CN101849024B - 核酸扩增用样品的制备方法及制备试剂盒 - Google Patents

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    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Abstract

本发明的目的在于去除生物试样及核酸提取液中所含的阻碍核酸的扩增的物质，从而能通过使用酶的核酸扩增方法简便且准确地评价生物试样中所含的目标核酸的有无及目标基因的表达量。本发明提供一种制备方法，该制备方法是用于生物试样中所含的核酸的扩增的核酸扩增用样品的制备方法，该制备方法包括：提取步骤，该提取步骤中，在生物试样中加入核酸提取试剂而得到核酸提取液；纯化步骤，该纯化步骤中，通过使核酸提取液与沸石接触，从而得到能实现更高灵敏度的核酸检测的适合于核酸扩增的核酸扩增用样品。

Description

核酸扩增用样品的制备方法及制备试剂盒
技术领域
本发明涉及核酸扩增用样品的制备方法及制备试剂盒。
背景技术
如今，以PCR法及LAMP法为代表的核酸扩增技术已渗透至以分子生物学及医学为代表的生物学的各个领域，在例如DNA鉴定、食品检查、环境卫生检查、动植物检查等中也已被广泛使用。
被检试样为液体的情况下，虽然有时将被检试样直接作为核酸扩增用样品用于目标核酸的扩增，但在生物试样的情况下，由于作为目标的核酸存在于细胞内，因此需要将生物试样用细胞溶解液(例如碱性溶液、表面活性剂)溶解，使核酸溶出至细胞外，从而制备核酸扩增用样品。
例如，在生物试样中加入含十二烷基硫酸钠的溶液并加热而使蛋白质变性，或者加入氢氧化钠水溶液，从而破坏细胞膜以使核酸溶出，将其用作核酸扩增用样品。
另一方面，在生物试样中，痰液或唾液是用于结核病等肺部疾病的诊断的非常重要的标本。
然而，大多数情况下难以使痰液或唾液中所含的核酸稳定地扩增，要检出痰液或唾液中的分枝杆菌属菌，通常用氢氧化钠等将所采集的痰液或唾液液化，离心分离，将分枝杆菌属菌作为沉淀回收并培养，从而进行诊断(专利文献1)。
此外，现状是即使在由痰液或唾液以外的生物试样来制备核酸扩增用样品的情况下，由于与核酸一起从细胞内溶出的蛋白质、多糖类、脂质等物质会部分或完全地阻碍核酸的扩增反应，因此有时会得出没有再现性的结果或者无法准确地评价目标核酸的有无或表达量。
另外，如果由生物试样制备核酸扩增用样品时使用的表面活性剂的含量在核酸扩增用样品中达到一定浓度以上，则该表面活性剂有时会部分或完全地阻碍核酸的扩增反应，因此在核酸扩增反应时，需要将核酸扩增用样品稀释后使用。
上述情况给通过扩增目标核酸来进行的患者的诊断及食品、环境卫生、动植物等的准确的检查带来很大的困难。
专利文献1：日本专利特开平9-173065号公报
发明的揭示
于是，本发明的目的在于去除生物试样及核酸提取液中所含的阻碍核酸的扩增的物质，从而能通过使用酶的核酸扩增方法简便且准确地评价生物试样中所含的目标核酸的有无及目标基因的表达量。
为达到上述目的，本发明提供一种制备方法，该制备方法是用于生物试样中所含的核酸的扩增的核酸扩增用样品的制备方法，其特征在于，包括：提取步骤，该提取步骤中，在生物试样中加入核酸提取试剂而得到核酸提取液；纯化步骤，该纯化步骤中，通过使核酸提取液与沸石接触，从而得到能实现更高灵敏度的核酸检测的适合于核酸扩增的核酸扩增用样品。
这里的“沸石”是结晶中具有微细孔的铝硅酸盐的总称，以SiO4和AlO4的正四面体通过共有的氧结合而成的三维网状结构为基本骨架。沸石的结晶中包含例如碱金属离子、碱土金属离子、铵离子、氢离子等阳离子，“质子型沸石”是指结晶中包含氢离子的沸石。此外，“晶体结构为丝光沸石型”的沸石是指具有呈现六棱柱状的骨架结构的晶体结构的沸石。另外，所述沸石优选S/A比(硅和铝的存在比)在20以上的沸石，更优选S/A比在39以上的沸石。
本发明人发现，生物试样及核酸提取液中所含的阻碍核酸的扩增的物质有效地吸附于沸石，而作为核酸的扩增反应的模板的目标核酸本身不吸附于沸石。这里的“吸附”是指在沸石的表面或细孔中结合或包合有物质的状态。
利用上述制备方法，可将生物试样及核酸提取液中所含的阻碍核酸的扩增的物质从核酸扩增用样品中除去，因此即使是难以进行核酸的扩增的生物试样，也能从中制备能以良好的再现性检出目标核酸的核酸扩增用样品。
上述核酸提取试剂较好是包含表面活性剂和/或碱，表面活性剂更好是阴离子性表面活性剂。
上述阴离子性表面活性剂优选是选自烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐和烷基苯磺酸盐的至少1种化合物，更优选十二烷基硫酸钠。
阴离子性表面活性剂中，烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐和烷基苯磺酸盐能提高由生物试样提取核酸的效率，能通过沸石从核酸扩增用样品中高效地除去。
上述提取步骤较好是如下所述的步骤：在添加无机盐的条件下在上述生物试样中加入核酸提取试剂而得到核酸提取液。
上述纯化步骤较好是如下所述的步骤：在上述核酸提取液中加入沸石并混合，通过离心分离或过滤将沸石分离，从而得到核酸扩增用样品。
此外，上述纯化步骤较好是如下所述的步骤：通过使上述核酸提取液通过填充有沸石的除去柱，从而将吸附于沸石的物质、即阻碍更高灵敏度的核酸检测的物质除去，得到核酸扩增用样品。作为阻碍更高灵敏度的核酸检测的物质，包括来源于标本的盐、蛋白质等阻碍成分及来源于提取试剂的碱、表面活性剂、水等。
如果使用填充有沸石的除去柱，则不需要通过离心分离从核酸扩增用样品中去除沸石的工序，可在缩短核酸扩增用样品的制备工序的同时防止核酸扩增用样品的损失。
此外，利用上述核酸扩增用样品的制备方法，即使生物试样是血液、脊液、尿、粪便、痰液、唾液、鼻涕或拭液，也能在无需去除粘性或稀释阻碍核酸的扩增的物质的情况下制备良好地进行核酸的扩增的核酸扩增用样品。
上述沸石优选质子型沸石，晶体结构优选丝光沸石型。
如果是质子型沸石，则能从核酸扩增用样品中良好地除去阴离子性表面活性剂，如果晶体结构是丝光沸石型，则能同时进行核酸扩增用样品的脱盐和中和。
此外，本发明提供上述制备方法中使用的核酸扩增用样品的制备试剂盒，该制备试剂盒包括核酸提取试剂和沸石。
利用上述制备试剂盒，可将生物试样及核酸提取液中所含的阻碍核酸的扩增的物质除去，因此即使是难以进行核酸的扩增的生物试样，也能简便地从中制备能以良好的再现性检出目标核酸的核酸扩增用样品。
上述制备试剂盒所包括的核酸提取试剂较好是包含表面活性剂和/或碱，更好是表面活性剂为阴离子性表面活性剂。沸石优选质子型沸石，晶体结构优选丝光沸石型。
如果沸石是质子型且其晶体结构是丝光沸石型，则能高效地从核酸扩增用样品中除去阴离子性表面活性剂，还能同时进行脱盐和中和。
另外，上述本发明的制备试剂盒能制备可实现高灵敏度的核酸检测的核酸扩增用样品，因此适合用作核酸扩增检测用试剂盒的构成试剂，如果核酸扩增检测用试剂盒所包括的试剂的一部分或全部是干燥试剂，则可实现更高的检测灵敏度，还能大幅提高基因检查的操作性。
利用本发明，可将生物试样及核酸提取液中所含的阻碍核酸的扩增的物质从核酸扩增用样品中除去，因此即使是难以进行核酸的扩增的生物试样，也能从中制备能以良好的再现性检出目标核酸的核酸扩增用样品。此外，利用本发明，即使生物试样是血液、脊液、尿、粪便、痰液、唾液、鼻涕或拭液，也能在无需去除粘性或稀释阻碍核酸的扩增的物质的情况下制备良好地进行核酸的扩增的核酸扩增用样品。另外，利用本发明，能从核酸扩增用样品中良好地除去阴离子性表面活性剂，能同时进行核酸扩增用样品的脱盐和中和。
附图的简单说明
图1是表示填充有沸石的除去柱的立体图。
图2是表示对有无目标核酸吸附于沸石(HSZ-690HOA；东曹株式会社(東ソ一社))进行考察的结果的图。
