JP6480579B2 - 大環状ランタニドキレートのための新規発色団構造 - Google Patents

大環状ランタニドキレートのための新規発色団構造 Download PDF

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Description

本発明は、発光ランタニドコアの周りに置換４−（フェニルエチニル）ピリジン発色団を有するアザ大環状ランタニドキレート設計物に関する。この発色団は、ランタニドイオンと共に高いモル吸光係数及びルミネセンスを有する。本発明は、キレートを生成する配位子、及び生体特異的反応体に結合するキレート、及び種々のアッセイにおけるそれらの使用にも関する。
国際公開第２０１３／０１１２３６号は、トリアザ大環状コアに結合した３個の４−（フェニルエチニル）ピリジン発色基を有する発光ランタニドキレートを開示している。この４−（フェニルエチニル）ピリジン発色基は、フェニル環のパラ位が電子供与基で置換されている。
科学文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５５，２０１４，１３５７−１３６１）は、国際公開第２０１３／０１１２３６号に開示されている種類のトリアザ大環状配位子は比較的低い水溶性を有することを確認している。電子供与性パラ置換基にＰＥＧ基を付加することによって水溶性を改善する試みは、あまり成功しなかった。
国際公開第２０１３／０９２９９２号は、非環式コアに結合した３個の４−（フェニルエチニル）ピリジン発色基を有する発光ランタニドキレートを開示している。いくつかの実施形態では、１つの発色基は反応性基を含み、他の２つの発色基は２又は３個の−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ基をオルト及び／又はパラ位に含む。
国際公開第２０１４／１４７２８８号は、標識試薬として有用なトリアザシクロノナン系ランタニドキレート錯体を開示している。開示されたキレートは、３個の４−（フェニルエチニル）ピリジン発色基を有し、この発色基のうちの１つは反応性基を含み、他の２つの発色基は（ｉ）フェニル環上のメタ位及びパラ位の２個のカルボキシル（−ＣＯ２Ｈ）置換基、又は（ｉｉ）フェニル環上のメタ位の２個−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈ基のいずれかである。
本発明の第１の態様は、式（Ｉ）の発光ランタニドキレート又はその塩若しくは溶媒和物に関し、

式中、ａ、ｂ、及びｃは、独立して０及び１から選択され、
Ｌｎ３＋は、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｄｙ３＋、及びＳｍ３＋から選択され、
Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３は式（ＩＩ）のものであり、

式中、Ｃｈｅは、−ＣＯ２Ｈ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＰＯ（ＯＨ）Ｒ２、−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ２、及び−ＣＯＮＲ３Ｒ４から独立して選択されるキレート化基であり、
Ｒ２は、フェニル、ベンジル、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルから選択され、
Ｒ３及びＲ４は、水素及び−Ｌ１−Ｚ１から独立して選択され、式中、Ｌ１は直接結合又はスペーサー基であり、Ｚ１はキレートが生体特異的反応体に連結することを可能にする反応性基であり、
ｄは、１、２、３、４、又は５であり、
Ｒ１は、独立して、以下からなる群のいずれか１つから選択される１つ以上の置換基であり：
（ｉ）水素、
（ｉｉ）−Ｘ−Ｒ５から選択される電子供与性可溶化基であって、式中、Ｘは酸素原子、硫黄原子、又は−Ｎ（Ｒ６）ＣＯ−であり、Ｒ６は水素又は−Ｃ１〜６アルキルであり、Ｒ５は水素、−Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＯＣ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯＮＲ７Ｒ８、−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）２ ＋−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３ −及びポリエチレングリコールから選択され、式中、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立して水素、Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）２、及び−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）３から選択される、電子供与性可溶化基、
（ｉｉｉ）Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＯＣＨ３、−（ＣＨ２）１〜６ＳＣＨ３から選択される基、
（ｉｖ）−Ｌ２−Ｚ２（Ｌ２は直接結合又はスペーサー基であり、Ｚ２は、標識しようとする分子にキレート化剤が連結することを可能にする反応性基である）、
ここで、Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３のうちの少なくとも１つは、（ｉｉ）群から選択された２個以上のＲ１置換基をアセチレン基に対してパラ及びオルト位に有し、
ただし、式（Ｉ）のキレートは、Ｚ１及びＺ２から選択される１個以下の反応性基を有する。
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様による発光ランタニドキレートと共役した生体特異的結合試薬（reagent）を含む検出可能分子に関する。
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様のキレートがそれから調製されるランタニドキレート化配位子に関する。
本発明の第４の態様は、生体特異的結合アッセイの実施方法に関し、この方法は以下の工程を含む：
ａ）検体と、本発明の第１の態様による発光ランタニドキレートで標識化された生体特異的結合反応体との間でバイオ複合体を形成する工程、
ｂ）励起波長を有する放射線で上記バイオ複合体を励起させ、これにより励起バイオ複合体を形成する工程、及び
ｃ）上記励起バイオ複合体から放出される発光放射線を検出する工程。
本発明の第５の態様は、固有ルミネセンスの時間分解蛍光光度測定を利用した特異的生体親和性に基づく結合アッセイにおける、本発明の第２の態様による検出可能分子の使用に関する。
本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様による発光ランタニドキレート又は本発明の第３の態様によるランタニドキレート化配位子と共役した固体担体物質に関する。
本発明のランタニドキレート及び検出可能分子は、有利には高い水溶性を有する。高い水溶性を有する検出可能分子は、例えば、高濃度の検出可能分子が有益となるバイオアッセイにおいて有用である。検出可能分子の濃度が高いほど、より高感度のアッセイが可能になり、必然的にアッセイ媒体の体積が低減される。これは、検出可能分子が、血漿、唾液、その他の体液、及びそれらの調剤などの分析を必要とする水性試料への高い溶解性を有することからも有利である。
本発明のランタニドキレート及び検出可能分子は、有利には、高いルミネセンス効率、すなわち輝度（εΦ）を、特に乾燥時に有する。特許請求されるキレートで標識した抗体の実施例（実施例１８及び１９参照）は、乾燥時に最大で６９５００Ｍ−１ｃｍ−１の並外れた高いルミネセンス効率を示す。この高いルミネセンスにより、明るい生体分子−検出可能分子共役体が容易に検出されることから、非常に感度の高いアッセイが可能になる。乾燥検出可能分子のルミネセンスが、その水溶液と比較して８０〜１００倍と驚くほど改善されることで、当業者は、単に乾燥工程を追加することによってアッセイの感度を大幅に上げることができる。
特許請求される発明の配位子は、驚くほど安定な錯体をランタニドイオンと形成する。したがって、特許請求される発光ランタニドキレート及び検出可能分子は、有利に高い安定性を有する。「高い安定性」とは、錯化したランタニドイオンが配位子から脱離するか又は別のイオンで交換される傾向が小さいことを意味する。配位子からランタニドイオンが失われると、検出可能なルミネセンスが失われ、そのため本発明のアッセイの有用性が低下することから、高い安定性は有利である。この高い安定性は、キレート又は検出可能分子が、代替金属イオン及び／又は他のキレートの濃度が高い条件で使用される場合に特に有用である。安定性が高いことで、例えば、２個以上の異なるプローブがイムノアッセイ又はＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイで使用される場合のように、本発明のキレートを、他の標識されたキレートと一緒に使用することが可能になる。特許請求されるキレート及び検出可能分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、特に増殖サイクル中のような、高温を必要とする条件で使用できることから、高い安定性は有利である。さらに、キレート及び検出可能分子は、追加の金属イオンの存在下及び／又は高温で、長いインキュベーション時間に耐えることができる。
