CN107074815A - 用于大环镧系螯合物的新型发色结构 - Google Patents

用于大环镧系螯合物的新型发色结构 Download PDF

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Abstract

本专利申请公开了一种新型氮杂大环镧系螯合物设计(式(I))，所述设计围绕发光镧系核例如铕(III)离子具有取代的4‑(苯乙炔基)吡啶发色团。带有镧系离子的所述发色团具有高摩尔吸光系数和高发光值。本专利申请还公开了一种包含缀合至所述发光螯合物上的生物特异性结合剂的可检测分子、发光镧系螯合配体、以及与所述螯合物缀合的一种固体载体及其在各种测定法中的用途。

Description

用于大环镧系螯合物的新型发色结构
技术领域
本发明涉及一种围绕发光镧系核具有取代的4-(苯乙炔基)吡啶发色团的氮杂大环镧系螯合物设计。带有镧系离子的发色团具有高摩尔吸光系数和高发光值。本发明还涉及制备螯合物的配体、连接到生物特异性反应物的螯合物及其在各种测定法中的用途。
背景技术
WO2013/011236公开了具有连接到三氮杂大环核的三个4-(苯乙炔基)吡啶发色基团的发光镧系螯合物。苯环对位处的4-(苯乙炔基)吡啶发色基团被供电子基团取代。
科学文献(Tetrahedron Letters,55,2014,1357-1361(《四面体通讯》，第55卷，2014年，第1357-1361页)确认在WO2013/011236中所公开的类型的三氮杂大环配体具有相对较差的水溶性。通过将PEG基团附接到供电子对位取代基来改善水溶性的尝试只取得有限的成功。
WO2013/092992公开了具有连接到无环核的三个4-(苯乙炔基)吡啶发色基团的发光镧系螯合物。在一些实施例中，一个发色基团包含反应性基团，另外两个发色基团包含处于邻位和/或对位的两个或三个–OCH2CO2H基团。
WO2014/147288公开了用作标记试剂的基于三氮杂环壬烷的镧系螯合物复合物。所公开的螯合物具有三个4-(苯乙炔基)吡啶发色基团，其中一个发色基团包含反应性基团；另外两个发色基团具有(i)处于苯环间位和对位的两个羧基(-CO2H)取代基，或(ii)处于苯环间位的两个–OCH2CO2H基团。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种由式(I)表示的发光镧系螯合物或者其盐或溶剂化物：
其中a、b和c独立地选自0和1；并且
Ln3+选自Eu3+、Tb3+、Dy3+和Sm3+；并且
Chrom1、Chrom2和Chrom3由式(II)表示：
其中Che为独立地选自–CO2H、-PO3H2、-PO(OH)R2、-CH2PO3H2和–CONR3R4的螯合基团，
R2选自苯基、苄基、甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，
R3和R4独立地选自氢和-L1-Z1，其中L1为直接键或间隔基团，Z1为使得螯合物连接到生物特异性反应物的反应性基团；并且
d为1、2、3、4或5；
R1为独立地选自下列任一基团的一个或多个取代基：
(i)氢，
(ii)选自–X-R5的供电子增溶基团，其中X为氧原子、硫原子或–N(R6)CO-，R6为氢或-C1-6烷基，并且R5选自氢、-C1-6烷基、-(CH2)1-6OH、-(CH2)1-6OC1-6烷基、-(CH2)1-6CO2H、-(CH2)1-6CONR7R8、-(CH2)1-6SO3H、-(CH2)1-6NH2、-(CH2)1-6N(CH3)2、-(CH2)1-6N(CH3)2 +-(CH2)1- 6SO3 -和聚乙二醇，其中R7和R8各自独立地选自氢、C1-6烷基、-(CH2)1-6OH、-CH(CH2OH)2和-CH(CH2OH)3，
(iii)选自C1-6烷基、-(CH2)1-6OH、-(CH2)1-6OCH3、-(CH2)1-6SCH3的基团，
(iv)–L2-Z2，其中L2为直接键或间隔基团，并且Z2为使得螯合剂连接到待标记分子上的反应性基团，
其中基团Chrom1、Chrom2和Chrom3中的至少一者具有相对于乙炔基团处于对位和邻位的两个或更多个选自基团(ii)的R1取代基；并且
前提条件是由式(I)表示的螯合物具有不超过一个选自Z1和Z2的反应性基团。
本发明的第二方面涉及一种可检测的分子，其包括缀合至根据本发明第一方面的发光镧系螯合物的生物特异性结合剂。
本发明的第三方面涉及用于制备本发明第一方面的螯合物的镧系螯合配体。
本发明的第四方面涉及一种执行生物特异性结合测定法的方法，所述方法包括下列步骤：
a)在被分析物与用根据本发明第一方面的发光镧系螯合物标记的生物特异性结合反应物之间形成生物复合物；
b)用具有激发波长的辐射激发所述生物复合物，从而形成激发的生物复合物；以及
c)检测由所述激发的生物复合物发出的发射辐射。
本发明的第五方面涉及根据本发明第二方面的可检测分子在基于特异性生物亲和力的结合测定法中的用途，该结合测定法利用特异性发光的特异性发光分辨荧光测定的时间分辨荧光测定。
本发明的第六方面涉及一种与根据本发明第一方面的发光镧系螯合物或根据本发明第三方面的镧系螯合配体缀合的固体载体材料。
本发明的镧系螯合物和可检测分子有利地具有高水溶性。具有高水溶性的可检测分子可用于例如受益于高浓度可检测分子的生物测定法中。更高浓度的可检测分子使得更灵敏的测定法成为可能，并且所需分析培养基的体积减小。还有利的是因为可检测分子在需要分析的水性样品(例如，血液血浆、唾液、其他体液及它们的制剂)中具有高溶解度。
本发明的镧系螯合物和可检测分子有利地具有高发光产额即亮度(εΦ)，尤其是在干燥时。用受权利要求书保护的螯合物(参见实例18和19)标记的抗体的示例在干燥时具有高达69500M-1cm-1的极高发光产额。这一高发光值使得非常灵敏的测定法成为可能，因为这种明亮的生物分子-可检测分子缀合物很容易被检测到。与相同可检测分子的水溶液相比，干燥可检测分子的发光值令人惊讶地提高了80-100倍，这使得技术人员仅通过增加干燥步骤就能显著提高测定法的灵敏度。
