CN113122535A - 从含有核酸的样品中分离核酸的方法及用于该方法的样品处理试剂 - Google Patents

从含有核酸的样品中分离核酸的方法及用于该方法的样品处理试剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供从含有核酸的样品中分离核酸的方法及用于该方法的样品处理试剂。所述样品处理试剂含有：0.5重量％～15重量％的选自N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸、L‑半胱氨酸乙酯、L‑半胱氨酸甲酯、N‑乙基‑L‑半胱氨酸、N‑甲基‑L‑半胱氨酸和它们的盐中的至少一种硫醇系还原剂；3重量％～20重量％的选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡及氢氧化钙中的至少1种碱性物质；和20重量％～80重量％的乙醇。所述方法为在所述样品处理试剂与所述样品的混合物的存在下、使从所述样品游离的核酸吸附在含有二氧化硅的载体上。

Description

从含有核酸的样品中分离核酸的方法及用于该方法的样品处 理试剂
本申请是申请日为2016年9月9日、优先权日为2015年9月10日、中国专利申请号为201680062710.4、发明名称为“从含有核酸的样品中分离核酸的方法及用于该方法的装置”的分案申请。
技术领域
本发明涉及从生物体试样等含有核酸的样品中分离核酸的方法。本发明还涉及用于从含有核酸的样品中分离核酸的装置。
背景技术
基因检查通过对核酸进行解析，能够高灵敏度且在短时间内对结果进行判定，是在医疗、农畜水产、品质检查等多种领域中应用的产业上重要的检查方法。为了该检查，需要从样品中对核酸进行洗脱、精制，作为核酸精制法，最为常用的是应用了在促溶剂的存在下、核酸与核酸吸附性载体相结合的性质的结合-洗脱法(专利文献1、2)。该精制法由所下述工序构成：(a)溶解工序：样品的溶解和核酸的溶解析出、(b)吸附工序：核酸吸附性载体与核酸的结合、(c)洗涤工序：结合于核酸吸附性载体的核酸的洗涤、(d)溶解析出工序：核酸的溶解析出；特别是与吸附柱组合的方法是能够精制高纯度核酸的优异方法。
但是，该方法需要熟练的研究者在设备齐备的实验室等中使用离心机或微量移液器、旋涡混合器、培养箱等理化学机器进行作业，是技术难度高的作业。实际上，在需要进行基因检查的医疗、农畜水产、食品等领域中，不具备具有所需技术的人才或设备的机构也很多。这种机构中，实际情况是将本来能够在短时间内进行结果判定的基因检查委托至花费时间和费用的外单位，无法充分地发挥作为基因检查特征的结果判定的迅速性。
另外，成为基因检查对象的样品多是病毒或细菌等具有病原性的物质，对检查作业者的感染风险经常成为问题。因此，基因检查多需要使用对应于生物安全等级的装备、设备，这些设备或装备的使用对于不需要其的情况而言，是非常繁琐的操作。实际情况是会对作业者造成很大的负担。
专利文献3中公开了使含有自样品溶解析出的核酸的核酸提取液接触于沸石、使不需要的物质吸附在沸石上，对核酸进行精制的方法，但该方法不具有如结合-洗脱法那样对核酸进行浓缩精制的能力，存在依赖于样品中的核酸浓度的课题。另外，能够吸附除去的杂质是有限的，精制度比结合-洗脱法差，在代替结合-洗脱法方面技术水平还不足。
专利文献4中公开了用于痰中所含抗酸杆菌的基因检测的前处理方法。该方法的目的是从痰中将抗酸杆菌的菌体分离，而并非是从痰中对基因(核酸)进行提取的方法。
专利文献5中公开了适于自动化及小型化、使用了核酸吸附性多孔性膜的核酸的分离精制方法。专利文献5中作为核酸吸附性多孔性膜，其特征在于使用核酸以与离子键实质上无关的相互作用吸附的多孔性膜。专利文献5的方法仍无法解决现有的结合-洗脱法的上述课题。
专利文献6中公开了用于使溶液中的核酸吸附在固相载体上的促溶剂的组成。但是，专利文献6中未公开用于解决现有的结合-洗脱法的上述课题的手段。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2001-78790号公报
专利文献2：日本特表2014-526255号公报
专利文献3：国际公开WO2009/060847
专利文献4：日本特开2009-100688号公报
专利文献5：日本特开2005-168449号公报
专利文献6：美国专利公开US2009/0306359
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供从含有核酸的样品中有效率地分离核酸的方法、用于该方法的装置及用于该方法的试剂。
用于解决课题的手段
本发明中，作为用于解决上述课题的手段，提供以下的发明。
本发明提供一种方法，其为通过使含有核酸的样品与使样品中的核酸游离的处理试剂的混合物与吸附核酸的载体接触，从含有核酸的样品中将核酸分离的方法，
其特征在于，使用具备处理试剂收纳容器和核酸采集构件的装置，
所述处理试剂收纳容器将使样品中的核酸游离的处理试剂收纳在容器内空间，具有释放所述处理试剂的释放口且按照容器内空间的体积能够减少的方式构成；
所述核酸采集构件形成有用于收纳样品的收纳空间，在所述收纳空间的一侧形成有按照能够供给处理试剂的方式与所述处理试剂收纳容器连接的处理试剂供给口，在所述收纳空间的另一侧形成有介由在透过所述混合物的同时将所述混合物中游离的核酸吸附的载体将所述混合物排出的混合物排出口，
所述处理试剂收纳容器的释放口安装有对所述释放口进行密封的盖体，
所述核酸采集构件按照在将所述处理试剂收纳容器与所述核酸采集构件的处理试剂供给口连接时、由所述盖体密封的所述释放口开放、将所述释放口与所述处理试剂供给口连通的方式构成，
所述方法包含以下工序：
工序1：在所述核酸采集构件的收纳空间中收纳样品；
工序2：在工序1后，将所述处理试剂收纳容器与所述核酸采集构件的处理试剂供给口连接，使所述释放口与所述处理试剂供给口连通；
工序3：在工序2中形成的、所述处理试剂收纳容器的容器内空间与所述核酸采集构件的收纳空间成为一体的混合用空间内，将所述样品与所述处理试剂混合形成所述混合物，在所述混合物内使所述样品中的核酸游离；
工序4：通过减少所述处理试剂收纳容器的容器内空间的体积来压送含有工序3中游离的核酸的所述混合物，介由所述载体从所述核酸采集构件的混合物排出口排出。
本发明方法中使用的装置优选具备后述装置的特征。
本发明的方法优选在工序4后进一步包含工序5：使用洗涤液对载体进行洗涤、从载体中将除核酸以外的不需要成分除去。
本发明的方法优选在工序5后进一步包含工序6：使将核酸洗脱的洗脱液与载体接触、从载体中将核酸洗脱。
本发明的方法中，优选所述处理试剂含有降低微生物感染性的成分和使核酸游离的成分。
本发明还提供一种装置，其为通过使含有核酸的样品与使样品中的核酸游离的处理试剂的混合物与吸附核酸的载体接触，从含有核酸的样品中将核酸分离的装置，其具备处理试剂收纳容器和核酸采集构件，
所述处理试剂收纳容器将使样品中的核酸游离的处理试剂收纳在容器内空间，具有释放所述处理试剂的释放口且按照容器内空间的体积能够减少的方式构成；
所述核酸采集构件形成有用于收纳样品的收纳空间，在所述收纳空间的一侧形成有按照能够供给处理试剂的方式与所述处理试剂收纳容器连接的处理试剂供给口，在所述收纳空间的另一侧形成有介由在透过所述混合物的同时将所述混合物中游离的核酸吸附的载体将所述混合物排出的混合物排出口，
所述处理试剂收纳容器的释放口安装有对所述释放口进行密封的盖体，
所述核酸采集构件按照在将所述处理试剂收纳容器与所述核酸采集构件的处理试剂供给口连接时、由所述盖体密封的所述释放口开放、将所述释放口与所述处理试剂供给口连通的方式构成。
这里，作为“所述核酸采集构件按照在将所述处理试剂收纳容器与所述核酸采集构件的处理试剂供给口连接时、由所述盖体密封的所述释放口开放、将所述释放口与所述处理试剂供给口连通的方式构成”这一特征的具体方式，可以举出下述方式：所述核酸采集构件具备在将所述处理试剂收纳容器与所述核酸采集构件的处理试剂供给口连接时、被压入到所述盖体中而将所述盖体破坏的部分。该方式中，所述部分通过压入导致所述盖体的破坏，由所述盖体密封的所述释放口开放、所述释放口与所述处理试剂供给口连通。在所述核酸采集构件具备包围所述收纳空间的周壁部、所述周壁部中包围所述处理试剂供给口周边的部分为处理试剂供给口周边部的方式中，所述处理试剂供给口周边部的端部可作为所述部分进行示例。该具体的方式中，所述盖体是通过所述核酸采集构件具备的所述部分压入而能够破坏的盖体，具体而言是由膜形成的盖体。
本发明的装置优选：
所述处理试剂收纳容器具备包围所述释放口周边的释放口周边部，
所述核酸采集构件具备包围所述收纳空间的周壁部、所述周壁部中将所述处理试剂供给口的周边包围的部分是处理试剂供给口周边部，
所述处理试剂收纳容器与所述核酸采集构件按照能够以所述释放口周边部的内周面与所述处理试剂供给口周边部的外周面相接的状态进行连接的方式构成，
所述核酸采集构件的处理试剂供给口周边部的所述处理试剂供给口一侧的端部按照在将所述处理试剂收纳容器与所述核酸采集构件连接时、将所述处理试剂收纳容器的所述盖体破坏的方式构成。
这里，作为“所述核酸采集构件的处理试剂供给口周边部的所述处理试剂供给口一侧的端部按照在将所述处理试剂收纳容器与所述核酸采集构件连接时、将所述处理试剂收纳容器的所述盖体破坏的方式构成”这一特征的具体方式，可以举出下述方式：所述核酸采集构件的处理试剂供给口周边部包含在所述处理试剂供给口一侧、在使所述释放口周边部的内周面与所述处理试剂供给口周边部的外周面接触的同时将所述处理试剂收纳容器与所述核酸采集构件连接时，被压入所述盖体、将所述盖体破坏的端部。所述盖体是通过所述处理试剂供给口周边部的所述端部压入而能够破坏的盖体，具体而言是由膜形成的盖体。该具体方式中，优选所述端部是锐利的端部。
本发明的装置中，更优选：
所述核酸采集构件进一步具备从周壁部的外周面向外方向伸出的伸出部、和从伸出部的周边向所述周壁部的存在有所述处理试剂供给口的一侧立起的防混合物漏出的壁部，
在所述释放口周边部的外周面和所述防混合物漏出的壁部的内周面中的一个面或两个面上，形成有至少1个按照将整周包围的方式在周方向上延伸、向径方向突出的、能够压缩变形的环状突起，
所述处理试剂收纳容器和所述核酸采集构件按照下述方式构成：在将所述处理试剂收纳容器与所述核酸采集构件连接时，所述释放口周边部的外周面与所述防混合物漏出的壁部的内周面对置、被夹在所述释放口周边部的外周面和所述防混合物漏出的壁部的内周面之间的所述环状突起发生压缩变形、阻碍所述混合物从所述释放口周边部的外周面与所述防混合物漏出的壁部的内周面之间通过、和/或所述混合物从所述处理试剂供给口周边部的外周面与所述释放口周边部的内周面之间通过。
本发明的装置优选进一步具备收纳从所述载体中将除核酸以外的不需要成分除去的洗涤液的洗涤液收纳容器。
本发明的装置优选进一步具备收纳用于从所述载体将核酸洗脱的洗脱液的洗脱液收纳容器。
本发明的装置中优选所述处理试剂含有降低微生物感染性的成分和使核酸游离的成分。
本发明还提供一种用于使样品中的核酸游离的样品处理试剂，其含有：
选自有机溶剂、醛系消毒剂、碘剂、氯剂、过乙酸、臭氧、过氧化氢、红汞、乳酸6,9-二氨基-2-乙氧基吖啶、表面活性剂及碱性物质中的至少1种的降低微生物感染性的成分；和
选自碱性物质及表面活性剂中的至少1种使核酸游离的成分。
本发明的样品处理试剂优选进一步含有选自促溶剂及有机溶剂中的至少1种促进核酸在载体上吸附的成分。
本发明的样品处理试剂优选进一步含有硫醇系还原剂，更优选含有醇作为减少微生物感染性的所述成分、且含有碱性物质作为使核酸游离的所述成分。
本发明的样品处理试剂优选进一步含有硫醇系还原剂，含有碱性物质作为减少微生物感染性的所述成分及使核酸游离的所述成分，更优选进一步含有醇作为减少微生物感染性的所述成分。
本发明的样品处理试剂优选是用于使所述样品中的核酸游离、使其吸附于含有二氧化硅的载体的样品处理试剂。
本发明还提供用于使样品中的核酸游离的所述样品处理试剂的用途。
本发明的用途优选是用于使所述样品中的核酸游离、使其吸附于含有二氧化硅的载体的所述样品处理试剂的用途。
作为本发明进一步的方法，本发明提供使样品中的核酸游离的方法，其包含工序1：将样品与所述样品处理试剂混合，形成混合物，在该混合物中，减少所述样品可含有的微生物感染性、同时使所述样品中的核酸游离。
