KR20160086057A - 인공합성 핵산유사체 압타머를 포함하는 미생물 및 미세입자의 여과 장치, 및 이를 이용한 여과 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인공합성 핵산유사체 압타머를 포함하는 미생물 및 미세입자의 여과장치, 및 이를 이용한 여과 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 펩티드핵산 압타머를 함유하는 필터 또는 자성체 고형물을 이용한 표적 용액에 함유된 오염물질인 단백질, 항생제, 세균, 바이러스 등을 제거할 수 있는 여과 장치 및 이를 이용한 여과 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 핵산유사체 압타머를 함유하는 고형물을 사용할 경우 표적 용액의 오염물질을 효과적으로 제거할 수 있고, 필터의 기능을 대체할 수 있는 항생제, 단백질, 세균, 바이러스 등의 유기화합물 또는 유기체를 여과할 수 있는 정화 수단에 보편적으로 적용할 수 있을 것이다. 본 발명은 또한, 다양한 표적 물질에 결합 가능한 핵산유사체 압타머를 사용할 수 있으며, 특히 안정성이 높은 펩티드핵산을 압타머로 사용함으로써 여과 장치의 수명을 높이고, 물리적인 크기를 기반으로 한 정제법과 다르게 압력을 조절하기 위한 부수적인 장비가 필요 없으며, 신속한 표적 용액의 정제가 가능한 효과가 있다.

Description

인공합성 핵산유사체 압타머를 포함하는 미생물 및 미세입자의 여과 장치, 및 이를 이용한 여과 방법{Apparatus for Filtering Microorganism and Microparticle Containing Artificial Nucleic Acid Analog Aptamer, And Method for Filtering Using the Same}

본 발명은 인공합성 핵산유사체 압타머를 포함하는 미생물 및 미세입자의 여과장치, 및 이를 이용한 여과 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 펩티드핵산 압타머를 함유하는 필터 또는 자성체 고형물을 이용한 표적 용액에 함유된 오염물질인 단백질, 항생제, 세균, 바이러스 등을 제거할 수 있는 여과 장치 및 이를 이용한 여과 방법에 관한 것이다.

일반적으로 정수필터는 물의 불순물을 제거하는 기구로, 물리적인 막이나, 생화학적인 방법이 있다. 음용이 가능한 물로의 정화를 위하여, 부유고형물, 세균, 조류, 바이러스 및 항생제 등의 화학 오염물 등의 제거를 필요로 한다. 물리적인 방법을 사용한 정제의 경우 불순물의 크기 구배에 의한 정제가 기본이며, 화학적인 방법의 경우 오염 물질을 2차 산물화를 통하여 불순물의 상태를 변환하는 방법을 사용한다. 물리적인 방법의 경우 세균나 바이러스의 정제를 위하여 물리적인 장애물의 크기가 0.1μm 이하로 작아져야 가능하며, 이러한 과정은 필터에 물을 통과시키기 위한 진공펌프나 압력을 주는 장치를 필요로 한다. 필터의 사이즈가 작을수록 높은 압력을 요구하며, 필터의 수명이 짧아지게 되는 단점을 가진다. 또한 제작기술의 한계로 항생제 등의 화학 오염물 등의 제거가 불가능하다. 화학적인 방법의 정수는 오염 물질의 원천적인 제거가 아닌 변환을 통하여 위험성을 제거하는 방법으로 원천적인 정수에 한계가 있다.

미생물의 능동적인 정제를 위하여, 항체를 사용한 방법이 사용되었으나, 단백질의 특성으로 열변성, 화학변성 등 안정성이 낮고, 제작비용이 비싸 사용에 문제가 있다. 이러한 문제점을 대체하기 위하여 최근 항체를 대체할 수 있는 물질인 압타머를 사용한 연구가 진행 중이다. 하지만 현재까지의 압타머는 DNA 및 RNA를 사용하여 제작되었으나 DNA 압타머의 경우 결합력이 낮아 사용성이 낮으며, RNA 압타머의 경우 선택성과 결합력은 DNA에 비하여 좋으나 안정성이 떨어지고 제작의 과정이 복잡한 단점을 가진다, 최근 PNA를 사용한 압타머가 개발되었으나, 스크리닝의 문제로 널리 사용되지 못하고 있다.

이에 본 발명자들은 표적 용액의 오염물질을 침전시키고 자성을 이용하여 상기 침전물질을 여과시킬 수 있는 인공합성 핵산유사체 압타머를 이용한 여과 장치, 및 이를 이용한 여과 방법으로 단백질, 항생제, 세균, 바이러스 등을 여과할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 핵산유사체 기반의 압타머를 사용한 단백질, 항생제, 세균, 바이러스 등을 제거할 수 있는 여과 장치 및 여과 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마개와 몸체로 구성된 용기; 및 상기 마개에 부착된 펩티드핵산 압타머를 함유하는 필터 또는 펩티드핵산 압타머와 결합된 고형체를 구비하는 오염물질 여과 장치를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 용기에 표적 용액을 넣고, 마개를 닫은 다음, 상기 용기를 뒤집고, 교반하여 오염물질과 펩티드핵산 압타머를 결합시키는 단계; (b) 용기의 마개를 열고, 상기 펩티드핵산 압타머와 결합된 오염물질을 분리한 다음, 정화된 표적 용액을 회수하는 단계; (c) 상기 회수된 표적 용액의 오염도를 확인하는 단계; 및 (d) 상기 확인 결과, 오염도가 높으면 (a)∼(c)를 반복하는 단계를 포함하는 펩티드핵산 압타머를 함유하는 용기가 구비된 여과 장치를 이용한 오염물질 여과 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 핵산유사체 압타머를 함유하는 고형물을 사용할 경우 표적 용액의 오염물질을 효과적으로 제거할 수 있고, 필터의 기능을 대체할 수 있는 항생제, 단백질, 세균, 바이러스 등의 유기화합물 또는 유기체를 여과할 수 있는 정화 수단에 보편적으로 적용할 수 있을 것이다. 본 발명은 또한, 다양한 표적 물질에 결합 가능한 핵산유사체 압타머를 사용할 수 있으며, 특히 안정성이 높은 펩티드핵산을 압타머로 사용함으로써 여과 장치의 수명을 높이고, 물리적인 크기를 기반으로 한 정제법과 다르게 압력을 조절하기 위한 부수적인 장비가 필요 없으며, 신속한 표적 용액의 정제가 가능한 효과가 있다.