受权利要求书保护的本发明的配体与镧系离子形成十分稳定的复合物。因此，受权利要求书保护的发光镧系螯合物和可检测分子具有有利的高稳定性。所谓“高稳定性”意指复合的镧系离子脱离配体或与替代离子交换的趋势降低。高稳定性是有利的，因为配体中镧系离子的丢失会导致可检测发光强度减弱，并因此导致本发明的测定法的实用性降低。在存在高浓度替代金属离子和/或其他螯合物的条件下使用螯合物或可检测分子时，高稳定性是特别有用的。例如，当在免疫测定法或DNA杂交测定法中使用两种或更多种不同的探针时，高稳定性使得本发明的螯合物能够与其他标记的螯合物一起使用。高稳定性是有利的，因为受权利要求书保护的螯合物和可检测分子可以在需要高温的条件(例如，聚合酶链反应(PCR)试验)下使用，尤其在倍增循环期间。此外，本发明的螯合物和可检测分子在另外金属离子的存在下和/或在高温下可经受长时间温育。
具体实施方式
本发明的目的是提供手段来获得改进的镧系螯合物标记物以用于基于特异性生物亲和力的结合测定法中，诸如免疫测定法(均相免疫测定法和非均相免疫测定法)、核酸杂交测定法、受体结合测定法、酶测定法、免疫细胞化学测定法、免疫组织化学测定法以及利用基于单光子或双光子激发的特异性发光的荧光测定或时间分辨荧光测定的基于细胞的测定法。本发明的螯合物提供了获得改进的基于生物亲和力的结合测定法(甚至是在大于340nm的波长下)的手段。本发明提供了新型配体、螯合物和可检测分子，在其他离子和螯合物的存在下，它们具有例如改善的溶解度、改善的分析灵敏度、改善的高温稳定性以及改善的稳定性。
发光镧系螯合物
本发明的一个方面涉及一种由式(I)表示的发光镧系螯合物或者其盐：
在本发明的三氮杂大环中，单元a、b和c独立地选自0和1。在一个实施例中，a＝b＝c＝0。
Ln3+为选自铕(III)(Eu3+)、铽(III)(Tb3+)、镝(III)(Dy3+)和钐(III)(Sm3+)的三价镧系离子。在一个优选的实施例中，Ln3+为Eu3+。
本发明的螯合物具有三个由式(II)表示的发色基团，即Chrom1、Chrom2和Chrom3。
基团Che为独立地选自–CO2H、-PO3H2、-PO(OH)R2、-CH2PO3H2和–CONR3R4如–CONH2的螯合基团。在一个优选的实施例中，基团Che为–CO2H。在其中Che是可电离的(例如其中Che＝CO2H)实施例中，Che基团可以电离(例如，–CO2 -)或非电离(CO2H)形式存在。
基团R2选自苯基、苄基、甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
R3和R4独立地选自氢和-L1-Z1，其中L1为直接键或间隔基团，并且Z1为使得螯合物连接到分子生物特异性反应物的反应性基团。在一个实施例中，基团R3和R4均为氢。
发色基团Chrom1、Chrom2和Chrom3的苯环各自被1、2、3、4或5个R1基团取代。
所述1、2、3、4或5个R1基团各自单独地选自下述任一基团：
(i)氢，
(ii)选自–X-R5的供电子增溶基团，其中X为氧原子、硫原子或–N(R6)CO-，R6为氢或C1-6烷基(例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基)，并且R5选自氢、-C1-6烷基(例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基)、-(CH2)1-6OH(例如，–CH2OH或-(CH2)2OH)、-(CH2)1-6OC1-6烷基(例如，-(CH2)OCH3或-(CH2)2OCH3)、-(CH2)1-6CO2H(例如，–CH2CO2H或-(CH2)2CO2H)、-(CH2)1-6CONR7R8(例如，–CH2CONH2)、-(CH2)1-6SO3H、-(CH2)1-6NH2、-(CH2)1-6N(CH3)2、-(CH2)1-6N(CH3)2 +-(CH2)1-6SO3-以及聚乙二醇(例如，-(CH2CH2O)1- 4OCH2CH2OH或-(CH2CH2O)1-4OCH2CH2OCH3)；
其中R7和R8各自独立地选自氢、C1-6烷基(例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基)、-(CH2)1-6OH(例如，–CH2OH或-(CH2)2OH)、-CH(CH2OH)2以及-CH(CH2OH)3，
在一个实施例中，选自–X-R5的供电子增溶基团，其中X为氧原子或–N(R6)CO-，R6为氢或C1-6烷基，并且R5选自氢、-(CH2)1-6OH、-(CH2)1-6CO2H、-(CH2)1-6CONR7R8和-(CH2)1-6SO3H，其中R7和R8各自独立地选自氢、C1-6烷基-OH、-CH(CH2OH)2以及CH(CH2OH)3，
(iii)选自C1-6烷基(例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基)、-(CH2)1-6OH(例如，–CH2OH或-(CH2)2OH)、-(CH2)1-6OCH3(例如，-(CH2)OCH3或-(CH2)2OCH3)、或者-(CH2)1-6SCH3的基团，
在一个实施例中，选自C1-6烷基(如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基)、-(CH2)1-6OH(例如，–CH2OH或–(CH2)2OH)的基团；
(iv)–L2-Z2，其中L2为直接键或间隔基团，并且Z2为使得螯合剂连接到生物特异性反应物上的反应性基团。
基团Chrom1、Chrom2和Chrom3中的至少一者(即，一者、两者或所有三者)具有相对于乙炔基团处于对位和邻位的两个或更多个选自基团(ii)的R1取代基。在一个优选的实施例中，基团Chrom1、Chrom2和Chrom3中的两者具有相对于乙炔基团处于对位和邻位的两个或三个选自基团(ii)的R1取代基，并且第三发色基团被–L2-Z2取代。
在一个实施例中，X为氧原子。在一个优选的实施例中，X为氧原子，并且R5为-(CH2)1-6CO2H(例如，–CH2CO2H)、-(CH2)1-6SO3H或-(CH2)1-6N(CH3)2 +-(CH2)1-6-SO3 -。
在一个实施例中，发色基团Chrom1、Chrom2和Chrom3中的一者或两者独立地选自由式(IIa)、(IIb)或(IIc)表示的发色基团，其中基团R1A、R1AA、R1AAA、R1B、R1BB、R1C和R1CC各自独立地选自如上文所定义的R1基团(ii)。
