CN112159813A - 特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供由SEQ ID NO:1所示的特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的单链DNA核酸适配体及其应用。具体地,本发明的核酸适配体及其衍生物相对抗体而言,具有能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。本发明还提供所述单链DNA核酸适配体的应用,它们可以单独地或组合地用于卵巢浆液性腺癌细胞的检测或者卵巢浆液性腺癌病人卵巢组织切片的检测,或者靶向到卵巢浆液性腺癌病人的肿瘤部位。
Description
技术领域
本发明涉及生物和医学领域,特别涉及一种可用于结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体及其筛选方法和用途。
背景技术
卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,其发病率在女性生殖系统肿瘤中占第三位,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。主要原因可能是由于其侵袭性强,发现晚,易产生化疗耐药以及临床缺乏有效的靶向药物。卵巢癌主要包括四种组织学类型:上皮性肿瘤,生殖细胞肿瘤,性索-间质肿瘤和转移性肿瘤。上皮性卵巢肿瘤,尤其是卵巢浆液性腺癌是最常见的类型,占卵巢癌发病率的90%。在卵巢癌早期,血清标志物如CA125和人附睾蛋白4(humanepididymis protein4,HE4)常常处于正常范围内,但是肿瘤的中晚期迅速增加。卵巢癌缺乏有效的早期监测手段,NCCN 2018推荐的早期监测和预后评估方法是经阴道超声检查结合血清标志物HE4和CA125。HE4最早在人附睾远端的上皮细胞中发现,对卵巢浆液性腺癌的敏感性为90%,特异性为97%,是鉴别卵巢良恶性肿瘤的一个具有重要价值的肿瘤标志物。HE4蛋白在正常卵巢以及非上皮性卵巢癌病人血清中的表达水平为<140pmol/L。目前卵巢癌的诊断往往是依据术中快速病理,但是传统的术中冰冻方法是对组织切片进行H&E染色,该方法对鉴别卵巢恶性肿瘤的组织学类别具有一定的局限性,而术中冰冻的病理结果对临床手术方式具有决定性的影响;新提出的快速免疫组化,因其价格昂贵,技术不稳定,不能在临床广泛使用,因此寻找卵巢浆液性腺癌更加敏感的标志物,及更加快速简单的术中病理辅助方法,对该疾病的诊断及治疗具有重要意义。
核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选分离得到的DNA或者RNA分子,它可以与其它靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合,因此在生化分析、环境监测、基础医学、新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小,稳定性更好,易改造修饰,无免疫原性,制作周期短,可以通过人工合成等优势,免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。
在卵巢癌的早期检测和靶向治疗中,迫切需要更多敏感和特异性分子探针。特异结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体在检测和靶向治疗上具有重大应用前景。目前已经有一些研究者公布了他们所发现的一些HE4蛋白的核酸适配体序列,然而,这些核酸适配体存在一些缺点,例如,有些核酸适配体的靶标是鼠源的蛋白,实际应用受限;有些核酸适配体分子量大,有些核酸适配体没有动物实验以及细胞和切片实验的验证,是否可应用到检测和治疗上还有待进一步证实。因此,本领域对具有特异性识别卵巢浆液性腺癌细胞的结合亲和力更高的核酸适配体存在需求。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明要解决的问题是提供一种具有高度特异性、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体及其衍生物,还相应提供所述核酸适配体的筛选方法和用途。
第一方面,为了解决上述技术问题,使用体外指数富集的配基系统进化(SELEX)技术,筛选得到了特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体。具体的,本发明人设计并合成了一个随机单链DNA文库和相应的引物,用卵巢浆液性腺癌的原代细胞作为正筛细胞,以HOSE细胞和HO8910作为反筛细胞,来筛选具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体,由此筛选得到一些特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体,并检测了它们与卵巢浆液性腺癌细胞的结合能力。在此基础上,本发明人完成了本发明。
在第二方面,本发明提供了一种核酸适配体,所述核酸适配体的序列包含或由以下组成:
(1)如下所示的核苷酸序列:
SEQ ID NO:1(mApoc 46):
5’-GTGCTGGATGTCACCTCCACTCACCACCTCTTCTCCGCTCCTCGTCATGACACATCCAG-3’