作为本发明进一步的方法，本发明提供从样品中分离核酸的方法，其包含以下工序：
所述工序1；和
工序2：在所述工序1中形成的混合物的存在下、使从所述样品游离的核酸吸附在载体上。
作为本发明进一步的方法，本发明提供从含有核酸且含有通过S-S键交联的成分的样品中将核酸分离的方法，其包含：在含有硫醇系还原剂的所述样品处理试剂和所述样品的混合物的存在下、使从所述样品游离的核酸吸附在载体上。
本发明进一步的方法中，优选所述载体是含有二氧化硅的载体。
上述本发明的方法、装置、试剂、用途或进一步的方法的一个实施方式中，含有核酸的样品为痰，优选是含有感染性微生物或来自于感染性微生物的核酸的痰，特别优选是含有抗酸杆菌(优选结核杆菌、以下相同)或来自于抗酸杆菌的核酸的痰。该实施方式中，待分离的核酸是痰中含有的核酸，优选是来自于感染性微生物或其他细胞(例如痰中的人类细胞或其他动物的细胞)的核酸，特别优选是来自于抗酸杆菌的核酸。该实施方式的方法、装置、试剂、用途或进一步的方法中，优选所使用的处理试剂含有用于提高痰的流动性的还原剂。作为还原剂，优选是硫醇系还原剂，更优选是半胱氨酸系还原剂，作为半胱氨酸系还原剂，优选选自N-乙酰基-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸乙酯、L-半胱氨酸甲酯、N-乙基-L-半胱氨酸及N-甲基-L-半胱氨酸以及这些化合物的盐中的至少1种。作为所述盐，只要是作为还原剂发挥作用的形态则无特别限定，可以是卤化氢盐(盐酸盐等)、碱金属盐(钠盐等)等形态，例如可以示例L-半胱氨酸乙酯的盐酸盐、L-半胱氨酸甲酯的盐酸盐等。另外，所使用的处理试剂优选是液体。
上述本发明的方法、装置、试剂、用途或进一步的方法的另一实施方式中，含有核酸的样品是含有来自于抗酸杆菌的核酸的样品。该实施方式中，待分离的核酸是来自于抗酸杆菌的核酸。
上述本发明的方法、装置、试剂、用途或进一步的方法的另一实施方式中，含有核酸的样品是除了痰之外的样品，这里被除外的痰是含有感染性微生物或来自于感染性微生物的核酸的痰，特别是含有抗酸杆菌或来自于抗酸杆菌的核酸的痰。该实施方式的方法、装置、试剂、用途或进一步的方法中，所使用的处理试剂可以不含所述还原剂。
上述本发明的方法、装置、试剂、用途或进一步的方法的又一实施方式中，含有核酸的样品是含有除来自于抗酸杆菌的核酸以外的核酸的样品。本实施方式中，待分离的核酸是除来自于抗酸杆菌的核酸以外的核酸。
本说明书包含成为本申请优先权基础的日本专利申请号2015-178442号的公开内容。
发明效果
根据本发明，提供从含有核酸的样品中有效率地分离核酸的方法、用于该方法的装置及用于该方法的试剂。
附图说明
图1为处理试剂收纳容器的一个实施方式的截面示意图。
图2为核酸采集构件的一个实施方式的截面示意图。
图3为样品容纳构件的一个实施方式的截面示意图。
图4-1为用于说明本发明的核酸分离方法中的工序1的示意图。
图4-2为用于说明本发明的核酸分离方法中的工序2及3的示意图。
图4-3为用于说明本发明的核酸分离方法中的工序4的示意图。
图4-4为用于说明本发明的核酸分离方法中的工序5的示意图。
图4-5为用于说明本发明的核酸分离方法中的工序6的示意图。
图5为用于说明本发明处理试剂收纳容器的另一实施方式的截面示意图。
图6为用于说明本发明处理试剂收纳容器的另一实施方式的截面示意图。
具体实施方式
<分离核酸的方法>
本发明涉及使用处理试剂收纳容器和核酸采集构件、从含核酸样品中分离核酸的方法。作为处理试剂收纳容器的具体例子，可以举出图1所示的处理试剂收纳容器100。作为核酸采集构件的具体例子，可以举出图2所示的核酸采集构件200。以下参照附图所记载的实施方式，说明本发明中使用的各器具及使用了各器具的方法，但本发明并不限定于这些实施方式。
处理试剂收纳容器100在容器内空间110中收纳有使样品中的核酸游离的处理试剂101、且具有释放处理试剂101的释放口102。此外，处理试剂收纳容器100按照容器内空间110的体积能够减少的方式构成，作为用于实现该方式的具体手段，可以示例后面详细叙述的压送部103。释放口102中安装有按照将处理试剂101保持在容器内空间110的方式将释放口102密封的盖体104。
图1所示的处理试剂收纳容器100中，释放口102被释放口周边部105将周边包围而形成。释放口周边部105的一侧开放、将释放口102包围，另一侧与压送部103连接。释放口周边部105优选如图所示具有筒形状，但并不限定于此。容器内空间110是作为压送部103内部空间的压送部内部空间111与作为被释放口周边部105包围的空间的释放口附近空间112成为一体的空间。压送部103按照可以使压送部内部空间111的体积减少的方式构成。对应于压送部内部空间111的体积减少、容器内空间110的体积也减少。通过使压送部103工作、减少容器内空间110的体积，从而可以通过压送将后述混合物421从释放口102送出。这里，使压送部103“工作”是指按照使容器内空间110的体积减少的方式操作压送部103，在图示的实施方式中，是指使压送部103变形。
压送部103优选是图示的、在轴方向上能够伸缩、未与释放口周边部105连接一侧的端部闭塞或能够闭塞的、壁面具有蛇腹结构的筒体，但并不限定于此。图示的具有蛇腹结构的压送部103是能够变形而使容器内空间110的体积减少的处理试剂收纳容器100的部分结构之一例，并不限定于蛇腹结构的筒体，只要是具备开口与释放口周边部105连接、其他部分闭塞或能够闭塞的、能够按照使容器内空间110体积减少的方式进行变形的袋体的压送部103，则可以同样地使用。能够如此变形的压送部103优选能够弹性变形，更优选按照在容器内空间110的内外没有气压差的条件下、使其变形以减少容器内空间110体积、然后能够将容器内空间110的体积及形状复原的方式构成。作为压送部103的另一例子，可以举出是一端与释放口周边部105连接的筒体、和侧壁与该筒体内壁相接且该筒体的内壁与侧壁按照不漏空气的方式相接、同时能够沿着该筒体的轴方向滑动而被收纳的活塞的组合，通过活塞的运动，可以减少形成于筒体内的压送部内部空间111及容器内空间110的体积。
图示的释放口周边部105及压送部103由垂直于释放处理试剂101的方向的平面所形成的的截面为圆形，该截面的形状并无限定，还可以是四边形(正方形、长方形)、三角形、五边形等多边形。圆形包括正圆、椭圆、正圆扁平的形状、椭圆变形的形状等。多边形还包括角部发圆的形状。
将处理试剂收纳容器100的释放口102密封的盖体104如另外所叙述的那样，按照在将处理试剂收纳容器100与核酸采集构件200的处理试剂供给口连接时被破坏的方式构成。盖体104可以由含有合成树脂的膜或者铝膜等金属膜构成，还可以是多种膜层叠而成。还可以通过粘接剂、利用热或超声波进行的熔融粘合等手段将盖体104固定在包围释放口周边部105的释放口102的端部上。
在处理试剂收纳容器100的释放口周边部105的外周面1051上优选形成有1个或多个按照将释放口周边部105的周围整周包围的方式在周方向上延伸、向径方向外侧突出的环状突起1053-1、1053-2。环状突起1053-1、1053-2的功能在后叙述。处理试剂收纳容器100优选至少环状突起1053-1、1053-2的部分由能够压缩变形的材料构成。
对使样品中的核酸游离的处理试剂101的组成另外详细叙述。
图2所示的核酸采集构件200形成有用于收纳样品的收纳空间203，在在收纳空间203的一侧形成有按照能够供给处理试剂101的方式与处理试剂收纳容器100连接的处理试剂供给口204，在收纳空间203的另一侧形成有介由对在透过后述的混合物421的同时将混合物421中游离的核酸吸附的载体205、将混合物421排出的混合物排出口206。
核酸采集构件200具备将收纳空间203的周围包围的周壁部210。周壁部210中，将规定处理试剂供给口204周边的部分作为处理试剂供给口周边部211、将规定混合物排出口206周围的部分作为混合物排出口周边部213。图示的实施方式中，将连接处理试剂供给口周边部211和混合物排出口周边部213的部分作为周壁连接部212，但并不限定于该方式，周壁部210可以是处理试剂供给口周边部211与混合物排出口周边部213连续、具有相同直径的筒体等各种形状。载体205配置于混合物排出口206，按照将在收纳空间203内形成的混合物421从混合物排出口206排出时、透过载体205的方式构成。载体205按照下述方式构成：在夹着载体205、收纳空间203的内部与外部没有实质性气压差的条件下，在重力下将处理试剂101、混合物421或后述样品S收纳在收纳空间203中时，实质上不透过处理试剂101、混合物421或样品S。这里，载体205“实质上不透过”处理试剂101、混合物421或样品S不仅是完全不透过的情况，还包含只要是不妨碍本发明用途的程度、也可透过微量的处理试剂101、混合物421或样品S的情况，例如可以示例在所述条件下、重力下的处理试剂101、混合物421或样品S的透过速度低于10μL/秒。
周壁部210与载体205无论如何连接都可以，优选按照能够将周壁部210与载体205分开的方式连接。更优选如图2所示，核酸采集构件200具备具有周壁部210的样品容纳构件240、和具有载体205及保持载体205的保持部230的载体保持构件250，按照样品容纳构件240与载体保持构件250能够分开的方式连接。
这里，用于保持载体205的保持部230具备：保持载体205且形成有成为通过透过载体205的混合物421的排出流路251的起点的开口的主保持部231；自主保持部231立起、规定排出流路251周围的流路周边部232；从主保持部231的周边、在与流路周边部232存在的一侧相反的一侧立起的样品容纳构件连接部233；和从主保持部231的周边、在流路周边部232存在的一侧立起的排出物收纳容器连接部234。载体205可以固定于保持部230。图示的例子中，在主保持部231的一个面上配置载体205，样品容纳构件连接部233的主保持部231的附近部分搭在载体205的周边、将载体205把持并固定，但并不限定于该方式。另外，载体205可以按照能够与保持部230分离的方式构成。
载体保持构件250的样品容纳构件连接部233和样品容纳构件240的混合物排出口周边部213如图所示，可以按照一个嵌合在另一个上地进行连接的构成，虽未图示，也可以是一个螺合在另一个上地进行连接的构成。
图3表示图2中示出截面的、使具备周壁部210的样品容纳构件240从载体保持构件250分离的状态的立体图。图示实施方式的样品容纳构件240除了周壁部210之外，还进一步具备从周壁部210的外周面向外方向伸出的伸出部241和从伸出部241的周边向周壁部210存在处理试剂供给口204的一侧立起的防混合物漏出的壁部242。防混合物漏出的壁部242的端部2422当按照相比较于处理试剂供给口周边部211的处理试剂供给口204一侧的端部2112、位于更远离混合物排出口206的位置的方式突出而形成时，后述的防漏出效果进一步提高，因此优选。在防混合物漏出的壁部242的内周面2421上，优选形成有至少1个在周方向上延伸、向径方向内侧突出的壁面上环状突起2423。壁面上环状突起2423优选形成在防混合物漏出的壁部242的开放侧端2422附近。
核酸采集构件200在另一实施方式中，由具备周壁部210和载体205的1个构件形成(未图示)。该实施方式的核酸采集构件200中，周壁部210也可以具有与图2、图3所示相同的结构，周壁部210更优选组合有伸出部241及防混合物漏出的壁部242。
样品容纳构件240的周壁部210的处理试剂供给口周边部211中，包围处理试剂供给口204的端部2112优选是在将处理试剂收纳容器100与核酸采集构件200连接时、能够压入处理试剂收纳容器100的盖体104中将盖体104破坏、开口的部分，具体而言，所述端部优选至少一部分具有锐利的形状以能够将盖体104破坏。图示的例子中，处理试剂供给口周边部211中包围处理试剂供给口204的部分按照壁面的厚度越接近开放的端部变得越薄的方式、即变得锐利的方式构成。此外，处理试剂供给口周边部211中包围处理试剂供给口204的部分优选包含至少1个向连接处理试剂收纳容器100的一侧突出的突出部2113。突出部2113优选按照由垂直于突出方向的平面所形成的截面越接近前端变得越小的方式、即变得锐利的方式形成。图示的例子中，突出部2113仅为1个，但也可以形成多个。