在一个优选的实施例中，基团R1A、R1AA、R1AAA、R1B、R1BB、R1C和R1CC为–OCH2CO2H。
在一个优选的实施例中，由式(I)表示的螯合剂仅具有一个反应性基团。在一个优选的实施例中，Che基团不包含反应性基团。相反，反应性基团Z2经由L2连接到选自Chrom1、Chrom2和Chrom3的发色基团的苯环上。
在一个优选的实施例中，发色基团Chrom1、Chrom2和Chrom3中的两者选自如上文所定义的式(IIa)、(IIb)或(IIc)，并且第三发色基团选自(IId)、(IIe)或(IIf)：
其中R1A、R1AA、R1AAA、R1B、R1BB、R1C和R1CC各自独立地选自如上文所定义的R1基团(ii)。在一个优选的实施例中，L2为直接键，并且Z2为异硫氰酸酯基(-NCS)。在一个优选的实施例中，包含反应性基团的发色基团具有式(IIg)。
如本文所用，术语C1-6烷基包括但不限于下面的烷基：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文所用，当用于描述6元环(例如，苯基)的取代模式时，术语“邻位”和“对位”意指分别在2位和4位上取代。例如，在邻位和对位上被三个取代基取代的苯环为2,4,6取代苯环。
应当理解，当本发明的配体和螯合物包含可电离基团(如羧酸盐、硫酸盐等)时，该螯合物可以电离(例如，–CO2 -)或非电离(例如，–CO2H)形式存在，并且如果以电离形式存在，则其可包括阳离子作为反离子，例如Na+、K+、Ca2+等。
本发明的螯合物和配体包含任选地通过间隔基(L1或L2)连接到配体或螯合物的反应性基团(Z1或Z2)。在所述实例中，反应性基团促进标记生物特异性结合反应物，或促进形成与固体载体材料的共价键。在螯合物具有聚合基团作为反应性基团的情况下，那么此螯合物可在制备颗粒的同时被引入到固体载体(例如，颗粒)中。
如果存在，则所述反应性基团通常选自叠氮基(-N3)、炔基(-C＝CH)、烯基(-CH＝CH2)、氨基(-NH2)、氨基氧基(-O-NH2)、羧基(-CO2H)、醛基(-CHO)、巯基(-SH)、马来酰亚胺基、活化的马来酰亚胺基衍生物、异氰酸酯基(-NCO)、异硫氰酸酯基(-NCS)、重氮基(-N+N)、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、反应性酯、吡啶基-2-二硫基和6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基，特别地，所述反应性基团包含异硫氰酸酯基(-NCS)。
6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基中的取代基可选自氢、卤素、烷氧基、芳氧基、氨基、具有一至六个碳原子的烷基、取代的氨基或硫醚，并且优选选自氯、氟、乙氧基、2-甲氧基乙氧基、2-氰基乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基、硫代苯氧基或乙氧羰基硫代甲氧基。取代的氨基或硫醚优选为单取代的或二取代的，每个取代基优选独立地选自C1-6烷基、C1-6烷基-O-、苯基、羰基或羧基。
因此，在与生物特异性结合反应物发生反应时，所述反应性基团与所述生物特异性结合反应物建立例如下列类型之一的连接：硫脲(-NH-C(＝S)-NH-)、甘氨酰胺(-NH-CO-CH2-NH-)、酰胺(-NH-CO-、CO-NH-、-NCH3-CO-和–CO-NCH3-)、肟(-O-N＝CH-)、腙(-CO-NH-NH＝CH-)以及脂族硫醚(S)、二硫化物(-S-S-)、6-取代的-1,3,5-三嗪-2,4-二胺、(其中n＝1-6)以及三唑(例如，通过所谓的“点击”化学形成)。
应当理解，当存在反应性基团(例如Z1或Z2)时，所述基团可包含间隔基(例如L1或L2)，即形成间距的双基，以便(如果必要或所需)使反应性基团定位在能对生物特异性结合反应物可及而进行反应的位置。所述间隔基可以很容易地在合成配体或螯合物的过程中被引入。
术语“间隔基”旨在意指在例如共轭基团或芯结构的吡啶部分与例如反应性基团之间的间隔基团。间隔基通常在附接点与反应性基团之间具有1-20个键(例如，3-15个键或5-12个键)的长度。所述间隔基由一至五个部分形成，每个部分选自亚苯基、含1-10个碳原子的烯基、乙炔二基(-C＝C-)、醚(-O-)、硫醚(-S-)、二硫化物(-S-S-)、酰胺(-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NCH3-和–NCH3-C(＝O)-)、硫脲(-NH-C(＝S)-NH-)以及三唑。
具体实施例
在一个优选的实施例中，本发明的螯合物具有式(IIIa)，其中R1AA为氢或-OCH2CO2 -：
在另一个优选的实施例中，本发明的螯合物具有式(IIIb)
镧系螯合配体
本发明的另一方面涉及一种由式(IV)表示的镧系螯合配体，其中a、b、c、Chrom1、Chrom2和Chrom3如针对式(I)所定义。
可检测的分子
本发明的又另一方面涉及一种可检测的分子，其包括缀合至如上文所定义的发光镧系螯合物的生物特异性结合反应物。缀合通常通过所述螯合物的反应性基团实现。
生物特异性结合反应物应当能够特异性结合目标被分析物，以便对样品中的所述被分析物进行定量或定性分析。
生物特异性结合反应物的例子是选自下列物质的那些：抗体、抗原、受体配体、特异性结合蛋白、DNA探针、RNA探针、寡肽、寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸(例如，经LNA修饰的寡核苷酸)、经修饰的多核苷酸(例如，经LNA修饰的多核苷酸)、蛋白质、低聚糖、多糖、磷脂、PNA、类固醇、半抗原、药物、受体结合配体和凝集素。在一个优选的实施例中，所述生物特异性结合反应物选自抗体，例如肌钙蛋白I抗体(抗-Tni)。
执行生物特异性结合测定法的方法
本发明的仍另外的方面涉及一种执行生物特异性结合测定法的方法，其中该方法包括下列步骤：
a)在被分析物与用如本文所定义的镧系螯合物标记的生物特异性结合反应物之间形成生物复合物；
b)用具有激发波长的辐射激发所述生物复合物，从而形成激发的生物复合物；以及