本発明の目的は、１又は２光子励起に基づく固有ルミネセンスの蛍光光度測定又は時間分解蛍光光度測定を利用した、特異的生体親和性に基づく結合アッセイ（例えば、イムノアッセイ（均一系及び不均一系の両方）、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、酵素アッセイ、免疫細胞化学的アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、及び細胞ベースアッセイ）で使用するための、改善されたランタニドキレート標識を得るための手段を提供することである。本発明のキレートは、３４０ｎｍを超える波長でも、改善された生体親和性に基づく結合アッセイを得るための手段を提供する。本発明は、例えば、改善された溶解度、改善されたアッセイ感度、改善されたルミネセンス、改善された高温安定性、並びに他のイオン及びキレート存在時の改善された安定性を有する新規配位子、キレート及び検出可能分子を利用可能にする。
発光ランタニドキレート
本発明の一態様は、式（Ｉ）の発光ランタニドキレート又はその塩に関する：

本発明のトリアザ大環状環において、単位ａ、ｂ、及びｃは、独立して０及び１から選択される。一実施形態では、ａ＝ｂ＝ｃ＝０である。
Ｌｎ３＋は、ユーロピウム（ＩＩＩ）（Ｅｕ３＋）、テルビウム（ＩＩＩ）（Ｔｂ３＋）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）（Ｄｙ３＋）、及びサマリウム（ＩＩＩ）（Ｓｍ３＋）から選択される三価のランタニドイオンである。好ましい実施形態では、Ｌｎ３＋はＥｕ３＋である。
本発明のキレートは、３個の式（ＩＩ）の発色基、すなわち、Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３を有する。

Ｃｈｅ基は、−ＣＯ２Ｈ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＰＯ（ＯＨ）Ｒ２、−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ２、及び−ＣＯＮＲ３Ｒ４（例えば、−ＣＯＮＨ２）から独立して選択されるキレート化基である。好ましい実施形態では、Ｃｈｅ基は−ＣＯ２Ｈである。Ｃｈｅ＝ＣＯ２Ｈの場合のように、Ｃｈｅがイオン化可能である実施形態では、Ｃｈｅ基はイオン化形態（例えば、−ＣＯ２ −）又は非イオン化形態（ＣＯ２Ｈ）で存在し得る。
Ｒ２基は、フェニル、ベンジル、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルから選択される。
Ｒ３及びＲ４は水素及び−Ｌ１−Ｚ１から独立して選択され、式中、Ｌ１は直接結合又はスペーサー基であり、Ｚ１はキレートが分子生体特異的反応体に結合することを可能にする反応性基である。一実施形態では、Ｒ３基及びＲ４基はいずれも水素である。
発色基Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３のフェニル環はそれぞれ、１、２、３、４、又は５個のＲ１基で置換されている。
この１、２、３、４又は５個のＲ１基は、それぞれ独立して、以下からなる群のいずれか１つから選択される：
（ｉ）水素、
（ｉｉ）−Ｘ−Ｒ５から選択される電子供与性可溶化基であって、式中、Ｘは酸素原子、硫黄原子、又は−Ｎ（Ｒ６）ＣＯ−であり、Ｒ６は水素又はＣ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔ−ブチル）であり、Ｒ５は水素、−Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔ−ブチル）、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ（例えば、−ＣＨ２ＯＨ又は−（ＣＨ２）２ＯＨ）、−（ＣＨ２）１〜６ＯＣ１〜６アルキル（例えば、−（ＣＨ２）ＯＣＨ３又は−（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ２Ｈ（例えば、−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ又は−（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈ））、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯＮＲ７Ｒ８（例えば、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２）、−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）２ ＋−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３ −及びポリエチレングリコール（例えば、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜４ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜４ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）から選択され、
式中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔ−ブチル）、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ（例えば、−ＣＨ２ＯＨ又は−（ＣＨ２）２ＯＨ）、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）２、及び−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）３から選択される、電子供与性可溶化基であり、
一実施形態では、−Ｘ−Ｒ５から選択される電子供与性可溶化基であって、式中、Ｘは酸素原子又は−Ｎ（Ｒ６）ＣＯ−であり、Ｒ６は水素又はＣ１〜６アルキルであり、Ｒ５は、水素、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯＮＲ７Ｒ８、及び−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３Ｈから選択され、式中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル−ＯＨ、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）２、及びＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）３から選択される、電子供与性可溶化基、
（ｉｉｉ）Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔ−ブチル）、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ（例えば、−ＣＨ２ＯＨ又は−（ＣＨ２）２ＯＨ）、−（ＣＨ２）１〜６ＯＣＨ３（例えば、−（ＣＨ２）ＯＣＨ３又は−（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、又は−（ＣＨ２）１〜６ＳＣＨ３から選択される基であり、
一実施形態では、Ｃ１〜６アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル又はｔ−ブチル）、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ（例えば、−ＣＨ２ＯＨ又は−（ＣＨ２）２ＯＨ）から選択される基、
（ｉｖ）−Ｌ２−Ｚ２（式中、Ｌ２は直接結合又はスペーサー基であり、Ｚ２はキレートが生体特異的反応体に結合することを可能にする反応性基である）。
Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３基のうちの少なくとも１つ（すなわち、１つ、２つ又は３つ全て）は、基（ｉｉ）から選択される２個以上のＲ１置換基を、アセチレン基に対してパラ及びオルト位に有する。好ましい実施形態では、Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３基のうちの２つは、基（ｉｉ）から選択される２又は３個のＲ１置換基を、アセチレン基に対してパラ及びオルト位に有し、第３の発色基は−Ｌ２−Ｚ２で置換されている。
