CN114751854B - 近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及了一种近红外荧光探针及其制备方法和应用，旨在荧光探针制备过程复杂、成本较高，且发光大都集中在可见光的范围的问题。一种近红外荧光探针由近红外染料与WZB117通过亲核取代反应得到含有近红外荧光探针的混合物，将混合物纯化后得到。该近红外荧光探针仅通过亲核取代一步反应即可得到，制备工艺简单，且WZB117和近红外染料均为市售产品，原料易得，成本可控，本发明中的近红外荧光探针相对于传统可见光荧光探针，穿透性更强，信噪比更高。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及了一种近红外荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
目前，肿瘤已是威胁人类健康的一种全球性疾病。研发高效地用于肿瘤早期筛查、微小转移灶及淋巴结转移监测的药物对于改善治疗效果、延长病人术后生存周期以及生活质量十分重要。
目前传统的肿瘤诊断方法主要依靠肿瘤组织和肿瘤细胞的形态学特征进行判断，需要对具有一定体积的肿瘤组织进行取样检测，无法实现在肿瘤细胞数量很少时检测其存在，即无法实现肿瘤的早期筛查和判断肿瘤的转移或复发。
近年来，随着肿瘤基因组学和分子药理学的飞速发展，新型的分子探针被开发应用到肿瘤细胞的检测中，其中基于抗原-抗体反应的识别探针的原理是利用肿瘤发生发展过程中新出现或过度表达的抗原物质刺激免疫系统产生特异性抗体，肿瘤抗原物质主要是上皮细胞角蛋白、上皮细胞膜特异性抗原和肿瘤相关糖蛋白三类。以特异性的抗体作为探针，与上述抗原特异性结合进行检测，现有的此类探针的制备过程复杂，需要多步反应，合成成本较高，并且传统的荧光分子探针的发光大都集中在可见光的范围(400-750nm)，而许多生物体及其组织在紫外/可见光的激发下自身会发射荧光，因而严重干扰生物样品的荧光检测和成像。
中国专利CN111808059A公开了一种靶向肿瘤沃伯格效应的肿瘤诊断和治疗荧光探针，该探针的合成需要先通过取代反应合成荧光发色团7,8-二羟基香豆素，经过多步反应才能得到荧光探针，并且该荧光探针的发射光谱在380-640nm，在可见光的范围内。
发明内容
本发明提供了一种近红外荧光探针及其制备方法和应用，以解决现有荧光探针制备过程复杂、成本较高，且发光大都集中在可见光的范围的问题。
为了缓解上述技术问题，本发明提供的技术方案在于：
一种近红外荧光探针由近红外染料与WZB117通过亲核取代反应得到含有近红外荧光探针的混合物，将混合物纯化后得到。
更进一步地，近红外染料为IR-820，IR-820与WZB117反应得到的近红外荧光探针的结构如式(I)所示：
(I)。
一种制备上述的近红外荧光探针的方法，包括如下步骤：
(1)亲核取代：将IR820与WZB117溶于N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入碳酸盐反应得到含有近红外荧光探针的混合物；
(2)纯化：将混合物减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺得粗品，将粗品经柱层析纯化后得到近红外荧光探针WZB117-IR820。
更进一步地，IR820、WZB117和碳酸盐的物质的量比为1:1:3。
更进一步地，步骤(1)中加入碳酸盐后的反应条件为60℃反应24小时。
更进一步地，碳酸盐包括碳酸钠或碳酸钾。
一种上述的近红外荧光探针的应用，近红外荧光探针用于制备肿瘤检测产品。
一种上述的近红外荧光探针的应用，近红外荧光探针用于制备肿瘤组织体外病理染色产品。
更进一步地，检测产品用于检测良性肿瘤、恶性肿瘤或癌前病变组织。
更进一步地，检测产品用于检测口腔鳞癌、头颈鳞癌、食管鳞癌中的一种或几种。
本发明中的近红外荧光探针及其制备方法和应用的有益效果分析如下：
1、本发明的近红外荧光探针仅通过亲核取代一步反应即可得到，制备工艺简单，且WZB117和近红外染料均为市售产品，原料易得，成本可控；
2、在多种肿瘤中，葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)均相对于正常组织高表达。WZB117是一种靶向葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的小分子抑制剂，可与GLUT1特异性结合。WZB117小分子抑制剂具有高度的肿瘤特异性，其目标分子在正常组织中低表达，因此能特异显像肿瘤组织，具有较高的信背比，精确显示癌灶边界；