c)检测由所述激发的生物复合物发出的发射辐射。
在步骤b)中，激发波长优选为300nm或更长，例如大约320-360nm。
所述方法遵循常规分析步骤，如对于技术人员而言将显而易见的。
因此，本发明的另一方面涉及如上文所定义的可检测分子在基于特异性生物亲和力的结合测定法中的用途，该测定法利用基于单光子或双光子激发的特异性发光的时间分辨荧光测定。在一个实施例中，基于特异性生物亲和力的结合测定法是非均相免疫测定法、均相免疫测定法、DNA杂交测定法、受体结合测定法、免疫细胞化学测定法或免疫组织化学测定法。
在可供选择的实施例中，步骤a)、b)和c)中的一个或多个在高温诸如高于40℃、高于50℃、高于60℃、高于70℃、高于80℃、高于90℃或高于100℃下进行。在一个实施例步骤中，步骤a)(即，形成生物复合物)在如上文所定义的高温下进行。
在可供选择的实施例中，执行生物特异性结合测定法的方法包括干燥生物复合物的额外步骤。在一个优选的实施例中，所述干燥步骤在步骤a)之后且步骤b)之前进行。
固体载体
本发明的又另一方面涉及一种与如上文所定义的发光镧系螯合物缀合的固体载体材料。发光镧系螯合物通常以共价或非共价方式固定到固体载体材料上。
在一些受关注的实施例中，所述固体载体材料选自纳米颗粒、微粒、玻片、板和固相合成树脂。
新型镧系螯合物配体和对应的发光镧系螯合物以及标记的生物特异性结合反应物基于环状配体结构，这种结构使螯合的镧系离子实现令人惊讶的高效激发。同时，可保持发光镧系螯合物和标记的生物特异性结合反应物的所有重要特征，而不会有任何额外的聚集体形成和纯化问题。
本发明的螯合物旨在将若干重要特征结合在单个标记物中，诸如：
(a)约350nm处的宽激发波长(参见实例部分)使得能够使用UVLED作为激发源，这会降低仪器制造成本，并为仪器小型化提供可能性。
(b)所述螯合物适用于不同的镧系元素。
(c)配体的高发光值意味着可能在不损失信号的情况下降低标记程度。
(d)更低的标记程度可改善生物分子的亲和力并降低分析过程中的非特异性结合。因此，更快的动力学是可能的，并且观察到更低背景，这也可改善分析灵敏度。
(e)通过改善的水溶性减少发色团部分的不期望的吸收特性，尤其是对于具有若干芳族发色团部分的螯合物。这应当降低标记抗体的非特异性结合并提供改善的分析灵敏度。
(f)改善的螯合物稳定性意味着可以采用更苛刻的分析条件，诸如高温、长时间温育和高浓度的其他金属离子。
实验部分
实例
以下非限制性实例旨在进一步展示本发明。所采用的结构和合成路线示于方案1-5中。
使用Bruker AVANCE DRX 500MHz记录1H-NMR谱图。使用四甲基硅烷作为内标参照物。使用α-氰基-4-肉桂酸基质，采用PerSeptive Biosystems Voyager DE-PRO MALDI-TOF仪器记录质谱。在Pharmacia Ultrospec 3300pro上记录紫外可见光谱。使用Perkin-ElmerWallac Victor平板荧光计测定荧光效率。通过ICP-MS仪器PerkinElmer 6100DRC Plus以定量模式测量Eu螯合物和标记抗体中的Eu含量。在Varian Cary Eclipse荧光光度计上记录激发光谱、发射光谱和衰减时间。
运行HPLC纯化的条件：反相HPLC(RP-18色谱柱)溶剂为A：三乙基乙酸铵缓冲液(20mM，pH7)和B：50％乙腈的三乙基乙酸铵缓冲液(20mM，pH7)。以5％溶剂B开始梯度洗脱，在30分钟内溶剂B的量线性增加到100％。
使用填充有硅胶60(默克公司(Merck))的色谱柱进行柱层析。FC＝快速色谱法，RT＝室温。
实例1化合物3的合成
用氩气为化合物1(0.34g，1.60mmol；WO2011026790)和2(0.47g，2.15mmol；Takalo,H.,et al.,Helv.Chim.Acta,79(1996)789(Takalo,H.等人，《瑞士化学学报》，1996年，第79卷，第789页))在无水TEA(5mL)和THF(10mL)中的混合物脱气。在加入二(三苯基膦)二氯化钯(II)(19mg，27μmol)和CuI(10mg，53μmol)之后，在55℃下搅拌该混合物24小时。蒸发至干，然后通过FC(硅胶，10％EtOH/DCM/1％TEA)纯化所得产物(0.49g，94％)。1H-NMR(CDCl3)：8.49(1H,s),8.08(1H,s),7.66(2H,d,J＝8.7Hz),7.60(1H,s,),7.59(2H,d,J＝8.7Hz),4.85(2H,s),4.49(2H,q,J＝7.1Hz),1.43(3H,t,J＝7.1Hz)。13C-NMR(CDCl3)：164.55,160.42,155.24,154.94,154.64,154.34,147.42,136.24,133.10,132.99,125.58,125.27,120.30,119.36,118.94,116.65,114.35,112.06,94.24,87.57,64.30,62.10,14.18。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+H+)为393.18；实测值为394.16。
实例2化合物4的合成
将化合物3(0.47g，1.20mmol)和PBr3(0.17mL，1.80mmol)在无水CHCl3(40mL)中的混合物在+55℃下搅拌18h，然后用5％NaHCO3溶液(20mL)中和，之后用CHCl3(2×10mL)萃取水相并用Na2SO4干燥合并的有机相。所得产物(0.43g，78％)经FC(硅胶，10％EtOH/DCM)纯化。1H-NMR(CDCl3)：8.25(1H,s),8.01(1H,d,J＝1.1Hz),7.75(1H,d,J＝1.1Hz)；7.68(2H,d,J＝8.7Hz),7.65(2H,d,J＝8.7Hz)；4.62(2H,s),4.50(2H,q,J＝7.1Hz),1.45(3H,t,J＝7.1Hz)。13C-NMR(CDCl3)：164.32,157.68,155.16,154.85,154.55,154.25,148.06,136.21,133.59,133.06,128.36,126.09,120.26,119.32, 118.92,116.62,114.32,112.03,94.61,86.29,62.25,32.62,14.20。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+H+)为455.02和457.02；实测值为455.78和457.73。