一実施形態では、Ｘは原子である。好ましい実施形態では、Ｘは酸素原子であり、Ｒ５は−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ２Ｈ（例えば、−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ）、又は−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３Ｈ、又は−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）２ ＋−（ＣＨ２）１〜６−ＳＯ３ −である。
一実施形態では、発色基Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３のうちの１つ又は２つは、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩｃ）の発色基から独立して選択され、ここで基Ｒ１Ａ、Ｒ１ＡＡ、Ｒ１ＡＡＡ、Ｒ１Ｂ、Ｒ１ＢＢ、Ｒ１Ｃ、及びＲ１ＣＣはそれぞれ独立して、上記定義によるＲ１基（ｉｉ）から選択される。

好ましい実施形態では、基Ｒ１Ａ、Ｒ１ＡＡ、Ｒ１ＡＡＡ、Ｒ１Ｂ、Ｒ１ＢＢ、Ｒ１Ｃ、及びＲ１ＣＣは、−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈである。
好ましい実施形態では、式（Ｉ）のキレート剤は、反応性基を１つだけ有する。好ましい実施形態では、Ｃｈｅ基は反応性基を含まない。むしろ、反応性基Ｚ２はＬ２を介して、Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３から選択される発色基のフェニル環に結合する。
好ましい実施形態では、発色基Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３のうちの２つは、上記定義による式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩｃ）から選択され、第３の発色基は（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、又は（ＩＩｆ）から選択される：

式中、Ｒ１Ａ、Ｒ１ＡＡ、Ｒ１ＡＡＡ、Ｒ１Ｂ、Ｒ１ＢＢ、Ｒ１Ｃ、及びＲ１ＣＣは、それぞれ独立して上記定義によるＲ１基（ｉｉ）から選択される。好ましい実施形態では、Ｌ２は直接結合であり、Ｚ２はイソチオシアナト（−ＮＣＳ）基である。好ましい実施形態では、反応性基を含む発色基は、式（ＩＩｇ）を有する。
本明細書で使用するとき、Ｃ１〜６アルキルという用語は、限定するものではないが、次のアルキル基を含む：メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル及びｔ−ブチル。
本明細書で使用するとき、用語「オルト」及び「パラ」は、６員環（例えば、フェニル）の置換パターンを説明するために使用される場合、それぞれ２位及び４位での置換を意味する。例えば、オルト及びパラ位で３個の置換基で置換されたフェニル環は、２、４、６置換環である。
本発明の配位子及びキレートがカルボキシレート、スルホネートなどのようなイオン化可能基を含むとき、キレートはイオン化形態（例えば、−ＣＯ２ −）又は非イオン化形態（例えば、−ＣＯ２Ｈ）で存在してもよく、イオン化されている場合には、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋などのカチオンを対イオンとして含み得ることが理解されるべきである。
本発明のキレート及び配位子は、反応性基（Ｚ１又はＺ２）を含み、任意にスペーサー（Ｌ１又はＬ２）によって配位子又はキレートに連結する。このような場合、反応性基は、生体特異的結合反応体の標識を容易にするか、又は固体担体物質との共有結合の形成を容易にする。キレートが重合基を反応性基として有する場合、キレートを固体担体（例えば粒子）中に、粒子の製造と同時に、導入してもよい。
存在する場合、反応性基は、典型的には、アジド（−Ｎ３）、アルキニル（−Ｃ＝ＣＨ）、アルキレン（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アミノ（−ＮＨ２）、アミノオキシ（−Ｏ−ＮＨ２）、カルボキシル（−ＣＯ２Ｈ）、アルデヒド（−ＣＨＯ）、メルカプト（−ＳＨ）、マレイミド、マレイミドの活性化誘導体、イソシアナト（−ＮＣＯ）、イソチオシアナト（−ＮＣＳ）、ジアゾニウム（−Ｎ＋Ｎ）、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、反応性エステル、ピリジル−２−ジチオ、及び６−置換４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノから選択され、特に、反応性基は、イソチオシアナト（−ＮＣＳ）基を含む。
６−置換４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ中の置換基は、水素、ハロゲン、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル、置換アミノ又はチオエーテルからなる群から選択でき、好ましくは、クロロ、フルオロ、エトキシ、２−メトキシエトキシ、２−シアノエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、チオフェノキシ又はエトキシカルボニルチオメトキシからなる群から選択できる。置換アミノ又はチオエーテルは、好ましくは一置換又は二置換であり、各置換基は、好ましくはＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキル−Ｏ−、フェニル、カルボニル又はカルボキシルから独立して選択される。
反応性基は、生体特異的結合反応体と反応すると、上記生体特異的結合反応体への結合（例えば、下記の種類のうちの１つ）を確立する：チオ尿素（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−）、アミノアセトアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＣＨ３−ＣＯ−及び−ＣＯ−ＮＣＨ３−）、オキシム（−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ−）、ヒドラゾン（−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ＝ＣＨ−）（及び脂肪族チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン、

（式中、ｎ＝１〜６）；及びトリアゾール（例えば、いわゆる「クリック」ケスミトリーによって形成される）。
反応性基（例えば、Ｚ１又はＺ２）が存在する場合、その基は、必要又は望ましい場合に、反応性基を生体特異的結合反応体との反応に関与できる位置に配置するための、スペーサー（例えば、Ｌ１又はＬ２）、すなわち、間隔形成ビラジカルを含んでもよいことが理解されるべきである。スペーサーは、配位子又はキレートの合成の過程で容易に導入することができる。
「スペーサー」という用語は、例えば、共役基又はコア構造のピリジン部分と、例え ば、反応性基との間の間隔形成基を意味することを意図する。スペーサーは、典型的には、結合箇所と反応性基との間に１〜２０結合（例えば、３〜１５結合又は５〜１２結合）の長さを有する。前記スペーサーは、１〜５個の部分から形成されており、各部分は、フェニレン、１〜１０個の炭素原子を有するアルキレン、エチンジイル（−Ｃ＝Ｃ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、アミド（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＣＨ３−、及び−ＮＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−）、チオ尿素（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−）及びトリアゾールからなる群から選ばれる。
［発明を実施するための形態］
好ましい実施形態では、本発明のキレートは、式（ＩＩＩａ）を有し、式中、Ｒ１ＡＡは水素又は−ＯＣＨ２ＣＯ２ −である。
別の好ましい実施形態では、本発明のキレートは、式（ＩＩＩｂ）を有する。
ランタニドキレート化配位子
本発明の別の態様は、式（ＩＶ）のランタニドキレート化配位子に関し、式中、ａ、ｂ、ｃ、Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３は、式（Ｉ）で定義したとおりである。
検出可能分子
本発明の更に別の態様は、上記定義による発光ランタニドキレートと共役した生体特異的結合反応体を含む検出可能分子に関する。共役は通常、上記キレートの反応性基によって得られる。
生体特異的結合反応体は、サンプル中の検体を定量又は定性分析するために、その検体と特異的に結合できることが必要である。
