CN114045289B - 一种核酸适配体及其在特异性识别对羟基苄亚硫酸氢中的应用 - Google Patents

一种核酸适配体及其在特异性识别对羟基苄亚硫酸氢中的应用 Download PDF

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    • C12N2310/16—Aptamers
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Abstract

本发明公开了一种核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该核酸适配体是单链DNA，由76个核苷酸组成，其二级结构含有突出的环和茎，其中SEQ16吉布斯自由能DG=‑16.65；基于氧化石墨烯荧光法对核酸适配体的特异性、亲和力等的评估，结果显示核酸适配体SEQ16解离常数Kd=32.12±2.91，能与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合；该核酸适配体SEQ16具有高特异性、高亲和力的特点，能够应用在制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂中，或用于制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂盒中，为硫磺熏蒸天麻的检测提供了一种有效方法。

Description

一种核酸适配体及其在特异性识别对羟基苄亚硫酸氢中的 应用
技术领域
本发明公开了一种能够与硫磺熏蒸后天麻产生的标志物对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体及应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
寡核苷酸适配体是具有10-100个核苷酸长度的单链DNA或RNA分子，传统上使用指数富集配体系统进化技术（SELEX）进行筛选。核酸适配体具有广泛的靶标，包括氨基酸、金属离子、真菌毒素、抗生素等小分子物质，同时肽、核酸、蛋白质等大分子物质和细菌、细胞、病毒等完整个体也可作为核酸适配体靶标。核酸适配体通过氢键、疏水相互作用、范德华力和其他具有高特异性和亲和力的非共价相互作用与靶标结合。适配体自发现之初，至今已经历近30多年的发展，适配体凭借其对靶标高亲和力和强特异性等优势，已被应用于疾病诊断及治疗、分析化学及检测等众多方向和领域。
天麻为兰科植物天麻（GastrodiaelataBl.）的干燥块茎，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络之功效，用于小儿惊风，癫痫抽搐，头痛眩晕，手足不遂，肢体麻木，风湿痹痛等，为我国传统名贵中药。天麻中含有大量水分和多糖，不易干燥，容易霉变且出现虫蛀现象，不易于保存及运输。因此，在产地加工时常用低成本的硫磺熏蒸来使天麻快速干燥，以达到易于保存运输、杀菌防腐的作用，同时也改善了天麻外观。但硫磺熏蒸会造成天麻中残留大量SO2，且会导致天麻有效成分降低，从而影响天麻饮片的安全性和临床疗效，因此有必要对天麻硫磺熏蒸的情况进行监测。对羟基苄亚硫酸氢是天麻经过硫磺熏蒸后形成的一种稳定产物，可以作为识别硫熏天麻的标志物。
目前，对羟基苄亚硫酸氢的检测是通过高效液相串联质谱法完成的。但是这种检测方法需要特定的仪器设备和一定的操作技能，无法广泛应用。因此发展一种操作简单、成本低廉且稳定性和灵敏性均较高的对羟基苄亚硫酸氢检测方法十分必要。
发明内容
本发明提供了一种核酸适配体SEQ16，其能够与对羟基苄亚硫酸氢（p-Hydroxybenzyl hydrogen sulfite，p-HS）特异性结合，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该核酸适配体为单链DNA，由76个核苷酸组成，其预测的二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能DG=-16.65。
本发明另一目的是将上述能够与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体SEQ16应用于制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂中，或用于制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂盒中。
本发明目的通过以下技术方案实现：
1、对羟基苄亚硫酸氢核酸适配体的筛选、测序
采用指数富集的配体系统进化技术（SELEX），通过链霉亲和素（SA）磁珠固定文库的方法经过多轮筛选获得能够与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体文库，经高通量测序得到核酸适配体序列，通过软件DNAMNA对序列进行同源性分析，获得进化树分析图，挑选不同家族的序列作为候选序列；
2、利用氧化石墨烯（GO）荧光法对核酸适配体SEQ16进行表征
