CN110606859A - 聚集诱导发光化合物、其制备方法及其检测免疫相关的目标分析物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于检测免疫相关的目标分析物的多功能聚集诱导发光(AIE)化合物、其制备方法及其检测目标分析物的应用。该化合物能够用于融合了荧光和等离子体比色两种信号模式的检测方法以及相关的试剂盒，以用于检测各种免疫相关的目标分析物，尤其是能够实现对病毒的准确、快速、简便并且可靠的鉴定。

Description

聚集诱导发光化合物、其制备方法及其检测免疫相关的目标 分析物的应用
技术领域
本发明涉及功能材料领域，特别是涉及一种多功能的聚集诱导发光化合物、其制备方法及其检测免疫相关的目标分析物的应用，例如所述化合物用于制备检测诸如病毒颗粒等目标分析物的应用(例如，快速检测和鉴定病毒)以及制备试剂盒的应用。
背景技术
许多免疫相关的微生物(如细菌或者病毒，特别是病毒)、细胞、蛋白和/核酸都与人类健康和死亡密切相关，因而对这些物质，尤其是对病毒进行检测和/或鉴定至关重要。
特别是，新出现和反复流行的一系列病毒感染性病原体，从“A”病毒流感病毒到具有高发病率和高死亡率的“Z”卡病毒，严重威胁着人类健康，成为主要的公共卫生问题之一。例如，人感染禽流感A(H7N9)病毒于2013年3月在中国被正式发现，引起了全世界的广泛关注。根据世界卫生组织(WHO)于2017年10月发表的一份官方报告，自2013年初以来共有1564例实验室确认的人类感染H7N9病毒。另一种可能导致严重的人类手足口病(HFMD)的人类肠道病毒71型(EV71)病毒，已成为一场流行病危机。手足口病的频率和严重程度对婴幼儿的健康构成严重威胁。在EV71流行之后，寨卡病毒(ZIKV)迅速爆发并且自2007年以来至少影响了84个国家和地区。ZIKV可以从孕妇传染给她的胎儿，这可能导致某些先天缺陷。因此，迫切需要开发灵敏准确的病毒临床诊断方法，尤其是在感染早期，可以防止病毒传播和疾病爆发。
然而，目前用于检测这些免疫相关的物质，特别是病毒的方法仍然存在很多缺点。因此，仍然需要改善的检测病毒等免疫相关物质的方法以及用于这些方法的新材料。
发明内容
本发明提供了新型的可用于检测免疫相关的目标分析物的多功能聚集诱导发光(AIE)化合物、其制备方法及其检测目标分析物的应用。该化合物能够用于融合了荧光和等离子体比色两种信号模式的检测方法以及相关的试剂盒，以用于检测各种免疫相关的目标分析物，尤其是能够实现对病毒的准确、快速、简便并且可靠的鉴定。
具体来说，本发明提供了：
1、一种聚集诱导发光化合物，由下式I表示：
其中，表示取代或者未取代的聚集诱导发光骨架，在取代的情况下，取代基选自取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基、硝基、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和其他氨基酸类似物中的至少一者；
L表示可携带正电荷的氧化还原部分，其使得聚集诱导发光化合物可溶于水性溶剂中，
M表示酶可切割部分，
n表示1-20中的整数，以及
m表示1-20中的整数。
2、一种制备聚集诱导发光化合物的方法，包括下列步骤：
(1)在有机溶剂的存在下，将式III的化合物与式IV的化合物反应，从而得到式II的中间体化合物，以及
(2)在有机溶剂以及脱保护剂的存在下，将式II的化合物进行脱保护，从而得到式I的化合物；
其中表示取代或者未取代的聚集诱导发光骨架，在取代的情况下，取代基选自取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基、硝基、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和其他氨基酸类似物中的至少一者；
B为亲核基团，
E为亲电基团，
L表示可携带正电荷的氧化还原部分，其使得聚集诱导发光化合物可溶于水性溶剂中；
M表示酶可切割部分，
P表示酶可切割部分的保护基团；
n表示1-20中的整数，以及
m表示1-20中的整数。
3、根据上述的方法，所述有机溶剂选自芳香烃类溶剂、脂肪烃溶剂、含氧杂环类溶剂、含腈基基团的溶剂，更优选乙腈；
任选地，所述脱保护剂选自三甲基甲硅烷基溴化物TMSBr或三甲基硅烷碘化物TMSI。
4、根据上述的方法，所述亲核基团选自-N(R)X，
其中R各自独立地选自H、取代或未取代的C1-C18羟烷基、氨基、取代或未取代的C2-C18烷氨基、取代或未取代的C1-C18烷基、取代或未取代的C2-C18不饱和烃基、取代或未取代的C2-C18杂烷基、取代或未取代的C3-C18环烃基、取代或未取代的C1-C18杂烃基、取代或未取代的C6-C18芳环烃基、取代或未取代的杂芳基或其组合中的至少一者，在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者；
x为1或2；
任选地，所述亲电基团选自卤素，优选F-、Cl-、Br-或I-。
5、根据上述的化合物或者上述的方法，所述氧化还原部分如下式V表示：
D-Ar-O-
式V
其中，D表示二价连接基团，任选地含有杂原子，如O、S、N，任选地，杂原子直接与聚集诱导发光骨架连接；
Ar表示芳香环基团，优选取代或未取代的C6-C18芳香族环烃基、取代或未取代的成环碳原子5-18的芳香族杂环基或其组合，在取代的情况下，芳香族环烃基和芳香族杂环基的至少一个氢被选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者取代；并且
其中-O-表示氧原子直接连接在芳香环上。
6、根据所述的化合物或者所述的方法，所述酶可切割部分如下式VI表示：
其中，F表示P或C；
R1各自独立地选自氢、取代或未取代的C1-C18烷基、取代或未取代的C2-C18不饱和烃基、取代或未取代的C1-C18杂烷基、取代或未取代的C3-C18环烷基、取代或未取代的C3-C18杂环烷基、取代或未取代的C6-C18芳基、取代或未取代的C6-C18杂芳基、CnH2n+1、C10H7、C12H9、OC6H5、OC10H7、OC12H9、CnH2nCOOH、CnH2nNCS、CnH2nN3、CnH2nNH2、CnH2nSH、CnH2nCl、CnH2nBr、CnH2nI、N(CnHm)2、SCnHm、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和其他氨基酸类似物中的至少一者，
在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者；
y表示1或2。
7、根据所述的化合物或者所述的方法，所述聚集诱导发光骨架选自下列中的至少一者：
以及
8、根据所述的化合物或者根据所述的方法，所述氧化还原部分选自下列中的至少一者：
9、根据所述的化合物或者根据所述的方法，所述酶可切割部分选自下列中的至少一者：
R1此处应该为O-R3,其中O为氧原子，R3为取代或未取代的C1-C18烷基、取代或未取代的C2-C18不饱和烃基。
10、一种用于检测免疫相关的目标分析物的成套组合，包括：
上述任意的化合物，以及
免疫复合物，其包含所述免疫相关的目标分析物。
11、根据所述的成套组合，还包括能够被所述氧化还原部分还原从而形成纳米颗粒的金属离子和/金属纳米颗粒。
12、根据所述的成套组合，所述免疫复合物还包含免疫磁珠、任选的特异于所述目标分析物的抗体以及任选的用于切割所述酶切割部分的酶，任选地，所述酶为磷酸酶、酯酶和/或蛋白酶。
13、根据所述的成套组合，所述免疫相关的目标分析物选自病毒、细菌、细胞、酶、核酸、蛋白质、多糖、固醇类、生物因子等中的至少一者。
14、根据所述的成套组合，所述成套组合为用于检测病毒的试剂盒。
15、一种检测免疫相关的目标分析物的方法，包括下列步骤：
提供包含所述免疫相关的目标分析物的免疫复合物；以及
使所述的化合物与所述免疫复合物接触。
16、根据上述的检测免疫相关的目标分析物的方法，所述接触包括通过酶可切割部分的切割而释放氧化还原活性部分，
任选地，所述免疫复合物还包含免疫磁珠、任选的特异于所述目标分析物的抗体以及任选的用于切割所述酶切割部分的酶，任选地，所述酶为磷酸酶、酯酶和/或蛋白酶。
17、根据上述的检测免疫相关的目标分析物的方法，所述方法还包括使所述的化合物与包含等离子共振纳米颗粒的溶液接触，任选地，所述溶液还包含金属离子，并且释放的氧化还原活性部分还原金属离子以产生可观察到的颜色比色变化，优选地，金属离子包含银、金、铜和铂中的至少一者。
18、根据上述的检测免疫相关的目标分析物的方法，所述等离子共振纳米颗粒为Au纳米颗粒，任选地，释放的氧化还原活性部分还原Ag离子从而在Au纳米颗粒表面形成Ag纳米壳而产生可观察到的颜色比色变化，优选地，颜色比色变化比色变化通过UV-vis光谱仪定量或通过肉眼裸眼进行观察。