生体特異的結合反応体の例としては、抗体、抗原、受容体配位子、特異的結合タンパク質、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド（例えばＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチド）、修飾ポリヌクレオチド（例えばＬＮＡ修飾ポリヌクレオチド）、タンパク質、オリゴ糖、多糖、リン脂質、ＰＮＡ、ステロイド、ハプテン、ドラッグ、受容体結合配位子、及びレクチンから選択されるものが挙げられる。好ましい実施形態において、生体特異的結合反応体は、抗体、例えば、トロポニンＩ抗体（抗ＴｎＩ）から選択される。
生体特異的結合アッセイの実施方法
本発明のまた更なる態様は、生体特異的結合アッセイの実施方法に関し、この方法は以下の工程を含む：
ａ）検体と、本明細書の定義によるランタニドキレートで標識化された生体特異的結合反応体との間でバイオ複合体を形成する工程、
ｂ）励起波長を有する放射線で上記バイオ複合体を励起させ、これにより励起バイオ複合体を形成する工程、及び
ｃ）上記励起バイオ複合体から放出される発光放射線を検出する工程。
工程ｂ）において、励起波長は好ましくは３００ｎｍ以上、例えば３２０〜３６０ｎｍ付近である。
本発明の方法は、当業者には明白であると思われる従来のアッセイ工程に従う。
つまり、本発明の更なる態様は、１又は２光子励起に基づく固有ルミネセンスの時間分解蛍光光度測定を利用した特異的生体親和性に基づく結合アッセイにおける、上記定義による検出可能分子の使用に関する。一実施形態において、特異的生体親和性に基づく結合アッセイは、不均一系イムノアッセイ、均一系イムノアッセイ、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、受容体結合アッセイ、免疫細胞化学的アッセイ、又は免疫組織化学的アッセイである。
別の実施形態では、工程ａ）、ｂ）、及びｃ）のうちの１つ以上は、４０℃超、５０℃超、６０℃超、７０℃超、８０℃超、９０℃超又は１００℃超などの高温で実施される。一実施形態の工程では、工程ａ）（すなわち、バイオ複合体の形成）は、上記定義による高温で実施される。
別の実施形態では、生体特異的結合アッセイを実施する方法は、バイオ複合体を乾燥する追加工程を含む。好ましい実施形態では、乾燥工程は、工程ａ）の後かつ工程ｂ）の前に実施される。
固体担体
本発明の更に別の態様は、上記定義による発光ランタニドキレートと共役した固体担体物質に関する。発光ランタニドキレートは通常、共有結合又は非共有結合のいずれかにより固体担体物質に固定化される。
いくつかの興味深い実施形態では、固体担体物質は、ナノ粒子、マイクロ粒子、スライド、プレート、及び固相合成樹脂から選択される。
新規ランタニドキレート配位子並びに対応する発光ランタニドキレート及び標識化された生体特異的結合反応体は、環状配位子構造をベースとし、この構造はキレート化ランタニドイオンの驚くほど効率的な励起をもたらす。同時に、発光ランタニドキレート及び標識化生体特異的結合反応体の重要な特徴を、凝集物の追加形成及び精製問題を生じることなく、全て保持することができる。
本発明のキレートは、以下のような、単一標識のいくつかの重要な特徴を組み合わせることを目的とする：
（ａ）約３５０ｎｍ付近のブロードな励起波長（実施例を参照）により、ＵＶ ＬＥＤを励起源として使用することが可能になり、これは計器製造におけるコスト削減、及び計器小型化の可能性をもたらすと予想される。
（ｂ）キレートを、異なるランタニドに適用できる。
（ｃ）配位子のルミネセンスが高いことは、シグナルの損失なく標識化度を低下できることを意味する。
（ｄ）標識化度の低下により、生体分子の親和性の改善及びアッセイ中の非特異的結合の減少が可能になる。それ故、より速い反応速度が可能となり、アッセイ感度を向上させることもできるより低いバックグラウンドが見られる。
（ｅ）特に数個の芳香族発色団部分を有するキレートに関して、水溶性が改善された発色団部分の望ましくない吸光特性の低下。これは、標識化抗体の非特異的結合を低減し、アッセイ感度の向上をもたらす。
（ｆ）キレートの安定性が改善されることは、高温、長いインキュベーション時間及び高濃度の追加金属イオンなどの、より厳しいアッセイ条件を使用できることを意味する。
（実験項）
実施例
以下の非限定的実施例は、本発明を更に実証することを目的とする。用いられる構造及び合成経路をスキーム１〜５に示す。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ブルカー社ＡＶＡＮＣＥ ＤＲＸ ５００ＭＨｚで記録した。テトラメチルシランを内部標準として使用した。質量スペクトルは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置で、α−シアノ−４−ケイ皮酸マトリックスを用いて記録した。ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３３００ ｐｒｏで記録した。蛍光収率は、パーキンエルマー社Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒプレート蛍光光度計を使用して測定した。Ｅｕキレート及び標識化抗体のＥｕ含有量は、ＩＣＰ−ＭＳ装置のパーキンエルマー社６１００ ＤＲＣ Ｐｌｕｓを定量モードで使用することによって測定した。励起、発光スペクトル及び減衰時間は、Ｖａｒｉａｎ社Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計を使用して測定した。
ＨＰＬＣ精製の条件：逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８カラム）。溶媒は、Ａ：トリエチル酢酸アンモニウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）及びＢ：５０％アセトニトリル／トリエチル酢酸アンモニウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）であった。グラジエントは、５％の溶媒Ｂから開始して、溶媒Ｂの量を３０分間で１００％まで直線的に増やした。
カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ）を充填したカラムを用いて実施した。ＦＣ＝フラッシュクロマトグラフィー、ＲＴ＝室温。
実施例１．化合物３の合成
化合物１（０．３４ｇ、１．６０ｍｍｏｌ；国際公開第２０１１０２６７９０号）と２（０．４７ｇ、２．１５ｍｍｏｌ；Ｔａｋａｌｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７９（１９９６）７８９）との乾燥ＴＥＡ（５ｍＬ）及びＴＨＦ（１０ｍＬ）中混合物を、アルゴンで脱気した。ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロライド（１９ｍｇ、２７μｍｏｌ）及びＣｕＩ（１０ｍｇ、５３μｍｏｌ）を添加した後、混合物を５５℃で２４時間撹拌した。蒸発乾固の後、生成物（０．４９ｇ、９４％）をＦＣ（シリカゲル、１０％ＥｔＯＨ／ＤＣＭ／１％ＴＥＡ）で精製した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８．４９（１Ｈ，ｓ），８．０８（１Ｈ，ｓ），７．６６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．６０（１Ｈ，ｓ，），７．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），４．８５（２Ｈ，ｓ），４．４９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．４３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１６４．５５，１６０．４２，１５５．２４，１５４．９４，１５４．６４，１５４．３４，１４７．４２，１３６．２４，１３３．１０，１３２．９９，１２５．５８，１２５．２７，１２０．３０，１１９．３６，１１８．９４，１１６．６５，１１４．３５，１１２．０６，９４．２４，８７．５７，６４．３０，６２．１０，１４．１８。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋Ｈ＋）３９３．１８、測定値３９４．１６。
実施例２．化合物４の合成