图3是表示对由沸石产生的氢氧化钠的中和作用进行考察的结果的图。
图4是表示对由沸石产生的SDS的除去作用进行考察的结果的图。
图5是表示对由沸石产生的脱盐作用进行考察的结果的图。
图6是表示对生物试样的制备及核酸提取液的组成对目标核酸的扩增造成的影响进行考察的结果的图。
图7是使用进行沸石处理而由血液制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)以及未进行沸石处理而由血液制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)，通过LAMP法进行目标核酸的扩增的结果。
图8是对进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品在LAMP反应液(25μL)中的加入量对核酸的扩增反应造成的影响进行试验的结果(1)。
图9是对进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品在LAMP反应液(25μL)中的加入量对核酸的扩增反应造成的影响进行试验的结果(2)。
图10是使用进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)以及未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)，通过PCR法进行目标核酸的扩增的结果。
图11是使用进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)以及未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)，通过RT-LAMP法进行目标核酸的扩增的结果。
符号的说明
1…离心管，3…沸石，5…盒，7…膜，10…除去柱。
实施发明的最佳方式
以下对本发明的优选实施方式进行说明。
本发明的制备方法是用于生物试样中所含的核酸的扩增的核酸扩增用样品的制备方法，其特征在于，包括：提取步骤，该提取步骤中，在生物试样中加入核酸提取试剂而得到核酸提取液；纯化步骤，该纯化步骤中，通过使核酸提取液与沸石接触，从而得到能实现更高灵敏度的核酸检测的适合于核酸扩增的核酸扩增用样品。
这里的“沸石”是结晶中具有微细孔的铝硅酸盐的总称，以SiO4和AlO4的正四面体通过共有的氧结合而成的三维网状结构为基本骨架。沸石的结晶中包含例如碱金属离子、碱土金属离子、铵离子、氢离子等阳离子，“质子型沸石”是指结晶中包含氢离子的沸石。此外，“晶体结构为丝光沸石型”的沸石是指具有呈现六棱柱状的骨架结构的晶体结构的沸石。另外，所述沸石优选S/A比(硅和铝的存在比)在20以上的沸石，更优选S/A比在39以上的沸石。
本说明书中的“生物试样”是指生物的细胞、组织或器官的一部分或全部，是供制备核酸扩增用样品的标本，除了直接从生物体采集的试样外，也包括从水中、土壤中、空气中等环境中得到的试样。此外，“核酸扩增用样品”是指为了在目标核酸的扩增反应中使用而制备的样品，是包含目标核酸的溶液。
作为生物试样，可例举例如血液、脊液、尿、粪便、痰液、唾液、鼻涕或拭液。
上述提取步骤中，较好是在生物试样中加入含阴离子性表面活性剂和/或碱的核酸提取试剂来提取核酸，作为阴离子性表面活性剂，优选是选自烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐和烷基苯磺酸盐的至少1种化合物。
作为烷基硫酸盐，可例举例如十二烷基硫酸钠、癸基硫酸钠、月桂基硫酸钠，作为烷基醚硫酸盐，可例举例如月桂基醚硫酸钠、聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠、聚氧乙烯肉豆蔻基醚硫酸钠，作为烷基苯磺酸盐，可例举例如十二烷基苯磺酸钠、乙基苯磺酸钠、丁基苯磺酸钠，优选十二烷基硫酸钠。
作为碱，可例举例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氨水，特优选氢氧化钠。
上述提取步骤的程序按照本领域技术人员能容易地实施的煮沸法或碱溶解法进行即可。
具体而言，在煮沸法中，将生物试样投入微型管，生物试样为液体(血液、脊液、尿、粪便混悬液、痰液、唾液、鼻涕或拭液等)的情况下，直接加入含阴离子性表面活性剂的核酸提取试剂煮沸15分钟或者于95℃的加热块(heatingblock)中静置10～15分钟(以下称作加热处理)即可。生物试样为固体(组织或脏器等)的情况下，例如在投入有生物试样的微型管中加入等量的无菌水，快速重复进行多次冻融，用移液管或调药刀物理粉碎后，加入含阴离子性表面活性剂的核酸提取试剂，直接进行加热处理即可。此外，也可在将生物试样悬浮于无菌水、缓冲液等而得的混悬液中加入核酸提取试剂，供于后续处理。
另外，生物试样容易提取的情况下，可以不添加含阴离子性表面活性剂的核酸提取试剂，而是加入无菌水进行加热处理。
另一方面，在碱溶解法中，将生物试样投入微型管，生物试样为液体的情况下，直接加入含碱的核酸提取试剂，使用旋涡搅拌器进行搅拌直至细胞溶解，然后进行加热处理即可。
生物试样为固体的情况下，与上述同样，在投入有生物试样的微型管中加入等量的无菌水，快速重复进行多次冻融，用移液管或调药刀物理粉碎后，加入含碱的核酸提取试剂，使用旋涡搅拌器进行搅拌直至组织或脏器溶解，然后进行加热处理即可。
此时，为提高提取效率，也可在含碱的核酸提取试剂中加入阴离子性表面活性剂来进行由生物试样提取核酸的操作。
上述提取步骤中，较好是在添加无机盐的条件下在生物试样中加入核酸提取试剂而得到核酸提取液。添加无机盐的条件是指如下所述的条件：通过用含无机盐的缓冲液等溶液来稀释生物试样或使用含无机盐的核酸提取试剂，或者将上述两种操作组合，从而在用于提取核酸的生物试样-核酸提取试剂混合液中添加无机盐的条件。作为由生物试样提取核酸的程序，可在添加有无机盐的条件下实施上述方法。
作为无机盐，可例举例如钠盐、钾盐，特优选氯化钠、氯化钾等。此外，无机盐的添加量以生物试样-核酸提取试剂的混合液中的终浓度表示较好是5～100mM，更好是15～30mM。
在上述纯化步骤中，使上述核酸提取液与沸石接触，从核酸提取液中将吸附于沸石的物质除去，沸石优选质子型沸石，更优选晶体结构为丝光沸石型。这里的“吸附”是指在沸石的表面或细孔中结合或包合有物质的状态。
这里的“沸石”是结晶中具有微细孔的铝硅酸盐的总称，以SiO4和AlO4的正四面体通过共有的氧结合而成的三维网状结构为基本骨架。沸石的结晶中包含例如碱金属离子、碱土金属离子、铵离子、氢离子等阳离子，“质子型沸石”是指结晶中包含氢离子的沸石。此外，“晶体结构为丝光沸石型”的沸石是指具有呈现六棱柱状的骨架结构的晶体结构的沸石。另外，所述沸石优选S/A比(硅和铝的存在比)在20以上的沸石，更优选S/A比在39以上的沸石。
在上述纯化步骤中，作为第一种实施方式，可例举如下所述的步骤：在上述核酸提取液中加入沸石并混合，通过离心分离或过滤将沸石分离，从而得到核酸扩增用样品。通过该操作，可将吸附于沸石的物质从核酸提取液中除去，可将所得的溶液用作核酸扩增用样品。
此外，在上述纯化步骤中，作为第二种实施方式，可例举如下所述的步骤：通过使上述核酸提取液通过填充有沸石的除去柱，从而将吸附于沸石的物质除去，得到核酸扩增用样品。通过该操作，可将阻碍更高灵敏度的核酸检测的物质从核酸提取液中除去，可将从除去柱洗脱的溶液用作核酸扩增用样品。
作为阻碍更高灵敏度的核酸检测的物质，包括来源于标本的盐等阻碍成分及来源于提取试剂的碱、表面活性剂、水等。
图1是表示填充有沸石的除去柱的立体图。