19、根据上述的检测免疫相关的目标分析物的方法，所述接触包括切割所述酶可切割部分，从而产生能够聚集诱导发光的聚集体，任选地，所述聚集体发出荧光，任选地，通过荧光分光光度计测量荧光光谱。
20、根据上述的检测免疫相关的目标分析物的方法，所述免疫相关的目标分析物选自病毒、细菌、细胞、酶、核酸等中的至少一者，优选病毒颗粒。
附图说明
图1示出根据本发明的一个例子利用多功能AIE化合物进行荧光和等离子体比色双模态病毒检测的示意图。
图2示出根据本发明的一个实施例，化合物TPE-DMA和TPE-APP的合成路线。
图3示出化合物TPE-DMA的核磁氢谱。
图4示出化合物TPE-DMA的核磁碳谱。
图5示出TPE-APP的晶体结构。
图6示出化合物TPE-APP的核磁氢谱。
图7示出化合物TPE-APP的核磁碳谱。
图8示出化合物TPE-APP在氘代氯仿中的核磁磷谱。
图9示出TPE-DMA的AIE性质：(a)在不同体积比例的DEA/DMSO混合物中，TPE-DMA在365nm紫外灯下拍摄的照片。(b)在不同体积比例的DEA/DMSO混合物中1mM的TPE-DMA的荧光光谱图；(c)DEA/DMSO混合物的不同体积比例与TPE-DMA的相对荧光强度的散点关系图。
图10示出：(a)在Au纳米溶液中，4-HA可以还原Ag+并在Au纳米粒表面形成Ag纳米壳层，从而导致明显的颜色变化；(b)在不含Ag+的情况下，Au纳米粒自身与4-HA不反应，也不表现出颜色的变化；(c)4-HA可以还原Ag+以形成Ag纳米粒；(d)为(a)的吸收光谱；(e)为(b)的吸收光谱以及(f)为(c)的吸收光谱。
图11示出Au纳米粒和Au/Ag核壳纳米粒的透射电镜(TEM)图像：(a)在不存在4-HA的情况下Au纳米粒与Ag+混合溶液的TEM图像；(b)在50μM 4-HA条件下Au纳米粒与Ag+混合溶液的TEM图像；(c)在150μM 4-HA条件下Au纳米粒与Ag+混合溶液的TEM图像；(d)和(e)分别是图像(b)和(c)的放大图；上述结果表明碱性溶液中的具有氧化还原活性的4-HA可以还原Ag+并原位沉积在Au纳米粒子的表面上，从而形成Au/Ag核壳型纳米粒。
图12示出不同浓度的ALP对Au/Ag核壳纳米粒生长的影响；含有100μM TPE-APP的溶液在与不同浓度的ALP在4℃孵育30分钟后，然后向水解产物中分别加入3.2nM的Au纳米粒和1.2nM的Ag+，并在室温下再孵育30分钟；(a)照片显示在用100μM TPE-APP不同浓度的ALP共孵育后，所制备的具有不同颜色的Au/Ag核壳纳米粒的溶液；由于ALP的催化作用，可以观察到从红色到黄色再到棕色的明显颜色变化；不加入Ag+的对照实验中没有颜色的变化；(b)与(c)分别对应于图(a)上方和下方的吸收光谱。
图13示出ALP介导的酶促催化反应用于调控Au/Ag核壳纳米粒生长的形貌照片和元素分析：(a)Au/Ag核壳纳米粒的高分辨透射电镜(HRTEM)图像；(b)单个Au/Ag核壳纳米粒的HRTEM图像；(c)Au/Ag核壳纳米粒的扫描透射电镜(STEM-HAADF)图像；(d)单个Au/Ag核壳纳米粒的STEM-HAADF图像；(e)单个Ag纳米粒的STEM-HAADF图像；(f)单个Au纳米粒的STEM-HAADF图像；(g，h)单个Au/Ag核壳纳米粒的元素线扫描(EDXS)图谱。(i)单个Au/Ag核壳纳米粒的元素点扫描(EDXS)图谱。
图14示出免疫磁珠(IMNs)的表征：与Alexa-Fluor-488绿光染料修饰的donkey F(ab’)2抗鼠IgG(H&L)抗体孵育后，磁珠(MNs)(c，d)和IMNs的免疫复合物(a，b)的明场(a，c)和荧光图像(b，d)；IMNs和MNs之间存在显著差异，显示抗VP1抗体成功偶联至MNs表面。
图15示出免疫磁珠(IMN)的扫描电子显微镜(SEM)图像；(c，d)与Alexa-Fluor-488绿光染料修饰的donkey F(ab’)2抗鼠IgG(H&L)抗体孵育后的MNs的SEM图像；(a，b)与Alexa-Fluor-488绿光染料修饰的donkey F(ab’)2抗鼠IgG(H&L)抗体孵育后的IMNs的SEM图像；图像(b)和(d)分别是图像(a)和(c)的放大图。
图16示出从IMN-EV71病毒粒子复合物获得的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，其中泳道2-5分别对应的EV71浓度为3×102、3×103、3×104和3×105ng/mL；泳道1对应于EV71阳性参照；泳道6-8分别对应于水、MN和IMN；泳道9对应于DL 2000参照物；上述结果与RT-qPCR结果一致。
图17示出在6天的储存中，IMNs的平均水合直径和分布系数(PDI)。
图18示出使用视觉检测模式对不同EV71病毒粒子进行裸眼检测的示意图。
图19示出优化ALP活性测定中的TPE-APP浓度和孵育时间：(a)在10mM DEA缓冲液(pH 9.8，含有0.1mM MgCl2)中，不同浓度的TPE-APP(0、1.0、5.0、10、20、50、80、100、150、200、300和500μM)下，ALP(1.05nM)的荧光发射光谱；(b)在ALP作用期间TPE-APP的相应荧光强度；(c)在40分钟孵育期间，在3.5nM ALP下，TPE-APP(100μM)的荧光发射光谱；(d)37℃下在10mM DEA缓冲液(pH 9.8，含有0.1mM MgCl2)中,在不同浓度的ALP(从下到上：0、0.7、1.4和3.5nM)作用下，100μM TPE-APP的荧光强度与反应时间的关系；(e)在10mM DEA缓冲液中孵育30分钟，100μM TPE-APP在不同浓度ALP(0、0.002、0.005、0.01、0.02、0.1、0.2、0.5、2.0和5.0ng/mL)作用下的荧光发射光谱图；(f)在存在/不存在ALP和0.2mM或10-4mM钒酸钠(Na3VO4，Van)的情况下，TPE-APP的荧光光谱；内部插图显示了365nm紫外灯下的荧光图，如上面的箭头所示，其与单独的TPE-APP，单独的Van；TPE-APP+ALP和TPE-APP+Van+ALP的光谱一致。
图20示出基于多功能AIE化合物的EV71病毒粒子检测的双模态免疫分析的特异性研究：(a)纯化的EV71病毒颗粒的TEM图像；(b)使用IMN捕获EV71病毒粒子的RT-qPCR分析；曲线V-VIII对应的EV71浓度分别为3×102，3×103，3×104和3×105ng/mL，而Ct值分别为22.69，19.04，16.11和14.33；曲线I和II分别是MN和IMN；曲线III和IV分别是阴性和阳性EV71病毒粒子对照；其中阳性对照组的Ct值为21.36；(c)用于特异性检测EV71病毒粒子的荧光强度的直方图；CAV2，CAV4，CAV6，CAV16和ECHO-18用作阴性对照，PBS-BSA用作空白对照。内部插图为相应的荧光光谱图，下方为365nm紫外灯下的荧光照片；(d)在EV71病毒体存在/不存在下410nm处的吸光度直方图；内部插图为吸收光谱图。照片为可以通过裸眼识别的EV71病毒的照片。
图21示出所建立的ALP浓度与Au/Ag核壳纳米粒的颜色变化之间的相关关系：(a)不同浓度ALP触发的检测溶液中Au纳米粒和Au/Ag核壳纳米粒的吸收光谱图和照片；Au纳米粒(b)和所得Au/Ag核壳纳米粒(c，d)的TEM图像；比例尺：50nm；(e)在没有ALP的情况下Au纳米粒的暗场成像(DMF)图；(f)在12nM ALP下得到的检测溶液的DMF图像；比例尺：10μm。
图22示出通过改变与MN结合的单克隆识别抗体Abs以及以其他病毒粒子作为对照，来检验双模态免疫方法用于ZIKV病毒粒子检测的特异性；左图：用于特异性检测H7N9病毒的荧光强度直方图，其中DENV-2，CHIKV，JEV和YFV用作阴性对照，PBS-BSA用作空白对照。内部插图为荧光光谱图，下方为365nm紫外灯下的荧光照片；右图：在存在/不存在ZIKV时410nm处的吸光度的直方图；内部插图为吸收光谱图。照片为可以通过裸眼识别的ZIKV图像。
图23示出通过改变与MN结合的单克隆识别抗体Abs以及以其他病毒粒子作为对照，来检验双模态免疫方法用于H7N9病毒粒子检测的特异性；左图：用于特异性检测H7N9病毒的荧光强度直方图，其中H9N2，H5N1，H1N1和NDV用作阴性对照，PBS-BSA用作空白对照；内部插图为荧光光谱图，下方为365nm紫外灯下的荧光照片；右图：在存在/不存在H7N9时410nm处的吸光度的直方图。内部插图为吸收光谱图；照片为可以通过裸眼识别的H7N9图像。
图24示出基于多功能AIE化合物的双模态免疫分析方法检测梯度浓度的EV71病毒粒子；(a)不同浓度是EV71病毒的紫外-可见光谱；(b)随着EV71浓度的增加，410nm处的吸光度；内部插图为在EV71低浓度下的测定的相应线性范围；(c)在超低浓度下检测EV71病毒粒子的荧光光谱；(d)EV71检测溶液的荧光强度与EV71浓度的相关关系图；内部插图为EV71量化的校准曲线。