化合物３（０．４７ｇ、１．２０ｍｍｏｌ）とＰＢｒ３（０．１７ｍＬ、１．８０ｍｍｏｌ）との乾燥ＣＨＣｌ３（４０ｍＬ）中混合物を、＋５５℃で１８時間撹拌し、５％ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍＬ）で中和し、水相をＣＨＣｌ３（２×１０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。生成物（０．４３ｇ、７８％）をＦＣ（シリカゲル、１０％ＥｔＯＨ／ＤＣＭ）によって精製した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８．２５（１Ｈ，ｓ），８．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ）；７．６８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）；４．６２（２Ｈ，ｓ），４．５０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．４５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１６４．３２，１５７．６８，１５５．１６，１５４．８５，１５４．５５，１５４．２５，１４８．０６，１３６．２１，１３３．５９，１３３．０６，１２８．３６，１２６．０９，１２０．２６，１１９．３２，１１８．９２，１１６．６２，１１４．３２，１１２．０３，９４．６１，８６．２９，６２．２５，３２．６２，１４．２０。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋Ｈ＋）４５５．０２及び４５７．０２、測定値４５５．７８及び４５７．７３。
実施例３．化合物６の合成
化合物４（０．４１ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）、５（０．１４ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）、乾燥Ｋ２ＣＯ３（０．２３ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）及び乾燥ＭｅＣＮ（８ｍＬ）の混合物を、ＲＴで２４時間撹拌した。濾過及び洗浄の後、固体物質をＤＣＭで洗浄し、濾液を蒸発乾燥固した。生成物（０．３１ｇ、５３％）をＦＣ（シリカゲル、１％〜３％ＥｔＯＨ／ＤＣＭ）によって精製した。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ６−ＤＭＳＯ）：１１．４８（１Ｈ，ｓ），７．９７（１Ｈ，ｓ），７．７８−７．８５（３Ｈ，ｍ），７．６６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），４．３８（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；３．８０−３．８５（２Ｈ，ｍ），３．１０−３．４５（８Ｈ，ｍ），２．６５−２．７５（２Ｈ，ｍ），２．６５−２．５５（２Ｈ，ｍ），１．４３（３Ｈ，ｓ），１．４２（３Ｈ，ｓ），１．４０（６Ｈ，ｓ），１．３９（６Ｈ，ｓ），１．３４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ６−ＤＭＳＯ）：１６４．０９，１５５．７８，１５４．９６，１５４．８０，１５４．７０，１５４．５６，１５４．３７，１５４．０８，１４７．２２，１３７．５１，１３２．７４，１３２．５４，１２９．３３，１２７．０３，１２４．６９，１２０．８５，１１８．９７，１１６．６９，１１４．３９，１１２．６２，９３．８９，８６．３５，７８．７１，６１．４４，６１．２９，５１．４２，５０．１８，４９，６９，２８．０３，１４．０２。いずれのスペクトルも、異なる構造異性体を有する硬質化合物の存在を示す。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋Ｈ＋）７０４．３３、測定値７０５．０９。
実施例４．化合物７の合成
化合物６（０．２９ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）とＴＦＡ（２ｍＬ）との混合物を、ＲＴで２時間撹拌し、蒸発乾燥固し、Ｅｔ２Ｏ（４０ｍＬ）で倍散した。生成物（０．３４ｇ、８９％）を遠心分離し、Ｅｔ２Ｏ（２×１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥した。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ６−ＤＭＳＯ）：１１．５４（１Ｈ，ｓ），７．８２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．８１（１Ｈ，ｓ），７．８０（１Ｈ，ｓ），７．７１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），４．４４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．１７（２Ｈ，ｓ），３．６９（４Ｈ，ｂｓ），３，２６（４Ｈ，ｂｓ），２．９７（４Ｈ，ｂｓ），１．３９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ６−ＤＭＳＯ）：１５４．４１，１６０．６０，１５５．４８，１５５．１８，１５４．８９，１５４．５９，１４７．１７，１３８．３０，１３３．２４，１３３．０６，１２９．８７，１２８．４０，１２５．２２，１２１．４１，１１８，５７，１１６．１９，１１４．８４，１１２．５４，９５．５４，８６．３６，６２．４７，５７．６８，５０．４２，４５．９０，４５．３６，１４，４５。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋２Ｈ＋）５０５．５４、測定値５０５．３１。
実施例５．化合物１０の合成
この化合物１０は、実施例１に記載の合成と類似の方法を用いて、化合物８（国際公開第２０１３０２６７９０号）及び２から合成した。収率：７６％。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．５Ｈｚ），７．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．５Ｈｚ），６．０９（２Ｈ，ｓ），４．８４（２Ｈ，ｓ），４．７０（４Ｈ，ｓ），４．５８（２Ｈ，ｓ），４．４７（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．２９（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．２８（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．４５（１Ｈ，ｂｓ），１．４４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３１（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１６７．９７，１６７．８９，１６４．７０，１６１．０４，１６０．２２，１５８．８７，１４７．２１，１３４．１３，１２５．４２，１２５．１７，９６．１７，９４．２７，９３．８０，８７．７８，６６．２１，６５．４２，６４．２９，６１．８６，６１．６１，６１．４９，１４．２０，１４．０８，１４．０６。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋Ｈ＋）５８８．５６、測定値５８９．０３。
実施例６．化合物１１の合成
この化合物１１は、実施例１に記載の合成と類似の方法を用いて、化合物９（国際公開第２０１３０９２９９２号）及び２から合成した。収率：８０％。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８．０８（２Ｈ，ｓ），７．６０（２Ｈ，ｓ），７．４５（１Ｈ，ｄＪ＝８．５Ｈｚ），６．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．０ ａｎｄ ８．５Ｈｚ），６．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），４．８５（２Ｈ，ｓ），４．７１（２Ｈ，ｓ），４．６３（２Ｈ，ｓ），４．４７（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．３０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．２９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．４４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１６８．１１，１６８．００，１６４．６３，１６１．７１，１６０．０８，１５９．９５，１４７．２７，１３４．８１，１２７．０２，１２５．５０，１０６．４２，１０５．３８，１００．９９，９１．３０，８９．６７，６５．９１，６５．３４，６４．３２，６２．２４，６１．９３，６１．５４，１４．２０，１４．１９，１４．０７。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋Ｈ＋）４８６．１８、測定値４８６．４６。
実施例７．化合物１２の合成