或
(2)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同源性且特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的核苷酸序列,例如可将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列删除或增加部分互补的核苷酸;或
(3)由(1)或(2)的核苷酸序列转录且特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的RNA序列。
在本发明的具体实施方案中,所述核酸适配体特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞;优选地,所述卵巢浆液性腺癌为高表达HE4的细胞;更优选地,所述卵巢浆液性腺癌细胞是细胞上清液中或患者血清中HE4浓度为>140pmol/L的细胞或者是用HE4抗体免疫荧光染色为阳性的细胞。
另外,本领域技术人员应该理解,作为对上述技术方案的改进,可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰,例如,磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或连接同位素化等,条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质,例如,可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合卵巢浆液性腺癌细胞的亲和力,或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
在另一方面,本发明还提供核酸适配体的缀合物。本领域技术人员应该理解,作为对上述技术方案的改进,可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶标记等,条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质,例如,可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合卵巢浆液性腺癌细胞的亲和力,或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。
换言之,以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体序列,都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能,都可应用于与卵巢浆液性腺癌细胞结合。
此外,作为一个总的技术构思,本发明还提供核酸适配体衍生物,所述衍生物是将前述核酸适配体或核酸适配体的缀合物的核苷酸序列的骨架改造成硫代磷酸酯骨架而得,或者是前述核酸适配体或核酸适配体的缀合物改造成的相应肽核酸,条件是所述衍生物都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能,且都与卵巢浆液性腺癌细胞结合。
本发明所使用的术语“硫代磷酸酯骨架”具有本领域普通技术人员一般理解的含义,其是指RNA和DNA核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键氧原子可以被一个或两个硫原子取代,分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其靶标的结合亲和力,以及对核酸酶降解的增强的抗性。
本发明所使用的术语“肽核酸”具有本领域普通技术人员一般理解的含义,其是指一种人工合成DNA分子类似物,于1991年由Nielsen等首次报道。用N-2-(氨乙基)-甘氨酸(N-(2-aminoethyl)-glycine)单位代替糖-磷酸酯骨架作为重复结构单元,合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物,称为肽核酸。由于肽核酸(PNA)没有如DNA或RNA上的磷酸基团,因此PNA与DNA之间缺乏电性相斥的现象,使两者之间的结合强度大于DNA与DNA之间的结合强度。
在另一方面,本发明还提供了前述核酸适配体、其缀合物或者其衍生物在由以下各项组成的组中的任意一项中的用途:
(1)制备特异性靶向卵巢浆液性腺癌细胞或者组织的靶向性药物;
(2)制备特异性诊断卵巢浆液性腺癌的诊断试剂;
(3)卵巢浆液性腺癌细胞、组织或活体定位成像;或
(4)捕获卵巢浆液性腺癌细胞。
具体地,卵巢浆液性腺癌原代细胞高表达HE4,将该细胞与荧光基团修饰的SEQ IDNO:1所示的核酸适配体孵育,该经修饰的核酸适配体会特异性结合细胞,利用流式细胞仪或者共聚焦显微镜,可以检测核酸适配体上标记的荧光分子,从而对细胞进行检测,进一步进行精确定量。本领域技术人员能够依据实际需要选择适当的检测方式及检测对象。
其中,本发明中所述的“卵巢浆液性腺癌细胞”为高表达HE4的细胞,其中所述“高表达HE4”是指细胞上清液中或患者血清中HE4浓度为>140pmol/L的细胞或者是用HE4抗体免疫荧光染色为阳性的细胞。