3、IR-820是一种激光和近红外染料，具有更好的稳定性和更高的生物相容性；
4、本发明中的近红外荧光探针相对于传统可见光荧光探针，穿透性更强，信噪比更高；
5、本发明中的近红外荧光探针能够成像转移灶及微小癌灶，直径≤2mm。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或相关技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施1中提供的探针的质谱图；
图2为本发明实施3中激光共聚焦显微镜观察不同肿瘤细胞系对探针的摄取情况的结果对照图；
图3为本发明实施例4中静脉注射探针后不同时间点小鼠活体荧光图像。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要指出的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器、材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规商业途径获得。
下述实施例中的肿瘤细胞系HSC3、SCC9、CAL27-fLUC、FADU以及正常细胞系HOK的出处如下：
HSC3购自北纳创联生物科技有限公司；
SCC9和HOK购自北京宜君博远科技有限公司；
CAL27-fLUC和FADU购自南京科佰生物科技有限公司。
下述实施例中的动物出处如下：
Balb/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
下述实施例中的主要仪器及耗材的来源如下：
12-well白色底透细胞培养板(Costar产品，产品编号为No.3513)；
Fetal Bovine Serum(Gibco产品，产品编号为10099141)；
100mm培养皿(Corning产品，产品编号为430167)；
DMEM medium(Gibco产品，产品编号为11965-084)；
RPMI-1640medium(from Gibco，Cat#A1049101)；
DMSO(Sigma产品，产品编号为No.D4540)；
流式细胞仪(BD产品，产品型号为Accuri C6，USA)；
荧光倒置显微镜(Leica产品，产品型号DMI3000B，German)；
高检测灵敏度的光学成像系统(PerkinElmer产品，产品型号IVIS Spectrum，USA)。
实施例1
探针WZB117-IR820的合成与纯化
本实施例中WZB117-IR820的合成路线如下:
将IR820(2.6mg，3.2μmol)与WZB117(1.2mg,3.2μmol)溶于1mL N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入碳酸钾(1.3mg,10.0μmol)，将反应液加热至60℃反应24小时，减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺得粗品，用制备硅胶板纯化后得到1.4mg的WZB117-IR820，产率为37.5％。MS(ESI):m/z 1160.9([M+H]+)。
实施例2
探针WZB117-IR820对体外肿瘤细胞的检测
一、细胞培养
(1)配制各细胞所需的完全培养基
具体地，基本培养基DMEM或1640占80～90％，胎牛血清占10～20％，按1％的体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使用青霉素和链霉素的终浓度分别是100U/mL和100μg/mL。
(2)实验开始前，确认标记在100mm培养皿上的细胞系的名字、培养基以及传代时间、代次等信息，确保实验无误。
(3)利用无菌吸管吸取细胞培养基。
(4)用3～5mL的无菌PBS溶液润洗细胞表层，再用无菌吸管吸出PBS废液。
(5)向培养基中加入1mL 0.25％(w/v)含0.04％(w/v)EDTA的胰酶溶液用于消化细胞，轻轻混匀，使溶液覆盖住细胞表层，在显微镜下观察，等细胞完全脱离培养皿底部且细胞连接较松散时加入5～10mL完全培养基并进行吹打。
(6)将细胞分离成单个后，将此细胞悬液转移到15mL无菌离心管中，800rpm离心5min。
(7)利用无菌吸管吸出上清培养基，并加入5mL新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀，