化合物１０（０．３６ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）とＰＢｒ３（８６μＬ、０．９２ｍｍｏｌ）との乾燥ＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）中混合物を、ＲＴで２．５時間撹拌し、５％ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍＬ）で中和し、水相をＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。生成物（０．３３ｇ、８２％）をＦＣ（シリカゲル、１０％ＥｔＯＨ／ＤＣＭ）によって精製した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），６．０８（２Ｈ，ｓ），４．７１（４Ｈ，ｓ），４．５９（２Ｈ，ｓ），４．５１（２Ｈ，ｓ），４．４８（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．３０（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．２９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．４３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３１（９Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１６７．９２，１６７．７９，１６４．５２，１５６．２９，１３３．２７，１２５．９８，１２５．０８，９６．０９，９３．９２，９３．７６，８８．２１，６６．２２，６５．５９，６５．４３，６２．０４，６１．６２，６１．５１，３２．９６，１４．２２，１４．０７，１４．０３。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋Ｈ＋）６５０．１３及び６５２．１３、測定値６５１．０８及び６５３．０２。
実施例８．化合物１３の合成
この化合物１３は、実施例７に記載の合成と類似の方法を用いて、化合物１１から合成した。収率：８９％。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：８．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ），７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３ ａｎｄ ８．５Ｈｚ），６．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），４．７２（２Ｈ，ｓ），４．６３（２Ｈ，ｓ），４．６０（２Ｈ，ｓ），４．４９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．３０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．２９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．４５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．３１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１６８．１０，１６７．９７，１６４．４３，１６０．０５，１６０．０３，１５７．４１，１４７．９５，１３４．８８，１２７．６５，１２６．００，１０６．４２，１０５．２８，１００．９７，９１．９７，８９．３４，６５．９２，６５．３５，６２．４０，６２．０９，６１．５４，６１．４９，３２．８８，１４．２２，１４．０９，１４．９７。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋Ｈ＋）５４８．０９及び５５０．０９、測定値５４８．８３及び５５０．８０。
実施例９．化合物１４の合成
化合物７（０．１２ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、１２（０．２１ｇ、０．３２ｇ）、ＤＩＰＥＡ（０．４ｍＬ）及び乾燥ＭｅＣＮ（３ｍＬ）の混合物を、ＲＴで５．５時間撹拌し、蒸発乾燥固した。生成物（０．１９ｇ、７９％）をＦＣ（シリカゲル、最初に１０％ＥｔＯＨ／ＤＣＭ〜１５％ＥｔＯＨ／ＤＣＭ、次いで１５％ＥｔＯＨ／ＤＣＭ／５％ＴＥＡ）によって精製した。生成物が２〜３種の硬質異性体を含有することから、ＮＭＲスペクトルはあまりにも複雑で、異性体に帰属することができなかった。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋Ｈ＋）１６４２．６０、測定値１６４３．５７。
実施例１０．化合物１５の合成
この化合物１５は、実施例９に記載の合成と類似の方法を用いて、化合物１３から合成した。生成物を、ＦＣ（シリカゲル、２％ＥｔＯＨ／ＤＣＭ／１％ＴＥＡ）により精製した。収率：８４％。生成物が２〜３種の硬質異性体を含有することから、ＮＭＲスペクトルはあまりにも複雑で、異性体に帰属することができなかった。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋Ｈ＋）１４３８．５４、測定値１４３９．４１。
実施例１１．化合物１６の合成
化合物１４（９２ｍｇ、６４μｍｏｌ）と０．５Ｍ ＫＯＨとのＥｔＯＨ（６．５ｍＬ）中混合物を、ＲＴで１時間撹拌し、Ｈ２Ｏ（３ｍＬ）を添加した。ＲＴで４時間撹拌した後、ＥｔＯＨを蒸発させ、いくらかのＨ２Ｏ（２ｍＬ）を添加し、残留物をＲＴで２４時間撹拌した。クエン酸（４１ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（０．２５ｍＬ）溶液を添加した後、ｐＨを６Ｍ ＨＣｌで約６．５に調節した。塩化ユーロピウム（ＩＩＩ）（２６ｍｇ、７１μｍｏｌ）のＨ２Ｏ（０．２５ｍＬ）溶液を１０分以内で添加し、ｐＨを１Ｍ ＮａＯＨで約９．５に調節した。この混合物を９５℃で４〜６週間（ＨＰＬＣクロマトグラムで錯化完了が示された後）、ｐＨを１Ｍ ＨＣｌで約７．０に調節し、蒸発乾燥固し、２０ｍｍｏｌＴＥＡＡ緩衝液（１ｍＬ）に溶解して、セミ分取ＨＰＬＣで精製した。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１６．０分、ＵＶ＝３６０ｎｍ。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋６Ｈ＋）１４４３．２３、測定値１４４３．９６。
Ｅｕ（ＩＩＩ）負荷中にＨＰＬＣに表れた配位子異性体：１）Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１８．５分、ＵＶ＝３４５ｎｍ；２）Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２０．４分、ＵＶ＝３４７ｎｍ；３）Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２１．７分、ＵＶ＝３４７ｎｍ。このピーク全てが、最終的にＲｆ＝１６．０分及びＵＶ＝３６０ｎｍの生成物ピークを与えた。Ｅｕ錯体形成は、ＵＶで１３〜１５ｎｍに観察された深色シフトを引き起こした。これは、追加の配位子異性体のＨＰＬＣ精製及び各異性体へのＥｕ（ＩＩＩ）イオン負荷によって別途確認された。この負荷は全て、最終的に、Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１６．０分で同じ生成物を与えた。
文献、特許及び特許出願に開示されている、類似の大環状配位子を用いた一般的なＥｕ負荷方法は、所望のキレートを与えず、非錯化配位子しか得られなかったことに注意する。広範にわたる実験により、Ｅｕ負荷は、高いｐＨ（＞９）、約８０〜９０℃の高温、及び約２週間の長いインキュベーション時間が必要であること判定された。Ｅｕの負荷が困難であることは、キレートが形成された後の高いキレート化安定性を示している。
実施例１２．化合物１７の合成
この化合物１７は、実施例１１に記載の合成と類似の方法を用いて、化合物１５から合成した。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１９．２分、ＵＶ＝３５０ｎｍ。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ質量：計算値（Ｍ＋４Ｈ＋）１２９５．２３、測定値１２９５．８５。
Ｅｕ（ＩＩＩ）負荷中にＨＰＬＣに表れた配位子異性体：１）Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２１．７分、ＵＶ＝３４７ｎｍ；２）Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２２．３分、ＵＶ＝３３９ｎｍ；３）Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝２３．６分、ＵＶ＝３４３ｎｍ。
実施例１３．化合物１８の合成