图25示出24名肠道病毒感染性手足口患者的临床样本检测结果；照片(a，b)两侧的顺序与表格中的顺序(中间，a，b)直接对应；使用EV71病毒体检测的双模态方法，来自EV71阴性手足口患者的样本显示出纳米金的红色，并且在365nm紫外灯下也不发出荧光；尽管EV71阳性手足口患者的大多数样本产生黄色或棕色的Au/Ag核壳纳米粒，可是由于EV71病毒颗粒的超低浓度，其中两个样本仍保持红色AuNP分散体；但在荧光检测模式中，来自EV71阳性手足口患者的10个样本在365nm紫外灯下均显示出荧光信号并可得到检测溶液的荧光光谱。双模态免疫测定的结果与RT-qPCR分析的结果完全一致；(P：阳性；N：阴性)。
图26示出：比色检测的对照实验；对照实验表明，在Au纳米粒溶液中，4-HA可以还原Ag+，并表现出快速显著的颜色变化。
图27示出ALP触发的比色法的对照实验：图片下方为添加到每个孔中的试剂。
图28示出从不同肠道病毒感染的手足口患者收集的24个喉咙和粪便样本的信息以及基于多功能AIE化合物的双模态免疫测定和RT-qPCR的样本检测结果。
图29示出TPE-APP的晶体数据和结构信息。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方案。下面描述的实施方案是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施方案中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
定义和一般术语
现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。
应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。
除非另外说明，应当应用本文所使用的下列定义。出于本发明的目的，化学元素与元素周期表CAS版，和《化学和物理手册》，第75版，1994一致。此外，有机化学一般原理可参考“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和“March's Advanced Organic Chemistry”by Michael B.Smith and Jerry March,JohnWiley&Sons,New York:2007中的描述，其全部内容通过引用并入本文。
除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个(种)”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。
术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
另外，需要说明的是，除非以其他方式明确指出，在本发明中所采用的描述方式“各…独立地为”与“…各自独立地为”和“…独立地为”可以互换，均应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
在本说明书的各部分，本发明公开化合物的取代基按照基团种类或范围公开。特别指出，本发明包括这些基团种类和范围的各个成员的每一个独立的次级组合。例如，术语“C1-18烷基”包括甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
在本发明的各部分，描述了连接取代基。当该结构清楚地需要连接基团时，针对该基团所列举的马库什变量应理解为连接基团。例如，如果该结构需要连接基团并且针对该变量的马库什基团定义列举了“烷基”或“芳香族基团”，则应该理解，该“烷基”或“芳基”分别代表连接的亚烷基基团或亚芳香族基团。
本发明使用的术语“烃基”包括芳香族烃基和脂肪族烃基。脂肪族烃基包括“烷基”或“烷基基团”，烯基和炔基，它们可以是饱和或不饱和的直链或支链二价烃基基团。所述烃基可以任选地被一个或多个本发明描述的取代基所取代。在本发明的一个实施方案中，烷基基团含有1-18个碳原子。在另一实施方案中，烷基基团含有1-12个碳原子；在又一实施方案中，烷基基团含有1-6个碳原子；再一实施方案中，烷基基团含有1-4个碳原子；还在一实施方案中，烷基基团含有1-3个碳原子。
烷基基团的实例包含，但并不限于，C1-12烷基，如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，2-戊基，3-戊基，2-甲基-2-丁基，3-甲基-2-丁基，3-甲基-1-丁基，2-甲基-1-丁基，正己基，2-己基，3-己基，2-甲基-2-戊基，3-甲基-2-戊基，4-甲基-2-戊基，3-甲基-3-戊基，2-甲基-3-戊基，2,3-二甲基-2-丁基，3,3-二甲基-2-丁基，正庚基，正辛基，等等。
术语“烯基”表示碳原子的直链或支链一价烃基，其中至少有一个不饱和位点，即有一个碳-碳sp2双键，其中，所述烯基基团任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代，其包括“cis”和“tans”的定位，或者"E"和"Z"的定位。在一实施方案中，烯基基团包含2-8个碳原子；在另一实施方案中，烯基基团包含2-6个碳原子；在又一实施方案中，烯基基团包含2-4个碳原子。烯基基团的实例包括，但并不限于，乙烯基、烯丙基等等。
术语“炔基”表示碳原子的直链或支链一价烃基，其中至少有一个不饱和位点，即有一个碳-碳sp三键，其中，所述炔基基团任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。在一实施方案中，炔基基团包含2-8个碳原子；在另一实施方案中，炔基基团包含2-6个碳原子；在又一实施方案中，炔基基团包含2-4个碳原子。炔基基团的实例包括，但并不限于，乙炔基、炔丙基、1-丙炔基等等。
术语“羧基”，无论是单独使用还是和其他术语连用，如“羧烷基”，表示-CO2H；术语“羰基”，无论是单独使用还是和其他术语连用，如“氨基羰基”或“酰氧基”，表示-(C＝O)-。
术语“卤素”和“卤代”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。
术语“芳香族基团”包括从芳香环中去掉两个氢原子从而与其他基团直接连接的基团。优选地，芳香族基团在成环原子中具有至少一个杂原子，例如N、O或S。
术语“芳香族环烃基”包括单环、双环和三环的芳基，其中，至少一个环体系是芳香族的，其中每一个环体系包含6-18个原子组成的环。芳基基团通常，但不必须地通过芳基基团的芳香性环与母体分子连接。术语“芳基”可以和术语“芳香环”或“芳环”交换使用。芳基基团的实例可以包括苯基、联苯基、萘基和蒽。所述芳基基团任选地被一个或多个本文所描述的取代基所取代。
在本发明中，取代基可以选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者。
芳香族环烃基和芳香族杂环基的例子包括(例如)苯基、萘基、苯基、萘基、蒽基、菲基、并四苯基、芘基、苯并[c]菲基、苯并菲基、芴基、苯并芴基、二苯并芴基、联苯基、三联苯基、四联苯基、荧蒽基、吡咯基、吡嗪基、吡啶基、嘧啶基、三嗪基、吲哚基、异吲哚基、咪唑基、呋喃基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、咔唑基、菲啶基、吖啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、噁唑基、噁二唑基、呋咱基、噻吩基、苯并噻吩基、二氢吖啶基、氮杂咔唑基、喹唑啉基等。
取代基的例子包括：
存在多种基于免疫方法检测免疫相关的目标分析物(例如病毒)的方法，例如基于特异性抗原-抗体反应和酶促催化的酶联免疫吸附测定(ELISA)。这些方法通常受制于低灵敏度的缺点。虽然聚合酶链反应(PCR)分析被认为是高灵敏的病毒鉴定的黄金标准，但复杂的样品预处理和昂贵仪器依赖限制了它们的广泛应用。
最近，许多基于金(AuNP)或银纳米粒(AgNP)的局部表面等离子体共振(LSPR)特性的比色分析方法已经应用于各种生物目标物的测定并且不需要使用昂贵的仪器。它们通常取决于酶与底物之间的特定反应或非特异性静电相互作用以产生裸眼可视化的颜色变化。然而，基于检测溶液的吸光度的这些测定通常表现出较低的灵敏度。相比之下，荧光测定法表现出超过一千倍的灵敏度，并且成为一种具有吸引力的检测方法。伴随着无机量子点(QD)和有机荧光团的快速发展，荧光方法已经被广泛应用于生物目标物的检测，其与等离子体比色测定法相比，具有更高的信噪比和灵敏度。然而，这些荧光材料的检测信号通常被背景荧光信号干扰，并且由于聚集引起的猝灭(ACQ)效应,其荧光强度在目标物浓度增加的同时而倾向于降低。与传统的有机荧光染料不同，具有螺旋桨形结构的聚集诱导发光(AIE)化合物或者骨架分子通常在溶液中不发出或发出较弱的荧光，但在聚集状态下荧光显著增强，从而成为一中优异的荧光材料。AIE染料聚集体在发光强度，耐光漂白和生物相容性等方面具有显著优势。AIE化合物或者骨架分子能够被广泛用于酶、核酸、癌细胞、病毒或者细菌等的检测分析。