实例3化合物6的合成
将化合物4(0.41g，0.90mmol)、5(0.14g，0.82mmol)、无水K2CO3(0.23g，1.62mmol)和无水MeCN(8mL)的混合物在RT下搅拌24h。过滤并用DCM洗涤固体材料之后，将滤液蒸干。所得产物(0.31g，53％)经FC(硅胶，1％至3％EtOH/DCM)纯化。1H-NMR(D6-DMSO)：11.48(1H,s),7.97(1H,s),7.78-7.85(3H,m),7.66(2H,d,J＝8.3Hz),4.38(2H,q,J＝7.1Hz)；3.80-3.85(2H,m),3.10-3.45(8H,m),2.65-2.75(2H,m),2.65-2.55(2H,m),1.43(3H,s),1.42(3H,s),1.40(6H,s),1.39(6H,s),1.34(3H,t,J＝7.1Hz)。13C-NMR(D6-DMSO)：164.09,155.78,154.96,154.80,154.70,154.56,154.37,154.08,147.22,137.51,132.74,132,54,129.33,127.03,124.69,120.85,118.97,116.69,114.39,112.62,93.89,86.35,78.71,61.44,61.29,51.42,50.18,49,69,28.03,14.02。两种谱图均表明，存在具有不同结构异构体的刚性化合物。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+H+)为704.33；实测值为705.09。
实例4化合物7的合成
将化合物6(0.29g，0.41mmol)和TFA(2mL)的混合物在RT下搅拌2h，蒸干并与Et2O(40mL)一起研磨。将所得产物(0.34g，89％)离心，用Et2O(2×15mL)洗涤并干燥。1H NMR(D6-DMSO)：11.54(1H,s),7.82(2H,d,J＝8.4Hz),7.81(1H,s),7.80(1H,s),7.71(2H,d,J＝8.4Hz),4.44(2H,q,J＝7.0Hz),4.17(2H,s),3.69(4H,bs),3,26(4H,bs),2.97(4H,bs),1.39(3H,t,J＝7.0Hz)。13C NMR(D6-DMSO)：154.41,160.60,155.48,155.18,154.89,154.59,147.17,138.30,133.24,133.06,129.87,128.40,125.22,121.41,118,57,116.19,114.84,112.54,95.54,86.36,62.47,57.68,50.42,45.90,45.36,14,45。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+2H+)为505.54；实测值为505.31。
实例5化合物10的合成
采用类似于实例1所述的合成方法，由化合物8(WO2013026790)和2合成化合物10。收率：76％。1H-NMR(CDCl3)：8.11(1H,d,J＝0.5Hz),7.64(1H,d,J＝0.5Hz),6.09(2H,s),4.84(2H,s),4.70(4H,s),4.58(2H,s),4.47(2H, q,J＝7.1Hz),4.29(4H,q,J＝7.1Hz),4.28(2H,q,J＝7.1Hz),3.45(1H,bs),1.44(3H,t,J＝7.1Hz),1.32(3H,t,J＝7.1Hz),1.31(6H,t,J＝7.1Hz)。13C-NMR(CDCl3)：167.97,167.89,164.70,161.04,160.22,158.87,147.21,134.13,125.42,125.17,96.17,94.27,93.80,87.78,66.21,65.42,64.29,61.86,61.61,61.49,14.20,14.08,14.06。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+H+)为588.56；实测值为589.03。
实例6化合物11的合成
采用类似于实例1所述的合成方法，由化合物9(WO2013092992)和2合成化合物11。收率：80％。1H-NMR(CDCl3)：8.08(2H,s),7.60(2H,s),7.45(1H,d J＝8.5Hz),6.50(1H,dd,J＝2.0 and 8.5Hz),6.45(1H,d,J＝2.0Hz),4.85(2H,s),4.71(2H,s),4.63(2H,s),4.47(2H,q,J＝7.1Hz),4.30(2H,q,J＝7.1Hz),4.29(2H,q,J＝7.1Hz),1.44(3H,t,J＝7.1Hz),1.32(3H,t,J＝7.1Hz),1.31(3H,t,J＝7.1Hz)。13C-NMR(CDCl3)：168.11,168.00,164.63,161.71,160.08,159.95,147.27,134.81,127.02,125.50,106.42,105.38,100.99,91.30,89.67,65.91,65.34,64.32,62.24,61.93,61.54,14.20,14.19,14.07。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+H+)为486.18；实测值为486.46。
实例7化合物12的合成