在另一方面,本发明提供特异性靶向卵巢浆液性腺癌的靶向性药物,所述的靶向性药物包括前述核酸适配体、其缀合物或其衍生物,以及与之相连的卵巢浆液性腺癌治疗药物。
在另一方面,本发明提供特异性诊断卵巢浆液性腺癌的诊断试剂,所述的诊断试剂包括前述核酸适配体、其缀合物或其衍生物,以及与之相连的可检测标记物。
在一个优选的实施例中,在所述的诊断试剂中,所述的可检测标记物是荧光标记。
在另一优选的实施例中,所述荧光标记包括(但不限于):Cy3、Cy5、FAM、荧光素、FITC、荧光纳米微球。
本发明的有益效果在于:所提供的核酸适配体、其缀合物及其衍生物高度特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞,且分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中,本发明的上述特征和优点将更明显,其中:
图1显示本发明实施例1筛选过程中部分文库与靶标细胞和反筛细胞的亲和力用流式细胞术检测的结果。
图2显示本发明实施例1筛选得到的Apoc46与截短后的mApoc46的流式细胞术检测结果。
图3显示本发明实施例1筛选得到的核酸适配体mApoc46亲和力检测数据(流式细胞术数据)。KD值为152±48nM。
图4显示本发明实施例1筛选得到的核酸适配体mApoc46可以与卵巢浆液性腺癌原代细胞活细胞结合(共聚焦显微镜拍摄图片)。
图5显示本发明实施例1筛选得到的核酸适配体mApoc46可以与卵巢浆液性腺癌原代细胞固定细胞结合,以及其与抗体的共定位情况(共聚焦显微镜拍摄图片)。
图6显示本发明实施例1筛选得到的核酸适配体mApoc46和卵巢浆液性腺癌的组织切片的结合能力(共聚焦显微镜拍摄图片)。
图7显示本发明实施例1筛选得到的核酸适配体mApoc46可以与卵巢浆液性腺癌的卵巢癌细胞结合的特异性实验(流式细胞术数据)。
图8显示本发明实施例1筛选得到的核酸适配体mApoc46对卵巢浆液性癌的PDX小鼠的体内亲和力评估结果,结果显示mApoc46可以很好的靶向到肿瘤区域,而对照序列mApoc14没有明显的靶向性。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明,但是本领域技术人员应该理解,以下的实施例便于更好的理解本发明,本发明并不限于这些具体的实施例。
以下实施例中的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明,均为常规生化试剂,可通过商业途径购买得到。
实施例1:特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的ssDNA核酸适配体的筛选
1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物:
随机单链DNA文库:
SEQ ID NO:2:5’-GTTCGTGGTGTGCTGGATGT(36N)TGACACATCCAGCAGCACGA-3’
其中,“36N”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
引物信息如表1,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1引物及其序列
其中,引物名称中的S代表正向引物,引物名称中A代表反向引物,序列中的19A表示由19个腺苷酸(A)组成的polyA尾,“Spacer 18”表示18原子的六乙二醇间臂。在上述3’端引物中所用的“Spacer 18”结构式如下式所示。
引物分别用DPBS缓冲液(CaCl2:0.1g/L,KCl:0.2g/L,KH2PO4:0.2g/L,MgCl2·6H2O:0.1g/L,NaCl:8g/L,Na2HPO4:1.15g/L;PH7.4,25℃)配制成100μM的贮存液,于-20℃保存备用。
2、以卵巢浆液性腺癌的原代细胞活细胞为靶标进行核酸适配体筛选
具体筛选方法如下:
1)文库溶解与变复性:取1OD随机单链核苷酸文库,14000rpm离心10分钟,将文库离心到管底,用添加了4.5g/L葡萄糖的DPBS缓冲液将文库溶解至5μM,分装到PCR管进行变复性处理。处理过程如下:PCR仪设定程序95℃保持10分钟,此步骤目的是使折叠的链解开,然后4℃保持5分钟,然后在25℃保持5分钟。
2)原代细胞处理与培养:实验采用改良的原发性卵巢癌细胞培养法。本实施例选择术前血清HE4水平明显升高的患者的肿瘤组织作为原代细胞培养的标本,将新鲜卵巢癌组织在低温下迅速送至实验室,在去除血液后用含1%mycillin的PBS将其分解成组织匀浆。然后匀浆被胰蛋白酶(BI,Israel)消化2-3分钟。加入含有15%胎牛血清(FBS,BI)的DMEM(HyClone,USA),然后1000r/min离心5分钟,丢弃上清液,消化组织涂抹到培养瓶的底部,培养一整夜。用含0.1mg/L表皮生长因子(EGF,Proteintech)和15%FBS的DMEM培养基覆盖组织,培养2-4天。当细胞密度达到80%左右时,用胰蛋白酶消化。所有的原代细胞经过2次传代实验后,尽可能保持其纯度。用人附睾蛋白4(HE4)的抗体(abcam)对这些细胞进行鉴定,用电化学系统(Roche,Germany)检测培养上清液中HE4和CA125蛋白的浓度,确保细胞为高表达HE4的卵巢癌细胞。电化学法检测培养的肿瘤细胞的上清液中HE4和CA125水平见表2.