本发明提供了一种新的多功能AIE化合物，其能够以超灵敏度和双重模式对免疫相关的目标分析物(例如的病毒粒子)进行免疫分析，并且在单一检测系统中融合了荧光和等离子体比色两种信号模式。首先，一种具有酶促切割位点的可溶的多功能AIE分子被成功合成出来。AIE分子可以被酶，例如碱性磷酸酶(ALP)，水解形成不溶于水的聚集体和强氧化还原性的中间产物。由于具有典型的AIE性质，所得的聚集体可以发出强烈的荧光信号。而氧化还原活性的中间产物可以氧化还原等离子体共振纳米颗粒的前体，以产生等离子体共振纳米颗粒。这可以导致纳米颗粒的LSPR峰的蓝移，显示出从红色到黄色甚至到棕色的显著颜色变化。这种明显的颜色变化可以被裸眼识别。可以通过利用高效的免疫磁富集和酶促放大反应，输出荧光颜色双重信号，从而进一步放大检测信号，并且实现超高灵敏度的目标分析物(例如，病毒粒子)的超灵敏检测。其对真实临床样品中的目标分析物(例如，病毒粒子)的准确检测也被成功证实，并且表现出高度的可靠性和抗干扰能力。通过改变修饰的抗体，这种双模态免疫分析方法将会具有通用性，可适用于检测诸如H7N9和Zika等其他类型的病毒。
具体来说，在一个方面中，本发明提供了一种聚集诱导发光化合物，由下式I表示：
其中，表示取代或者未取代的聚集诱导发光骨架，在取代的情况下，取代基选自取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基、硝基、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和其他氨基酸类似物中的至少一者；
L表示可携带正电荷的氧化还原部分，其使得聚集诱导发光化合物可溶于水性溶剂中，
M表示酶可切割部分，
n表示1-20中的整数，以及
m表示1-20中的整数。
在另一个方面中，本发明还提供了一种制备聚集诱导发光化合物的方法，包括下列步骤：
(1)在有机溶剂的存在下，将式III的化合物与式IV的化合物反应，从而得到式II的中间体化合物，以及
(2)在有机溶剂以及脱保护剂的存在下，将式II的化合物进行脱保护，从而得到式I的化合物；
其中表示取代或者未取代的聚集诱导发光骨架，在取代的情况下，取代基选自取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基、硝基、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和其他氨基酸类似物中的至少一者；
B为亲核基团，
E为亲电基团，
L表示可携带正电荷的氧化还原部分，其使得聚集诱导发光化合物可溶于水性溶剂中；
M表示酶可切割部分，
P表示酶可切割部分的保护基团；
n表示1-20中的整数，以及
m表示1-20中的整数。
有机溶剂可以选自芳香烃类溶剂、脂肪烃溶剂、含氧杂环类溶剂、含腈基基团的溶剂，更优选甲腈、乙腈。
任选地，脱保护剂选自TMSBr或TMSI。
任选地，亲核基团选自-N(R)X，其中x为1或2；R各自独立地选自H、取代或未取代的C1-C18羟烷基、氨基、取代或未取代的C2-C18烷氨基、取代或未取代的C1-C18烷基、取代或未取代的C2-C18不饱和烃基、取代或未取代的C2-C18杂烷基、取代或未取代的C3-C18环烃基、取代或未取代的C1-C18杂烃基、取代或未取代的C6-C18芳环烃基、取代或未取代的杂芳基或其组合中的至少一者，在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者；
任选地，亲电基团可以选自卤素，如F-、Cl-、Br-、I-。
氧化还原部分可以如下式V表示：
D-Ar-O-
式V
其中，D表示二价连接基团，任选地含有杂原子，如O、S、N，任选地，杂原子直接与聚集诱导发光骨架连接；
Ar表示芳香环基团，优选取代或未取代的C6-C18芳香族环烃基、取代或未取代的成环碳原子5-18的芳香族杂环基或其组合，在取代的情况下，芳香族环烃基和芳香族杂环基的至少一个氢被选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者取代；并且
其中-O-表示氧原子直接连接在芳香环上。
酶可切割部分可以如下式VI表示：
其中，F表示P或C；
R1各自独立地选自氢、取代或未取代的C1-C18烷基、取代或未取代的C2-C18不饱和烃基、取代或未取代的C1-C18杂烷基、取代或未取代的C3-C18环烷基、取代或未取代的C3-C18杂环烷基、取代或未取代的C6-C18芳基、取代或未取代的C6-C18杂芳基、CnH2n+1、C10H7、C12H9、OC6H5、OC10H7、OC12H9、CnH2nCOOH、CnH2nNCS、CnH2nN3、CnH2nNH2、CnH2nSH、CnH2nCl、CnH2nBr、CnH2nI、N(CnHm)2、SCnHm、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和其他氨基酸类似物中的至少一者，
在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者；
y表示1或2，
n表示1或更大的整数。
优选地，聚集诱导发光骨架可以选自下列中的至少一者：
以及
具有氧化还原活性的部分可以选自下列中的至少一者：
酶可切割部分可以选自下列中的至少一者：
R1此处应该为O-R3,其中O为氧原子，R3为取代或未取代的C1-C18烷基、取代或未取代的C2-C18不饱和烃基。
在又一个方面中，本发明还提供了一种用于检测免疫相关的目标分析物的成套组合，包括：上述任意的化合物，以及免疫复合物，其包含所述免疫相关的目标分析物。
任选地，成套组合还包括可以能够被所述氧化还原部分氧化还原从而形成等离子体共振特性的纳米颗粒的金属离子和/金属纳米颗粒。金属离子可以包含银、金、铜和铂中的至少一者
免疫复合物还可以包含免疫磁珠、任选的特异于所述目标分析物的抗体以及任选的用于切割所述酶切割部分的酶。任选地，所述酶为磷酸酶、酯酶和/或蛋白酶。磷酸酶可以为ATP。
免疫磁珠可以为具有活性基团的超顺磁珠，粒径在1-1000nm之间，优选200-600nm。活性基团可以是免疫修饰领域中常用的反应性基团，如羧基、氨基、巯基、磷酸基、叠氮基团、炔基基团等。在形成免疫磁珠之前，可以用EDC、NHS等激活磁珠表面的活性基团。然后将活化基团与特异于目标分析物的抗体、优选单克隆抗体反应，从而得到结合单克隆抗体的磁珠。
免疫复合物还可以包括任选地生物素化的多克隆抗体，如生物素化的山羊抗兔二级抗体、山羊抗鼠二级抗体，驴抗山羊二级抗体，兔抗鼠二级抗体等。可以在结合目标分析物之后再与多克隆体结合，得到含有目标分析物的夹心结构的免疫复合物。然后，复合物可以结合任选地修饰的酶，例如SA修饰的酶、生物素修饰的酶。
成套组合可以制成各种形式，以用于检测目标分析物，例如试剂盒、生物传感器等等，优选试剂盒。
在又一个方面中，本发明还提供一种检测免疫相关的目标分析物的方法，包括下列步骤：提供包含免疫相关的目标分析物的免疫复合物；以及使本文所述的任意化合物与免疫复合物接触。
接触可以包括将本文所述的化合物的溶液(例如二乙醇胺缓冲液、PBS缓冲液)加入到免疫复合物中。在孵育一段时间后，可以用荧光分光光度仪来检测发出的荧光，并且得到荧光光谱，以进行分析。
接触还可以包括将免疫复合物加入到多孔板(例如96孔板)中，该多孔板可以含有用以形成等离子体共振特征的纳米颗粒的前体物质溶液，例如含有Au纳米颗粒和银离子溶液。这样，通过酶可切割部分的切割而释放的氧化还原活性部分可以还原金属离子以产生可观察到的颜色比色变化，优选地，金属离子包含银、金、铜和铂中的至少一者。
优选地，释放的氧化还原活性部分还原Ag离子从而在Au纳米颗粒表面形成Ag纳米壳而产生可观察到的颜色比色变化，优选地，颜色比色变化比色变化通过UV-vis光谱仪定量或通过肉眼裸眼进行观察。因此，本发明的方法可以进行双模态超灵敏检测。
图1示出了利用多功能AIE化合物进行荧光和等离子体比色双模态病毒检测的示意图。如该图所示，用于病毒检测的基于荧光和等离子体比色的双模态免疫测定方法取决于多功能的水溶性AIE化合物(图1)。多功能AIE化合物的结构中含有ALP酶切割位点(图2)。为了实现免疫分析，目标病毒颗粒首先被免疫磁珠(IMNs)捕获形成IMNs病毒复合物，然后兔多克隆抗体(P-Abs)结合捕获的病毒并形成IMNs-病毒-P-Abs复合物。在与生物素化的Abs(B-Abs)和作为信号标签的链霉抗生物素蛋白修饰的ALP(SA-ALP)依次连接后，IMNs-病毒-P-Abs-B-Abs-SA-ALP的最终免疫复合物被成功构建。ALP酶可以通过水解AIE分子中的酶可切割部分来催化多功能的AIE分子的水解。生成的中间体(AIEgen)不溶于水，可聚集并产生强烈的荧光信号(图1)。这被作为为信号通道A，它为病毒检测提供了点亮型的荧光信号。另一方面，AIE分子的水解还可以产生高还原活性的中间产物，其可以将金属离子还原成金属原子并在纳米粒表面上形成金属纳米壳层。如通道B(图1)所示，这可以产生裸眼可辨别的等离子体颜色变化。综上，可以通过基于荧光和等离子体比色测定的双模态免疫测定方法方便地检测目标病毒。