将化合物10(0.36g，0.61mmol)和PBr3(86μL，0.92mmol)在无水CHCl3(20mL)中的混合物在RT下搅拌2.5h，然后用5％NaHCO3溶液(20mL)中和，之后用CHCl3(20mL)萃取水相并用Na2SO4干燥合并的有机相。所得产物(0.33g，82％)经FC(硅胶，10％EtOH/DCM)纯化。1H-NMR(CDCl3)：8.12(1H,d,J＝1.3Hz),7.79(1H,d,J＝1.3Hz),6.08(2H,s),4.71(4H,s),4.59(2H,s),4.51(2H,s),4.48(2H,q,J＝7.1Hz),4.30(4H,q,J＝7.1Hz),4.29(2H,q,J＝7.1Hz),1.43(3H,t,J＝7.1Hz),1.31(9H,t,J＝7.1Hz)。13C-NMR(CDCl3)：167.92,167.79,164.52,156.29,133.27,125.98,125.08,96.09,93.92,93.76,88.21,66.22,65.59,65.43,62.04,61.62,61.51,32.96,14.22,14.07,14.03。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+H+)为650.13和652.13；实测值为651.08和653.02。
实例8化合物13的合成
采用类似于实例7所述的合成方法，由化合物11合成化合物13。收率：89％。1H-NMR(CDCl3)：8.10(1H,d,J＝1.2Hz),7.75(1H,d,J＝1.2Hz), 7.46(1H,d,J＝8.5Hz),6.50(1H,dd,J＝2.3和8.5Hz),6.46(1H,d,J＝2.3Hz),4.72(2H,s),4.63(2H,s),4.60(2H,s),4.49(2H,q,J＝7.1Hz),4.30(2H,q,J＝7.1Hz),4.29(2H,q,J＝7.1Hz),1.45(3H,t,J＝7.1Hz),1.32(3H,t,J＝7.1Hz),1.31(3H,t,J＝7.1Hz)。13C-NMR(CDCl3)：168.10,167.97,164.43,160.05,160.03,157.41,147.95,134.88,127.65,126.00,106.42,105.28,100.97,91.97,89.34,65.92,65.35,62.40,62.09,61.54,61.49,32.88,14.22,14.09,14.97。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+H+)为548.09和550.09；实测值为548.83和550.80。
实例9化合物14的合成
将化合物7(0.12g，0.15mmol)、12(0.21g，0.32g)、DIPEA(0.4mL)和无水MeCN(3mL)的混合物在RT下搅拌5.5h，并蒸干。所得产物(0.19g，79％)经FC(硅胶，首先10％EtOH/DCM至15％EtOH/DCM，然后15％EtOH/DCM/5％TEA)纯化。由于产物包含2-3个刚性异构体，NMR谱图过于复杂而难以指定异构体。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+H+)为1642.60；实测值为1643.57。
实例10化合物15的合成
采用类似于实例9所述的合成方法，由化合物13合成化合物15。所得产物经FC(硅胶，从2％EtOH/DCM/1％TEA)纯化。收率：84％。由于产物包含2-3个刚性异构体，NMR谱图过于复杂而难以指定异构体。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+H+)为1438.54；实测值为1439.41。
实例11化合物16的合成
将化合物14(92mg，64μmol)和0.5M KOH在EtOH(6.5mL)中的混合物在RT下搅拌1h，并加入H2O(3mL)。在RT下搅拌4小时之后，蒸发掉EtOH，加入一些H2O(2mL)，并将残余物在RT下搅拌24h。在加入以H2O(0.25mL)为溶剂的柠檬酸(41mg，0.21mmol)之后，用6M HCl调节pH至约6.5。在10分钟内加入以H2O(0.25mL)为溶剂的三氯化铕(III)(26mg，71μmol)，并用1MNaOH调节pH至约9.5。将该混合物在95℃下搅拌4-6周(在分析型HPLC色谱图显示出完整的复合物之后)，用1M HCl调节pH至约7.0，蒸干，接着溶解在20mmol TEAA缓冲液(1mL)中并通过半制备型HPLC纯化。Rf(HPLC)＝16.0min。UV＝360nm。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+6H+)为1443.23；实测值为1443.96。
在Eu(III)负载期间HPLC中示出的配体异构体：1)Rf(HPLC)＝18.5min，UV＝345nm；2)Rf(HPLC)＝20.4min，UV＝347nm；3)Rf(HPLC)＝21.7min，UV＝347nm。所有这些峰最终在Rf＝16.0min和UV＝360nm下得到产物峰。Eu复合物的形成导致观察到紫外吸收出现13-15nm的红移。这分别通过对配体异构体进行额外的HPLC纯化并将Eu(III)离子负载到各个异构体进一步确认。所有这些负载最终在Rf(HPLC)＝16.0min处得到相同产物。
在此应注意，有关类似大环配体的文献、专利和专利申请中所公开的一般Eu负载方法未得到期望的螯合物，只得到非复合配体。在进行大量的试验之后确定，Eu负载需要高pH(>9)、约80-90℃的高温和长达约两周的温育时间。难以负载Eu表明，螯合物一旦形成，便具有高螯合稳定性。
实例12化合物17的合成
采用类似于实例11所述的合成方法，由化合物15合成化合物17。Rf(HPLC)＝19.2min。UV＝350nm。MALDI TOF-MS质量：计算值(M+4H+)为1295.23；实测值为1295.85。
在Eu(III)负载期间HPLC中示出的配体异构体：1)Rf(HPLC)＝21.7min，UV＝347nm；2)Rf(HPLC)＝22.3min，UV＝339nm；3)Rf(HPLC)＝23.6min，UV＝343nm。
实例13化合物18的合成
在5min内将以H2O(1mL)为溶剂的化合物16(43mg，21μmol)加入CSCl2(22μL，0.29mmol)、NaHCO3(28mg，0.33mmol)和CHCl3(1mL)的混合物中。在RT下搅拌40min之后，用CHCl3(3×1mL)洗涤水相。用丙酮使所得产物沉淀，然后离心，并用丙酮洗涤。
实例14化合物19的合成
采用类似于实例13所述的合成方法，由化合物17合成化合物19。