除去柱10是在离心管1中安装填充有沸石3的盒5而成的柱。盒5固定于离心管的开口部和底部之间的中央附近，以与离心管1密合的方式固定，形成从离心管1的开口部供给的上述核酸提取液必然与填充于盒5的沸石接触的结构。
盒5的底部有膜7，设计成即使在用离心分离机对除去柱10进行离心的情况下，沸石3也停留在盒5中，不会下落至离心管1的底部。作为膜7，可例举例如滤纸、玻璃纤维、纸浆制无纺布、人造纤维、合成纤维、氟树脂等。沸石3的填充量在生物试样在100μL以下的情况下可以为约300mg，可根据生物试样的种类和量进行适当调整。
要使用除去柱10从上述核酸提取液中除去吸附于沸石3的物质，可例举将上述核酸提取液供给至除去柱10而待其自然下落的方法以及用离心分离机对除去柱进行离心分离的方法，不论是哪一种方法，均可在除去柱10的底部获得除去了吸附于沸石3的物质的核酸扩增用样品。
本发明的核酸扩增用样品的制备方法所需的各种试剂类可以预先包装好，以核酸扩增用样品的制备试剂盒或核酸扩增检测用试剂盒的形式使用。即，可提供核酸扩增用样品的制备试剂盒或核酸扩增检测用试剂盒，其特征在于，包括含阴离子性表面活性剂和/或碱的核酸提取试剂以及沸石。
阴离子性表面活性剂、碱及沸石的具体例子如上所述。
此外，上述沸石优选质子型，晶体结构优选丝光沸石，也可采用组合上述除去柱10来代替沸石的试剂盒。
另外，如果将各试剂盒所包含的试剂的一部分或全部根据其必需量冷冻干燥，以干燥试剂的形式提供，则可实现更高的检测灵敏度，还能大幅提高基因检查的操作性。
实施例
下面例举实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不局限于这些例子。
(实施例1)：关于有无目标核酸吸附于沸石
为了利用沸石来除去由生物试样制备的核酸提取液中所含的阻碍核酸的扩增反应的物质(核酸扩增阻碍物质)，前提是作为模板的目标核酸不吸附于沸石。于是，采用3种沸石对作为模板的目标核酸是否吸附于沸石进行了试验。
首先，在微型管中加入80μL的无菌水和100μL的2×核酸提取试剂(0.4MNaOH，1％SDS)，于95℃加热15分钟，室温下放置5分钟以进行冷却，在其中加入20μL的目标核酸溶液。目标核酸溶液采用从培养的结核菌(结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)H37Rv株)中提取的基因组DNA溶液(100个拷贝/μL)。
然后，在加有目标核酸溶液的微型管中添加300mg的水悬浮沸石，颠倒混合，室温下静置5分钟后离心沉淀(spindown)，将所得上清作为核酸扩增用样品(沸石处理样品)，用10μL该样品通过LAMP法进行目标核酸的扩增。所使用的沸石有HSZ-690HOA(质子型、丝光沸石型；东曹株式会社)、HSZ-940HOA(质子型、β型；东曹株式会社)和HSZ-980HOA(质子型、β型；东曹株式会社)3种，对各沸石分别进行试验。
此时，对于添加等量的无菌水来代替目标核酸溶液而制得的核酸扩增用样品(阴性对照)以及在1μL的目标核酸溶液中仅添加了9μL的无菌水的核酸扩增用样品(含有100个拷贝的基因组DNA；阳性对照)，也同样地通过LAMP法进行了目标核酸的扩增。
利用LAMP法的目标核酸的扩增中，使用以下引物组，在由以下组成构成的LAMP反应液中于67℃静置60分钟来进行，用实时浊度测定装置(LA-200；特拉美克斯株式会社(Teramecs社))测定随着目标核酸的扩增而增加的浊度(turbidity)。
<以结核分枝杆菌的GyraseB基因为目标核酸的LAMP法用的引物组>
GyraseBFIP引物：5’-gcggttgatgtgtttcacgcacaaagttaagagccg-3’(序列编号1)
GyraseBBIP引物：5’-gcgattcatagcagcatcgttccattgcatcgcgatctccac-3’(序列编号2)
GyraseBF3引物：5’-cgcagccgaatccact-3’(序列编号3)
GyraseBB3引物：5’-cgactccgaatacccgg-3’(序列编号4)
GyraseBLF引物：5’-gaagtccaccaggcc-3’(序列编号5)
GyraseBLB引物：5’-tttccggcaagggcacc-3’(序列编号6)
<LAMP反应液的组成(25μL)>
规定量的核酸扩增用样品
20mMTris-HCl(pH8.8)
10mMKCl
10mM(NH4)2SO4
8mMMgSO4
0.1％吐温20
5.6mMdNTPs
1.6μMFIP引物
1.6μMBIP引物
0.4μMF3引物
0.4μMB3引物
0.8μMLF引物
0.8μMLB引物
16UBst聚合酶
1μLFD(钙黄绿素)
1.6％葡聚糖T40
图2是表示对有无目标核酸吸附于沸石(HSZ-690HOA；东曹株式会社)进行考察的结果的图。纵轴表示LAMP反应液的浊度(turbidity)，横轴表示反应时间。
其结果是，添加沸石(HSZ-690HOA；东曹株式会社)而制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)中的目标核酸的扩增的起始时间与阳性对照相同，目标核酸的扩增的起始时间并未因沸石处理而受到影响。另外，该结果不论在使用HSZ-690HOA(质子型、丝光沸石型；东曹株式会社)、HSZ-940HOA(质子型、β型；东曹株式会社)和HSZ-980HOA(质子型、β型；东曹株式会社)中的哪一种沸石的情况下都基本相同，目标核酸的扩增的起始时间并未因所使用的沸石的种类而受到影响。
另一方面，使用添加等量的无菌水来代替目标核酸溶液而制得的核酸扩增用样品(阴性对照)的情况下，在60分钟的反应时间内未确认到目标核酸的扩增。
由以上结果可知，核酸扩增用样品中的核酸几乎不吸附于沸石。
(实施例2)：由沸石产生的核酸提取试剂的碱中和作用及阴离子性表面活性剂的除去作用
接着，对通过沸石处理能否除去来源于核酸提取试剂的核酸扩增阻碍物质进行了考察。
首先，为了考察通过沸石处理能否中和核酸提取试剂中所含的碱，在含有0.2～0.4M的氢氧化钠的以下6种溶液(样品编号1～6)中添加300mg的水悬浮沸石(HSZ-690HOA；东曹株式会社)，颠倒混合，离心沉淀，测定所得上清的pH(沸石处理后的pH)，与进行沸石处理前的pH(沸石处理前的pH)进行比较。
<含有0.2～0.4M的氢氧化钠的以下6种溶液的组成>
样品编号1：0.4MNaOH
样品编号2：0.4MNaOH，0.5％SDS
样品编号3：0.4MNaOH，0.5％SDS，75mMNaCl
样品编号4：0.2MNaOH
样品编号5：0.2MNaOH，0.5％SDS
样品编号6：0.2MNaOH，0.5％SDS，75mMNaCl
图3是表示对由沸石产生的氢氧化钠的中和作用进行考察的结果的图。纵轴表示pH，横轴表示样品编号，白色圆表示沸石处理前的pH，黑色圆表示沸石处理后的pH。
其结果是，可知通过沸石处理，含有0.2～0.4M的氢氧化钠的6种溶液的pH下降至中性附近(pH7～8)，明确该pH的下降几乎不受0.5％SDS和75mMNaCl的影响。
以上结果表明，沸石具有中和核酸提取试剂中所含的碱的作用。
接着，为了考察通过沸石处理能否除去核酸提取试剂中所含的十二烷基硫酸钠(以下记作SDS)，在微型管中加入80μL的无菌水以及100μL的0.2％SDS溶液或含有75mM的NaCl的0.2％SDS溶液，于95℃加热15分钟，室温下放置5分钟以进行冷却，在其中加入20μL的目标核酸溶液。目标核酸溶液采用从培养的结核菌(结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv株)中提取的基因组DNA溶液(100个拷贝/μL)。