除了病毒以外，免疫相关的目标分析物可以为任何进行免疫反应的物质，例如病毒、细菌、细胞、酶、核酸、蛋白质、多糖、固醇类和生物因子，优选病毒颗粒。
例子
提供下述的例子来示意性描述以帮助本领域技术人员理解本发明。然而，本发明的以下例子不应被构建为不适当地限制本发明。在不脱离本发明发现的范围的情况下，本领域普通技术人员可以对所讨论的例子进行变化和修改。
1.1材料与仪器
EV71全病毒，柯萨奇病毒A2(CVA2)，柯萨奇病毒A4(CVA4)，柯萨奇病毒A6(CVA6)，柯萨奇病毒A16(CVA16)，肠道致病性人类孤儿病毒(ECHO)，无活性寨卡病毒(ZIKV)，登革热病毒(DENV-2)，流行性乙型脑炎病毒，基孔肯雅病毒(CHIKV)，黄热病病毒(YFV)，H7N9AIV，H9N2AIV，H1N1AIV，H5N1AIV，新城疫病毒(NDV)以及24种不同的肠道病毒感染性手足口病(HFMD)患者的喉咙和粪便的真实临床样本由深圳市疾病预防控制中心提供。EV71VP1小鼠单克隆抗体，EV71VP1纯化的MaxPab兔多克隆抗体，生物素化的山羊抗兔IgG(H&L)二抗购自Abnova。小鼠单克隆ZIKA包膜抗体，兔多克隆ZIKA包膜抗体购自GeneTex。小鼠抗H7N9血凝素(HA)单克隆抗体，抗H7N9血凝素(HA)兔多克隆抗体获自Sino Biological公司。
羧基修饰的超顺磁性磁珠(直径500nm)购自Ademtech SA。碱性磷酸酶链霉抗生物素蛋白购自Vector Laboratories。Alexa-Fluor-488标记的驴F(ab')2抗小鼠IgG(H&L)购自Abcam。小牛肠碱性磷酸酶(ALP)，三水合氯化金(III)(HAuCl4)，硝酸银(AgNO3)，N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，二乙醇胺(DEA)和牛白蛋白血清(BSA)购自Sigma-Aldrich。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自Thermo Scientific。锌(Zn，99.9％)，四氯化钛(TiCl4,99.9％)，4-羟基苄醇(4-HA，99％)，氯代亚磷酸二乙酯(97％)，氢化钠(NaH，分散于60％矿物油中)，三苯基膦(P(Ph3),99％)和溴代三甲基硅烷(TMSBr，97％)购自Sigma-Aldrich。无水硫酸钠(Na2SO4，AR)，碳酸钾(K2CO3，AR)，4-二甲基氨基二苯甲酮，二氯甲烷(DCM)，四氢呋喃(THF)，乙腈(CH3CN)，丙酮，正己烷，甲醇和三溴化硼(BBr3,溶于1.0M的DCM溶液中)购自J&K。磷酸盐缓冲溶液(10X PBS)购自Thermo Scientific(HyClone)。其他化合物购自AIEgen Biotech有限公司。超纯水(18.2MΩ)来自Milli-Q Direct-8水净化系统(Millipore)。所有其他试剂均为分析纯。其他溶剂包括DCM，THF和CH3CN等在使用前进行蒸馏纯化。
1.2Au纳米粒的合成。通过柠檬酸钠还原四氯金酸(HAuCl4)制备直径约13nm的柠檬酸包裹的Au纳米粒。在此实验之前，用新制备的王水(3：1盐酸与硝酸混合溶液)清洗所有玻璃器皿，用30mL0.01％HAuCl4冲洗，在剧烈搅拌下加热至沸腾，并在下加入1mL 1％柠檬酸钠，搅拌，在出现酒红色后，继续煮沸和搅拌30分钟。将制备的Au纳米粒溶液储存在4℃以备后续使用。
1.3优化ALP活性测定中的TPE-APP浓度和孵育时间。为了优化TPE-APP浓度，在二乙醇胺缓冲液(DEA；10mM，pH 9.8，含有0.1mM MgCl2)中加入一系列终浓度为0-500μM的TPE-APP，并在37℃下温育30分钟，以被ALP(1.05nM)水解。使用Horiba FluoroLog-3荧光分光光度计记录水解产物的荧光光谱。对于动力学研究，将不同量的ALP添加到TPE-APP溶液(100μL，100μM)中，然后在37℃下孵育40分钟。通过荧光光谱监测ALP的水解过程。
1.4通过在Au纳米粒表面可控生长Ag纳米壳层的比色法来检测ALP活性。通过在37℃下将不同量的ALP和TPE-APP的混合物在DEA缓冲液(pH 9.8,10mM，含有0.1mM MgCl2)中孵育30分钟，在96孔板中进行酶水解反应。96孔板中TPE-APP的最终浓度固定为100μM，ALP浓度范围为0-12nM。然后将Au纳米粒(终浓度：3.2nM)和硝酸银(AgNO3)(终浓度：1.2mM)加入到96孔板反应体系中。Au纳米粒溶液在室温下30分钟内会发生快速的颜色变化。在PerkinElmer Lambda 25UV-Vis吸收分光光度计上监测所得Au/Ag核壳纳米粒的UV-vis吸收光谱和410nm处的吸光度。通过使用具有80kV加速电压的HITACHI H-7650电子显微镜获得透射电子显微镜(TEM)图像。用Tecnai G2F30(FEI，Holland)进行高分辨透射电子显微成像(HRTEM)观察和线性EDX元素分布以测定其组成成分。通过将7μL样品滴加到镀有超薄碳膜的铜网上来制备用于TEM成像的Au纳米粒和Au/Ag核壳纳米粒的样品。通过暗视显微成像(DFM)进一步证实了Au纳米粒表面上Ag纳米壳层的生长。通过配备有DP72单芯片真彩色电荷耦合器件(CCD)照相机(Olympus，Japan)的BX51光学显微镜(Olympus，Japan)获得暗场成像图片。通过Image Pro Plus 6.0软件(IPP 6.0)分析暗场条件下蓝色和绿色点的散射强度的变化。
1.5用mAb-VP1制备免疫磁珠。EDC和NHS用于激活500nm粒径的超顺磁珠(MNs)上的羧基。简言之，将10μL MNs(50mg/mL)与50mM EDC和50mM NHS在400μL MES缓冲液(0.1MMES，0.15M NaCl，pH 6.5)中，于37℃下孵育30分钟，将MNs用1X PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤分离三次。然后将活化的MNs与20μL的0.5mg/mL抗VP1单克隆抗体(mAb)共价偶联4小时，在37℃下形成免疫磁珠(mAb-VP1结合的MNs，IMNs)。浓度为1mg/mL的IMNs在4℃下保持在含有1％(w/v)BSA和0.05％(w/v)NaN3的500μL 1X PBS(pH 7.4)中以供后续使用。IMNs的表征在补充信息中进行了详细描述。另外，按照相同方法，用其他单克隆抗体(mAb)修饰的MNs，mAb-HA修饰的MNs和mAb-Zika修饰的MNs也被成功制备出来。
1.6基于AIE分子的点亮型荧光和裸眼识别双模态免疫分析方法用于病毒粒子的检测。以EV71病毒粒子检测为例，用HITACHI H-7650电子显微镜获得EV71病毒粒子的TEM图像(图20)。并且通过使用蛋白质定量测定来定量病毒。双模态免疫测定的整个过程如图1所示。用缓冲液(PBST，由在1X PBS缓冲液(pH 7.4)中的0.1％Tween 20组成)洗涤50μL，1mg/mL的IMNs两次。然后将不同量的EV71病毒粒子加入到含2mg/mL的IMNs的BSA-PBS溶液中，终体积为100μL(pH 7.4)，将混合物在37℃下孵育30分钟并轻轻摇动。然后分离所得的磁珠-病毒复合物并用400μL PBST洗涤三次。
将复合物与兔源的多克隆抗VP1抗体(5μg/mL)在200μL封闭缓冲液(BB，由含有2mg/mL BSA的1X PBS缓冲液(pH 7.4) 组成)中，在37℃下孵育1小时并轻轻摇晃。将复合物用PBST洗涤三次后，加入含有10μg/mL生物素化的山羊抗兔二级抗体的100μL BB中孵育1小时，同时轻轻摇动。用PBST洗涤三次后，将在BB中稀释10倍的SA修饰的ALP(SA-ALP)加入到上述复合物中，并在37℃下孵育30分钟。分离后得到的免疫复合物用PBST洗涤三次。随后，将含有10μL TPE-APP(10mM)的100μL的DEA缓冲液(pH 9.8,10mM，含有0.1mM MgCl2)，加入到上述夹心结构的免疫复合物中，然后37℃下孵育30分钟。然后，用磁性支架将悬浮液与IMB分离，并通过Fluorolog-3(Horiba Jobin Yvon)荧光光谱仪收集荧光光谱信息，从而通过荧光方法来检测EV71病毒粒子。