处理试剂收纳容器100中，释放口周边部105和核酸采集构件200的周壁部210的处理试剂供给口周边部211如图所示，可以是一个嵌合在另一个上进行连接的构成，虽未图示，但还可以是一个螺合在另一个上进行连接的构成。释放口周边部105与处理试剂供给口周边部211通常具有能够相互嵌合或螺合的筒体的形状。更优选处理试剂收纳容器100和核酸采集构件200按照处理试剂收纳容器100的释放口周边部105的内周面1052与处理试剂供给口周边部211的外周面2111以相接的状态进行连接的方式构成。特别优选，释放口周边部105的内周面1052与处理试剂供给口周边部211的外周面2111在按照阻碍它们之间的处理试剂101、混合物421或样品S的通过、特别是混合物421的通过的方式相接的情况下，按照释放口周边部105与处理试剂供给口周边部211能够嵌合或螺合、优选嵌合的方式构成。此时，可以按照中间隔着被破坏的盖体104的一部分、释放口周边部105的内周面1052与处理试剂供给口周边部211的外周面2111相接的方式，将释放口周边部105与处理试剂供给口周边部211嵌合或螺合。
另外，释放口周边部105的内周面1052与处理试剂供给口周边部211的外周面2111并不限定于如图示的实施方式那样直接地相接，也可以是之间隔着密封材料相接。密封材料可以由橡胶等能够压缩变形的材料构成，可以固定在释放口周边部105的内周面1052上的部分及处理试剂供给口周边部211的外周面2111上的部分中的至少1个上。
核酸采集构件200具有防混合物漏出的壁部242的实施方式中，优选周壁部210的处理试剂供给口周边部211和防混合物漏出的壁部242分别具有相互间同轴地配置的筒体的形状。该实施方式中优选构成为：处理试剂供给口周边部211的外周面2111与防混合物漏出的壁部242的内周面2421的距离稍小于处理试剂收纳容器100的环状突起1053-1、1053-2的顶部距离释放口周边部105的壁部的内周面1052的距离，且环状突起1053-1、1053-2由能够压缩变形的材料构成。该材料优选具有弹性。此时，在后述的工序2中，在将处理试剂收纳容器100与核酸采集构件200连接时，释放口周边部105的外周面1051与防混合物漏出的壁部242的内周面2421对置、夹在释放口周边部105的外周面1051与防混合物漏出的壁部242的内周面2421之间的环状突起1053-1、1053-2发生压缩变形，阻碍处理试剂101、混合物421或样品S从释放口周边部105的外周面1051与防混合物漏出的壁部242的内周面2421之间通过、特别是混合物421的通过。另外，更优选的实施方式中，在将处理试剂收纳容器100与核酸采集构件200连接时，介由在释放口周边部105的外周面1051与防混合物漏出的壁部242的内周面2421之间发生压缩变形的环状突起1053-1、1053-2，释放口周边部105向处理试剂供给口周边部211靠近，阻碍处理试剂101、混合物421或样品S的通过、特别是混合物421从处理试剂供给口周边部211的外周面2111与释放口周边部105的内周面1052之间通过。此实施方式中，在释放口周边部105向处理试剂供给口周边部211靠近时，优选按照释放口周边部105的内周面1052向处理试剂供给口周边部211的外周面2111靠近的方式，用能够弹性变形的材料形成释放口周边部105。
未图示的其他实施方式中，配置于防混合物漏出的壁部242的内周面2421上的壁面上环状突起2423具有与所述环状突起1053-1、1053-2相同的功能。具体而言，是构成为释放口周边部105的外周面1051与防混合物漏出的壁部242的内周面2421之间的距离稍小于壁面上环状突起2423的顶部距离防混合物漏出的壁部242的内周面2421的距离(即高度)，且壁面上环状突起2423由能够压缩变形的材料构成的实施方式。该材料优选具有弹性。该实施方式中，与图示的方式不同，壁面上环状突起2423优选在处理试剂供给口周边部211的外周面2111与防混合物漏出的壁部242的内周面2421对置的位置上形成有1个以上。该实施方式也同样，在后述的工序2中，在将处理试剂收纳容器100与核酸采集构件200连接时，夹在释放口周边部105的外周面1051与防混合物漏出的壁部242的内周面2421之间的壁面上环状突起2423发生压缩变形，阻碍处理试剂101、混合物421或样品S从释放口周边部105的外周面1051与防混合物漏出的壁部242的内周面2421之间通过、特别是混合物421的通过。另外，介由在释放口周边部105的外周面1051与防混合物漏出的壁部242的内周面2421之间发生压缩变形的壁面上环状突起2423，释放口周边部105向处理试剂供给口周边部211靠近，阻碍处理试剂101、混合物421或样品S从处理试剂供给口周边部211的外周面2111与释放口周边部105的内周面1052之间通过、特别是混合物421的通过。此时，释放口周边部105优选由能够弹性变形的材料形成。
以下参照图4-1～4-5，说明本发明的核酸分离方法。
准备图示的排出物收纳容器400。排出物收纳容器400形成有排出物供给口401。排出物收纳容器400中，将规定排出物供给口401周边的部分作为排出物供给口周边部402。
如图4-1所示，首先将核酸采集构件200与排出物收纳容器400组合。图示的实施方式中，将核酸采集构件200的排出物收纳容器连接部234与排出物收纳容器400的排出物供给口周边部402以一个嵌合于另一个的方式进行连接。虽未图示，但也可以是按照一个可螺合在另一上进行连接的方式，分别构成排出物收纳容器连接部234和排出物供给口周边部402。
接着，进行将有可能含有核酸的样品S收纳在核酸采集构件200的收纳空间203内的工序1。
工序1之后，如图4-2所示，进行在核酸采集构件200的处理试剂供给口204上连接处理试剂收纳容器100、使处理试剂供给口204与处理试剂收纳容器100的释放口102连通的工序2。此时，密封释放口102的盖体104被包围处理试剂供给口周边部211的处理试剂供给口204的端部2112破坏，释放口102开放。图示的实施方式中，处理试剂收纳容器100的释放口周边部105和核酸采集构件200的处理试剂供给口周边部211均为筒体，释放口周边部105的内径与处理试剂供给口周边部211的外径大致相同，或者释放口周边部105的内径稍大于处理试剂供给口周边部211的外径地构成，处理试剂供给口周边部211通过嵌合或螺合连接在释放口周边部105的内部。
图示的实施方式中，核酸采集构件200进一步具有防混合物漏出的壁部242，周壁部210的处理试剂供给口周边部211与防混合物漏出的壁部242分别具有相互间同轴地配置的筒体的形状。该实施方式中，处理试剂供给口周边部211的外周面2111与防混合物漏出的壁部242的内周面2421的距离小于处理试剂收纳容器100的环状突起1053-1、1053-2的顶部自释放口周边部105的壁部内周面1052的距离地构成，且环状突起1053-1、1053-2由能够压缩变形的材料构成。此时，将处理试剂收纳容器100的释放口周边部105嵌合在核酸采集构件200的防混合物漏出的壁部242内侧，将核酸采集构件200的周壁部210的处理试剂供给口周边部211嵌合在处理试剂收纳容器100的释放口周边部105的内侧，压入至处理试剂收纳容器100的释放口周边部105的端部1054与核酸采集构件200的伸出部241相接时，在盖体104被处理试剂供给口周边部211的端部2112破坏的同时，在整个一周上，处理试剂收纳容器100的环状突起1053-1、1053-2的表面与防混合物漏出的壁部242的内周面2421可以按照混合物421不泄露的方式相接，且处理试剂供给口周边部211的外周面2111与释放口周边部105的壁部的内周面1052可以按照混合物421不泄露的方式相接。通过该构成，可以减少作业者接触样品S及含有样品S的混合物421的危险性。本实施方式中，处理试剂供给口周边部211的外周面2111与释放口周边部105的壁部的内周面1052还可以中间隔着被破坏的盖体104的一部分相接。
图示的实施方式进一步如下构成：在处理试剂收纳容器100的释放口周边部105的外周面1051上形成有至少1个环状突起1053-1、1053-2，且在防混合物漏出的壁部242的内周面2421上形成有至少1个壁面上环状突起2423，环状突起1053-1、1053-2中的1个(图示的例子中为1053-2)与壁面上环状突起2423中的1个以环状突起1053-2相比较于壁面上环状突起2423更靠近伸出部241的状态相卡合，可以防止处理试剂收纳容器100从核酸采集构件200上脱落。具体而言如下构成：在防混合物漏出的壁部242上形成有壁面上环状突起2423，且将处理试剂收纳容器100和核酸采集构件200压入至如上那样处理试剂收纳容器100的释放口周边部105端部1054与核酸采集构件200的伸出部241相接地进行连接时，作为环状突起中1个的环状突起1053-2与壁面上环状突起2423以环状突起1053-2相比较于壁面上环状突起2423更靠近伸出部2423的状态相卡合，可以防止处理试剂收纳容器100从核酸采集构件200上脱落。通过该构成，可以进一步降低作业者接触样品S及含有样品S的混合物421的危险性。
未图示的另一实施方式还可以如下构成：释放口周边部105由具有弹性的材料构成，处理试剂供给口周边部211的外周面2111与释放口周边部105的壁部的内周面1052可以在整个一周上按照混合物421不泄露的方式相接。此时，处理试剂供给口周边部211的外周面2111与释放口周边部105的壁部的内周面1052还可以中间隔着被破坏的盖体104的一部分相接。此实施方式中，还可以省略处理试剂收纳容器100的环状突起1053-1、1053-2。
工序2中，处理试剂收纳容器100的容器内空间110与核酸采集构件200的收纳空间203成为一体，形成混合用空间420。
接着，工序3中，在工序2中形成的混合用空间420内，样品S与处理试剂101混合，形成混合物，混合物内、样品S中可以含有的核酸发生游离。使样品S与处理试剂101的混合物作为混合物421。通过工序2中的处理试剂收纳容器100与核酸采集构件200的连接，成为以下构成：混合用空间420内的气压虽然有时会稍高于排出物收纳容器400内的气压，但核酸采集构件200中包含的载体205在不使压送部103工作的条件、即不使容器内空间110及混合用空间420的体积减少的条件下，在重力下实质上不会透过混合用空间420内的混合物421。更优选如后所述，工序3中即便是在混合用空间420内对混合物421进行振荡混合时，载体205也实质上不会透过混合物421。这里，载体205“实质上不透过”混合物421不仅包括完全不透过的情况，还包含只要是不妨碍本发明用途的程度、则也可透过微量的混合物421的情况，例如可以举出混合物421的透过速度小于10μL/秒。由于核酸的不充分溶解析出，优选用手对以图4-2所示状态连接有处理试剂收纳容器100、核酸采集构件200和排出物收纳容器400的整体充分地进行振荡混合等，在混合用空间420内将混合物421充分地搅拌。工序3可以在室温(20～30℃左右)下进行，优选混合后静置数分钟、例如3～7分钟，促进核酸的游离。
接着进行工序4。工序4如图4-3所示是下述工序，通过使处理试剂收纳容器100的压送部103工作、即通过减小容器内空间110及混合用空间420的体积，对含有已在工序3中游离的核酸的混合物421进行压送，介由载体205将载体205从核酸采集构件200的混合物排出口206排出。排出物收纳容器400与核酸采集构件200并非完全气密地连接，排出物收纳容器400内的空间也可以与周边大气连接。通过使压送部103工作(图示的例子中，使蛇腹结构的压缩部103压缩变形、减少容器内空间110及混合用空间420的体积)、混合用空间420内的气压提高时，混合物421透过载体205、通过排出流路251从混合物排出口206排出至排出物收纳容器400内。此时，游离存在于混合物421中的核酸被载体205吸附、混合物421的其他成分被排出、到达排出物收纳容器400。图4-3中，将工序4结束后的载体205特别地记为载体205’、工序4结束后被排出的混合物421特别地记为混合物421’。
适当地进行对通过工序4吸附在载体205’上的核酸进行回收的工序。核酸的回收方法并无特别限定。