然后，在加有目标核酸溶液的微型管中添加300mg的水悬浮沸石(HSZ-690HOA；东曹株式会社)，颠倒混合，室温下静置5分钟后离心沉淀，将所得上清作为核酸扩增用样品(沸石处理样品)，用12.5μL该样品通过LAMP法进行目标核酸的扩增。
此时，对于未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)、添加等量的无菌水来代替目标核酸溶液而制得的核酸扩增用样品(阴性对照)以及在1μL的目标核酸溶液中仅添加了9μL的无菌水的核酸扩增用样品(含有100个拷贝的基因组DNA；阳性对照)，也同样地通过LAMP法进行了目标核酸的扩增。
利用LAMP法的目标核酸的扩增中，使用实施例1中所用的由序列表的序列编号1～6的碱基序列构成的引物组，在实施例1所示的组成的LAMP反应液中于67℃静置90分钟来进行，实时地测定随着目标核酸的扩增而增加的浊度(turbidity)。
图4是表示对由沸石产生的SDS的除去作用进行考察的结果的图。
图4(a)是在含0.1％SDS的溶液中加入目标核酸溶液来进行目标核酸的扩增的结果，图4(b)是在含75mMNaCl和0.1％SDS的溶液中加入目标核酸溶液来进行目标核酸的扩增的结果。纵轴表示LAMP反应液的浊度(turbidity)，横轴表示反应时间。
其结果是，使用未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)的情况下，未确认到目标核酸的扩增，而使用进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)的情况下，确认到目标核酸的扩增，目标核酸的扩增的起始时间与阳性对照相同。另外，该结果在含75mMNaCl和0.1％SDS的溶液中加入目标核酸溶液来进行目标核酸的扩增的情况下也基本相同。
另一方面，使用添加等量的无菌水来代替目标核酸溶液而制得的核酸扩增用样品(阴性对照)的情况下，在90分钟的反应时间内未确认到目标核酸的扩增。
以上结果表明，沸石具有除去核酸提取试剂中所含的SDS的作用，具有除去阴离子性表面活性剂的作用。
(实施例3)：由沸石产生的脱盐作用
对通过沸石处理能否除去从生物样品中提取的核酸提取液中所含的NaCl进行了研究。
首先，在微型管中加入500μL的生理盐水，于95℃加热15分钟，室温下放置5分钟以进行冷却，在其中加入20μL的目标核酸溶液。目标核酸溶液采用从培养的结核菌(结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv株)中提取的基因组DNA溶液(100个拷贝/μL)。
然后，在加有目标核酸溶液的微型管中添加300mg的水悬浮沸石(HSZ-690HOA；东曹株式会社)，颠倒混合，室温下静置5分钟后离心沉淀，将所得上清作为核酸扩增用样品，用12.5μL该样品通过LAMP法进行目标核酸的扩增。
此时，对于未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)、添加等量的无菌水来代替目标核酸溶液而制得的核酸扩增用样品(阴性对照)以及在1μL的目标核酸溶液中仅添加了9μL的无菌水的核酸扩增用样品(含有100个拷贝的基因组DNA；阳性对照)，也同样地通过LAMP法进行了目标核酸的扩增。
利用LAMP法的目标核酸的扩增中，使用实施例1中所用的由序列表的序列编号1～6的碱基序列构成的引物组，在实施例1所示的组成的LAMP反应液中于67℃静置60分钟来进行，实时地测定随着目标核酸的扩增而增加的浊度(turbidity)。
图5是表示对由沸石产生的脱盐作用进行考察的结果的图。纵轴表示LAMP反应液的浊度(turbidity)，横轴表示反应时间。
其结果是，使用未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)的情况下，与阳性对照相比，目标核酸的扩增的起始时间延后了20分钟，与之相对，使用进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)的情况下，目标核酸的扩增的起始时间的延后在10分钟以内。
另一方面，使用添加等量的无菌水来代替目标核酸溶液而制得的核酸扩增用样品(阴性对照)的情况下，在60分钟的反应时间内未确认到目标核酸的扩增。
由以上结果可知，沸石具有除去核酸提取试剂及生物试样中所含的NaCl的作用、即脱盐作用。这就表明，即使是因为来源于生物试样的NaCl会阻碍核酸的扩增反应而使得核酸的扩增反应液中的加入量存在限制的核酸扩增用样品，也能以超过该限制的量将该核酸扩增用样品加入核酸扩增反应。
(实施例4)：生物试样的制备及核酸提取处理对目标核酸的扩增造成的影响
对由包括血液在内的生物试样制备核酸扩增用样品来扩增目标核酸时的沸石处理的预处理的效果进行了试验。具体而言，作为沸石处理的预处理，研究了生物试样的制备及核酸提取处理的条件。作为生物试样及核酸提取液，采用以下所示的12种生物试样及3种核酸提取液，对于它们的总共36种组合，通过LAMP法进行了目标核酸的扩增。
<生物试样的混悬液>
使0～30％的全血分别悬浮于3种基底，即无菌水、3倍稀释生理盐水(1/3生理盐水)及生理盐水，制备以下组成的12种生物试样的混悬液以及不含全血的对照样品。
不含全血的无菌水
含10％全血的无菌水
含20％全血的无菌水
含30％全血的无菌水
不含全血的1/3生理盐水
含10％全血的1/3生理盐水
含20％全血的1/3生理盐水
含30％全血的1/3生理盐水
不含全血的生理盐水
含10％全血的生理盐水
含20％全血的生理盐水
含30％全血的生理盐水
<核酸提取试剂>
作为核酸提取试剂，制作了氯化钠浓度不同的以下3种(核酸提取试剂A～C)。作为pH指示剂，添加了百里酚蓝。
核酸提取试剂A：174mMNaOH，0mMNaCl，0.00046％百里酚蓝
核酸提取试剂B：174mMNaOH，5mMNaCl，0.00046％百里酚蓝
核酸提取试剂C：174mMNaOH，10mMNaCl，0.00046％百里酚蓝
首先，在微型管中加入100μL的各种生物试样的混悬液和900μL的各种核酸提取试剂，于95℃加热15分钟，室温下放置5分钟以进行冷却，在其中加入1μL的目标核酸溶液。目标核酸溶液采用从培养的结核菌(结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)H37Rv株)中提取的基因组DNA溶液(100个拷贝/μL)。
然后，在加有目标核酸溶液的微型管中以400mg/mL的条件添加水悬浮沸石(HSZ-690HOA；东曹株式会社)，颠倒混合，室温下静置5分钟后离心沉淀，将所得上清作为核酸扩增用样品(沸石处理样品)，用30μL该样品通过LAMP法进行目标核酸的扩增。
此时，对于添加等量的无菌水来代替目标核酸溶液而制得的核酸扩增用样品(阴性对照)以及在1μL的目标核酸溶液中仅添加了9μL的无菌水的核酸扩增用样品(含有100个拷贝的基因组DNA；阳性对照)，也同样地通过LAMP法进行了目标核酸的扩增。
利用LAMP法的目标核酸的扩增中，使用实施例1中所用的由序列表的序列编号1～6的碱基序列构成的引物组，在实施例1所示的组成的LAMP反应液中于67℃静置60分钟来进行，实时地测定随着目标核酸的扩增而增加的浊度(turbidity)。
图6是表示对生物试样的制备及核酸提取液的组成对目标核酸的扩增造成的影响进行考察的结果的图。纵轴表示LAMP反应液的浊度(turbidity)达到0.1为止的时间(分钟)(Tt值)。ND表示未检出浊度的增加。横轴表示生物试样中的血液添加量(％)。
其结果是，在使用核酸提取试剂A的条件下采用含10～30％全血的无菌水作为生物试样的情况下，与阳性对照相比，目标核酸的扩增的起始时间延后了10～50分钟，目标核酸的扩增受到阻碍，阻碍的程度取决于血液添加量。另一方面，采用生理盐水作为生物试样的基底的情况下，与采用无菌水的情况相比，目标核酸的扩增的起始时间的延后减少。