表2
3)文库与细胞孵育:第一轮筛选中,将12孔板其中的3个孔的细胞用DPBS清洗3次,每次1mL,然后将步骤1)中处理后的文库加入到细胞中,在4℃孵育60分钟。孵育结束后用1mL DPBS清洗细胞3次。清洗后的细胞加入200μl纯水浴10min后用细胞刮收集细胞到1.5mL的EP管中,煮沸10分钟后用14000rpm离心3分钟,收集上清,标记为elution-HE4 cell。
4)扩增及单链制备:以elution-HE4 cell中的核酸分子为模板,用乳浊液PCR(ePCR)进行扩增。方法如下:将全部模板elution-HE4 cell加入2ml PCR mix中混匀,加入4倍体积的ePCR微液滴生成油,涡旋制备乳浊液。将乳浊液分成100μl/管加入到PCR管中,扩增条件如下:95℃预变性2分钟,95℃变性60秒,60℃退火60秒,72℃延伸60秒,共35个循环,4℃保存。ePCR微液滴生成油购自安徽省昂普拓迈(Aptamy)生物科技有限公司(货号:EPO100),PCR mix的配方见表3。
表3ePCR mix配方
扩增产物用正丁醇纯化:收集所有的ePCR产物于15ml尖底离心管中,加入2倍体积的正丁醇,在旋涡混合器上震荡以充分混匀;台式离心机,9000rpm(转/分钟)于25℃离心10分钟;移弃上相(正丁醇),得到浓缩的PCR扩增产物,按体积比1:1加入TBE/尿素变性缓冲液,煮沸变性15分钟使DNA变性,随后冰浴1分钟,将所有的样品进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,400V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部,使加长的反义链与FAM标记的链分开,7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如表4。
表4变性聚丙烯酰胺凝胶配方
切胶回收FAM标记的链:将凝胶取出放在塑料膜上,Ex(nm):495,Em(nm):517检测我们需要的带有FAM标记的ssDNA;用干净的刀片将目的条带直接切下,将胶条转移至1.5mlEP管中并捣碎,加入1ml ddH2O后沸水浴10分钟将胶中的ssDNA转移至溶液中,离心去除胶的碎片,留上清,再往胶碎片中加入1ml ddH2O后沸水浴10分钟,离心回收上清。两次回收的上清合并后转移到15mL离心管中,加入11.5毫升正丁醇后颠倒混匀,于9000rpm(转/分钟)离心5分钟。得到DNA单链用3.5KD的透析袋透析过夜,即可作为下一轮筛选的文库;
5)反筛:从第三轮筛选开始用不同的细胞进行反筛,方法为在进行以卵巢浆液性腺癌细胞正筛之前都先用其它细胞进行反筛,具体细胞种类见表5,反筛步骤如下:制备的单链核苷酸文库经变复性后,与反筛细胞于4℃孵育一定时间,收集上清,上清作为单链核苷酸文库与正筛细胞即卵巢浆液性腺癌细胞进行孵育,接下来的步骤同步骤3)。
6)重复筛选11轮,每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库,筛选过程中用流式细胞术检测DNA单链文库对靶标细胞的识别能力的变化,当DNA单链文库对靶标细胞的识别能力满足要求,即筛选后的DNA单链文库与靶标的结合能力高于筛选起始投入的文库,将所得产物送测序分析。筛选过程中文库与靶标细胞的亲和力用流式细胞术检测的方法见实施例2,检测结果如图1所示。
所述筛选方法中,可逐轮增加筛选压力,以增进筛选核酸适配体的富集程度,缩短筛选进程。所述增加筛选压力包括减少投入的单链DNA文库的量、靶标蛋白的用量和两者的孵育时间,增加清洗时间,清洗次数以及加大反筛细胞的用量和反筛力度。从第二轮筛选开始,文库与靶标细胞孵育时,缓冲液中加入0.05g/L BSA和2ug/ml鲑鱼精DNA。每一轮筛选的其它详细参数见表5。
表5.筛选过程细节
7)分析和鉴定多轮筛选后得到的核酸适配体,将得到的富集文库产物经克隆测序分析后,挑选若干条序列由上海生工合成,然后检测亲和力,在后续检测中,确定了1条序列具有很强的结合能力,命名为Apoc46(SEQ ID NO:8:GTTCGTGGTGTGCTGGATGTCACCTCCACTCACCACCTCTTCTCCGCTCCTCGTCATGACACATCCAGCAGCACGA),然后将该序列进行截短部分引物区之后得到了SEQ ID NO:1所示(GTGCTGGATGTCACCTCCACTCACCACCTCTTCTCCGCTCCTCGTCATGACACATCCAG)的核酸适配体,且验证其具有理想的结合卵巢浆液性腺癌细胞的亲和力,且比全长的序列对靶标细胞的结合能力更高,将它命名为mApoc46。检测结果见图2,检测方法见实施例3。