典型地，在工序4后进行使用洗涤液洗涤载体205’，将除核酸以外的不需要成分从载体中除去的工序5。将用于进行工序5的装置构成之一例示于图4-4中。从图4-3所示的工序4结束后的装置中取下处理试剂收纳容器100及样品容纳构件240，保留载体保持构件250及排出物收纳容器400。接着，如图4-4所示，介由连接构件450将洗涤液收纳容器440适当地连接于载体保持构件250。洗涤液收纳容器440只要是收纳有洗涤液443的容器，则无特别限定，优选具备压送部441、内部形成洗涤液443的排出流路的洗涤液排出头部442。压送部441的具体形态或其他形态与上文有关处理试剂收纳容器100的压送部103记载的内容相同。连接构件450具备形成有与洗涤液排出头部442相适合的形状的贯通孔的连接构件主体451和连接构件连接部452。洗涤液排出头部442与连接构件主体451的贯通孔可以是一个嵌合于另一个进行连接的构成，也可以是一个螺合于另一个进行连接的构成。连接构件连接部452与载体保持构件250的样品容纳构件连接部233可以是一个嵌合于另一个进行连接的构成，也可以是一个螺合于另一个进行连接的构成。工序5中，如图4-4所示，以介由连接构件450将洗涤液收纳容器440与载体保持构件250连接的状态，使压送部441工作，对洗涤液443进行压送，使其透过载体205’，将除核酸以外的不需要成分除去。被排出的液体与洗涤液收纳容器440内工序4中的混合物421’混合，作为废弃物进行废弃处理。工序5中将洗涤除去了不需要成分的、含有核酸的载体特别地记为载体205”。
工序5之后，优选进行使用于洗脱核酸的洗脱液与载体接触、从载体中将核酸洗脱的工序6。将用于进行工序6的装置的构成之一例示于图4-5。使用图4-4所示的装置进行工序5之后，将排出物收纳容器400和洗涤液收纳容器440取下，保留含有载体205”的载体保持构件250及连接构件450。接着，将核酸回收容器470配置在载体保持构件250的排出流路251的下游。进而，在连接构件450上设置洗脱液收纳容器460。这里，洗脱液收纳容器460只要是收纳有洗脱液463的容器则无特别限定，优选具备压送部461、内部形成洗脱液463的排出流路的洗脱液排出头部462。压送部461的具体形态或其他形态与上文有关处理试剂收纳容器100的压送部103记载的内容相同。形成于连接构件450的连接构件主体451的贯通孔构成为也适于洗脱液排出头部462的形状。洗脱液排出头部462与连接构件主体451的贯通孔可以是一个嵌合于另一个进行连接的构成，也可以是一个螺合于另一个进行连接的构成。工序6中，如图4-5所示，以介由连接构件450将洗脱液收纳容器460与载体保持构件250连接的状态，使压送部461工作，对洗脱液463进行压送，使其透过载体205”，将被载体205”吸附的核酸洗脱。将被排出的含核酸液收纳在核酸回收容器470中，可作为来自样品S的核酸提取物用于分析。
通过工序6回收的含核酸液优选含有经精制的核酸。核酸的精制表示将样品中含有的核酸从除核酸以外的夹杂物中分离精制，作为精制度的标准，是使用经精制的核酸、能够没有问题地实施PCR或等温核酸扩增法等核酸扩增法、限制酶处理、克隆、碱基序列解析、Southern杂交、Northern杂交、杂交捕获法、线性探针分析、微阵列解析、电泳、质谱分析、荧光染色、色素染色、利用了天然型或非天然型核酸链之间的互补结合的解析等分子生物学解析的程度。
<用于分离核酸的装置>
本发明还提供从含有核酸的样品中分离核酸的装置。
本发明的装置优选具备有关上述方法详述的处理试剂收纳容器100和核酸采集构件200。本发明的装置由于含有多个构成要素，因此也可以称为“试剂盒”。
本发明的装置更优选进一步具备有关上述方法详述的洗涤液收纳容器440和/或洗脱液收纳容器460。
本发明的装置还可以根据需要进一步含有有关上述方法详述的、选自排出物收纳容器400、连接构件450及核酸回收容器470中的1个以上。
本发明的装置或本发明的装置中含有的各要素也可组装在核酸制备装置、核酸扩增装置、核酸自动解析装置等构成要素的一部分中。
<处理试剂>
使样品中的核酸游离的处理试剂含有使核酸游离的成分，优选进一步含有选自降低微生物感染性的成分及促进核酸在载体上的吸附的成分中的1种以上。处理试剂作为所述成分、或作为除所述成分以外的成分，可以含有水或有机溶剂等液体介质。
处理试剂在图1～4-4所示的实施方式中为液体，但并不限定于液体，也可以是固体。例如，在图5所示的处理试剂收纳容器100的实施方式中，处理试剂101是粉体、颗粒等固体，其他特征与图1所示的处理试剂收纳容器100是同样的。
优选处理试剂及样品中的至少1个含有液体、混合处理试剂和样品所形成的混合物为液体。例如，样品为尿、血液、饮料、河水、海水等液体时，处理试剂即便是粉体、颗粒等固体，混合物也变为液体，样品为固体或痰、鼻涕等接近固体的性状时，通过使用液体作为处理试剂，可以将混合物制成液体。
降低微生物感染性的成分是能够减少样品中可能含有的感染性微生物感染性的成分，一般来说可以作为灭菌剂、消毒剂进行使用。作为降低微生物感染性的成分，例如可以举出选自有机溶剂、醛系消毒剂、碘剂、氯剂、过乙酸、臭氧、过氧化氢、红汞、乳酸6,9-二氨基-2-乙氧基吖啶、表面活性剂及碱性物质中的至少1种成分，但并不限定于此。例如，作为降低微生物感染性的成分，可以举出选自有机溶剂、戊二醛、phtharal、过乙酸、聚维酮碘、次氯酸钠、苯扎氯铵及表面活性剂中的至少1种成分(称为“第1组成分”)，但并不限定于此。另外，作为降低微生物感染性的成分的其他例子，可以示例选自上述有机溶剂、醛系消毒剂、碘剂、氯剂、过乙酸、臭氧、过氧化氢、红汞、乳酸6,9-二氨基-2-乙氧基吖啶、表面活性剂及碱性物质中的至少1种成分中，除了所述第1组成分之外的其他成分，更具体而言可以举出臭氧、过氧化氢、二氧化氯、红汞、葡萄糖酸氯己定、乳酸6,9-二氨基-2-乙氧基吖啶、氯化十六烷基吡啶、甲醛及碱性物质中的至少1种成分(称为“第2组成分”)，但并不限定于此。乳酸6,9-二氨基-2-乙氧基吖啶可以添加一水合物形态的化合物。
作为有机溶剂，可以示例甲醇、乙醇、异丙醇等醇，苯酚、甲酚等苯酚类等，还可以是混合有多种有机溶剂的混合溶剂。作为醛系消毒剂，可以示例戊二醛、phtharal及甲醛中的1个以上。作为碘剂，可以示例聚维酮碘。作为氯剂，可以示例选自次氯酸盐及二氧化氯中的1个以上，这里，作为次氯酸盐可以示例次氯酸钠。作为表面活性剂，可以示例选自阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性离子性表面活性剂及非离子性表面活性剂中的至少1种。作为阳离子性表面活性剂(转化皂，invert soap)，可以示例选自苯扎氯铵及氯化十六烷基吡啶中的至少1种。作为两性离子性表面活性剂(两性皂)，可以示例葡萄糖酸氯己定。作为碱性物质，除了氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化钙、四甲基氢氧化铵、氨、三甲基胺等碱性物质之外，可以示例碳酸钠等显示碱性的盐类。本发明中使用的处理试剂中的降低微生物感染性的成分的量可以是能够降低样品中可含有的微生物感染性的有效量。降低微生物感染性的成分在处理试剂中的浓度及量随各成分不同而最佳点不同，但只要是本领域技术人员，则可以容易地确定最佳值。
本发明中，核酸的“游离”是指成为载体能够将存在于样品中的分离对象的核酸吸附的状态，例如在样品中，核酸以含有在细胞或病毒等生物体膜内的状态存在时，是指将生物体膜破坏、使核酸游离至生物体膜外、成为载体能够吸附的状态。
作为使核酸游离的成分，可以利用具有将样品中包含核酸的膜(细胞或病毒具有的生物体膜等)可溶化的效力的成分，可以示例选自碱性物质及表面活性剂中的至少1种。本发明中所用处理试剂中的使核酸游离的成分的量可以是能够使样品中可含有的核酸游离的有效量。
碱性物质是降低微生物感染性的成分、同时也是使核酸游离的成分。作为使核酸游离的成分有用的碱性物质可以从与作为降低微生物感染性的成分有用的碱性物质所列举的具体例相同的范围中进行选择。
作为表面活性剂，可以示例选自阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性离子性表面活性剂及非离子性表面活性剂中的至少1种。表面活性剂是降低微生物感染性的成分、同时也是使核酸游离的成分。作为使核酸游离的成分有用的表面活性剂可以从与作为降低微生物感染性的成分有用的表面活性剂所列举的具体例相同的范围中进行选择。
作为促进核酸在载体上的吸附的成分，可以示例有机溶剂或促溶剂。
作为促进核酸在载体上的吸附的成分有用的有机溶剂，可以示例甲醇、乙醇、异丙醇等醇，苯酚、氯仿，还可以是混合有多种有机溶剂的混合溶剂。作为促溶剂，可以示例选自胍盐(例如选自异硫代氰酸胍、硫代氰酸胍、胍盐酸盐等中的1种以上)、尿素、碘化钠、碘化钾、溴化钠、溴化钾、溴化钙、溴化铵、过氯酸钠、氰酸钠、氰酸钾、硫代氰酸钠、过氯酸钠、三氯乙酸钠及三氟乙酸钠中的至少1种，更优选是选自胍塩、尿素及碘化钠中的1种，最优选胍塩。这些促溶剂可以单独使用，也可以组合使用。另外，促溶剂不仅促进核酸在核酸吸附性载体上的吸附，还作为蛋白改性剂发挥作用，对核酸的提取也起到作用。促进核酸在载体上的吸附的成分的量只要是对于促进核酸在载体上的吸附为充分量即可，本领域技术人员可以容易地确定最佳值，作为一例，若促进核酸在载体上的吸附的成分为有机溶剂，则相对于处理试剂的总量为20重量％以上、优选为40重量％以上的量，若促进核酸在载体上的吸附的成分为促溶剂，则为与样品混合时的混合物中的终浓度达到0.1M以上、更优选0.5M以上、进一步优选1M以上的量。
本发明中使用的处理试剂为了兼具降低样品可含有的病原性微生物的感染性、且使样品中的核酸游离、且使核酸吸附在核酸吸附性载体上这3种效力，优选组合使用多个所述成分。另外，也有1种物质具有多种功能的情况。例如，醇等有机溶剂兼具作为降低微生物感染性的成分的功能和作为促进核酸在载体上的吸附的成分的功能。还可以将具有多种功能的成分配合在处理试剂中。
本发明中使用的处理试剂优选含有降低微生物感染性的成分、和使核酸游离的成分。关于各成分，如上所述。作为降低微生物感染性的成分和使核酸游离的成分，并不必要为分别不同的物质，可以使用1种以上作为2个成分发挥功能的物质。碱性物质及表面活性剂如上所述，是降低微生物感染性且使核酸游离的成分。因而，本发明中使用的处理试剂作为降低微生物感染性且使核酸游离的成分，可以含有选自碱性物质及表面活性剂中的至少1种，更优选除了所述至少1种以外、还进一步含有降低微生物感染性的成分。本发明所用处理试剂中的选自碱性物质及表面活性剂中的至少1种的量可以是能够降低微生物感染性且能够使核酸游离的有效量。具体而言，作为碱性物质的浓度，相对于处理试剂总量优选为0.1重量％以上、更优选大于2重量％、进一步优选为3重量％以上、更进一步优选为4重量％以上。上限并无特别限定，优选为20重量％以下、更优选为10重量％以下。作为表面活性剂的浓度，可以举出相对于处理试剂总量，优选为0.05重量％以上、更优选为0.1重量％以上，优选为5重量％以下、更优选为2重量％以下。
本发明中使用的处理试剂不需要作为一体的成分收纳在处理试剂收纳容器100的容器内空间110中，也可以作为多个分离的成分进行收纳。此时，容器内空间110被分割成多个区域，可以将1种以上的处理试剂收纳在各区域中。例如，在图6所示的处理试剂收纳容器100的实施方式中，在释放口周边部105的释放口102侧的一端和与压送部103连接那侧的一端之间的位置上设置隔壁600，隔壁600将释放口附近空间112划分成释放口附近空间释放口侧部分112(1)和释放口附近空间压送部侧部分112(2)，由此可以将容器内空间110分割成释放口附近空间释放口侧部分112(1)和压送部内部空间111及释放口附近空间压送部侧部分112(2)成为一体的空间。该实施方式中，处理试剂含有第1处理试剂101(1)和第2处理试剂101(2)，第1处理试剂101(1)收纳在释放口附近空间释放口侧部分112(1)中，第2处理试剂101(2)收纳在压送部内部空间111及释放口附近空间压送部侧部分112(2)成为一体的空间中。图6所示的实施方式中，第1处理试剂101(1)为粉体、颗粒等固体，第2处理试剂101(2)为液体，但并不限定于此，例如可以是第1处理试剂101(1)和第2处理试剂101(2)同为固体，也可以同为液体。另外，处理试剂可以由3种以上的成分构成，此时各成分可以采用液体、固体等任意形状。划分容器内空间110的隔壁600与盖体104同样，在将处理试剂收纳容器100与核酸采集构件200的处理试剂供给口204连接时，按照不被破坏的方式构成。隔壁600与盖体104同样，可以由含有合成树脂的膜或者铝膜等金属膜构成，还可以是层叠了多种膜者。隔壁600可以通过粘接剂或者利用热或超声波进行的熔融粘合等手段适当固着在释放口周边部105的内周面1052上进行固定。