(8)用细胞计数板对细胞悬液进行计数，调整细胞悬液的浓度并接种到12孔培养板中进行铺板实验，细胞密度为2×105个细胞/孔，培养过夜，使细胞充分贴壁。
二、荧光倒置显微镜观察细胞对WZB117-IR820的摄取情况
(1)利用无菌吸管将培养板中的培养基吸除；
(2)将WZB117-IR820加入12孔培养板中，放入37℃培养箱中继续培养4h；
(3)利用无菌吸管吸出培养基废液，并加入1～2mL无菌PBS/孔清洗细胞表层2～3次，再用无菌吸管吸出PBS废液；
(4)将细胞置于激光共聚焦显微镜中进行观察。
关于不同肿瘤细胞系对WZB117-IR820的摄取情况，请参考图2，具体说明如下：
所有的头颈鳞癌肿瘤细胞(HSC3、SCC9、CAL27-fLUC)中能够看到红色荧光，说明肿瘤细胞对WZB117-IR820具有很好的摄取，而同等条件下的正常细胞(HOK)中的红色荧光很弱或不可见，说明其对WZB117-IR820的摄取量以及摄取探针的细胞数量均有明显降低，由此可见，WZB117-IR820具有很好的肿瘤特异性。
实施例3
探针WZB117-IR820对活体肿瘤细胞的检测
(1)荷瘤小鼠模型的建立
取CAL-fLUC肿瘤细胞，800rpm离心5min，再用无菌PBS洗涤肿瘤细胞3次，并做适当稀释，用血球计数板进行计数制成浓度为1×107个/ml的肿瘤细胞悬液，每只小鼠背部偏左后肢皮下接种肿瘤细胞悬液50μL。
(2)靶向性验证
肿瘤接种7天以后，静脉注射3mg/mL的WZB117-IR820溶液0.1mL，用高检测灵敏度的光学成像系统分析仪监测不同时间点小鼠体内的荧光及核磁信号分布。
关于静脉注射探针后不同时间点小鼠活体荧光图像的结果，请参考图3，具体说明如下：
随着时间的延长，WZB117-IR820在肿瘤部位的富集在2～4h时达到峰值，时间继续增加，虽然肿瘤部位荧光强度减弱，但肿瘤部位与周围组织的区分度越来越明显，说明WZB117-IR820具有很好的肿瘤靶向性。
综上所述，结合实施例一至实施例三，本发明中的近红外荧光探针及其制备方法和应用可实现如下有益效果：
1、原料均为市场产品，成本可控，制备工艺简单；
2、IR-820是一种激光和近红外染料，相对于荧光染料，穿透性更强，信噪比更高；
3、无论是在细胞水平还是动物水平都体现了很好的靶向性，能特异显像肿瘤组织，具有较高的信背比，达到了准确显示癌灶边缘以及微小癌灶的有效探测。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。
Claims (9)
1.一种近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光探针的结构如式(I)所示：
2.一种制备如权利要求1所述的近红外荧光探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)亲核取代：将IR820与WZB117溶于N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入碳酸盐反应得到含有近红外荧光探针的混合物；
WZB117的结构如式(II)所示：
(2)纯化：将所述混合物减压蒸馏除去N，N-二甲基甲酰胺得粗品，将所述粗品经柱层析纯化后得到近红外荧光探针WZB117-IR820。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述IR820、WZB117和碳酸盐的物质的量比为1:1:3。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中加入所述碳酸盐后的反应条件为60℃反应24小时。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述碳酸盐包括碳酸钠或碳酸钾。
6.一种如权利要求1所述的近红外荧光探针的应用，其特征在于，
所述近红外荧光探针用于制备肿瘤检测产品。
7.一种如权利要求1所述的近红外荧光探针的应用，其特征在于，
所述近红外荧光探针用于制备肿瘤组织体外病理染色产品。
8.根据如权利要求6所述的应用，其特征在于，
所述检测产品用于检测良性肿瘤、恶性肿瘤或癌前病变组织。
9.根据如权利要求6所述的应用，其特征在于，
所述检测产品用于检测口腔鳞癌、头颈鳞癌、食管鳞癌中的一种或几种。
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