在候选序列的5’端连接6-羧基荧光素（FAM）合成5’端带FAM标记的核酸适配体，基于氧化石墨烯荧光法（GO）对候选核酸适配体的亲和力进行检测，结果显示核酸适配体SEQ16的解离常数Kd=32.12±2.91，因此将核酸适配体SEQ16作为对羟基苄亚硫酸氢核酸适配体；利用氧化石墨烯（GO）荧光法检测核酸适配体SEQ16的特异性，结果显示含有对羟基苄亚硫酸氢溶液的荧光值明显高于含有其他结构类似物的溶液荧光值，表明本发明核酸适配体SEQ16具有很高的特异性和亲和力；
3、核酸适配体SEQ16单链DNA二级结构表征
使用MFOLD软件（http://mfold.rna.albany.edu/q）对能够与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体SEQ16的单链DNA分子进行二级结构预测；其二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能DG=-16.65，二级结构如下，该结构具有较高的稳定性；
本发明具有的有益效果是：
1、本发明核酸适配体与对羟基苄亚硫酸氢具有高亲和力、高特异性，对硫磺熏蒸天麻中的天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛等对羟基苄亚硫酸氢的结构类似物无亲和性；
2、本发明将核酸适配体作为对羟基苄亚硫酸氢的识别分子，应用在制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂中，或用于制备检测硫熏天麻的试剂盒中，为硫磺熏蒸天麻的检测提供了一种有效的检测方法，且本发明方法简单易操作，适用于工业化应用。
附图说明
图1为SELEX筛选过程中核酸适配体文库保留率结果示意图；
图2为20条序列同源性分析结果示意图；
图3为20条序列进化树分析结果示意图；
图4为核酸适配体SEQ16亲和力表征的非线性拟和结合曲线；
图5为核酸适配体SEQ16的特异性检测结果示意图。
具体实施方式
下面通过实例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购买试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：对羟基苄亚硫酸氢核酸适配体的筛选和二级结构分析
1、采用磁珠-SELEX法筛选，将靶标对羟基苄亚硫酸氢固定在磁珠（DynabeadsMyOne Streptavidin C1磁珠）上，然后将靶标-磁珠复合物与寡核苷酸文库孵育，能与靶标结合的寡核苷酸会与靶标-磁珠复合物结合，生成寡核苷酸-靶标-磁珠复合物，最后通过磁力架的磁吸作用即可将寡核苷酸-靶标-磁珠复合物和未与靶标结合的寡核苷酸分开，经过多轮筛选获得对对羟基苄亚硫酸氢具有亲和力、特异性的ssDNA富集文库；
每轮均采用SA磁珠固定文库筛选的方法，在文库富集以后，先用Q-PCR验证次级文库的亲和力，在初筛鉴定有亲和力的情况下，将筛选得到的第8轮文库进行高通量测序样品建库处理，经高通量测序得到与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体序列；
其中单链适配体文库、引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，76个碱基的随机ssDNA文库如下：
5’-GTTCGTGGTGTGCTGGATGT-(N36)-TGACACATCCAGCAGCACGA-3’，其中N36代表36个随机核苷酸；
引物如下：
DPBS缓冲液：（pH 7.2~7.4） ：137mmol/L NaCl、 2.7mmol/LKCl、1.5mmol/LKH2PO4、8mmol/LNa2HPO4、1mmol/L CaCl2、0.5mmol/LMgCl2；
核酸适配体的筛选由上海生工生物工程股份有限公司完成，核酸适配体文库筛选共筛选8轮，从第三轮开始每轮都进行反筛，并用荧光定量PCR监测各项数据，各轮筛选条件如下:
图1显示，第4-8轮筛选文库的正筛保留率高于反筛保留率，SELEX筛选8轮后，得到对对羟基苄亚硫酸氢具有高亲和力、高特异性的ssDNA富集文库，经过Q-PCR验证次级文库的亲和力，扩增引物为: Lib 26 S1 GTTCGTGGTGTGCTGGATGT，Lib 26 A2TCGTGCTGCTGGATGTGTCA，结果表明文库富集良好；由上海生工生物工程股份有限公司对文库8进行高通量测序；使用DNAMNA软件对高通量测序获得的文库8富集频次在前20的序列进行对比分析，高通量测序获得的20条核酸适配体的随机序列（N36）如下：
通过DNAMNA软件对序列1-20之间的同源性进行分析，图2结果显示获得的适配体富含GC序列；另外，通过序列的进化树分析（图3），根据它们的同源性和最低自由能（dG）将这些序列分成5个不同家族：L1（SEQ1、SEQ7、SEQ14、SEQ19、SEQ20），L2（SEQ2、SEQ9、SEQ5），L3（SEQ3、SEQ13、SEQ15、SEQ6、SEQ11），L4（SEQ8、SEQ16），L5（SEQ4、SEQ10、SEQ17、SEQ18）；每个家族选择一条序列作为候选适配体，分别是SEQ1、SEQ9、SEQ13、SEQ16和SEQ17。