此外，不论在哪一含全血的生物试样中，在采用NaCl浓度为5mM的核酸提取液(B)或10mM的核酸提取液(C)的情况下，与采用NaCl浓度为0mM的核酸提取液(A)的情况相比，目标核酸的扩增的起始时间的延后均减少。核酸提取液C的减少目标核酸的扩增的起始时间的延后的效果比核酸提取液B更明显。
比较了LAMP反应后的反应溶液的荧光强度，其结果是，采用核酸提取液A的情况下，采用含10％全血的生理盐水作为生物试样时可检出与不含全血的生物试样同等的荧光强度。此外，采用含20％全血的生理盐水作为生物试样时，虽然荧光强度比不含全血的生物试样弱，但可判定为阳性。
采用核酸提取液B的情况下，在采用含10％全血的生理盐水及含20％全血的生理盐水作为生物试样时，可检出与不含全血的生物试样同等的荧光强度。此外，采用含10％全血的生理盐水及含10％全血的1/3生理盐水作为生物试样时，虽然荧光强度比不含全血的生物试样弱，但可判定为阳性。
采用核酸提取液C的情况下，在采用含10％全血的无菌水、含10％全血的1/3生理盐水、含10％全血的生理盐水及含20％全血的生理盐水作为生物试样时，可检出与不含全血的生物试样同等的荧光强度。此外，采用含20％全血的1/3生理盐水及含30％全血的生理盐水作为生物试样时，虽然荧光强度比不含全血的生物试样弱，但可判定为阳性。
此外，对于沸石处理后的核酸扩增用样品及沸石处理前的核酸扩增用样品(生物试样的基底：无菌水、核酸提取液A)，测定了蛋白质量，其结果示于表1。
[表1]
由其结果可知，沸石具有除去生物试样中的蛋白质的作用、即除蛋白质作用。将所用的生物试样的基底进行比较时，与无菌水相比，采用1/3生理盐水时除蛋白质作用更强，采用生理盐水时表现出最强的除蛋白质效果。此外，将所用的核酸提取液进行比较时，与NaCl浓度为0mM的核酸提取液(A)相比，采用NaCl浓度为5mM的核酸提取液(B)时除蛋白质作用更强，采用NaCl浓度为10mM的核酸提取液(C)时表现出最强的除蛋白质效果。
由以上结果可知，采用NaCl浓度为生理盐水的1/3～1/1的生物试样(或生物试样的混悬液)的情况下，通过在NaCl的存在下进行核酸提取处理，然后进行沸石处理，可降低来源于血液的核酸扩增阻碍作用。此外，可知沸石具有除蛋白质作用。关于该除蛋白质作用，可知在沸石处理的预处理、即生物试样的制备和/或核酸提取处理中使用含NaCl的溶液的情况下，可获得更好的效果。另外，由实施例3可知，沸石具有脱盐作用，因此可降低核酸提取试剂及生物试样中所含的NaCl的核酸扩增阻碍作用。
这些结果表明，即使是因为来源于血液的核酸扩增阻碍物质而使得核酸的扩增反应液中的加入量存在限制的含血液的生物试样，也能以超过该限制的量将该生物试样用于核酸扩增反应。
(实施例5)：沸石处理对利用LAMP法的加热处理血液中的目标核酸的扩增产生的效果
因为已知沸石具有除去由生物试样制得的核酸扩增用样品中所含的核酸扩增阻碍物质的作用，所以对由血液制备核酸扩增用样品来扩增目标核酸时的沸石处理的效果进行了试验，
首先，在微型管中加入从受试者采集的血液(75μL)和75μL的0.025％SDS，于95℃加热5分钟，在冰中冷却后，用小型桌上离心机(商品名：プチはち；和研药株式会社(和研薬社))离心分离1分钟，回收上清。然后，在20μL所得上清中添加20mg水悬浮沸石(HSZ-690HOA；东曹株式会社)，颠倒混合，室温下静置5分钟后，离心沉淀，在10μL所得上清中加入104个拷贝的λDNA(宝生物公司(タカラバイオ社))，将该溶液作为核酸扩增用样品(沸石处理样品)，通过LAMP法进行目标核酸的扩增。
此时，对于未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)以及在无菌水中仅添加了104个拷贝的λDNA的核酸扩增用样品(阳性对照)，也同样地通过LAMP法进行了目标核酸的扩增。
利用LAMP法的目标核酸的扩增中，使用以下引物组，在由以下组成构成的LAMP反应液中于67℃静置60分钟来进行，实时地测定随着目标核酸的扩增而增加的荧光强度(fluorescence)。
<以λDNA为目标核酸的LAMP法用的引物组>
λDNAFIP引物：5’-aggccaagctgcttgcggtagccggacgctaccagcttct-3’(序列编号7)
λDNABIP引物：5’-caggacgctgtggcattgcagatcataggtaaagcgccacgc-3’(序列编号8)
λDNAF3引物：5’-aaaactcaaatcaacaggcg-3’(序列编号9)
λDNAB3引物：5’-gacggatatcaccacgatca-3’(序列编号10)
λDNALF引物：5’-aggcatcccaccaacgggaa-3’(序列编号11)
<LAMP反应液的组成(25μL)>
规定量的核酸扩增用样品
20mMTris-HCl(pH8.8)
10mMKCl
10mM(NH4)2SO4
8mMMgSO4
0.1％吐温20
5.6mMdNTPs
1.6μMFIP引物
1.6μMBIP引物
0.4μMF3引物
0.4μMB3引物
0.8μMLF引物
8UBst聚合酶
0.25μg/mL噁唑黄
图7是使用进行沸石处理而由血液制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)以及未进行沸石处理而由血液制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)，通过LAMP法进行目标核酸的扩增的结果。纵轴表示随着目标核酸的扩增而增加的LAMP反应液中的荧光强度，横轴表示反应时间。
其结果是，未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)中，虽然未确认到目标核酸的扩增，但与阳性对照相比，目标核酸的扩增起始时间延后了约5分钟，目标核酸的扩增受到了明显的阻碍。
另一方面，进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)中，目标核酸的扩增的起始时间与阳性对照相同，目标核酸的扩增未受到阻碍。
由以上结果可知，如果在由血液制备核酸扩增用样品时用沸石进行处理，则来源于血液的核酸扩增阻碍物质及为提取核酸而添加的SDS被除去，从而可消除这些物质对目标核酸的扩增的阻碍作用。
(实施例6)：核酸扩增用样品向核酸扩增反应液中的加入量的研究
因为已知沸石具有除去由生物试样制得的核酸扩增用样品中所含的核酸扩增阻碍物质的作用，所以对相对于核酸扩增反应液的体积能加入由痰液制得的核酸扩增用样品至何种程度进行了试验。
首先，在微型管中加入从受试者采集的痰液(100μL)和100μL的2×核酸提取试剂(0.4MNaOH，1％SDS)，于95℃加热15分钟，室温下放置5分钟以进行冷却，在其中加入20μL的目标核酸溶液。目标核酸溶液采用从培养的结核菌(结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv株)中提取的基因组DNA溶液(100个拷贝/μL)。
然后，在加有目标核酸溶液的微型管中添加300mg的水悬浮沸石(HSZ-690HOA；东曹株式会社)，颠倒混合，室温下静置5分钟后离心沉淀，将所得上清作为核酸扩增用样品(沸石处理样品)，用10、12.5、15、17.5或20μL该样品制成总量25μL的LAMP反应液，通过LAMP法进行目标核酸的扩增。
此时，对于10μL的未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)以及10μL的在1μL的目标核酸溶液中仅添加了9μL的无菌水的核酸扩增用样品(含有100个拷贝的基因组DNA；阳性对照)，也同样地通过LAMP法进行了目标核酸的扩增。