或者将悬浮液分离并加入到新的96孔板中，该板含有1.2μL的100mM AgNO3和1μL的320nM Au纳米粒。Au纳米粒溶液在30分钟内会发生快速变色，可以用裸眼检测EV71病毒粒子。测量UV-vis紫外可见吸收光谱和410nm处的吸光度以定量病毒浓度。基于上述方法构建了用于EV71病毒粒子检测的双模态免疫测定方法。对于免疫测定的特异性，还进行了六个对照实验：用几种其他常见的肠道病毒(CVA2，CVA4，CVA6，CVA16和ECHO-18)用作阴性对照样品，另一个对照实验用2％的没有任何病毒的BSA-PBS作为空白组，进行同样的检测。此外，通过改变与MNs和病毒结合的抗体，可以扩展这种新的基于AIE染料的免疫测定方法到其他病毒，例如H7N9和寨卡病毒的检测。
1.7Taqman实时PCR检测。根据制造商的方案，使用High Pure Viral RNA Kit(Roche)提取由IMN捕获的不同浓度的EV71病毒的RNA。按照制造商的EV71 RNA Taqman实时检测试剂盒(BioPerfectus Technologies)的说明书进行Taqman实时PCR。25μL反应体积由7.5μL RT-PCR反应溶液，5μL酶反应溶液，4μL EV71反应溶液，3.5μL去RNA酶(RNase)水和5μL RNA样品组成。反应在7500实时PCR系统(Applied Biosystems)中进行。PCR条件如下：1个循环50℃，30分钟，1个循环95℃，5分钟，45个循环95℃，10秒，45个循环55℃，40秒，45个循环55℃，40秒，结束后进行实时检测。
1.8用于临床样本中EV71病毒检测的双模态免疫分析。收集来自24名不同肠道病毒感染性手足口患者的人喉咙和粪便的临床样品，并用Hank's平衡盐溶液(1X HBSS)处理，包括10名EV71阳性感染的手足口患者和14名其他肠道病毒感染性手足口患者。然后使用上述相同的方法检测这些处理过的样品。此外，还进行了EV71病毒粒子的Taqman实时PCR检测，以验证我们提出的具有高度稳定性和灵敏度的检测方法。
1.9合成
TPE-TMA合成
如图2所示，合成化合物1((4-(羟甲基)苯基)磷酸二乙酯)：向4-羟基苄醇(2.0g；16.1mmol)和NaH(0.65g；16.1mmol)的混合物中加入THF(80mL)。然后用冰水浴将混合物冷却至0℃。然后逐滴加入氯代亚磷酸二乙酯(2.84g；16.5mmol)。将反应混合物恢复至室温并在氮气环境下搅拌2小时。通过加入10mL无水甲醇淬灭反应。旋转蒸发溶剂后的产物，将其溶解在乙醚中。过滤并蒸发溶剂后，粗产物用硅胶柱色谱进行纯化，用己烷-乙酸乙酯作为洗脱剂，得到黄色油状物，产率为72％(3.01g；11.6mmol)。核磁氢谱(1H-NMR，BrukerAvance，400MHz，CD3OD)：7.38-7.36(d，J＝8.8Hz，2H)；7.20-7.18(d，J＝8.4Hz，2H)；4.58(s，2H)；4.25-4.17(m，4H)；1.35-1.31(m，6H)。核磁碳谱(13C-NMR，Bruker Avance，100MHz，CD3OD)，δ(ppm)：149.7；149.6；138.9；128.1；119.6；64.9；64.8；63.0；15.2；15.1。
化合物2(4-(溴甲基)苯基二乙基磷酸酯)合成：0℃下，向含有化合物-1(1.0g；3.84mmol)和四溴化碳(1.91g；5.76mmol)的8mL CH2Cl2中的溶液中加入三苯基膦(1.51g；5.76mmol)。将所得混合物在室温和氮气环境下搅拌过夜。使用己烷-乙酸乙酯作为洗脱液，通过硅胶柱色谱法纯化化合物，收率为91％(1.13g；3.49mmol)。核磁氢谱(1H-NMR，BrukerAvance，400MHz，CDCl3)：δ(ppm)：7.33-7.31(d，J＝8.8Hz，2H)；7.16-7.14(d，J＝8Hz，2H)；4.42(s，2H)；4.19-4.15(m，4H)；1.33-1.29(m，6H)。核磁碳谱(13C-NMR，Bruker Avance，100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：149.7；149.6133.5；129.5；119.3；119.2；63.7；63.6；31.6；15.1；15.0.
合成化合物TPE-TMA(4,4'-(1,2-二苯基乙烯-1,2-二基)双(N，N-二甲基苯胺))：在0℃冰浴中向含有4-二甲基氨基二苯甲酮(4.00g，17.8mmol)和锌粉(3.47g，53.4mmol)的THF溶液(100mL)中滴加TiCl4(3.63mL，53.4mmol)。然后将混合物加热回流6小时。然后用50mL饱和K2CO3溶液淬灭反应，并用DCM萃取产物。将收集的有机层用无水硫酸钠干燥并蒸发干燥。使用DCM作为洗脱液对残余物进行硅胶柱色谱分离，得到黄色固体的化合物1(3.13g，7.48mmol)，产率为84％。图3示出了核磁氢谱(1H-NMR，Bruker Avance，400MHz，CDCl3)，δ(ppm)：7.15-7.05(m，10H)，6.94-6.92(d，J＝8.0Hz，2H)，6.86-6.84(d，J＝8.4Hz)，2H)，6.50-6.43(m，4H)，2.88(m，12H)。图4示出了核磁碳谱(13C-NMR，BrukerAvance，100MHz，CDCl3)，δ(ppm)：131.7；131.0；126.9；125.1；110.9；110.8；39.8。
TPP-APP合成.
合成化合物4(4,4'-(1,2-二苯基乙烯-1,2-二基)双(N-(4-((二乙氧基磷酰基)氧基)苄基)-N，N-二甲基苯胺))：将化合物2(966mg，3.0mmol))和TPE-TMA(500mg，1.2mmol)在氩气中溶于无水CH3CN(90mL)中。将混合物在室温下搅拌过夜。减压蒸发溶剂。加入2mL乙酸乙酯后，收集过滤析出的白色固体粉末，产率为67％(854mg，0.8mmol)；核磁氢谱(1H-NMR，Bruker Avance，400MHz，D2O)，δ(ppm)：7.32-7.29(m，10H)，7.26-7.24(m，4H)，7.16-7.13(m，8H)，6.97-6.95(m)(4H)，4.87(s，4H)，4.27-4.20(m，8H)，3.59(s，12H)，1.29-1.25(m，12H)。核磁碳谱(13C-NMR，Bruker Avance，100MHz，D2O)，δ(ppm)：150.9；144.8；141.5；140.6；139.9；133.7；131.7；130.4；127.7；126.9；124.2；120.3；119.5；72.4；65.9；65.8；52.2；14.7。核磁磷谱(31P-NMR，200MHz，D2O)：δ＝-6.01。
合成化合物TPP-APP(溴化物4,4'-(1,2-二苯基乙烯-1,2-二基)双(N，N-二甲基-N-(4-(膦酰氧基)苄基)苯胺))：室温下，将溴代三甲基硅烷TMSBr(60μL，0.44mmol)逐滴加入到含有化合物4(100mg，0.094mmol)的无水CH3CN溶液(10mL)中。将反应混合物在室温下氩气下搅拌24小时后，并用MeOH(2mL)淬灭。将反应混合物在室温下搅拌30分钟后，减压除去溶剂。将反应混合物重新溶解在H2O(1mL)中。过滤收集白色固体的沉淀产物，产率为53％(47.33mg，0.05mmol)；图6示出了核磁氢谱(1H-NMR，Bruker Avance，400MHz，CD3OD)，δ(ppm)：7.53-7.51(d，J＝8.8Hz，4H)，7.29-7.23(m，10H)，7.21-7.19(d，J＝8.0)Hz，2H)，7.11-7.09(m，4H)，6.95-6.92(d，J＝8.4Hz，4H)，4.92(s，4H)，3.58(s，12H)。图7示出了核磁碳谱(13C-NMR，Bruker Avance，100MHz，CD3OD)，δ(ppm)：153.6；153.5；145.0；141.7；141.3；140.1；133.0；131.8；130.1；127.6；126.9；122.2；120.4；120.3；119.5；72.1；51.7。图8示出了核磁磷谱(31P-NMR，200MHz，CD3OD)：δ＝-5.21。
图5示出了TPP-APP的晶体结构，并且图29示出了TPP-APP的晶体数据和结构信息。
2.建立ALP浓度与荧光和等离子体比色信号之间的相关关系。TPE-DMA表现出明显的AIE性质，在良溶剂DMSO中没有荧光信号，但在二乙醇胺(DEA)缓冲液中出现强烈的聚集态荧光，其强度增强了377倍(图9)。相反，TPE-APP分子在DEA缓冲液中不发出荧光，因为它在水中具有较高的溶解度(图19d)。接下来通过TPE-DMA聚集体的荧光检测多功能TPE-APP分子对ALP酶的响应性。如图19f所示，在ALP存在下，TPE-APP溶液显示出强烈的蓝绿色荧光信号，表明它可以被有效地水解并生成不溶性的TPE-DMA聚集体。为了获得线性检测范围，需要优化TPE-APP的投料浓度和反应时间。如图19a所示，在1.05nM ALP水解下，TPE-APP的浓度从0增加至100μM，其荧光强度逐渐增加并且达到平台期。当用不同浓度的ALP(0,0.7,1.4,3.5nM)处理TPE-APP(100μM) 时，荧光强度均随着孵育时间的持续而逐渐增加并且在接近30分钟时达到饱和(图19c，d)。这种短时间的反应表明基于ALP酶催化的免疫检测方法将会非常迅速。随着ALP浓度的增加荧光强度的增强也证实了ALP浓度与AIE产物的荧光强度之间的正相关性(图19d，e)。总之，ALP越多，产生的TPE-DMA越多，荧光强度也越强。