作为本发明中使用的处理试剂中的成分的优选组合，可以举出醇和碱性物质的组合，为了增强所述的3种效力，还可以追加选自促溶剂、表面活性剂及消毒剂中的至少1种成分或者所述还原剂。还可以进一步含有水等液体介质。作为醇，优选选自甲醇、乙醇及异丙醇中的至少1种，作为碱性物质，优选选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡及氢氧化钙中的至少1种。更优选为乙醇与氢氧化钠的组合。本发明中使用的处理试剂含有醇和碱性物质时，本领域技术人员可以适当地确定各自的浓度，作为一例，作为醇的浓度，相对于处理试剂总量优选为20重量％以上、更优选为40重量％以上，上限并无特别限定，优选为99重量％以下、更优选为80重量％以下。这些醇的浓度在处理试剂为液体时，特别优选。作为碱性物质的浓度，相对于处理试剂总量优选为0.1重量％以上、更优选为2重量％以上。上限并无特别限定，优选为20重量％以下、更优选为10重量％以下。这些碱性物质的浓度在处理试剂为液体时，特别优选。
本发明中使用的处理试剂含有促溶剂时，促溶剂的量是在与样品混合时的终浓度达到0.1M以上、更优选达到0.5M以上的量。促溶剂的终浓度上限并无特别限定，优选是达到10M以下、更优选是达到5M以下的量。
样品为痰等含有通过S-S键交联的成分的粘性高的样品时，优选在处理试剂中配合还原剂、优选硫醇系还原剂、特别优选N-乙酰基-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸乙酯、L-半胱氨酸甲酯、N-乙基-L-半胱氨酸、N-甲基-L-半胱氨酸等半胱氨酸系还原剂，切断样品中的S-S键、提高流动性。如上所述，这些还原剂可以是盐的形态。作为处理试剂中的还原剂的浓度，优选为0.5重量％以上、更优选为2重量％以上。上限并无特别限定，优选为15重量％以下、更优选为10重量％以下。这些还原剂的浓度在处理试剂为液体时特别优选。
<核酸>
本发明的核酸可示例DNA或RNA等脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物。核酸的起源并无特别限定，可以是来自于真核生物、细菌、古生菌(archaeon)、病毒、类病毒、人工合成物等核酸。
<含有核酸的样品>
本发明中能够使用的样品只要是含有核酸的样品(还包含具有含有核酸的可能性的样品)则无特别限定。作为含有核酸的样品，例如可以举出生物体试样、饮食物、河水、海水等。生物体试样可以来自于人等动物，还可以来自于植物，还可以来自于微生物。作为生物体试样，可以举出血液、尿、粪便、痰、唾液、鼻涕、擦拭液等。
本发明特别是对于含有感染性微生物的样品(还包含具有含有感染性微生物的可能性的样品)可以优选地使用。感染性微生物有可能成为感染病的原因。作为这种样品，可以举出来自于患有感染病或者有患病可能性的动植物的生物体试样、被感染性微生物污染或者有被污染可能性的饮食物、河水或海水等。
本发明中待分离的样品中的核酸并不限定于来自于样品中的感染性微生物的核酸，还可以是来自于样品中的其他细胞、例如人细胞或其他动物细胞的核酸。
<感染性微生物>
本发明中的感染性微生物是指具有感染其他生物、在宿主中引起感染病的性质或能力的微生物，例如可以举出梅毒螺旋体或包柔氏螺旋体等螺旋体、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、抗酸杆菌(结核杆菌等)、破伤风菌、大肠杆菌等病原性细菌、病原性真菌等。作为感染性微生物，还可以进一步示例流感病毒、腺病毒、疱疹病毒、肝炎病毒、HIV病毒、日本脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒等病毒。也就是说，本说明书中“微生物”这一用语的范围也包含病毒。
<吸附核酸的载体>
本发明中吸附核酸的载体(以下有时也称作“核酸吸附性载体”)是指在处理试剂与样品的混合物的存在下，能够将游离的核酸吸附的核酸吸附性载体。
作为载体，示例二氧化硅等无机核酸吸附性载体、树脂、不溶性多糖等有机核酸吸附性载体，但并不限定于此。这些核酸吸附性载体可以是粉末状、纤维状、多孔质状，还可以带有磁性，还可以进行任意的修饰。核酸吸附性载体可以使用成形为柱状、膜状等形状者。膜状的核酸吸附性载体的厚度并无特别限定，优选为1.0mm～1.5mm。膜状的核酸吸附性载体的俯视形状并无特别限定，优选是直径为1mm～10mm的圆形。作为多孔质状的核酸吸附性载体，例如可以示例单块结构(monolithic structure)的多孔质载体，特别优选为单块型二氧化硅。作为单块型二氧化硅，优选由扫描型电子显微镜(SEM)照片求得的贯通孔直径的平均值为5～50μm、特别优选为5～40μm范围的单块型二氧化硅。
核酸吸附性载体如有关载体205所详述的那样，优选是在由核酸吸附性载体划分的2个空间没有实质性气压差的条件下，在重力下实质上不透过配置于核酸吸附性载体的所述2个空间的一侧的处理试剂101、混合物421或样品S的形态者。“实质上不透过”的意思如有关载体205所详述的那样。
<洗涤液>
本发明中使用的洗涤液只要是能够将吸附有核酸的核酸吸附性载体中残存的可溶化试剂或试样来源的夹杂物洗净即可，可示例核酸不溶解的有机溶剂或水溶性高分子溶液、糖水溶液，但并不限定于此。
作为能够作为洗涤液使用的有机溶剂，可以举出乙醇、异丙醇、丙酮等。作为有机溶剂使用水溶性有机溶剂时，可以使用有机溶剂的水溶液，其浓度可以由本领域技术人员容易地确定最佳值，但作为一例可以举出20～100重量％、优选为30～90重量％、更优选为40％～80重量％。
<洗脱液>
本发明中使用的洗脱液只要是能够将吸附于核酸吸附性载体的核酸洗脱的液体，则无特别限定。作为洗脱液，可以举出水、Tris盐酸缓冲液等缓冲液等。洗脱液中只要不阻碍作为洗脱液的功能、且不阻碍PCR反应，则可以含有pH缓冲性成分、盐等成分。
<构成本发明装置的各要素的材料>
构成本发明装置的各要素的材料可以使用一般来说可以用于对液体进行保存的容器的材料，并无特别限定，例如可以举出聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氯乙烯、Teflon(注册商标)、丙烯腈丁二烯苯乙烯、丙烯酸等合成树脂。另外，还可以是玻璃或金属等一般来说用于对液体进行保存的容器的材料。其中，还可以组合多个进行使用。从经济性的观点出发，优选合成树脂。
<本发明处理试剂的优选实施方式>
用于使痰等含有通过S-S键交联的成分的样品中的核酸游离的处理试剂的优选实施方式是除了含有降低微生物感染性的所述成分及使核酸游离的所述成分之外、还含有硫醇系还原剂的处理试剂。本实施方式的处理试剂由于可以使痰等含有通过S-S键交联的成分的样品中的核酸游离、使其吸附于含有二氧化硅的载体，因此可以特别优选地使用。作为硫醇系还原剂，优选N-乙酰基-L-半胱氨酸。本实施方式的处理试剂中的硫醇系还原剂的浓度如上所述。处理试剂优选是降低微生物感染性的所述成分、使核酸游离的所述成分和硫醇系还原剂溶解在水中而成的水溶液。作为降低微生物感染性的所述成分及使核酸游离的所述成分，可以使用降低微生物感染性且使核酸游离的成分。处理试剂更优选是相对于处理试剂总量含有0.5重量％以上的硫醇系还原剂的水溶液，该浓度的更优选范围如上所述。本实施方式的处理试剂还可以进一步含有上述其他成分。作为其他成分优选促溶剂，促溶剂的量优选是与样品混合时的终浓度达到上述范围的量。
本实施方式的处理试剂更优选含有碱性物质和硫醇系还原剂，特别优选进一步含有醇。本实施方式的处理试剂由于可以使痰等含有通过S-S键交联的成分的样品中的核酸游离、使其吸附于含有二氧化硅的载体，因此可以特别优选地使用。各成分的具体例子如上所述，特别是作为碱性物质优选氢氧化钠，作为硫醇系还原剂优选N-乙酰基-L-半胱氨酸，作为醇优选乙醇。本实施方式的处理试剂中，硫醇系还原剂的浓度如上所述。本实施方式的处理试剂中，作为碱性物质的浓度，相对于处理试剂总量优选为0.1重量％以上、更优选大于2重量％、进一步优选为3重量％以上、更进一步优选为4重量％以上。上限并无特别限定，优选为20重量％以下、更优选为10重量％以下。这些碱性物质的浓度在处理试剂为液体时特别优选。本实施方式的处理试剂进一步含有醇时，作为醇的浓度，相对于处理试剂总量优选为20重量％以上、更优选为40重量％以上，上限并无特别限定，优选为99重量％以下、更优选为80重量％以下。这些醇的浓度在处理试剂为液体时特别优选。本实施方式的处理试剂更优选为相对于处理试剂总量含有0.1重量％以上的碱性物质及0.5重量％以上的硫醇系还原剂的水溶液，更优选为相对于处理试剂总量含有20重量％以上的醇的水溶液。各成分的浓度的更优选范围如上所述。本实施方式的处理试剂还可以进一步含有上述其他的成分。作为其他的成分，优选促溶剂，促溶剂的量优选是在与样品混合时的终浓度达到上述范围的量。
含有降低微生物感染性的所述成分、使核酸游离的所述成分和硫醇系还原剂的本实施方式的处理试剂可以同时发挥以下4个效果：(1)降低痰等含有通过S-S键交联的成分的粘性高的样品的粘性；(2)促进核酸在二氧化硅上的吸附；(3)杀菌；(4)从样品中的微生物或其他细胞(例如样品中的人体细胞)提取核酸。因此，本实施方式的处理试剂在从痰等粘性高的样品中分离来自于微生物或其他细胞的核酸时，仅使混合本实施方式的处理试剂和样品所形成的混合物与含有二氧化硅的载体接触即可，操作简单。使用本实施方式的处理试剂时，不需要进行与用于降低样品粘性的前处理和提取核酸的处理另外的工序。另外，在使游离在所述混合物中的核酸吸附在二氧化硅上进行回收的方法中，由于通过在二氧化硅上的吸附、核酸浓缩，因此核酸的回收效率高。作为从含有核酸和杂质的试样中回收核酸的方法，一直以来已知使含有核酸和杂质的试样通过沸石、使杂质吸附在沸石上而除去、将通过沸石的核酸回收的方法，但该方法中由于核酸未被浓缩，因此核酸的回收效率低。另外，一直以来，作为降低痰样品的粘性的样品处理方法，已知NALC(N-乙酰基-L-半胱氨酸)-NaOH法，但NALC-NaOH法由于是用于将处理后的样品用于培养试验或涂抹试验的方法，因此没有发挥上述(3)和(4)的效果。一直以来，对痰等粘性高的样品中的微生物进行核酸检查的方法包含通过NALC-NaOH法降低样品粘度的工序和利用加热提取等对样品中的核酸进行提取的工序，操作非常复杂。
另外，使利用本实施方式的处理试剂处理样品、使该样品中的核酸游离而得到的混合物与核酸吸附性载体接触，使核酸吸附在所述载体上进行回收的方法具有使核酸浓缩的效果、核酸的回收效率高。这方法特别在从核酸浓度(菌浓度)低的样品进行核酸提取中发挥效果，从基于以往方法(使用沸石的方法及NALC-NaOH法)的前处理中利用核酸扩增法无法检测的样品中，也可将能够检测的浓度的核酸浓缩、进行提取回收。另外，使核酸吸附在所述载体上进行回收的方法中，可以使核酸吸附在所述载体之后，使用不溶解析出核酸的物质对所述载体进行洗涤，此时可以将除核酸以外的杂质除去。已知除核酸以外的杂质、例如蛋白或脂质、多糖类等会对核酸扩增反应造成不良影响，特别是还考虑在样品中的扩增对象的核酸为微量时由于扩增抑制、停留在检测敏感度以下的扩增量的情况。因而，通过除去杂质，可以提高核酸扩增法的检测能力。
<本发明的核酸分离方法的优选实施方式>
本发明的另一实施方式涉及从含有核酸且含有通过S-S键交联的成分的样品中分离核酸的方法，其包含：在含有降低微生物感染性的所述成分、使核酸游离的所述成分及硫醇系还原剂的处理试剂与所述样品的混合物的存在下，使从所述样品游离的核酸吸附在载体上。
作为降低微生物感染性的所述成分及使核酸游离的所述成分，还可以使用降低微生物的感染性且使核酸游离的成分。
