叠氮化钠反应，制备得到上述如式Ⅰ所示结构的化合物；
所述化合物4具有如下结构：
Figure QLYQS_7
；
所述叠氮化钠与化合物4的质量比为（1~2）：1。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述化合物4由如下方法制备得到，包括：将化合物3和1,6-二碘丁烷进行反应，得到所述化合物4；
所述化合物3具有如下结构：
Figure QLYQS_8
；
所述化合物3与1,6-二碘丁烷的反应比为(400~600)mg:1 mL；
所述化合物3由如下方法制备得到，包括：将化合物2和乙烯基吡啶进行反应，得到所述化合物3；
所述化合物2具有如下结构：
Figure QLYQS_9
；
所述化合物2由如下方法制备得到，包括：将化合物1与金属进行反应，得到化合物2；
所述化合物1具有如下结构：
Figure QLYQS_10
；
所述化合物1与金属的反应质量比为（1~2）：1。
5.一种荧光探针，其特征在于，其含有如权利要求1所述式Ⅱ或式Ⅲ所示结构的化合物和/或权利要求2所述制备方法制得的式Ⅱ或式Ⅲ所示结构的化合物。
6.一种试剂盒，其特征在于，其包含权利要求5所述的荧光探针。
7.一种生物传感器，其特征在于，其包含权利要求5所述的荧光探针。
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