通过加入ALP磷酸酶的抑制剂钒酸钠(Na3VO4)，证实了ALP酶对多功能TPE-APP分子的特异性。在同样条件下，Na3VO4本身不影响TPE-APP的水解(图19f)。与不含Na3VO4的条件相比，ALP与Na3VO4共孵育后，加入TPE-APP导致荧光强度急剧下降。当Na3VO4抑制ALP活性时，TPE-APP的去磷酸化反应被阻断，TPE-APP的催化水解形成发光TPE-DMA聚集体的过程也受到阻碍。这些结果证明了ALP在将TPE-APP转化为发光的TPE-DMA聚集体中的关键作用。
ALP浓度与Au/Ag核壳纳米粒生长之间的相关关系。为了检验氧化还原物质在将Ag+还原为Ag纳米过程中的作用，选择4-HA作为在Au纳米粒存在下的Ag+还原的模型化合物。向Ag+和Au纳米粒混合物中加入4-HA后，肉眼可以观察到明显的从红色到黄色的颜色变化，证实了4-HA对Ag+的还原作用并在Au纳米粒表面形成Ag纳米壳(图10和图26)。通过TEM图像中的核壳形貌证实了壳层的形成(图11)。接下来，我们将Ag+和Au纳米粒引入到上述TPE-APP和ALP体系中，并将等离子体比色法与AIE荧光法结合起来。如图21a和图12所示，在不含ALP的情况下，Au纳米粒和Ag+混合物保持红色。相反，在ALP存在下，混合物的颜色迅速蓝移并从红色变为黄色，进一步变为棕色(图21a)。与Au纳米粒在520nm处的LSPR峰不同，观察到的Ag纳米壳层的最大特征吸收峰位于410nm处，进一步表明Au纳米粒与ALP，TPE-APP和Ag+反应后形成了Ag纳米壳。通过TEM和高分辨率TEM图像(图2b，c，d和图13a，b)证实了在ALP酶作用下，Au纳米粒表面上的壳层的形成并得到Au/Ag核壳型纳米结构。
显然，所制备的Au/Ag核-壳纳米结构的尺寸明显大于单独的Au纳米粒。Au/Ag核-壳结构的元素分析显示Ag元素均匀地分布在Au纳米粒的周围(图13c-i)。检测中ALP的浓度会影响沉积在Au纳米粒表面上的Ag纳米壳的形成。如图21a和图12所示，Ag纳米壳的吸收峰强度随着ALP浓度的增加而增加。在12nM ALP下产生的Ag纳米壳的厚度比在6.0nM ALP下产生的厚度要厚，并导致更高的吸收强度(图21c，d)。通过Au纳米粒和Ag纳米粒的LSPR散射信号的暗视场显微图像(DFM),进一步证实了Ag+导致的纳米结构变化的减少。尺寸为13nm的Au纳米粒的DFM信号由于其小尺寸而没有明显的散射信号(图21e)。而在ALP下，出现绿色或蓝色的LSPR散射信号(图21f，g)，表明形成了球形或棒状的Ag纳米粒。总之，TPE-APP的催化水解可以构建由点亮型荧光和裸眼可辨别的比色的双模态信号组成的分析方法。
3.目标病毒的高效捕获。这种具有双模态读出信号的分析方法与用于病毒粒子检测的高效免疫磁性富集方法相结合。EV71病毒作为一个例子用来验证这种方法的可行性。首先磁珠(MNs)与抗VP1的单抗(mAb)进行偶联以捕获检测体系中的目标EV71病毒粒子。如图14所示，与对照珠相比，抗VP1磁珠上与Alexa-Fluor-488标记的驴抗小鼠IgG的结合后，表现出明显的绿色荧光信号。扫描电子显微镜(SEM)图像也证实了相应的免疫聚集现象(图15)。这些结果都证明抗VP1的单抗(mAb)已经成功偶联在MNs的表面，并可用于EV71病毒粒子的捕获此外。与文献报道一致，TEM图像(如图20a)显示EV71病毒颗粒是完整的球形结构(20-30nm)，并具有多个可被抗体识别的特异性结合位点。
使用EV71病毒粒子的Taqman实时PCR(RT-qPCR)测定以检验IMNs捕获目标病毒的效率。RT-qPCR曲线显示来源于不同浓度的EV71病毒粒子的表现出与阳性EV71参照物(曲线VI)类似的循环阈值(Ct)(图20b)。作为阴性参考物的IMN或者与病毒一起孵育的MNs，则没有观察到明显的响应峰(曲线III)。通过琼脂糖凝胶电泳进一步分析RT-qPCR的反应产物(图16)。与IMNs混合的病毒的都得到相应的基因片段(泳道2-5)，与EV71阳性参照基因(泳道1)一致。当EV71病毒体与MNs孵育时则没有观察到片段(泳道7)，表明IMNs对病毒的捕获具有高可靠性和特异性。此外，通过监测六天内的平均水合粒径显示IMNs具有良好的稳定性(图17)。并且RT-qPCR确认其在储存过程中依然可以保留对病毒的高效捕获能力。接下来，将作为免疫信号放大标签的P-Abs，B-Abs和SA-ALP与EV71病毒粒子-IMNs反应以形成夹心结构的免疫复合物。使用IMNs作为免疫反应平台可以简化样品的制备过程，提高浓缩效率，并且由于它们在处理过程中具有快速的磁响应性和缓慢的损失率从而可以放大检测信号。同时，在病毒粒子表面上丰富表达的结合位点可以进一步放大免疫检测信号。免疫反应过程后，将TPE-APP加入到夹心结构免疫复合物中，可以通过ALP水解产生不溶性的TPE-DMA聚集体，得到强烈的荧光信号；同时产生的氧化还原活性的中间物质，可以将Ag+还原并对Au纳米粒表面进行原位壳层包裹，从而获得明显的颜色变化。
4.双模态免疫分析的特异性和灵敏度。使用空白和五个其他肠道病毒，包括CVA2，CVA4，CVA6，CVA16和ECHO-18作为阴性对照样品，来检验该免疫测定法对EV71病毒粒子检测的特异性和抗干扰能力。如图20c所示，，通过荧光光谱仪收集检测溶液的荧光强度作为荧光检测模式，其内部插图为荧光光谱图。在EV71病毒样品中可以检测到不溶于水的TPE-DMA聚集体的荧光，而在阴性样品中则未发现明显的荧光(图20c)。阴性样品因为不能桥接免疫复合物而易于被洗掉，不能结合ALP酶，从而不能水解TPE-APP来形成发光的TPE-DMA聚集体。结果表明，荧光检测通道对病毒具有良好的特异性。可以在普通的手持式UV灯下观察到荧光信号(图20c中的底部)。来自阳性样品的蓝绿色荧光信号，表明该病毒检测方法可以在简单的仪器的辅助下用视觉识别。同时通过比色模式，可以在没有任何仪器的辅助下通过裸眼识别病毒的检测信号。对于裸眼观察模式，仅在目标EV71病毒粒子的存在下，才能观察到Au/Ag核壳纳米粒的颜色变化。同时Au纳米粒溶液的红色仍保留在对照实验中(图20d)。比色法源于在紫外-可见光谱中形成新的LSPR峰。这些结果表明双模态免疫测定方法具有高度的选择性，可以区分EV71病毒和其他肠道病毒。
在加入了梯度浓度的EV71病毒粒子后，通过采集等离子体比色信号和荧光信号，来评估该双模态免疫测定方法的灵敏度和线性测定范围。如图18所示，随着EV71病毒浓度的增加，检测溶液明显从红色变为黄色再变为褐色，最后变为深棕色。检测溶液的这种比色变化是由Au纳米粒表面上形成的不同厚度的Ag纳米粒壳层导致的。检测溶液的颜色变化验证了吸收光谱的蓝移(图24a)。对于具有不同颜色的检测溶液，在410nm附近的吸收峰强度随着EV71病毒量的增加而增强。通过绘制410nm处的吸光度与EV71病毒粒子浓度的关系，可得到0.8至80ng/mL的线性检测范围，其线性相关系数(R2)高达0.996。检测限(LOD)可达0.52ng/mL(图24b)。众所周知，荧光检测方法比基于吸收的检测方法更加灵敏，因此可以使用荧光模式进行超灵敏检测。与预期一致，荧光光谱仪也可以在超低浓度病毒的存在下检测到荧光信号(图24c)，其可在1至150pg/mL的病毒浓度范围内获得良好的线性关系，线性相关系数R2可达0.992(图24d)。检测限可低至0.85pg/mL。这些结果表明，该双模态免疫分析具有灵敏度高，定量能力强，线性检测范围宽等优势。
5.双模态免疫分析用于临床样本中EV71病毒的检测。在上述优异性质的基础上，采用真实的临床样品来进一步研究该免疫测定方法的准确性和实际应用性。随机收集来自手足口患者的24个咽喉和粪便样本(图28)。首先通过病毒检测的金标准方法，用于EV71RNA的商业化RT-qPCR试剂盒对这些样品进行检测。其中，24名患者中有10名感染了EV71，而其他14名患者感染了其他肠道病毒，其病毒载量无法通过单独的核酸检测来诊断(图28)。进一步采用上述的免疫测定法对这些临床样本进行检测。因为收集的临床样本在开始时用1XHBSS预处理(参见方法)，因此选择将Hank's缓冲盐溶液(1X HBSS)作为对照。以50个对照样本的平均吸光度或荧光强度加上标准偏差的3倍作为检测阈值，当其吸光度或荧光信号强度大于该阈值时，样品被认为呈阳性。基于等离子体比色法，裸眼可以正确地检测出24个样品中含有8个EV71阳性样本(图25)，并通过高于阈值的410nm处的吸光度得到证实。得益于荧光信号的较高灵敏度，荧光模态结果显示24个样本中有10个呈现EV71阳性。其与标准RT-qPCR结果相比，具有100％的检测准确性(图26和图27)。上述结果证明了基于多功能AIE染料的双模式免疫分析方法在实际病毒样品的检测中具有较强的抗干扰能力，高准确度和高灵敏度等优势。
