CN103555317A - 一种pH敏感近红外荧光分子探针及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种pH敏感近红外荧光分子探针MP-Cy，其结构式如下。本发明还提供了该分子探针的制备方法及其在pH检测中的应用。该荧光分子探针结构新颖，制备工艺简单，能有效的避开生物自发荧光和细胞内源性物质的干扰，灵敏度高、光学稳定性好和细胞膜渗透性好，能够准确监测近体内中性生理pH值的波动。

Description

一种pH敏感近红外荧光分子探针及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于生化检测领域，特别涉及一种pH敏感近红外荧光分子探针，还涉及该分子探针的制备方法及其在pH检测中的应用。
背景技术
细胞内pH的变化对许多细胞性活动，包括受体介导的信号传导、酶活性、细胞的生长及凋亡、离子迁移及平衡、钙的调控、胞吞作用、趋药性及细胞粘附等均会产生重要影响。例如，肿瘤发生时细胞内pH会发生变化。
基于光学信号变化而建立的pH测定方法可弥补玻璃电极难以测定体内pH的不足。一些有机化合物的荧光或吸光性质随pH的变化，该性质可用来指示目标介质中酸碱性的改变,利用荧光法测定pH具有灵敏度高、可以采用缓和模式操作(这种技术特别适合研究混浊和非均匀体系)、分析仪器的几何设计更加灵活等特点（谢小燕,夏宁邵.生物技术通讯，2001,12(3):831–837;蒋林玲,丁立平,房喻.自然杂志,2004,26(6):333–338；刘春春,杭海英.生物化学与生物物理进展,2006,33(3):22-29）。此外，利用各种荧光参数，如荧光强度、荧光寿命等的变化来测定pH值，不仅便于荧光显微学研究，而且可实时检测细胞内pH的动态分布和区域变化（S.Anderson,H.LAnderson,A.Bashall,M.McPartlin,J.K.M.Sanders Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,106-109）。此外，很多pH荧光指示剂也可同时在细胞和非细胞体系中使用。pH荧光探针的上述优点推动了用于检测生理范围内pH变化的荧光染料的改进与发展。
Michael EC等人将一系列Cy5类荧光探针用于IN细胞pH检测，这是报道较早的该类研究（Michael EC,Gregory S,Adie E.pH-Sensitive Cyanine Dyes for BiologicalApplications[J].Journal of Fluorescence.2002,12(3):425-429）。TakuyaMyochin等用三个荧光探针检测pH，发现在酸性条件下这些荧光探针的最大吸收峰红移40-80nm（Takuya M,Kazuki K,Kenjiro H,et al.Rational Design of RatiometricNear-Infrared Fluorescent pH Probes with Various pKa Values,Based onAminocyanine[J].J Am Chem Soc.2011,133:3401-3409）。Hyeran Lee等合成了一种由pH敏感的荧光染料结合一种环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（cRGD）肽靶向作用于αvβ3整联蛋白（ABIR），该蛋白质在肿瘤发生时会在上皮细胞过度表达；该探针对pH变化高度敏感，在PH=6时，该探针几乎不显示荧光，当pH<5，Pka=4.7时，显示高强度荧光；该探针为酸性细胞器特别是肿瘤溶酶体及晚期内含体的理想成像剂；体内实验显示在注射探针4h后可检测到荧光（Hyeran L,Walter A,Kumar B,et al.Near-Infrared pH-Activatable Fluorescent Probes for Imaging Primary andMetastatic Breast Tumors[J].Bioconjugate Chem.2011,22:777-784）。
近红外光区的荧光检测可以降低光对生物体的损伤，也可以避免生物体自身荧光的干扰。然而，现有对荧光分子探针的研究主要为对酸性近红外pH荧光探针的研究，难以应用于活体内pH检测；用来监测活体内pH值的变化pKa值近中性的近红外荧光探针还未见报道。迫切需要设计一种pH近中性的近红外荧光探针来研究细胞内pH值的波动情况，