痰等含有通过S-S键交联的成分的样品通常粘性高、流动性低，但通过将含有硫醇系还原剂的所述处理试剂与所述样品混合，可以提高流动性。另外，所述处理试剂与所述样品的混合物中，通过降低样品的感染性、促进核酸的游离、使所述混合物与载体接触，使从所述混合物中的所述样品游离的核酸吸附在载体上。
本实施方式的方法中，如上所述由于在所述混合物中从样品游离的核酸被所述载体吸附而浓缩，因此核酸的回收效率高，还可以从以往方法中核酸浓度低、无法回收核酸的样品中将核酸回收。
所述混合物为了使核酸从所述样品充分地游离，优选混合后经过数分钟、例如3～7分钟后，使其与所述载体接触。所述混合物与所述载体的接触可以在室温、例如20～30℃的温度条件下进行。
本实施方式的方法中，载体优选含有二氧化硅。含有二氧化硅的载体的具体形态如上述<吸附核酸的载体>部分中所记载的那样。由于含有二氧化硅的载体的通液性较高，因此在手工操作时能够产生的小压力差作用下可容易地使所述混合物透过。因此，可以一边使所述混合物与所述载体接触、一边通过手工操作使其通液。
本实施方式的方法中，使核酸吸附在所述载体之后、从所述载体回收核酸的方法并无特别限定。例如，可以使核酸吸附在所述载体上之后，利用洗涤液对吸附有核酸的所述载体进行洗涤，之后，使将核酸洗脱的洗脱液与所述载体接触，使核酸从所述载体溶解析出进行回收。对于所述洗涤液及所述洗脱液的具体方式而言，如上述<洗涤液>部分及<洗脱液>部分中所记载的那样。
本实施方式的方法中使用的、有关含有降低微生物感染性的所述成分、使核酸游离的所述成分及硫醇系还原剂的处理试剂的具体方式，如上所述。该处理试剂更优选含有醇、碱性物质和硫醇系还原剂。
本实施方式的方法包含以下两者：使用本发明装置包含形态的所述载体、将核酸从所述样品中分离的方法；使用本发明装置不包含的形态的所述载体、将核酸从所述样品中分离的方法。这里，“本发明的装置”是指本申请权利要求书及说明书所记载的下述装置或其优选实施方式，
“一种装置，其为通过使含有核酸的样品与使样品中的核酸游离的处理试剂的混合物与吸附核酸的载体接触，从含有核酸的样品中将核酸分离的装置，其具备处理试剂收纳容器和核酸采集构件，
所述处理试剂收纳容器将使样品中的核酸游离的处理试剂收纳在容器内空间，具有释放所述处理试剂的释放口且按照容器内空间的体积能够减少的方式构成；
所述核酸采集构件形成有用于收纳样品的收纳空间，在所述收纳空间的一侧形成有按照能够供给处理试剂的方式与所述处理试剂收纳容器连接的处理试剂供给口，在所述收纳空间的另一侧形成有介由在透过所述混合物的同时将所述混合物中游离的核酸吸附的载体将所述混合物排出的混合物排出口，
所述处理试剂收纳容器的释放口安装有对所述释放口进行密封的盖体，
所述核酸采集构件按照在将所述处理试剂收纳容器与所述核酸采集构件的处理试剂供给口连接时、由所述盖体密封的所述释放口开放、将所述释放口与所述处理试剂供给口连通的方式构成”。
实施例
以下通过实施例具体地说明本发明。但本发明并不限定于这些实施例。
[实施例1]
使用图示的处理试剂收纳容器100、核酸采集构件200、排出物收纳容器400、洗涤液收纳容器440、连接构件450、洗脱液收纳容器460和核酸回收容器470进行以下的操作。核酸采集构件200如图2所示组合有样品容纳构件240和载体保持构件250。载体保持构件250作为载体205具备由圆形、膜状的二氧化硅单块形成的、具有核酸吸附能力的载体(膜厚为1.5mm、口径为4mm、贯通孔直径为30～40μm(测定方法：由扫描型电子显微镜图像求出的平均值))。其中，作为洗脱液收纳容器460，与图4-5所示的方式不同，压送部461使用了由通过挤压能够变形、从而使压送部内部空间111及容器内空间110的体积减少的袋体形成的容器。
(核酸的提取)
如图4-1所示，将核酸采集构件200与排出物收纳容器400连接，使作为抗酸杆菌一种的包皮垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis，M.smegmatis)的培养液(1.0×106CFU/mL)作为样品S，将样品3mL投入核酸采集构件200的收纳空间203中。接着，如图4-2所示，将作为处理试剂101密封有含5重量％的氢氧化钠和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳容器100与核酸采集构件200连接。接着，将样品S与处理试剂101的混合物421在混合用空间420内通过上下振荡混合整个装置10次进行混合，然后在室温条件下静置5分钟。
如图4-3所示，挤压处理试剂收纳容器100的蛇腹结构的压送部103，使混合物421通液至载体205。将吸附有核酸的未洗涤的载体205记为载体205’。将处理试剂收纳容器100和核酸采集构件200的样品容纳构件240同时取下。接着，如图4-4所示，将作为洗涤液443密封有40重量％乙醇水溶液15mL的洗涤液收纳容器440介由连接构件450与载体保持构件250连接。进而，挤压洗涤液收纳容器440的蛇腹结构的压送部441，使洗涤液443通液至载体205’。之后，待压送部441恢复至原来的形状，再次挤压压送部441，使洗涤液收纳容器440内的空气通气至载体205’。将吸附有核酸的洗涤后的载体205记为载体205”。取下洗涤液收纳容器440，如图4-5所示，将作为洗脱液463密封有水的洗脱液收纳容器460介由连接构件450与载体保持构件250连接，同时取下排出物收纳容器400，将核酸回收容器470连接于载体保持构件250。进而，挤压构成洗脱液收纳容器460的压送部461的所述袋体，使洗脱液463通液至载体205”，回收到核酸回收容器470内。采集10μL透过载体205”的洗脱液463，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例2]
除了作为样品S使用M.smegmatis的培养液(1.0×104CFU/mL)之外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例3]
除了作为样品S使用M.smegmatis的培养液(1.0×102CFU/mL)之外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例4]
除了作为洗涤液443使用密封有60重量％乙醇水溶液15mL的洗涤液收纳容器440之外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例5]
除了作为洗涤液443使用密封有20重量％乙醇水溶液15mL的洗涤液收纳容器440之外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例6]
除了作为处理试剂101使用密封有5重量％的氢氧化钠和60重量％的乙醇的水溶液3mL的处理试剂收纳容器100之外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例7]
除了作为处理试剂101使用密封有5重量％的氢氧化钠和60重量％的乙醇的水溶液15mL的处理试剂收纳容器100之外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例8]
作为处理试剂101，使用密封有5重量％的氢氧化钠、30重量％的碘化钠(与样品混合时的终浓度约为1.3M)和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳容器100，除此之外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例9]
作为处理试剂101，使用密封有5重量％的氢氧化钠、20重量％的碘化钠(与样品混合时的终浓度约为0.8M)和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳容器100，除此之外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例10]
作为处理试剂101，使用密封有5重量％的氢氧化钠、20重量％的尿素(与样品混合时的终浓度约为2.1M)和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳容器100，除此之外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例11]
作为由圆形、膜状的二氧化硅单块形成的、具有核酸吸附能力的载体，使用膜厚为1.0mm、口径为4mm、贯通孔直径为30～40μm(测定方法：由扫描型电子显微镜图像算出的平均值)者，除此之外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例12]
作为由圆形、膜状的二氧化硅单块形成的、具有核酸吸附能力的载体，使用膜厚为1.5mm、口径为10mm、贯通孔直径为30～40μm(测定方法：由扫描型电子显微镜图像算出的平均值)者，除此之外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例13]
作为由圆形、膜状的二氧化硅单块形成的、具有核酸吸附能力的载体，使用膜厚为1.0mm、口径为4mm、贯通孔直径为5～10μm(测定方法：由扫描型电子显微镜图像算出的平均值)者，除此之外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
实施例1～13中，用于检测M.smegmatis的核酸的实时PCR用引物使用正向引物/5’-ACATGCAAGTCGAACGGAAA-3’)(序列号1)、反向引物/(5’-CCCACCAACAAGCTGATAGG-3’)(序列号2)。实时PCR试剂使用Takara-bio公司制聚合酶TAKARA TaqHS，按照终浓度达到1/20000稀释的方式添加SYBR Green I(Lonza)而进行。反应使用LightCycler 96系统(Roche)，在98℃/1分钟之后，进行40个98℃/10秒→60℃/10秒→72℃/10秒的PCR循环，监测核酸扩增反应。
[实施例14]
使用图示的处理试剂收纳容器100、核酸采集构件200、排出物收纳容器400、洗涤液收纳容器440、连接构件450、洗脱液收纳容器460和核酸回收容器470，进行以下的操作。核酸采集构件200如图2所示，组合有样品容纳构件240和载体保持构件250。载体保持构件250作为载体205具备由圆形、膜状的二氧化硅单块形成的、具有核酸吸附能力的载体(膜厚为1.5mm、口径为4mm、贯通孔直径为30～40μm(测定方法：由扫描型电子显微镜图像算出的平均值)。其中，作为洗脱液收纳容器460与图4-5所示的方式不同，压送部461使用了由通过挤压能够变形、从而使压送部内部空间111及容器内空间110的体积减少的袋体形成的容器。
如图4-1所示，将核酸采集构件200与排出物收纳容器400连接，将作为结核杆菌一种的M.bovis(BCG株)的培养液(1.0×104CFU/mL)作为样品S，将样品3mL投入到核酸采集构件200的收纳空间203内。接着，如图4-2所示，将作为处理试剂101密封有含有5重量％的氢氧化钠和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳容器100与核酸采集构件200连接。接着，在混合用空间420内对样品S与处理试剂101的混合物421通过上下振荡混合整个装置10次进行混合，然后在室温条件下静置5分钟。
如图4-3所示，挤压处理试剂收纳容器100的蛇腹结构的压送部103，使混合物421通液至载体205。将吸附有核酸的未洗涤的载体205记为载体205’。将处理试剂收纳容器100和核酸采集构件200的样品容纳构件240同时取下。接着，如图4-4所示，将作为洗涤液443密封有40重量％乙醇水溶液15mL的洗涤液收纳容器440介由连接构件450与载体保持构件250连接。进而，挤压洗涤液收纳容器440的蛇腹结构的压送部441，使洗涤液443通液至载体205’。之后，待压送部441恢复至原来的形状，再次挤压压送部441，使洗涤液收纳容器440内的空气通气至载体205’。将吸附有核酸的洗涤后的载体205记为载体205”。将洗涤液收纳容器440取下，如图4-5所示，将作为洗脱液463密封有水的洗脱液收纳容器460介由连接构件450与载体保持构件250连接，同时取下排出物收纳容器400，将核酸回收容器47与载体保持构件250连接。进而，挤压构成洗脱液收纳容器460的压送部461的所述袋体，使洗脱液463通液至载体205”，回收到核酸回收容器470内。采集10μL透过载体205”的洗脱液463，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.bovis的核酸提取。除去PCR所需要的时间之外，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例15]