实施例2流式细胞术检测富集文库和亲和力
1、将贴壁培养的处于对数生长期的细胞(实施例1步骤2方法处理得到的细胞),弃去培养基,用DPBS(无钙镁,购自corning,#21-031)清洗2遍,加入1ml无胰酶消化液(普利莱,#C1000)25℃消化10min,显微镜下观察,细胞变圆,加入1ml细胞培养基终止消化。用移液器将细胞从皿上吹打悬浮,收集到1.5ml离心管中,3000rpm离心3min,弃上清,加入DPBS清洗一遍。1ml DPBS重悬细胞,按照实验需求等分成6份,3000rpm离心3min,弃上清,收获细胞。
2、在上述步骤1收获第二组至第六组的细胞中,分别加入200微升的100nM的FAM修饰的初始文库(用作对照)以及第二轮次级文库(pool2),第五轮次级文库(pool5),第九轮次级文库(pool9),第11轮次级文库(pool11)。第一组细胞加入DPBS,作为空白对照。六组细胞于4℃旋转避光孵育60min,3000rpm离心3min,弃上清。DPBS清洗两遍,200μl DPBS重悬细胞,流式细胞仪检测。结果见图1。数据表明,相对于阴性对照随机核苷酸初始文库,添加pool2、pool5、pool9、pool11的荧光强度呈现递增的趋势,说明随着筛选的进行,得到的文库与靶标细胞结合的越来越多,筛选的效果很好,可以将pool11送测序。
3、对照细胞采用低表达HE4的卵巢癌细胞系HOSE(正常卵巢细胞)和HO8910细胞株,培养方法为:含有10%FBS和1%Mycillin(Gibco)的RPMI1640(美国Hyclone)培养基,37℃,5%的CO2培养箱中培养。HOSE购自中国微生物菌种保藏中心,HO8910细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。亲和力检测方法同靶标细胞。结果见图1。数据表明,相对于阴性对照随机核苷酸初始文库,添加pool2、pool5、pool9、pool11的荧光强度变化不大,与阴性细胞的结合量变化不大。
实施例3核酸适配体Apoc46与截短的mApoc46的流式细胞术检测
1、将贴壁培养的处于对数生长期的细胞(实施例1步骤2方法处理得到的细胞),弃去培养基,用DPBS(无钙镁,购自corning,#21-031)清洗2遍,加入1ml无胰酶消化液(普利莱,#C1000)25℃消化10min,显微镜下观察,细胞变圆,加入1ml细胞培养基终止消化。用移液器将细胞从皿上吹打悬浮,收集到1.5ml离心管中,3000rpm离心3min,弃上清,加入DPBS清洗一遍。1ml DPBS重悬细胞,按照实验需求等分成4份,3000rpm离心3min,弃上清,收获细胞。
2、在上述步骤1收获的第一组细胞用作空白对照。第二组至第4组的细胞中,分别加入100nM的FAM修饰的mApoc46,Apoc46以及挑选出的对照序列mApoc14(SEQ ID NO:7:TGCTGGATGTTGGGATAAGC TCCCATCCATGTCAGTTCTCCGCTTTTGACACATCCAGC)于4℃旋转避光孵育60min,3000rpm离心3min,弃上清。DPBS清洗两遍,200μl DPBS重悬细胞,流式细胞仪检测。结果见图2,荧光值平均值的数据见下表6。数据表明,相对于对照序列mApoc14,mApoc46和全长的Apoc46均与靶标细胞有明显的结合,且mApoc46与靶标细胞结合量比Apoc46要多。故后续的实验都采用了mApoc46。
表6卵巢浆液性腺癌细胞的核酸适配体与靶标细胞的亲和力
组 | 荧光值(平均值) |
mApoc46 | 456 |
Apoc46 | 323 |
mApoc14 | 156 |
空白对照 | 8.35 |
实施例4 mApoc46的流式细胞术表征亲和力(图3)
1.将生工生物工程(上海)股份有限公司合成的标记了FAM的核酸适配体mApoc46用DPBS分别稀释成浓度为0、25、50、100、200、400、800nM的溶液;
2.将一个培养面积25cm2的细胞培养瓶中处于对数生长期的靶标细胞(来源见实施例1步骤2)用PBS清洗4遍,然后用无酶消化液(普利莱,#C1000)于37℃消化10分钟,用细胞刮收集细胞,然后用枪头打散细胞,2000rpm离心3分钟后去上清,用2ml PBS离心洗涤2次;
3.经步骤2处理的靶标细胞中加入0.05g/L BSA和2ug/ml鲑鱼精DNA,体积为300微升,于4℃封闭细胞20分钟。封闭后离心后去上清,加入1mL DPBS重悬细胞,将细胞平均分成7组,离心后去除上清。