利用LAMP法的目标核酸的扩增中，使用实施例1中所用的由序列表的序列编号1～6的碱基序列构成的引物组，在实施例1所示的组成的LAMP反应液中静置60分钟来进行，实时地测定随着目标核酸的扩增而增加的浊度(turbidity)。
图8是对进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品在LAMP反应液(25μL)中的加入量对核酸的扩增反应造成的影响进行试验的结果(1)。纵轴表示LAMP反应液的浊度(turbidity)达到0.1为止的时间(分钟)(Tt值)。ND表示未检出浊度的增加。
其结果是，使用10μL的未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)的情况下，未确认到目标核酸的扩增，而在进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)的情况下，即使在25μL的LAMP反应液中加入20μL的核酸扩增用样品时，也确认到目标核酸的扩增，阳性对照的Tt值约为12分钟，与之相对，沸石处理样品的Tt值约为18分钟左右，两者没有大的差异。
于是，接着将除核酸扩增用样品和硫酸铵以外的LAMP反应液中所含的所有成分冷冻干燥，在其中添加25μL的上述沸石处理样品进行LAMP反应，实时地测定随着目标核酸的扩增而增加的浊度(turbidity)。
此时，对于添加等量的无菌水来代替目标核酸溶液而制得的25μL的核酸扩增用样品(阴性对照)以及在1μL的目标核酸溶液中仅添加了24μL的无菌水的核酸扩增用样品(含有100个拷贝的基因组DNA；阳性对照)，也将其分别添加至经冷冻干燥的LAMP反应液所含的成分中，同样地通过LAMP法进行了目标核酸的扩增。
图9是对进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品在LAMP反应液(25μL)中的加入量对核酸的扩增反应造成的影响进行试验的结果(2)。纵轴表示LAMP反应液的浊度(turbidity)达到0.1为止的时间(分钟)(Tt值)。ND表示未检出浊度的增加。
其结果是，即使在25μL的LAMP反应液中加入25μL的进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)的情况下，也确认到目标核酸的扩增，阳性对照的Tt值约为12分钟，与之相对，沸石处理样品的Tt值约为14～18分钟，两者没有大的差异。
由以上结果可知，如果进行沸石处理而由生物试样制备核酸扩增用样品，则在能大幅去除核酸扩增阻碍物质的同时，能以至多LAMP反应液的最大体积的量来加入核酸扩增用样品。这就表明，进行沸石处理而由生物试样制备核酸扩增用样品的方法在因生物试样中含有大量的核酸扩增阻碍物质而需要纯化核酸的步骤的来自标本的目标核酸的检测中以及表达量非常低的基因的检测中是非常有用的。此外，将本方法和干燥化的扩增试剂一起使用的情况下，可将干燥化扩增试剂的再溶解操作和样品添加操作合并成一个步骤，因而能大幅提高基因检查的操作性。
(实施例7)：沸石处理对采用PCR法的目标核酸的扩增反应产生的效果
已知通过在制备核酸扩增用样品时进行沸石处理可除去核酸扩增阻碍物质，该效果已通过利用LAMP法的目标核酸的扩增反应得到确认，因此对利用PCR法来扩增目标核酸时的沸石处理的效果进行了试验。
首先，在微型管中加入从受试者采集的血浆(250μL)和250μL的0.5％SDS，于95℃加热15分钟，室温下放置5分钟以进行冷却，在其中添加300mg的水悬浮沸石(HSZ-690HOA；东曹株式会社)，颠倒混合，室温下静置5分钟后离心沉淀，在3μL所得上清中加入105个拷贝的λDNA(宝生物公司)，将该溶液作为核酸扩增用样品(沸石处理样品)，通过PCR法进行目标核酸的扩增。
此时，对于未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)以及在无菌水中仅添加了105个拷贝的λDNA的核酸扩增用样品(阳性对照)，也同样地通过PCR法进行了目标核酸的扩增。
利用PCR法的目标核酸的扩增中，使用以下引物组，在由以下组成构成的PCR反应液中进行，实时地测定随着目标核酸的扩增而增加的荧光强度(fluorescence)。
<以λDNA为目标核酸的PCR法用的引物组>
λ正义引物：5’-aaaactcaaatcaacaggcg-3’(序列编号12)
λ反义引物：5’-gacggatatcaccacgatca-3’(序列编号13)
<PCR反应液的组成(50μL)>
核酸扩增用样品
1UZ-taq(宝生物公司)
1×Z-Taq缓冲液(宝生物公司)
0.2mMdATP
0.2mMdCTP
0.2mMdGTP
0.2mMdTTP
0.2μMλ正义引物
0.2μMλ反义引物
0.25μg/mL噁唑黄
图10是使用进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)以及未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)，通过PCR法进行目标核酸的扩增的结果。纵轴表示随着目标核酸的扩增而增加的PCR反应液中的荧光强度，横轴表示反应时间。
其结果是，未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)中，未确认到目标核酸的扩增，而进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)中，与阳性对照相比，虽然目标核酸的扩增起始时间延后了约5分钟，但确认到足够的灵敏度的扩增反应。
(实施例8)：沸石处理对利用RT-LAMP法的目标核酸的扩增反应产生的效果
已知通过在制备核酸扩增用样品时进行沸石处理可除去核酸扩增阻碍物质，该效果已通过利用LAMP法及PCR法的目标核酸的扩增反应得到确认，因此对利用RT-LAMP法来扩增目标核酸时的沸石处理的效果进行了试验。
首先，在微型管中加入从受试者采集的血浆(250μL)和250μL的0.5％SDS，于95℃加热15分钟，室温下放置5分钟以进行冷却，在其中添加300mg的水悬浮沸石(HSZ-690HOA；东曹株式会社)，颠倒混合，室温下静置5分钟后离心沉淀，在4μL所得上清中加入80个拷贝的SARS冠状病毒基因组RNA(荣研化学株式会社(栄研化学社))，将该溶液作为核酸扩增用样品(沸石处理样品)，通过RT-LAMP法进行目标核酸的扩增。
此时，对于未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)以及在无核糖核酸酶的无菌水中仅添加了80个拷贝的SARS冠状病毒基因组RNA的核酸扩增用样品(阳性对照)，也同样地通过RT-LAMP法进行了目标核酸的扩增。
利用RT-LAMP法的目标核酸的扩增中，使用以下引物组，在由以下组成构成的RT-LAMP反应液中进行，实时地测定随着目标核酸的扩增而增加的浊度(turbidity)。
<以SARS冠状病毒基因组RNA为目标核酸的RT-LAMP法用的引物组>
SARSFIP引物：5’-tgcatgacagccctcgaagaagctattcgtcac-3’(序列编号14)
SARSBIP引物：5’-gctgtgggtactaacctacctgtcaacataaccagtcgg-3’(序列编号15)
SARSF3引物：5’-ctaatatgtttatcacccgc-3’(序列编号16)
SARSB3引物：5’-ctctggtgaattctgtgtt-3’(序列编号17)