除了作为样品S使用M.bovis(BCG株)的培养液(1.0×102CFU/mL)之外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例16]
除了作为样品S使用M.bovis(BCG株)的培养液(5.0×101CFU/mL)之外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例17]
除了作为样品S使用M.bovis(BCG株)的培养液(2.5×101CFU/mL)之外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例18]
作为样品S使用在M.bovis(BCG株)的培养液(5.0×101CFU/mL)中添加了来自于猪的黏蛋白至达到20重量％的粘稠溶液、作为处理试剂101使用密封有含5重量％的氢氧化钠、5重量％的N-乙酰基-L-半胱氨酸和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳容器100，除此之外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.smegmatis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例19]
除了作为样品S使用作为革兰氏阴性菌的大肠杆菌(Escherichia coli)的培养液(1.0×102CFU/mL)之外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认E.Coli的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例20]
除了作为样品S使用作为革兰氏阳性菌的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)的培养液(1.0×102CFU/mL)之外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认S.thermophilus的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例21]
(杀菌效力的试验)
本实施例中，评价核酸分离装置中所用的处理试剂对M.smegmatis及M.bovis BCG(BCG)的杀菌效力。
<菌液的制备>
M.smegmatis使用抗酸杆菌増菌用液体培养基(极东制药工业公司制)在37℃下培养2周。利用孔径为5μm的Acrodisk filter(Pall Corporation制)对培养的菌液进行过滤，除去不需要的菌块。在吸光度530nm下测定本过滤液，确认了过滤液的O.D.达到0.1。将该过滤液制成相当于1ml中含有10的7次方的菌的菌液，用于后述的杀菌效力评价。
另外，将上述菌液与来自于猪胃的黏蛋白粉末(SIGMA ALDRICH公司制)混合、制备将黏蛋白浓度调至20重量％的溶液。将本溶液作为流动性类似于痰的M.smegmatis模拟痰，用于后述的杀菌效力评价。
BCG也用与M.smegmatis同样的液体培养基培养三周，利用与上述M.smegmatis菌液及模拟痰同样的制备方法，制备杀菌效力评价中使用的BCG菌液及BCG模拟痰。
<处理试剂的制备>
作为本评价中使用的处理试剂，制备混合有乙醇(EtOH)、氢氧化钠(NaOH)两个成分的组成，在这两个成分中混合有N-乙酰基-L-半胱氨酸(NALC)第三成分的组成，在这三个成分中混合有戊二醛的组成。另外，设定苯酚溶液为阳性对照(PC)、设定生理盐水为阴性对照(NC)。将本评价中使用的处理试剂的组成示于表1中。表1中，各组合物为水溶液，各组合物中的各成分的比例用重量％表示。
表1
处理试剂组成
组成1 60％EtOH+5％NaOH
组成2 60％EtOH+5％NaOH+5％NALC
组成3 60％EtOH+5％NaOH+5％NALC+3.5％戊二醛
组成4 5％苯酚(阳性对照)
组成5 生理盐水(阴性对照)
<杀菌效力评价>
使用上述M.smegmatis菌液、BCG菌液、含有M.smegmatis的模拟痰、含有BCG的模拟痰这四种，进行各处理试剂的杀菌效力的评价。
对M.smegmatis、BCG的各菌液500μL混合表1所示各处理试剂250～1500μL，颠倒混合后，在室温下放置5分钟。之后，为了去除处理试剂，进行离心(5600rpm、4℃、20分钟)，除去上清，替换成生理盐水。按照在后述培养中不会受到因处理试剂的抑菌作用所造成的影响的方式，重复三次进行离心、替换成生理盐水的操作。
重复三次之后，使用生理盐水制备稀释系列(～105倍稀释)，接种于7H11C琼脂培养基(极东制药工业公司制)，在37℃下进行培养，计数活菌数(克隆数)。以所得活菌数为基础，算出杀菌率作为杀菌效力的指标。杀菌率利用以下公式求出。
杀菌率(％)＝[(NC的活菌数)－(处理试剂使用使的活菌数)]/(NC的活菌数)×100
对于M.smegmatis模拟痰、BCG模拟痰的杀菌效力评价也利用与对于上述菌液的评价同样的方法进行，算出杀菌率。
将本评价结果示于表2。所算出的杀菌率达到99.99999％时，看做是作为核酸分离装置中使用的处理试剂有效的药剂组成。下述表中“○”可以表示为“A”、“×”可以表示为“B”。
表2
Figure BDA0003023910230000381
*表中的“○”表示杀菌率达到99.99999％，“×”表示杀菌率未达到99.99999％，“-”表示未进行试验。
通过本评价中使用的处理试剂，菌液及模拟痰中的M.smegmatis、BCG的99.99999％被杀灭。
[实施例22]
除了作为样品S使用在小鼠血液3mL中添加M.bovis的培养液(1.0×107CFU/mL)3μL、充分地混合而成的混合物以外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.bovis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例23]
除了作为样品S使用在小鼠肌肉组织3cc的捣碎物中添加M.bovis的培养液(1.0×107CFU/mL)3μL、充分地混合而成的混合物以外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.bovis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例24]
除了作为样品S使用在E.coli的培养液(1.0×107CFU/mL)3mL中添加M.bovis的培养液(0.5×105CFU/mL)3μL、充分地混合而成的混合物以外，利用与实施例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.bovis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例25]
作为样品S使用痰(涂抹检查：2+、培养检查：阳性)、作为处理试剂101使用密封有含5重量％的氢氧化钠、5重量％的N-乙酰基-L-半胱氨酸和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳溶液100，除此以外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行提取、精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了结核杆菌群的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
本说明书中“涂抹检查”是指根据《结核检查指针2007》(发行：财团法人结核预防会)所记载的涂抹检查法，通过痰的前处理及染色、镜检，确认有无抗酸杆菌的方法。对所采集的痰添加倍容量的NALC-NaOH试剂(BD MycoPrep、日本BD制)，利用旋涡混合器进行搅拌。按照总量达到50mL容量的方式，添加0.07M的灭菌磷酸缓冲液，在3000g下离心20分钟。废弃上清，利用1mL的灭菌磷酸缓冲液将沉渣混悬。将混悬液0.05mL涂抹在载玻片上，将其自然干燥之后，使其通过煤气灯火焰中4次，进行固定。根据Z-N法对经固定的涂抹标本进行染色，使用光学显微镜以1000倍放大进行观察。根据《结核检查指针2007》所记载的镜检的检测菌数记载法记录所观察的视野内的菌数。
本说明书中“检查培养”是指根据《结核检查指针2007》(发行：财团法人结核预防会)所记载的分离培养法，经过痰的前处理、集菌、接种、培养，确认抗酸杆菌有无生长的方法。将利用与所述涂膜检查相同的方法得到的混悬液0.1mL接种涂布在琼脂平板培养基(Middle Block 7H10琼脂培养基)上，在37℃下进行培养。每周2次，观察至8周，记录培养基表面有无集落。
[实施例26]
作为样品S使用痰(涂抹检查：1+、培养检查：阳性)、作为处理试剂101使用密封有含5重量％的氢氧化钠、5重量％的N-乙酰基-L-半胱氨酸和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳溶液100，除此以外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行提取、精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了结核杆菌群的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例27]
作为样品S使用痰(涂抹检查：±、培养检查：阳性)、作为处理试剂101使用密封有含5重量％的氢氧化钠、5重量％的N-乙酰基-L-半胱氨酸和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳溶液100，除此以外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行提取、精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了结核杆菌群的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例28]
作为样品S使用痰(涂抹检查：―、培养检查：阳性)、作为处理试剂101使用密封有含5重量％的氢氧化钠、5重量％的N-乙酰基-L-半胱氨酸和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳溶液100，除此以外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行提取、精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了结核杆菌群的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例29]
作为样品S使用将痰(涂抹检查：―、培养检查：阳性)稀释了10倍的稀释液、作为处理试剂101使用密封有含5重量％的氢氧化钠、5重量％的N-乙酰基-L-半胱氨酸和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳溶液100，除此以外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行提取、精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了结核杆菌群的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例30]