实例15化合物20的合成
将化合物18(2mg)和牛磺酸(2mg)在50mM Na2CO3缓冲液(300μL，pH 9.8)中的混合物在RT下搅拌过夜。使用半制备型HPLC纯化所得产物。Rf(HPLC)＝15.2min。UV＝354nm。
使产物级分蒸发之后，将残余物溶于50mM TRIS缓冲液(1mL)中。通过ICP-MS测量Eu浓度。分析参数为：跳峰模式，20次扫描/读数，重复7 次，驻留时间和积分时间分别为50ms和1000ms。使用铑作为内标物，经测量铕质量为152.929。使用从Ultra Scientific公司商购获得的混标IMS–101，ICP-MS校准标准品1进行校准。
使用消解方法即购自安东帕公司(Anton Paar)的微波消解系统，微波样品预处理系统Multiwave 3000进行ICP-MS的样品预处理。在Suprapur酸、HNO3(5mL)和H2O2(1mL)的混合物中，通过微波消解50mM TRIS缓冲液中的Eu螯合物。然后用去离子水(100mL)稀释该样品。
实例16化合物21的合成
采用类似于实例15所述的合成方法，由化合物19合成化合物21。Rf(HPLC)＝17.2min。UV＝348nm。
使产物级分蒸发之后，将残余物溶于50mM TRIS缓冲液(1mL)中。采用类似于实例15中的方法，通过IPC-MS测量Eu浓度。
实例17用标记试剂18和19标记抗体
使用过量300倍的标记试剂18或19，按照von Lode P.et al.,Anal.Chem.,2003,75,3193-3201(von Lode P.等人，《分析化学》，2003年，第75卷，第3193-3201页)中所述进行TnI抗体的标记。在RT下反应过夜。通过使用含叠氮钠的Tris缓冲液盐水(Tris 50mM，NaCl 0.9％，pH 7.75)作为洗脱液，在Superdex 200HR 10/30凝胶过滤柱(通用医疗公司(GE healthcare))上使标记抗体与过量螯合物分离。收集包含抗体的级分，通过紫外光度计测量Eu浓度，并按照实例15中所述通过IPC-MS确认。
实例18肌钙蛋白I免疫测定法
采用心肌肌钙蛋白I的夹心免疫测定法测试用螯合物18或19标记的TnI抗体。使用α-gal-9-D Eu(von Lode P.et al.,Anal.Chem.,2003,75,3193-3201(von Lode P.等人，《分析化学》，2003年，第75卷，第3193-3201页))标记的TnI抗体作为参照化合物。用移液管移取10μL稀释的示踪物抗体(5ng/μL)和20μL TnI标准溶液到预涂覆测定孔(96孔板中的单个孔，用链霉亲和素和抗TnI的生物素酰化捕获抗体涂覆孔，Innotrac Diagnostics公司)中。在搅拌条件下，将反应混合物在36℃下温育20min。将这些孔洗涤6次，并在用VictorTM平板荧光计测量之前进行干燥。
根据von Lode P.et al.,Anal.Chem.,2003,75,3193-3201(von Lode P.等人，《分析化学》，2003年，第75卷，第3193-3201页)中所述制备常规9-齿α-半乳糖Eu螯合物(表1中的参照物)。
结果汇总于表1中。A和B标准品均重复测定12次，其他标准品C-F重复测定6次。
表1
实例19缀合至牛磺酸的新型螯合物(螯合物20和21)和用螯合物18和19标记的cTnI抗体的光物理特性。
新型螯合物(20和21)以及用螯合物18和19标记的cTnI抗体在50mM TRIS缓冲液(pH7.75)中所测得的光物理特性激发波长(λ激发)、发光衰减时间(τ)、摩尔吸光系数(ε)、估计的发光产额(εΦ)示于表2中。
干燥测量过程(18(干燥)和19(干燥))表示在完成如实例18所述的干燥免疫测定法之后基于信号测量值的估计发光产额。
表2
化合物 λ激发/nm τ/ms ε/M-1cm-1 εΦ/M-1cm-1
20 345 0.48 77000 700
21 341 0.58 89000 600
18a) 348 0.42 104000 1000
18a)(干燥) 69 500
19a) 346 0.51 99000 500
19a)(干燥) 40 200
a连接到蛋白质
如可从表2的结果中看出，当在缓冲水溶液中测量时，牛磺酸衍生物和标记的IgG具有相当低的发光值(低于1000M-1cm-1)，但是在干燥形式下信号显著增强，例如亮度增加大约80-100倍。在干燥形式下发光值这种令人惊讶的提高意味着在有必要的情况下，技术人员可通过简单增加干燥步骤来显著提高分析灵敏度。
不希望受理论的束缚，假设缓冲水溶液的低发光强度可能是由于配体处于低能CT态造成的，如已经针对相似类型的吡啶二羧酸所公布的那样(参见：Andraud,C.,et al.inEur.J.Inorg.Chem 2009,4357(Andraud,C.等人，《欧洲无机化学杂志》，2009年，第4357页)；Inorg.Chem.2011,4987(《无机化学》，2011年，第4987页)；以及Takalo,H.等人在the1st International Conference on luminescence of Lanthanides Odessa,Ukraine(2010年乌克兰敖德萨市召开的第一届镧系元素发光国际会议)上所作报展的结果。此外，此前未曾报道在干燥测量形式下会如此显著地增强这种低发光值。
方案1
方案2
方案3
方案4
方案5。

Claims (22)

1.一种由式(I)表示的发光镧系螯合物或其盐：
其中a、b和c独立地选自0和1；并且
Ln3+选自Eu3+、Tb3+、Dy3+和Sm3+；并且
Chrom1、Chrom2和Chrom3由式(II)表示：
其中Che为独立地选自–CO2H、-PO3H2、-PO(OH)R2、-CH2PO3H2和–CONR3R4的螯合基团，
R2选自苯基、苄基、甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，
R3和R4独立地选自氢和-L1-Z1，其中L1为直接键或间隔基团，Z1为使得所述螯合物连接到生物特异性反应物的反应性基团；并且
d为1、2、3、4或5；
R1为独立地选自下列任一基团的一个或多个取代基：
(i)氢，