SARSLF引物：5’-aaagccaatccacgc-3’(序列编号18)
SARSLB引物：5’-ccagctaggattttctacagg-3’(序列编号19)
<RT-LAMP反应液的组成(25μL)>
规定量的核酸扩增用样品
20mMTris-HCl(pH8.8)
10mMKCl
10mM(NH4)2SO4
8mMMgSO4
0.1％吐温20
5.6mMdNTPs
3.2μMFIP引物
3.2μMBIP引物
0.8μMF3引物
0.8μMB3引物
1.6μMLF引物
1.6μMLB引物
16UBst聚合酶
2UAMV反转录酶
1μLFD(钙黄绿素)
图11是使用进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)以及未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)，通过RT-LAMP法进行目标核酸的扩增的结果。纵轴表示随着目标核酸的扩增而增加的RT-LAMP反应液中的浊度(turbidity)，横轴表示反应时间。
其结果是，未进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(无沸石处理样品)中，未确认到目标核酸的扩增，而进行沸石处理而制得的核酸扩增用样品(沸石处理样品)中，与阳性对照相比，虽然目标核酸的扩增起始时间提前了约10分钟，但确认到足够的灵敏度的扩增反应。
序列表
<110>荣研化学株式会社(EikenKagakuKabushikiKaisha)
<120>核酸扩增用样品的制备方法
<130>08-0542
<150>JP2007-287655
<151>2007-11-05
<160>19
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>36
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)
<400>1
gcggttgatgtgtttcacgcacaaagttaagagccg36
<210>2
<211>42
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)
<400>2
gcgattcatagcagcatcgttccattgcatcgcgatctccac42
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)
<400>3
cgcagccgaatccact16
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)
<400>4
cgactccgaatacccgg17
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)
<400>5
gaagtccaccaggcc15
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)
<400>6
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<213>SARS病毒(SARSvirus)
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Claims (13)

1.一种制备方法，该制备方法是用于生物试样中所含的核酸的扩增的核酸扩增用样品的制备方法，其特征在于，包括：
提取步骤，该提取步骤中，在所述生物试样中加入核酸提取试剂而得到核酸提取液；
纯化步骤，该纯化步骤中，通过使所述核酸提取液与沸石接触，从而得到能实现更高灵敏度的核酸检测的适合于核酸扩增的所述核酸扩增用样品；
所述生物试样是血液、脊液、尿、粪便、痰液、唾液、鼻涕或拭液；
所述沸石是质子型沸石，所述沸石的晶体结构是丝光沸石型。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核酸提取试剂包含表面活性剂和/或碱。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂是阴离子性表面活性剂。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述阴离子性表面活性剂是选自烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐和烷基苯磺酸盐的至少1种化合物。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述阴离子性表面活性剂是十二烷基硫酸钠。
6.如权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述提取步骤是如下所述的步骤：在添加无机盐的条件下在所述生物试样中加入核酸提取试剂而得到核酸提取液。
7.如权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤是如下所述的步骤：在所述核酸提取液中加入沸石并混合，通过离心分离或过滤将沸石分离，从而得到所述核酸扩增用样品。
8.如权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤是如下所述的步骤：通过使所述核酸提取液通过填充有所述沸石的除去柱，从而将吸附于所述沸石的物质除去，得到所述核酸扩增用样品。
9.一种制备试剂盒，该制备试剂盒是权利要求1～8中任一项所述的制备方法中使用的核酸扩增用样品的制备试剂盒，其特征在于，
包括核酸提取试剂和沸石，所述沸石是质子型沸石，所述沸石的晶体结构是丝光沸石型。
10.如权利要求9所述的制备试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂包含表面活性剂和/或碱。
11.如权利要求10所述的制备试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂是阴离子性表面活性剂。
12.一种核酸扩增检测用试剂盒，其特征在于，包括权利要求9或10所述的制备试剂盒。
13.一种核酸扩增检测用试剂盒，其特征在于，以权利要求12所述的核酸扩增检测用试剂盒所包括的试剂的一部分或全部是干燥试剂的形式提供。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9567628B2 (en) 2011-06-08 2017-02-14 Life Technologies Corporation Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points
ES2692894T3 (es) 2011-06-08 2018-12-05 Life Technologies Corporation Diseño y desarrollo de nuevos detergentes para su uso en sistemas de PCR
EP2721140B1 (en) 2011-06-19 2016-11-23 Abogen, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection
EP2726595A1 (en) 2011-07-01 2014-05-07 Qiagen GmbH Filter module in biomolecule isolation
JP5821358B2 (ja) * 2011-07-20 2015-11-24 ソニー株式会社 核酸抽出方法及び核酸抽出用カートリッジ