可以理解的是，以上实施方案仅仅是为了说明本公开的原理而采用的示例性实施方案，然而本公开并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本公开的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本公开的保护范围。

Claims (20)

1.一种聚集诱导发光化合物，其特征在于由下式I表示：
其中，表示取代或者未取代的聚集诱导发光骨架，在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基、硝基、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和其他氨基酸类似物中的至少一者；
L表示可携带正电荷的氧化还原部分，其使得聚集诱导发光化合物可溶于水性溶剂中，
M表示酶可切割部分，
n表示1-20中的整数，以及
m表示1-20中的整数。
2.一种制备聚集诱导发光化合物的方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)在有机溶剂的存在下，将式III的化合物与式IV的化合物反应，从而得到式II的中间体化合物，以及
(2)在有机溶剂以及脱保护剂的存在下，将式II的化合物进行脱保护，从而得到式I的化合物；
其中表示取代或者未取代的聚集诱导发光骨架，在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基、硝基、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和其他氨基酸类似物中的至少一者；
B为亲核基团，
E为亲电基团，
L表示可携带正电荷的氧化还原部分，其使得聚集诱导发光化合物可溶于水性溶剂中；
M表示酶可切割部分，
P表示酶可切割部分的保护基团；
n表示1-20中的整数，以及
m表示1-20中的整数。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述有机溶剂选自芳香烃类溶剂、脂肪烃溶剂、含氧杂环类溶剂、含腈基基团的溶剂，更优选乙腈；
任选地，所述脱保护剂选自三甲基甲硅烷基溴化物或三甲基硅烷碘化物。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述亲核基团选自-N(R)X，
其中R各自独立地选自H、取代或未取代的C1-C18羟烷基、氨基、取代或未取代的C2-C18烷氨基、取代或未取代的C1-C18烷基、取代或未取代的C2-C18不饱和烃基、取代或未取代的C2-C18杂烷基、取代或未取代的C3-C18环烃基、取代或未取代的C1-C18杂烃基、取代或未取代的C6-C18芳环烃基、取代或未取代的杂芳基或其组合中的至少一者，在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者；
x为1或2；
任选地，所述亲电基团选自卤素，优选F-、Cl-、Br-或I-。
5.根据权利要求1所述的化合物或者权利要求2-4中任意一项所述的方法，其特征在于所述氧化还原部分如下式V表示：
D-Ar-O-
式V
其中，D表示二价连接基团，任选地含有杂原子，如O、S、N，任选地，杂原子直接与聚集诱导发光骨架连接；
Ar表示芳香环基团，优选取代或未取代的C6-C18芳香族环烃基、取代或未取代的成环碳原子5-18的芳香族杂环基或其组合，在取代的情况下，芳香族环烃基和芳香族杂环基的至少一个氢被选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者取代；并且
其中-O-表示氧原子直接连接在芳香环上。
6.根据权利要求1和5中任意一项所述的化合物或者权利要求2-5中任意一项所述的方法，其特征在于所述酶可切割部分如下式VI表示：
其中，F表示P或C；
R1各自独立地选自氢、取代或未取代的C1-C18烷基、取代或未取代的C2-C18不饱和烃基、取代或未取代的C1-C18杂烷基、取代或未取代的C3-C18环烷基、取代或未取代的C3-C18杂环烷基、取代或未取代的C6-C18芳基、取代或未取代的C6-C18杂芳基、CnH2n+1、C10H7、C12H9、OC6H5、OC10H7、OC12H9、CnH2nCOOH、CnH2nNCS、CnH2nN3、CnH2nNH2、CnH2nSH、CnH2nCl、CnH2nBr、CnH2nI、N(CnHm)2、SCnHm、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和其他氨基酸类似物中的至少一者，
在取代的情况下，取代基选自卤原子、羟基、醛基、羧基、氨基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18烯基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的C2-C18炔基、任选地被一个或多个C6-C18芳香族环烃基或成环碳原子5-18的芳香族杂环基取代的的C1-C18烷基、成环碳原子6-18的芳香族环烃基、成环碳原子5-18的芳香族杂环基、巯基、氰基和硝基中的至少一者；
y表示1或2。
7.根据权利要求1和5-6中任意一项所述的化合物或者权利要求2-6中任意一项所述的方法，其特征在于所述聚集诱导发光骨架选自下列中的至少一者：
8.根据权利要求1和5-7中任意一项所述的化合物或者根据权利要求2-7中任意一项所述的方法，其特征在于所述氧化还原部分选自下列中的至少一者：
9.根据权利要求1和5-8中任意一项所述的化合物或者根据权利要求2-8中任意一项所述的方法，其特征在于所述酶可切割部分选自下列中的至少一者：
R1为O-R3,其中O为氧原子，R3为取代或未取代的C1-C18烷基或取代或未取代的C2-C18不饱和烃基。
10.一种用于检测免疫相关的目标分析物的成套组合，其特征在于包括：
根据权利要求1和3-9中的任意一项所述的化合物，以及
免疫复合物，其包含所述免疫相关的目标分析物。
11.根据权利要求10所述的成套组合，其特征在于还包括能够被所述氧化还原部分还原从而形成纳米颗粒的金属离子和/金属纳米颗粒。
12.根据权利要求10或11所述的成套组合，其特征在于所述免疫复合物还包含免疫磁珠、任选的特异于所述目标分析物的抗体以及任选的用于切割所述酶切割部分的酶，任选地，所述酶为磷酸酶、酯酶和/或蛋白酶。
13.根据权利要求10-12中任意一项所述的成套组合，其特征在于所述免疫相关的目标分析物选自病毒、细菌、细胞、酶、核酸、蛋白质、多糖、固醇类和生物因子中的至少一者。
14.根据权利要求10-13中任意一项所述的成套组合，其特征在于所述成套组合为用于检测病毒的试剂盒。
15.一种检测免疫相关的目标分析物的方法，其特征在于包括下列步骤：
提供包含所述免疫相关的目标分析物的免疫复合物；以及
使权利要求1和5-9中的任意一项所述的化合物与所述免疫复合物接触。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述接触包括通过酶可切割部分的切割而释放氧化还原活性部分，
任选地，所述免疫复合物还包含免疫磁珠、任选的特异于所述目标分析物的抗体以及任选的用于切割所述酶切割部分的酶，任选地，所述酶为磷酸酶、酯酶和/或蛋白酶。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述方法还包括使权利要求1和5-9中的任意一项所述的化合物与包含等离子共振纳米颗粒的溶液接触，任选地，所述溶液还包含金属离子，并且释放的氧化还原活性部分还原金属离子以产生可观察到的颜色比色变化，优选地，金属离子包含银、金、铜和铂中的至少一者。
18.权利要求17所述的方法，其特征在于所述等离子共振纳米颗粒为Au纳米颗粒，任选地，释放的氧化还原活性部分还原Ag离子从而在Au纳米颗粒表面形成Ag纳米壳而产生可观察到的颜色比色变化，优选地，颜色比色变化比色变化通过UV-vis光谱仪定量或通过肉眼裸眼进行观察。
19.权利要求15-18中任意一项所述的方法，其特征在于所述接触包括切割所述酶可切割部分，从而产生能够聚集诱导发光的聚集体，任选地，所述聚集体发出荧光，任选地，通过荧光分光光度计测量荧光光谱。
20.权利要求15-19中任意一项所述的方法，其特征在于所述免疫相关的目标分析物选自病毒、细菌、细胞、酶、核酸、蛋白质、多糖、固醇类和生物因子中的至少一者，优选病毒颗粒。
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