4.分别与步骤1中不同浓度的标记了FAM的核酸适配体mApoc46溶液在4℃孵育30分钟,孵育结束,每管用DPBS清洗2遍,每遍200ul,然后用流式细胞仪检测。检测结果如图3A所示。以流式细胞仪检测到的荧光强度几何平均值为纵坐标,以核酸适配体mApoc46的浓度为横坐标,由Y=Bmax*X/(Kd+X)方程模拟曲线,得到核酸适配体mApoc46结合常数绘制曲线,如图3B所示,图3B为核酸适配体mApoc46与靶标细胞的解离常数曲线,由此得到核酸适配体mApoc46与靶标细胞的解离常数Kd为152±48nM。
实施例5:共聚焦显微镜检测mApoc46可以与卵巢浆液性腺癌原代细胞活细胞结合(图4)
1.细胞培养:取对数生长期的来源于卵巢浆液性腺癌组织培养获得的高表达HE4的原代细胞,以5×104个/孔种植到共聚焦专用孔板中(NEST,#801001),在含5%CO2的细胞培养箱中于37℃培养。观察细胞生长情况,大约48小时,待到细胞密度适合共聚焦观测时,开始细胞免疫荧光实验。
2.细胞免疫荧光:将旧培养基吸弃,加入DPBS清洗,每次500uL。相应的孔中分别加入150nM的FAM标记的mApoc46和mApoc14,其中mApoc14是作为阴性对照的。在5%CO2,37℃培养箱中孵育20分钟后,吸弃上清,用DPBS清洗2次细胞,每次体积500uL。然后加入Hoechst33342(Beyotime,C1022)染色细胞核,室温孵育5分钟后,细胞拿去用共聚焦显微镜(OLYMPUS FV1000-IX81)观察,观察结果用软件Olympus FV10-ASW 4.2分析。结果如图4所示,可以看出我们的特异性结合高表达HE4的卵巢癌细胞的核酸适配体mApoc46可以使活细胞染色,且对照序列mApoc14不可使细胞染色。
实施例6激光共聚焦显微镜检测mApoc46可以与卵巢浆液性腺癌原代细胞固定细胞结合,及其与抗体的共定位情况
1、细胞培养:取对数生长期的来源于卵巢浆液性腺癌组织培养获得的高表达HE4的原代细胞,以5×104个/孔种植到共聚焦专用孔板中(NEST,货号#801001),在含5%CO2的细胞培养箱中于37℃培养。观察细胞生长情况,大约48小时,待到细胞密度适合共聚焦观测时,开始细胞免疫荧光实验。
2、细胞免疫荧光:将旧培养基吸弃,加入DPBS清洗,每次500uL。相应的孔中分别加入1ml预冷的4%多聚甲醛,4℃固定30min。吸弃4%多聚甲醛,加入1ml DPBS,放置于摇床上清洗3min,吸弃DPBS,如此重复清洗3次。加入1ml 0.2%的Triton-X 100 25℃透化10min,弃去透化液,用DPBS重复清洗3次。向核酸适配体及阴性对照测试孔加入300μl封闭液(5%BSA+1ug/ml鲑鱼精DNA)封闭过夜;向阳性对照孔(抗体孵育孔)加入300μl封闭液25℃封闭1h,弃去封闭液,加入200μl兔抗人HE4(Abcam,#ab24480,抗体稀释液1:100稀释使用),4℃,湿盒孵育过夜。吸弃一抗,加入1ml漂洗液(1%BSA和0.5%Tween 20,现配现用),置于摇床,25℃漂洗5min,吸弃漂洗液,重复漂洗3次。加入300μl Alexa 594标记的羊抗兔荧光二抗(Thermo,#R37117,抗体稀释液1:300稀释使用),25℃避光孵育60min。同步地,核酸适配体mApoc46及阴性对照孔mApoc14分别加入100nM的FAM修饰序列,4℃避光孵育30min。吸弃二抗及核酸,加入200μl 3nM的DAPI(Beyotime#c1006)染核5min。抗体孵育孔用漂洗液按上述漂洗操作清洗3次,mApoc14和mApoc46对应的孵育孔用DPBS按同样的漂洗操作清洗3次。甘油封片,共聚焦观测。结果见图5。
图5的数据表明,阴性对照mApoc14与卵巢浆液性腺癌细胞不结合,mApoc46与卵巢浆液性腺癌细胞结合,且和抗体有相同的细胞定位。这说明mApoc46可以用于卵巢浆液性腺癌细胞免疫荧光的检测。
实施例7激光共聚焦显微镜检测适配体mApoc46和卵巢浆液性腺癌的组织切片的结合能力(图6)
1.分别将来自卵巢浆液性腺癌病人(病人血清中HE4水平高于140pmol/L),交界性卵巢癌病人(病人血清中HE4水平低于140pmol/L)的卵巢癌组织和正常卵巢组织制备成冰冻切片;所有切片在4%多聚甲醛中固定15分钟。用DPBS洗涤两次后,用20%的FBS在4℃封闭20分钟后吸弃上清液。
3.同步地,FAM标记的核酸适配体mApoc46稀释到100nM,然后与切片于4℃避光孵育30min。