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供灵敏度高、结果准确、可用于体内pH监测的pH敏感近红外荧光分子探针MP-Cy。
本发明的第二目的在于提供上述荧光分子探针的制备方法。
本发明的第三目的在于提供上述荧光分子探针的应用。
技术方案：本发明提供的一种pH敏感近红外荧光分子探针MP-Cy，其结构式如下：
Figure BDA0000392487950000021
本发明还提供了上述pH敏感近红外荧光分子探针MP-Cy的制备方法：将化合物IR-820和甲基哌嗪反应；纯化后即得。
作为优选，化合物IR-820和甲基哌嗪的摩尔比为1：（5-15），优选1：10，反应温度为70-90℃，优选80℃，反应时间为5～8h，反应体系溶剂为THF或者DMSO。
作为改进，纯化工艺具体为：减压浓缩反应液，加入醚类溶剂，过滤；滤饼经柱层析，即得。
其中，所述醚类溶剂为分子量为74-186的醚类化合物，优选乙醚或甲基叔丁基醚。
其中，色谱柱为硅胶柱，硅胶的规格为200-300目；洗脱液为体积比4:1～8:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，或为体积比3:1～6:1的乙酸乙酯和甲醇的混合物。
本发明还提供了上述pH敏感近红外荧光分子探针MP-Cy在pH检测中的应用。
有益效果：本发明提供的荧光分子探针结构新颖，制备工艺简单，能有效的避开生物自发荧光和细胞内源性物质的干扰，灵敏度高、光学稳定性好和细胞膜渗透性好，能够准确监测近体内中性生理pH值的波动。
该荧光分子探针基于快速光诱导电子转移机理(PET)来检测生物体内pH，采用拥有高消光系数的近红外荧光染料花菁(Cy)作为荧光团、甲基哌嗪(MP)作为受体，MP-Cy的荧光由于受体和荧光团之间的光诱导电子转移而猝灭，而当氮原子质子化时，PET过程受到了抑制，探针的荧光由此恢复，因此近中性时对H+反应灵敏，能够灵敏的监测近中性生理pH值的波动。
此外，该荧光分子探针在酸性范围内其响应范围为（pH=3.05～7.10）,还可适用于诸多酸性环境的pH检测，在分析化学、生命科学、环境科学等领域具有较强的实际应用价值。
附图说明
图1是本发明的荧光探针MP-Cy的1H NMR。
图2是本发明的荧光探针MP-Cy的MS。
图3为在pH=3.05～11.42范围内，本发明的荧光探针MP-Cy吸收光谱随pH值的变化图；横坐标为波长，纵坐标为吸收光谱强度，自左向右各曲线为体系pH值自11.42减小至3.05；
图4为在pH=3.05～7.10范围内，本发明的荧光探针MP-Cy吸收光谱随pH值的变化图；横坐标为pH，纵坐标为吸收率。
图5是在pH=3.05～11.42范围内，本发明的荧光探针MP-Cy荧光光谱随pH值的变化图；横坐标为波长，纵坐标为荧光光谱强度，自下而上各曲线为体系pH值自11.42减小至3.05；
图6为在pH=3.05～7.10范围内，本发明的荧光探针MP-Cy荧光光谱随pH值的变化图；横坐标为pH，纵坐标为吸收率。
图7为MP-Cy在活的HepG2细胞内成像，检测该探针是否能在生物体中成像。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
取化合物IR-8201.0g和甲基哌嗪1.18g，在20ml THF中混合，80℃加热搅拌5h；减压浓缩溶剂，加入甲基叔丁基醚80ml有深蓝色固体析出，过滤出固体，得深蓝色粗品；将深蓝色粗品以二氯甲烷：甲醇为洗脱液(4:1v/v)过200-300目硅胶柱柱层析分离，然后减压浓缩溶剂，真空干燥，得近红外荧光探针MP-Cy纯品0.42g，产率为38.89%。
其氢谱谱图和质谱谱图见图1和图2。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ1.94(s,12H),1.70-1.90(m,12H),2.43-2.50(m,4H),2.51-2.69(m,6H),3.29(s,3H),3.70(m,4H),4.18(m,4H),6.07(d,2H,J=13.2Hz),7.43(t,2H,J=7.3Hz),7.59(t,2H,J=7.3Hz)7.68(d,2H,J=8.0Hz),7.84(d,2H,J=8.0Hz),8.0(d,2H,J=13.2Hz),8.24(d,2H,J=13.2Hz)。
MS:913.30。
测定其吸收光谱和荧光光谱，谱图见图3至图6。
由图3可知在pH=3.05～11.42范围内，该荧光探针MP-Cy吸收光谱随pH值的减小红移；