JP5899731B2 (ja) 2011-09-13 2016-04-06 ソニー株式会社 核酸精製方法、核酸抽出方法、及び核酸精製用キット
JP5972705B2 (ja) * 2012-08-03 2016-08-17 日本碍子株式会社 標的核酸の検出方法、検出キット
JP6170154B2 (ja) * 2012-08-28 2017-07-26 バイオキューブシステム インコーポレイテッド 生物学的試料から核酸増幅反応用生物学的分子を迅速に分離するための多孔性固体相及びその用途
KR101380909B1 (ko) * 2013-03-20 2014-04-01 한국생명공학연구원 핵산 정제용 흡착제 및 그 흡착제를 이용한 정제방법
EP3063129B1 (en) 2013-10-25 2019-04-17 Life Technologies Corporation Novel compounds for use in pcr systems and applications thereof
DK3114225T3 (da) 2014-03-07 2021-07-26 Dna Genotek Inc Sammensætning og fremgangsmåde til stabilisering af nukleinsyrer i biologiske prøver
CN113122535A (zh) 2015-09-10 2021-07-16 株式会社钟化 从含有核酸的样品中分离核酸的方法及用于该方法的样品处理试剂
US11091792B2 (en) 2016-05-04 2021-08-17 Children's Hospital & Research Center At Oakland Rapid extraction of nucleic acids from clinical samples for downstream applications
JP7143596B2 (ja) * 2017-03-13 2022-09-29 東ソー株式会社 核酸抽出および増幅試薬
WO2020075696A1 (ja) * 2018-10-09 2020-04-16 公益財団法人筑波メディカルセンター 試料の前処理方法
CN110724633A (zh) * 2019-11-11 2020-01-24 浙江汇泽医药科技有限公司 一种微量细胞核酸提取与扩增系统及工艺
CN113687003B (zh) * 2021-09-14 2022-06-14 谱天（天津）生物科技有限公司 一种提高蛋白质和/或肽段组质谱鉴定数的方法
WO2023095704A1 (ja) * 2021-11-25 2023-06-01 富士フイルム株式会社 核酸検査方法および検査キット

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004003200A1 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Amersham Biosciences Ab Isolation of nucleic acids using a polycationic polymer as precipitation agent
CN1680421A (zh) * 2004-02-20 2005-10-12 霍夫曼-拉罗奇有限公司 在核酸固相上的吸附

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19530132C2 (de) 1995-08-16 1998-07-16 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien
US5620869A (en) 1995-09-28 1997-04-15 Becton, Dickinson And Company Methods for reducing inhibition of nucleic acid amplification reactions
DE19856064C2 (de) * 1998-12-04 2000-11-30 Invitek Gmbh Universelles Verfahren zur Isolierung von DNA aus beliebigen Ausgangsmaterialien
AU2001278133A1 (en) * 2000-08-01 2002-02-13 Surromed, Inc. Methods for solid phase nanoextraction and desorption
JP2002345463A (ja) 2001-05-24 2002-12-03 Fuji Photo Film Co Ltd 核酸吸着バッファ及び核酸精製方法
JP2002345462A (ja) 2001-05-24 2002-12-03 Fuji Photo Film Co Ltd 吸着バッファ及び核酸精製方法
US7597936B2 (en) * 2002-11-26 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Method of producing a pigmented composite microporous material
NL1026271C2 (nl) 2004-05-26 2005-11-30 Keygene Nv Werkwijze en inrichting voor het isoleren van nucleïnezuur uit nucleïnezuur bevattend materiaal.
US8030034B2 (en) * 2005-12-09 2011-10-04 Promega Corporation Nucleic acid purification with a binding matrix

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004003200A1 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Amersham Biosciences Ab Isolation of nucleic acids using a polycationic polymer as precipitation agent
CN1680421A (zh) * 2004-02-20 2005-10-12 霍夫曼-拉罗奇有限公司 在核酸固相上的吸附

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hakan Eriksson等.the use of zeolite Y in the purification of intracellular accumulated proteins from genetically engineered cells.《biotechnology techniques》.1992,第6卷(第3期),239-244. *
郭建成主编.PCR检测的样品来源和核酸提取.《消化系统疾病现代诊断与治疗》.1993,第366-367页. *

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Publication number Publication date
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