2、取适量浓度为100μmol/L5’端荧光基团FAM修饰的核酸适配体SEQ1、SEQ9、SEQ13、SEQ16和SEQ17（上海生工生物工程股份有限公司合成）分别加入到200μL结合缓冲液（pH=7.2的Tris-HCl缓冲液）中配制成不同浓度的核酸适配体溶液（10nmol/L、20nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L），不同浓度的核酸适配体溶液在95℃沸水浴中预变性10min后，立即冰浴10min防止适配体复性，最后常温下放置10min，然后加入100μg/mL氧化石墨烯溶液200μL在室温条件下孵育2h，再将2μL对羟基苄亚硫酸氢（10μg/mL）加入到孵育后的混合液中，轻微震荡，室温反应2h后，以13000 rpm/min离心10min，最后取200μL上清液用多功能酶标仪测定其荧光强度（发射波长520nm，激发波长485nm），以无菌水代替靶标对羟基苄亚硫酸氢作为阴性对照；通过Origin 2018软件对不同浓度适配体的相对荧光强度（△F）进行非线性拟和，获得非线性拟和结合曲线，并计算解离常数（Kd值），其中相对荧光强度（△F）=试验组的荧光强度-阴性对照组的荧光强度。
结果显示：核酸适配体SEQ1、SEQ17两条适配体与阴性对照结果无明显差异，核酸适配体SEQ16的Kd=32.12±2.91；SEQ9的Kd=31.85±1.33，SEQ13的Kd=26.75±6.48，核酸适配体SEQ16的非线性拟和结合曲线见图4；本发明对核酸适配体SEQ16进一步分析，通过MFOLD软件在温度为26℃、Na+浓度为150mmol/L、Mg2+浓度为1mmol/L（http://mfold .rna.albany .edu/q=mfold/DNA-Folding-Form）的条件下对核酸适配体SEQ16进行二级结构预测；结果表明该核酸适配体SEQ16是单链DNA，由76个核苷酸组成，其二级结构含有突出的环和茎，其中SEQ16吉布斯自由能DG=-16.65，吉布斯自由能低、结构稳定。
实施例2：利用氧化石墨烯（GO）荧光法检测对羟基苄亚硫酸氢核酸适配体SEQ16的特异性
本实验选取与对羟基苄亚硫酸氢结构相似的化合物对羟基苯甲醇、对羟基苯磺酸、天麻素、对羟基苯甲醛、巴利森苷A验证核酸适配体SEQ16对对羟基苄亚硫酸氢的特异性。
将适量100μmol/L FAM修饰的核酸适配体SEQ16（上海生工生物工程股份有限公司合成）加入到200μL结合缓冲液（pH=7.2的Tris-HCl缓冲液）中配置成终浓度为200nmol/L的核酸适配体溶液，在95℃沸水浴中预变性10min后立即冰浴10min，常温下放置10min；然后加入100μg/mL氧化石墨烯水溶液200μL在室温条件下孵育2h；将浓度10μg /mL的对羟基苄亚硫酸氢、对羟基苯甲醇、对羟基苯磺酸、天麻素、对羟基苯甲醛、巴利森苷A分别取2μL加入到孵育后的混合液中，轻微震荡，室温反应2h后，以13000 rpm/min离心10min；最后取200μL上清液用多功能酶标仪测其荧光强度（发射波长520nm，激发波长485nm），计算其相对荧光强度；结果见图5；从图中可以看出添加有对羟基苄亚硫酸氢（p-HS）的混合溶液的荧光值明显提高，结果表明核酸适配体SEQ16可以特异性结合对羟基苄亚硫酸氢。
本发明通过SELEX技术筛选出了能结合天麻硫熏标志物对羟基苄亚硫酸氢的核酸适配体SEQ16，通过氧化石墨烯（GO）荧光法证明了该核酸适配体SEQ16特异性结合对羟基苄亚硫酸氢。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种核酸适配体及其在特异性识别对羟基苄亚硫酸氢中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
gttcgtggtg tgctggatgt gccaacagcc agcatgacca cacattgacg gatgattgac 60
acatccagca gcacga 76
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
gttcgtggtg tgctggatgt 20
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaatcgtg ctgctggatg tgtca 45
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
gttcgtggtg tgctggatgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
tcgtgctgct ggatgtgtca 20

Claims (2)

1.一种与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的与对羟基苄亚硫酸氢特异性结合的核酸适配体在制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂或制备检测硫磺熏蒸天麻的试剂盒中的应用。
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