作为样品S使用将痰(涂抹检查：―、培养检查：阳性)稀释了100倍的稀释液、作为处理试剂101使用密封有含5重量％的氢氧化钠、5重量％的N-乙酰基-L-半胱氨酸和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳溶液100，除此之外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行提取、精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了结核杆菌群的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[实施例31]
作为样品S使用将痰(涂抹检查：―、培养检查：阳性)稀释了1000倍的稀释物、作为处理试剂101使用密封有含5重量％的氢氧化钠、5重量％的N-乙酰基-L-半胱氨酸和60重量％的乙醇的水溶液5mL的处理试剂收纳溶液100，除此之外，利用与实施例14相同的方法对核酸进行提取、精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了结核杆菌群的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为7分钟。
[比较例1]
将作为结核杆菌一种的M.bovis(BCG株)的培养液(1.0×104CFU/mL)作为样品，使用由荣研化学(株式会社)出售的Loopamp(注册商标)PURE DNA提取试剂盒，根据试剂盒的操作说明书，进行核酸的提取。将培养液60μL添加在样品处理管中，在90℃下加热5分钟，在室温下放置2分钟。将样品处理管与吸附剂管连接，上下左右振荡混合。连接滴加注入盖，挤拧吸附剂管，采集核酸提取液。采集10μL所采集的核酸提取液10μL，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.bovis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为9分钟。
[比较例2]
除了作为样品使用M.bovis(BCG株)的培养液(1.0×102CFU/mL)以外，利用与比较例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.bovis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为9分钟。
[比较例3]
除了作为样品使用M.bovis(BCG株)的培养液(5.0×101CFU/mL)以外，利用与比较例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，确认了M.bovis的核酸提取。除去PCR所需要的时间，核酸的提取、精制所需要的时间约为9分钟。
[比较例4]
除了作为样品使用M.bovis(BCG株)的培养液(2.5×101CFU/mL)以外，利用与比较例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，结果通过实时PCR未检测到核酸的扩增。
[比较例5]
除了作为样品使用在M.bovis(BCG株)的培养液(1.0×103CFU/mL)中添加来自猪的黏蛋白至达到20重量％而成的粘稠溶液以外，利用与比较例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，结果通过实时PCR未检测到核酸的扩增。
[比较例6]
除了作为样品使用在M.bovis(BCG株)的培养液(1.0×102CFU/mL)中添加来自猪的黏蛋白至达到20重量％而成的粘稠溶液以外，利用与比较例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，结果通过实时PCR未检测到核酸的扩增。
[比较例7]
作为样品使用与实施例28相同的痰(涂抹检查：―、培养检查：阳性)，使用结核检查指针2007(发行：财团法人结核预防会)所记载的NALC-NaOH法进行痰的消化、污染除去，接着，根据结核分支杆菌样品前处理试剂盒II(Roche-diagnostics株式会社制)所附文书中记载的顺序进行核酸提取。利用实时PCR对所得核酸提取物进行扩增、检测，确认了结核杆菌群的核酸提取。
[比较例8]
作为样品使用将与实施例30相同的痰(涂抹检查：―、培养检查：阳性)稀释了100倍的稀释物，使用结核检查指针2007(发行：财团法人结核预防会)所记载的NALC-NaOH法进行痰的消化、污染除去，接着，根据结核分支杆菌样品前处理试剂盒II(Roche-diagnostics株式会社制)所附文书中记载的顺序进行核酸提取。将所得核酸提取物供至实时PCR，结果未检测到核酸的扩增。
[比较例9]
作为样品使用将与实施例31相同的痰(涂抹检查：―、培养检查：阳性)稀释了1000倍的产物，使用结核检查指针2007(发行：财团法人结核预防会)所记载的NALC-NaOH法进行痰的消化、污染除去，接着，根据结核分支杆菌样品前处理试剂盒II(Roche-diagnostics株式会社制)所附文书中记载的顺序进行核酸提取。将所得核酸提取物供至实时PCR，结果未检测到核酸的扩增。
[比较例10]
出了作为样品使用与实施例28相同的痰(涂抹检查：―、培养检查：阳性)以外，利用与比较例1相同的方法对核酸进行精制，利用实时PCR进行扩增、检测，结果通过实时PCR未检测到核酸的扩增。
实施例14～18、22～24及比较例1～6中的以M.bovis为对象的实时PCR用引物使用正向引物/5’-ACCTCACCTATGTGTCGACC-3’)(序列号3)、反向引物/(5’-AACGTCTTTCAGGTCGAGTACG-3’)(序列号4)。实时PCR试剂使用Takara-bio公司制聚合酶TAKARA TaqHS，以终浓度达到1/20000稀释的方式添加SYBR Green I(Lonza)进行。反应使用LightCycler 96系统(Roche)，在98℃/1分钟之后，进行50个98℃/10秒→60℃/10秒→72℃/10秒的PCR循环，监测核酸扩增反应。
实施例19中的以E.coli为对象的实时PCR用引物使用正向引物/5’-GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC-3’)(序列号5)、反向引物/(5’-AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA-3’)(序列号6)。实时PCR试剂使用Takara-bio公司制聚合酶TAKARA TaqHS，以终浓度达到1/20000稀释的方式添加SYBR Green I(Lonza)进行。反应使用LightCycler 96系统(Roche)，在98℃/1分钟之后，进行40个98℃/10秒→60℃/10秒→72℃/10秒的PCR循环，监测核酸扩增反应。
实施例20中的以S.thermophilus为对象的实时PCR用引物使用正向引物/5’-GCTCCACTACAAGATGGACCTGC-3’)(序列号7)、反向引物/(5’-TAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAG-3’)(序列号8)。实时PCR试剂使用Takara-bio公司制聚合酶TAKARA TaqHS，以终浓度达到1/20000稀释的方式添加SYBR Green I(Lonza)进行。反应使用LightCycler 96系统(Roche)，在98℃/1分钟之后，进行40个98℃/10秒→60℃/10秒→72℃/10秒的PCR循环，监测核酸扩增反应。
实施例25～31及比较例7～10中的以结核杆菌群为对象的实时PCR用引物使用正向引物/5’-ACCTCACCTATGTGTCGACC-3’)(序列号3)、反向引物/(5’-AACGTCTTTCAGGTCGAGTACG-3’)(序列号4)。实时PCR试剂使用Takara-bio公司制聚合酶TAKARA TaqHS，以终浓度达到1/20000稀释的方式添加SYBR Green I(Lonza)进行。反应使用LightCycler 96系统(Roche)，在98℃/1分钟之后，进行50个98℃/10秒→60℃/10秒→72℃/10秒的PCR循环，监测核酸扩增反应。
本说明书中引用的全部刊物、专利及专利申请通过直接引用援引至本说明书中。
符号说明
S 样品
100 处理试剂收纳容器
101 处理试剂
102 释放口
103 压送部
104 盖体
110 容器内空间
200 核酸采集构件
203 收纳空间
204 处理试剂供给口
205 吸附核酸的载体
206 混合物排出口
420 混合用空间
421 混合物
序 列 表
<110> 株式会社钟化
<120> 从含有核酸的样品中分离核酸的方法及用于该方法的样品处理试剂
<130> B150429
<150> JP 2015-178442
<151> 2015-09-10
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 1
acatgcaagt cgaacggaaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 2
cccaccaaca agctgatagg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 3
acctcaccta tgtgtcgacc 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 4
aacgtctttc aggtcgagta cg 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 5
ggaagaagct tgcttctttg ctgac 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 6
agcccgggga tttcacatct gactta 26
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 7
gctccactac aagatggacc tgc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 8
taggagtctg ggccgtgtct cag 23

Claims (4)

1.一种用于使含有通过S-S键交联的成分的样品中的核酸游离、使其吸附于含有二氧化硅的载体的样品处理试剂，其含有：
0.5重量％～15重量％的选自N-乙酰基-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸乙酯、L-半胱氨酸甲酯、N-乙基-L-半胱氨酸、N-甲基-L-半胱氨酸和它们的盐中的至少一种硫醇系还原剂；
3重量％～20重量％的选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡及氢氧化钙中的至少1种碱性物质；和
20重量％～80重量％的乙醇。
2.根据权利要求1所述的样品处理试剂，其中，硫醇系还原剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸和/或其盐。
3.根据权利要求1或2所述的样品处理试剂，其进一步含有选自促溶剂及有机溶剂中的至少1种促进核酸在载体上的吸附的成分。
4.一种方法，其为从含有核酸且含有通过S-S键交联的成分的样品中将核酸分离的方法，其包含：
在权利要求1～3中任一项所述的样品处理试剂与所述样品的混合物的存在下、使从所述样品游离的核酸吸附在含有二氧化硅的载体上。
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