由图4可知在pH=3.05～7.10范围内，吸收光谱随pH值变化更明显。
由图5可知在pH=3.05～11.42范围内，该荧光探针MP-Cy荧光光谱随pH值的减小红移；
由图6可知在pH=3.05～7.10范围内，荧光光谱随pH值变化更明显。
实施例2
取化合物IR-8205.0g和甲基哌嗪5.90g，在100ml THF中混合，80℃加热搅拌6h；减压浓缩溶剂，加入乙醚400ml有深蓝色固体析出，过滤出固体，得深蓝色粗品；将深蓝色粗品以二氯甲烷：甲醇为洗脱液(6:1v/v)过200-300目硅胶柱柱层析分离，然后减压浓缩溶剂，真空干燥，得近红外荧光探针MP-Cy纯品2.50g，产率为46.90%。
实施例3
取化合物IR-82010.0g和甲基哌嗪11.70g，在200ml THF中混合，80℃加热搅拌6.5h；减压浓缩溶剂，加入甲基叔丁基醚800ml有深蓝色固体析出，过滤出固体，得深蓝色粗品；将深蓝色粗品以乙酸乙酯：甲醇为洗脱液(4:1v/v)进行柱层析分离，然后减压浓缩溶剂，真空干燥，得近红外荧光探针MP-Cy纯品3.62g；产率为33.92%。
实施例4
取化合物IR-82020g和甲基哌嗪23.40g，在380ml THF中混合，80℃加热搅拌6.5h；减压浓缩溶剂，加入乙醚1600ml有深蓝色固体析出，过滤出固体，得深蓝色粗品；将深蓝色粗品以乙酸乙酯：甲醇为洗脱液(3:1v/v)过200-300目硅胶柱柱层析分离，然后减压浓缩溶剂，真空干燥，得近红外荧光探针MP-Cy纯品8.78g；产率为41.14%。
实施例5
取化合物IR-82020mmol和甲基哌嗪100mmol，在500ml DMSO中混合，70℃加热搅拌8h；减压浓缩溶剂，加入乙醚1600ml有深蓝色固体析出，过滤出固体，得深蓝色粗品；将蓝色粗品以二氯甲烷：甲醇为洗脱液(8:1v/v)过200-300目硅胶柱柱层析分离，然后减压浓缩溶剂，真空干燥，得近红外荧光探针MP-Cy。
实施例6
取化合物IR-82020mmol和甲基哌嗪300mmol，在500ml DMSO中混合，90℃加热搅拌5h；减压浓缩溶剂，加入二己醚1600ml有深蓝色固体析出，过滤出固体，得深蓝色粗品；将深蓝色粗品以乙酸乙酯：甲醇为洗脱液(6:1v/v)过200-300目硅胶柱柱层析分离，然后减压浓缩溶剂，真空干燥，得近红外荧光探针MP-Cy。
实施例7
应用实施例1的MP-Cy在活的HepG2细胞内成像，检测该探针是否能在生物体中成像。
37℃在HepG2细胞中加入MP-Cy（10μM）孵育1h，然后用PBS缓冲溶液（0.1M，pH7.4）冲洗3遍。在激发波长为640nm下观察探针在HepG2细胞中的荧光分布情况。
从图7a中我们可以看到探针MP-Cy可以透过细胞膜，但是在细胞内部其荧光强度不同，这也恰恰符合细胞内部pH不同的情况。
在明场图片中（图7b）证实了HepG2细胞是具有活性的。
实验结果证实在HepG2细胞中加入探针MP-Cy后显现出不同的荧光强度，这也说明了该探针能探测在近中性的细胞中pH产生的波动。

Claims (7)

1.一种pH敏感近红外荧光分子探针MP-Cy，其结构式如下：
2.一种权利要求1所述的pH敏感近红外荧光分子探针MP-Cy的制备方法，其特征在于：将化合物IR-820和甲基哌嗪反应；纯化后即得。
3.根据权利要求2所述的pH敏感近红外荧光分子探针MP-Cy的制备方法，其特征在于：化合物IR-820和甲基哌嗪的摩尔比为1：（5-15），反应温度为70-90℃，反应时间为5～8h，反应体系溶剂为THF或者DMSO。
4.根据权利要求2所述的pH敏感近红外荧光分子探针MP-Cy的制备方法，其特征在于：纯化工艺具体为：减压浓缩反应液，加入醚类溶剂，过滤；滤饼经柱层析，即得。
5.根据权利要求4所述的pH敏感近红外荧光分子探针MP-Cy的制备方法，其特征在于：所述醚类溶剂为分子量为74-186的醚类化合物，优选乙醚或甲基叔丁基醚。
6.根据权利要求4所述的pH敏感近红外荧光分子探针MP-Cy的制备方法，其特征在于：色谱柱为硅胶柱，硅胶的规格为200-300目；洗脱液为体积比4:1～8:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，或为体积比3:1～6:1的乙酸乙酯和甲醇的混合物。
7.权利要求1所述的pH敏感近红外荧光分子探针MP-Cy在pH检测中的应用。
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