4.吸弃二抗及核酸,加入200μl 3nM的DAPI染核5min。抗体孵育片子用漂洗液清洗3次,mApoc46对应的片子用DPBS按同样的漂洗操作清洗3次。切片晾干后用共聚焦显微镜观察。
结果如图6所示,图6为核酸适配体mApoc46与不同来源的卵巢癌组织染色结果,可以看出mApoc46与抗体染色效果一样,可以染色高表达HE4的卵巢浆液性腺癌组织,而不染色交界性卵巢癌组织和正常卵巢组织。
实施例8适配体mApoc46可以与卵巢浆液性腺癌细胞结合的特异性实验细胞系MCF-7(乳腺癌细胞,ATCC HTB-22),MGC-803(胃癌细胞,购于上海细胞库),HepG-2(肝癌细胞,购于上海细胞库),HOSE(正常卵巢细胞,购于中国微生物菌种保藏中心),我们用这几种细胞验证mApoc46结合的特异性,实验步骤如下。
1.分别将贴壁培养的处于对数生长期的MCF-7细胞、MGC-803细胞、HepG-2细胞、HOSE细胞各一皿(直径6cm的皿)用DPBS(无钙镁,购自corning,#21-031)清洗2遍,然后用无酶消化液(普利莱,#C1000)消化,加入1ml细胞培养基终止消化。用移液器将细胞从皿上吹打悬浮,2000rpm离心3min后去上清,每种细胞平均分成2份,分别用1ml DPBS离心洗涤2次后,一份用作空白对照,另一份分别与100nM的标记了FAM的核酸适配体mApoc46在4℃孵育1小时;
2.将步骤1孵育后的细胞分别用DPBS缓冲液清洗2次,每次用量400μl,最后加入200μl的DPBS缓冲液重悬细胞,用于流式细胞仪检测。检测结果如图7所示,结果证明,核酸适配体mApoc46与其它不同组织来源的细胞系均无结合或者结合能力很弱。
上述所有细胞系均是在37℃,5%CO2的培养箱里培养;MCF-7细胞、MGC-803细胞、HepG-2细胞、HOSE细胞的培养基为含10%胎牛血清(Hyclone)的RPMI-1640。
实施例9 mApoc46对HGSOC肿瘤的PDX小鼠模型的体内亲和力评估
1.准备高压灭菌后的DPBS,用0.22um过滤器过滤后保存。从金斯瑞合成CY5修饰的核酸适配体:Cy5-mApoc46、Cy5-mApoc14;将干粉12000转/分钟离心10分钟,加DPBS溶解到100uM。
2.两只PDX小鼠(购自江苏集萃药康生物科技)提前一天脱毛并观察小鼠的身体状态。小鼠的肿瘤组织来自病人新鲜的瘤组织(2×2×2毫米),直接移植到六周龄雌性免疫缺陷小鼠体右腋窝而建立的模型。经过饲养三个月后的小鼠称为P1代小鼠,将其肿瘤组织取2×2×2毫米,然后移植到其它小鼠上,这是所谓的p2代小鼠。我们使用的是这个p2代小鼠。
3.以每只鼠2.4nmol总量,200ul的体积,稀释我们的核酸适配体序列和对照序列。溶解后并分装。
4.操作台内称每只小鼠体重;抓住小鼠,用小鼠固定器盖住,露出小鼠尾巴;寻找好小鼠尾静脉;左手食指和拇指拉住小鼠尾巴的3/1处,适当力量拉住,把静脉面朝上,用棉球来回擦拭几次,小鼠的尾静脉就会清晰出现。1ml注射器吸取核酸适配体Cy5-mApoc46和Cy5-mApoc14,针口斜面向上,在小鼠尾巴压折处水平进针注射,对准静脉管。注射的同时记录注射时间。
5.注射完之后,开始进行气体麻醉;将注射后的小鼠放置2.5%异氟烷麻醉小盒子中,待2-3min后小鼠昏迷后,将小鼠置入IVIS Spectrum仪器中。设置荧光通道值以及观察时间点,观察Cy5-mApoc46和Cy5-mApoc14在小鼠体内扩散以及代谢的过程。拍摄图片并分析。
结果显示,其中图8A显示了Cy5-mApoc46可以在4-5分钟内迅速进入动物体内循环,在身体的大部分部位,特别是肾脏和左下肢肿瘤部位,都能看到荧光信号。从8到12分钟,全身出现明显的荧光图像,肿瘤部位出现明显的信号,这意味着mAPOC46可以靶向肿瘤部位的癌细胞。此后,荧光信号在身体大部分区域逐渐消失,但信号仍留在肿瘤部位。60分钟时,mAPOC46几乎从全身大部分清除,但肿瘤仍然可见,即使在注射后120分钟,肿瘤部位仍观察到可见荧光信号,表明在肿瘤区mAPOC46清除较慢。图8B为对照小鼠荧光图像,显示了mAPOC14能在5分钟内进入小鼠全身,12分钟后不在肿瘤区聚集,再次验证了mAPOC46的特异性结合能力。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.核酸适配体,其特征在于所述核酸适配体包含或由以下组成:
(1)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列:GTGCTGGATGTCACCTCCACTCACCACCTCTTCTCCGCTCCTCGTCAT GACACATCCAG;或