化合物１６（４３ｍｇ、２１μｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１ｍＬ）溶液を、ＣＳＣｌ２（２２μＬ、０．２９ｍｍｏｌ）とＮａＨＣＯ３（２８ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）とＣＨＣｌ３（１ｍＬ）との混合物に５分以内で添加した。ＲＴで４０分間撹拌した後、水相をＣＨＣｌ３（３×１ｍＬ）で洗浄した。生成物をアセトンで沈殿させ、遠心分離し、アセトンで洗浄した。
実施例１４．化合物１９の合成
この化合物１９は、実施例１３に記載の合成と類似の方法を用いて、化合物１７から合成した。
実施例１５．化合物２０の合成
化合物１８（２ｍｇ）とタウリン（２ｍｇ）との５０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（３００μＬ、ｐＨ９．８）中混合物を、ＲＴで一晩撹拌した。生成物を、セミ分取ＨＰＬＣを使用して精製した。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１５．２分、ＵＶ＝３５４ｎｍ。
生成物の画分をエバポレートした後、残留物を５０ｍＭトリス緩衝液（１ｍＬ）に溶解した。Ｅｕ濃度は、ＩＣＰ−ＭＳによって測定した。分析パラメータは、ピークホッピングモード、２０回スイープス（sweeps）／リーディング（reading）、７回繰返し、ドウェル時間及び積分時間はそれぞれ５０ミリ秒及び１０００ミリ秒であった。ロジウムを内部標準として使用し、質量１５２．９２９でユーロピウムを測定した。Ｕｌｔｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の市販多標準ＩＭＳ−１０１、ＩＣＰ−ＭＳ較正標準１を較正に使用した。
ＩＣＰ−ＭＳ用試料調製は、分解処理、すなわちアントンパール社マイクロ波分解システムマイクロ波試料前処理システムＭｕｌｔｉｗａｖｅ ３０００を使用することで実施した。５０ｍＭトリス緩衝液中のＥｕキレートを、スプラピュア酸、ＨＮＯ３（５ｍＬ）及びＨ２Ｏ２（１ｍＬ）の混合物中で、マイクロ波で分解した。その後、試料を脱イオン水（１００ｍＬ）で希釈した。
実施例１６．化合物２１の合成
この化合物２１は、実施例１５に記載の合成と類似の方法を用いて、化合物１９から合成した。Ｒｆ（ＨＰＬＣ）＝１７．２分、ＵＶ＝３４８ｎｍ。
生成物の画分をエバポレートした後、残留物を５０ｍＭトリス緩衝液（１ｍＬ）に溶解した。Ｅｕ濃度は、実施例１５と同様の方法を使用して、ＩＰＣ−ＭＳで測定した。
実施例１７．標識試薬１８及び１９を用いた抗体の標識化
ＴｎＩ抗体の標識化は、ｖｏｎ Ｌｏｄｅ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３−３２０１に記載のように、３００倍過剰の標識試薬１８又は１９を使用することによって実施した。反応は、ＲＴで一晩実施した。標識化抗体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ１０／３０ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケア）で、トリス−生理食塩水−アジド緩衝液（トリス５０ｍＭ、ＮａＣｌ０．９％、ｐＨ７．７５）を溶離液として用いて、過剰のキレートから分離した。抗体を含有する画分をプールし、Ｅｕ濃度をＵＶで測定し、実施例１５に記載のＩＰＣ−ＭＳによって確認した。
実施例１８．トロポニンＩイムノアッセイ
キレート１８又は１９で標識化したＴｎＩ抗体を、心筋トロポニンＩに対するサンドイッチイムノアッセイにて評価した。参照化合物として、α−ｇａｌ−９−Ｄ Ｅｕで標識化したＴｎＩ抗体（ｖｏｎ Ｌｏｄｅ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３−３２０１）を使用した。１０μＬの希釈トレーサー抗体（５ｎｇ／μＬ）及び２０μＬのＴｎＩ標準溶液を、プレコートされたアッセイウェル（９６ウェルプレートフォーマット中の単一ウェル、ＴｎＩに対してストレプタビジンとビオチン化捕捉抗体でコーティングされたウェル、Ｉｎｎｏｔｒａｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）にピペットで移した。反応混合物を、振とうしながら３６℃で２０分インキュベートした。ウェルを６回洗浄し、乾燥した後に、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）Ｐｌａｔｅ蛍光光度計により測定を行った。
従来の九座α−ガラクトースＥｕキレート（表１のＲｅｆ）を、ｖｏｎ Ｌｏｄｅ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，３１９３−３２０１に従って調製した。
結果を表１にまとめて示す。Ａ標準及びＢ標準はいずれも１２回繰り返して測定し、その他の標準Ｃ〜Ｆは６回繰り返して測定した。
実施例１９タウリンと共役した新規キレート（キレート２０及び２１）の光物理的特性及びキレート１８及び１９で標識化したｃＴｎＩ抗体
５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．７５）中で測定した新規キレート（２０及び２１）及びキレート１８及び１９で標識化したｃＴｎＩ抗体の光物理的特性である励起波長（λｅｘｃ）、ルミネセンス減衰時間（τ）、モル吸光係数（ε）、推定ルミネセンス効率（εΦ）を、表２に示す。
乾燥測定（１８（乾燥）及び１９（乾燥））は、実施例１８に記載のように実施したドライイムノアッセイの後のシグナル測定に基づく推定ルミネセンス効率を表す。
ａタンパク質に結合
表２の結果からわかるように、タウリン誘導体及び標識ＩｇＧは、水性緩衝液中で測定したときにかなり低いルミネセンス（１０００Ｍ−１ｃｍ−１未満）を有するが、乾燥フォーマットではシグナルが大幅に増強され、すなわち、輝度が８０〜１００倍に増大する。この乾燥フォーマットにおけるルミネセンスの驚くべき改善は、当業者が、必要であれば、単に乾燥工程を追加するだけで、アッセイの感度を大幅に改善できることを意味する。
理論に束縛されるものではないが、水性緩衝液中での低いルミネセンス強度は、類似の種類のピリジンジカルボン酸について発表されているように、配位子の低位ＣＴ状態によって説明できると仮定される（Ａｎｄｒａｕｄ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ２００９，４３５７；Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１１，４９８７及びＴａｋａｌｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０，ａ ｐｏｓｔｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ １ｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅｓ Ｏｄｅｓｓａ，Ｕｋｒａｉｎｅ参照）。更に、かかる低ルミネセンスが、乾燥測定フォーマットでこれほど大幅に増強されることは、過去に明らかにされていない。

Claims (19)

  1. 式（Ｉ）の発光ランタニドキレート又はその塩であって、
    式中、ａ、ｂ、及びｃは、独立して０及び１から選択され、
    Ｌｎ３＋は、Ｅｕ３＋、Ｔｂ３＋、Ｄｙ３＋、及びＳｍ３＋から選択され、
    Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３は式（ＩＩ）のものであり、
    式中、Ｃｈｅは、−ＣＯ２Ｈ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＰＯ（ＯＨ）Ｒ２、−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ２、及び−ＣＯＮＲ３Ｒ４から独立して選択されるキレート化基であり、
    Ｒ２は、フェニル、ベンジル、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、
    ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルから選択され、
    Ｒ３及びＲ４は水素及び−Ｌ１−Ｚ１から独立して選択され、式中、Ｌ１は直接結合又はスペーサー基であり、Ｚ１は前記キレートが生体特異的反応体に連結することを可能にする反応性基であり、
    ｄは、１、２、３、４、又は５であり、
    Ｒ１は、独立して、
    （ｉ）水素、