(ii)选自–X-R5的供电子增溶基团，其中X为氧原子、硫原子或–N(R6)CO-，R6为氢或-C1-6烷基，并且R5选自氢、-C1-6烷基、-(CH2)1-6OH、-(CH2)1-6OC1-6烷基、-(CH2)1-6CO2H、-(CH2)1- 6CONR7R8、-(CH2)1-6SO3H、-(CH2)1-6NH2、-(CH2)1-6N(CH3)2、-(CH2)1-6N(CH3)2 +-(CH2)1-6SO3 -和聚乙二醇，其中R7和R8各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷基-OH、-CH(CH2OH)2和-CH(CH2OH)3，
(iii)选自C1-6烷基、-(CH2)1-6OH、-(CH2)1-6OCH3、-(CH2)1-6SCH3的基团，
(iv)–L2-Z2，其中L2为直接键或间隔基团，并且Z2为使得螯合剂连接到待标记分子上的反应性基团，
其中基团Chrom1、Chrom2和Chrom3中的至少一者具有相对于乙炔基团处于对位和邻位的两个或更多个选自基团(ii)的R1取代基；并且前提条件是由式(I)表示的螯合物具有不超过一个选自Z1和Z2的反应性基团。
2.根据权利要求1所述的螯合物，其中a＝b＝c＝0。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的螯合物，其中所述基团Chrom1、Chrom2和Chrom3中的至少一者选自式(IIa)、(IIb)或(IIc)：
其中R1A、R1AA、R1AAA、R1B、R1BB、R1C和R1CC各自独立地选自如权利要求1中所述的R1基团(ii)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的螯合物，其中所述基团Chrom1、Chrom2和Chrom3中的至少两者选自如权利要求3中所述的式(IIa)、(IIb)或(IIc)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的螯合物，其中所述基团Chrom1、Chrom2和Chrom3中的一者选自(IId)、(IIe)或(IIf)：
其中R1A、R1AA、R1AAA、R1B、R1BB、R1C和R1CC各自独立地选自如权利要求1中所述的R1基团(ii)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的螯合物，其中X＝-O-。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的螯合物，其中R1为–OCH2CO2H。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的螯合物，其中所述基团L1或L2(如果存在的话)为直接键。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的螯合物，其中L2为选自-O(CH2)1-6–和–O(CH2)1- 6Ph-的间隔基团，其中所述氧原子直接连接到含R1的所述苯环上。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的螯合物，其中L1为选自–(CH2)1-6–和*–(CH2)1-6Ph的间隔基团，其中标有*的所述键直接连接到-CONR3R4的所述氮原子上。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的螯合物，其中Z1或Z2选自叠氮基(-N3)、炔基(-C≡CH)、烯基(-CH＝CH2)、氨基(-NH2)、氨基氧基(-O-NH2)、羧基(-COOH)、醛基(-CHO)、酰肼基(-CONHNH2)、巯基(-SH)、马来酰亚胺基、活化的马来酰亚胺基衍生物、异氰酸酯基(-NCO)、异硫氰酸酯基(-NCS)、重氮基(-N+N)、溴乙酰胺基、碘乙酰胺基、反应性酯、吡啶基-2-二硫基和6-取代的4-氯-1,3,5-三嗪-2-基氨基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的螯合物，其中Z1或Z2为异硫氰酸酯基(-NCS)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的螯合物，其中L2为直接键，并且Z2为异硫氰酸酯基(-NCS)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的螯合物，其中Che为–CO2H。
15.具有式(IIIa)的螯合物或其盐：
其中R1AA为氢或-OCH2CO2 -。
16.一种包含生物特异性结合剂的可检测分子，所述生物特异性结合剂缀合到如权利要求1至15中任一项所限定的由式(I)表示的发光镧系螯合物。
17.根据权利要求16所述的可检测分子，其中所述生物特异性结合反应物选自抗体、抗原、受体配体、特异性结合蛋白、DNA探针、RNA探针、寡肽、寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、经修饰的多核苷酸、蛋白质、低聚糖、多糖、磷脂、PNA、类固醇、半抗原、药物、受体结合配体和凝集素。
18.根据权利要求16或17所述的可检测分子，其中所述生物特异性结合反应物为抗体。
19.一种由式(IV)表示的镧系螯合配体或其盐：
其中a、b、c、Chrom1、Chrom2和Chrom3如权利要求1至15中任一项所限定。
20.一种执行生物特异性结合测定法的方法，所述方法包括下列步骤：
a)在被分析物与用根据权利要求1至15中任一项所述的发光镧系螯合物标记的生物特异性结合反应物之间形成生物复合物；
b)用具有激发波长的辐射激发所述生物复合物，从而形成激发的生物复合物；以及
c)检测由所述激发的生物复合物发出的发射辐射。
21.根据权利要求16至18中任一项所述的可检测分子在基于特异性生物亲和力的结合测定法中的用途，所述测定法利用基于单光子或双光子激发的特异性发光的时间分辨荧光测定。
22.一种固体载体材料，其与根据权利要求1至15中任一项所述的发光镧系螯合物或根据权利要求19所述的镧系螯合配体缀合。
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