(2)与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%的同源性且特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的核苷酸序列;或
(3)由(1)的核苷酸序列转录且特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的RNA序列。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体,其特征在于,所述核酸适配体特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞;优选地,所述卵巢浆液性腺癌为高表达HE4的细胞;更优选地,所述卵巢浆液性腺癌细胞是在细胞上清液中或患者血清中HE4浓度为>140pmol/L的细胞或者是用HE4抗体免疫荧光染色为阳性的细胞。
3.根据权利要求1所述的核酸适配体,其特征在于,所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰,且修饰后的核酸适配体特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞,所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种。
4.核酸适配体的缀合物,其特征在于:在根据权利要求1-3所述核酸适配体的核苷酸序列上连接其它用于标记、检测、诊断或治疗的物质,且连接所述物质后的所述核酸适配体的缀合物特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞,所述物质是荧光标记物例如FAM、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA和酶标记中的至少一种。
5.核酸适配体的衍生物,其特征在于,所述衍生物是将权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体或权利要求4所述的核酸适配体的缀合物的核苷酸序列的骨架改造成特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的硫代磷酸酯骨架而得,或者是由权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体或权利要求4所述的核酸适配体的缀合物改造成的特异性结合卵巢浆液性腺癌细胞的肽核酸。
6.权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体或权利要求4所述的核酸适配体的缀合物或权利要求5所述的核酸适配体的衍生物的筛选方法,其特征在于,基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术,以HOSE细胞和HO8910作为反筛细胞,以卵巢浆液性腺癌细胞的原代细胞为正筛细胞,筛选出与卵巢浆液性腺癌细胞特异性结合的核酸适配体。
7.权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体或权利要求4所述的核酸适配体的缀合物或权利要求5所述的核酸适配体的衍生物在由以下各项组成的组中的任意一项中的用途:
(1)制备特异性靶向卵巢浆液性腺癌细胞或者组织的靶向性药物;
(2)制备特异性诊断卵巢浆液性腺癌的诊断试剂;
(3)卵巢浆液性腺癌细胞、组织或活体定位成像;或
(4)捕获卵巢浆液性腺癌细胞。
8.特异性靶向卵巢浆液性腺癌细胞或者组织的靶向性药物,其特征在于,所述的靶向性药物包括:权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体或权利要求4所述的核酸适配体的缀合物或权利要求5所述的核酸适配体的衍生物,以及与之相连的卵巢浆液性腺癌治疗药物。
9.特异性诊断卵巢浆液性腺癌的诊断试剂,其特征在于,所述的诊断试剂包括:权利要求1-3中任一项所述的核酸适配体或权利要求4所述的核酸适配体的缀合物或权利要求5所述的核酸适配体的衍生物,以及与之相连的可检测标记物。
10.根据权利要求9所述的诊断试剂,其特征在于,所述的可检测标记物是荧光标记,例如Cy3、Cy5、FAM、荧光素、FITC、荧光纳米微球。
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