    （ｉｉ）−Ｘ−Ｒ５から選択される電子供与性可溶化基であって、式中、Ｘは酸素原子、硫黄原子、又は−Ｎ（Ｒ６）ＣＯ−であり、Ｒ６は水素又は−Ｃ１〜６アルキルであり、Ｒ５は水素、−Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＯＣ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６ＣＯＮＲ７Ｒ８、−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）２、−（ＣＨ２）１〜６Ｎ（ＣＨ３）２ ＋−（ＣＨ２）１〜６ＳＯ３ −及びポリエチレングリコールから選択され、式中、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立して水素、Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ１〜６アルキル−ＯＨ、−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）２、及び−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）３から選択される、電子供与性可溶化基、
    （ｉｉｉ）Ｃ１〜６アルキル、−（ＣＨ２）１〜６ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜６ＯＣＨ３、−（ＣＨ２）１〜６ＳＣＨ３から選択される基、
    （ｉｖ）−Ｌ２−Ｚ２
    （Ｌ２は直接結合又はスペーサー基であり、Ｚ２は、標識しようとする分子に前記キレートが連結することを可能にする反応性基である）、
    からなる群のいずれか１つから選択される１つ以上の置換基であり、
    ここで、スペーサー基であるＬ １ 及びＬ ２ は結合箇所と反応性基との間に１〜２０結合の長さを有し、且つ１〜５個の部分から形成されており、各部分は、フェニレン、１〜１０個の炭素原子を有するアルキレン、エチンジイル（−Ｃ＝Ｃ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、アミド（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＣＨ ３ −、及び−ＮＣＨ ３ −Ｃ（＝Ｏ）−）、チオ尿素（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−）及びトリアゾールからなる群から選ばれ、
    Ｚ １ 又はＺ ２ が、アジド（−Ｎ ３ ）、アルキニル（−Ｃ≡ＣＨ）、アルキレン（−ＣＨ＝ＣＨ ２ ）、アミノ（−ＮＨ ２ ）、アミノオキシ（−Ｏ−ＮＨ ２ ）、アルデヒド（−ＣＨＯ）、ヒドラジド（−ＣＯＮＨＮＨ ２ ）、メルカプト（−ＳＨ）、マレイミド、マレイミドの活性化誘導体、イソシアナト（−ＮＣＯ）、イソチオシアナト（−ＮＣＳ）、ジアゾニウム（−Ｎ ＋ Ｎ）、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ピリジル−２−ジチオ、及び６−置換４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノから選択され、
    ここで、前記Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３基のうちの少なくとも１つは、基（ｉｉ）から選択される２個以上のＲ１置換基をアセチレン基に対してパラ位及びオルト位に有し、
    ただし、スペーサー基であるＬ ２ は、Ｒ １ を有するフェニル基に直接結合しているエーテル（−Ｏ−）官能基も、Ｒ １ を有するフェニル基に直接結合しているアミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−）官能基も有さず、
    ただし、前記式（Ｉ）のキレートは、Ｃｈｅとして選択される−ＣＯＮＲ ３ Ｒ ４ （式中、Ｒ ３ またはＲ ４ の一つは−Ｌ １ −Ｚ １ から選択される）を有するか、または−Ｌ ２ −Ｚ ２ （ｉｖ）から選択される一つのＲ １ 置換基を有する、
    キレート又はその塩。
  2. ａ＝ｂ＝ｃ＝０である、請求項１に記載のキレート。
  3. 前記Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３基のうちの少なくとも１つは式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩｃ）から選択され、
    式中、Ｒ１Ａ、Ｒ１ＡＡ、Ｒ１ＡＡＡ、Ｒ１Ｂ、Ｒ１ＢＢ、Ｒ１Ｃ、及びＲ１ＣＣは、それぞれ独立して請求項１に記載のＲ１基（ｉｉ）及び（ｉｖ）から選択される、請求項１又は２に記載のキレート。
  4. 前記Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３基のうちの少なくとも２つが、請求項３の定義による式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）又は（ＩＩｃ）から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキレート。
  5. 前記Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３基のうちの１つが（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）又は（ＩＩｇ）から選択され、
    式中、Ｒ１Ａ、Ｒ１ＡＡ、Ｒ１ＡＡＡ、Ｒ１Ｂ、Ｒ１ＢＢ、Ｒ１Ｃ、及びＲ１ＣＣは、それぞれ独立して請求項１に記載のＲ１基（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキレート。
  6. Ｘ＝−Ｏ−である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキレート。
  7. 前記Ｌ１又はＬ２基が、存在する場合、直接結合である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキレート。
  8. Ｌ１が、−（ＣＨ２）１〜６−、及び＊−（ＣＨ２）１〜６Ｐｈから選択されるスペーサー基であり、前記＊印付きの結合が−ＣＯＮＲ３Ｒ４の窒素原子に直接結合した、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキレート。
  9. Ｚ１又はＺ２がイソチオシアナト（−ＮＣＳ）基である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のキレート。
  10. Ｌ２が直接結合であり、Ｚ２がイソチオシアナト（−ＮＣＳ）基である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキレート。
  11. Ｃｈｅが−ＣＯ２Ｈである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキレート。
  12. 式（ＩＩＩａ）を有するキレート又はその塩であって、
    式中、Ｒ１ＡＡは水素又は−ＯＣＨ２ＣＯ２ −である、キレート又はその塩。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項の定義による式（Ｉ）の発光ランタニドキレートと共役した生体特異的結合反応体を含む、検出可能分子。
  14. 前記生体特異的結合反応体が、抗体、抗原、受容体配位子、特異的結合タンパク質、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、タンパク質、オリゴ糖、多糖、リン脂質、ＰＮＡ、ステロイド、ハプテン、ドラッグ、受容体結合配位子、及びレクチンから選択される、請求項１３に記載の検出可能分子。
  15. 前記生体特異的結合反応体が抗体である、請求項１３又は１４に記載の検出可能分子。
  16. 式（ＩＶ）のランタニドキレート化配位子又はその塩であって、
    式中、ａ、ｂ、ｃ、Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２、及びＣｈｒｏｍ３は、請求項１〜１１のいずれか一項に定義したとおりである、配位子又はその塩。
  17. 生体特異的結合アッセイを実施する方法であって、前記方法が、
    ａ）検体と、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレートで標識化された生体特異的結合反応体との間でバイオ複合体を形成する工程、
    ｂ）励起波長を有する放射線で上記バイオ複合体を励起させ、これにより励起バイオ複合体を形成する工程、及び
    ｃ）前記励起バイオ複合体から放出される発光放射線を検出する工程を含む、方法。
  18. １又は２光子励起に基づく固有ルミネセンスの時間分解蛍光光度測定を利用した特異的生体親和性に基づく結合アッセイにおける、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の検出可能分子の使用。
  19. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の発光ランタニドキレート又は請求項１６に記載のランタニドキレート化配位子と共役した固体担体物質。
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