도 1은 펩티드핵산 압타머 여과 장치의 용도를 설명하기 위한 개념도이다.
도 2는 펩티드핵산 압타머 필터를 사용한 여과 장치의 특징을 설명하기 위한 개념도이다.
도 3은 펩티드핵산 압타머를 사용한 여과 장치의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 펩티드핵산 압타머를 사용한 단백질의 여과 여부를 검사한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 펩티드핵산 압타머를 사용한 항생제의 여과 여부를 검사한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 펩티드핵산 압타머를 사용한 대장균의 여과 여부를 검사한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 펩티드핵산 압타머를 사용한 식중독균의 여과 여부를 검사한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 펩티드핵산 압타머를 사용한 바이러스의 여과 여부를 검사한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 서열번호 1 또는 2의 염기서열 및 구조에 해당하는 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid: PNA) 압타머를 제작하였고, 이를 이용하여 임의의 단백질, 항생제, 세균 또는 바이러스가 포함되는 것으로 추정되는 표적 용액으로부터 상기 오염물질의 분리를 시도하였으며, 흡광도 측정법, 균수측정법, 항생제 감수성분석 또는 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 오염물질 제거 전후의 양을 확인하였다. 그 결과, 후술하는 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군에 비해 펩티드핵산 압타머를 사용한 실험군에서는 전술한 오염물질이 모두 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명의 오염물질 종류에 따른 펩티드핵산 압타머의 여과용 용도는 도 1에 도시하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 도 4에 나타난 바와 같이, 여과 장치의 펩티드핵산을 사용한 경우 3μg/ml의 단백질 농도를 가지는 물로 정수가 된 것을 확인하였고, 대조군의 경우 19.9μg/ml의 단백질 농도를 유지하는 것으로 나타나 여과 장치의 펩티드핵산에 의한 정수효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 도 5에 나타난 바와 같이, 펩티드핵산 압타머 여과 장치가 항생제를 물에서부터 분리할 수 있는지를 항생제 제거과정을 거친 후 세균배양에 따른 항생효과를 간접적으로 확인한 결과, 팹티드핵산을 포함하지 않은 스트렙트아비딘(streptavidin)-자성 비드 결합체만을 사용한 정수튜브를 사용한 대조군은 3cm의 항생제 확산을 보여주었으며, 펩티드핵산 압타머 2종을 농도별로 자성 비드에 결합하여 정수를 진행한 물의 경우 2.4~2.6cm의 항생제 확산을 보이며 대조군 대비 항생제의 제거가 가능하였음을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 도 6에 나타난 바와 같이, 펩티드핵산 압타머가 결합되지 않은 여과 장치에서 2675, 567 및 56개의 대장균 집락을 보였으나, 펩티드핵산이 결합된 여과 장치에서의 25mer 펩티드핵산을 사용한 경우 4, 0 및 0개의 집락을 보였으며, 30mer 펩티드핵산을 사용한 경우 12, 4 및 1개의 집락을 보이는 것으로 확인되어 펩티드핵산 압타머을 포함하는 여과 장치가 세균을 물에서부터 매우 효과적으로 분리할 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 도 7에 나타난 바와 같이, 펩티드핵산 압타머가 결합되지 않은 여과 장치에 비하여, 펩티드핵산이 결합된 여과 장치를 사용한 경우 2종의 식중독 균주(Listeria monocytogenes , Yersinia enterocolitica) 모두에서 낮은 흡광도를 보이며 정수가 되는 것을 확인하였고, 이는 펩티드핵산 정수장치를 사용하여 세균을 분리하는 것이 가능하다는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 도 8에 나타난 바와 같이, 펩티드핵산 압타머 여과 장치가 바이러스를 물에서부터 분리할 수 있는지를 확인한 결과, 팹티드핵산을 포함하지 않은 스트렙트아비딘(streptavidin)-자성 비드 결합체만을 사용한 정수튜브를 이용한 대조군의 증폭곡선과 펩티드핵산 압타머를 자성 비드에 결합하여 정수를 진행한 실험군의 증폭곡선을 비교한 결과 4.93의 증폭 사이클(cycle) 차이(ΔCt)를 보이며 대조군 대비 바이러스의 제거가 가능하였음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 마개와 몸체로 구성된 용기; 및 상기 마개에 부착된 펩티드핵산 압타머를 함유하는 필터 또는 펩티드핵산 압타머와 결합된 고형체를 구비하는 오염물질 여과 장치에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 펩티드핵산 압타머는 25∼30mer의 길이를 가지는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 무작위(random) 서열을 가지고, 상기 압타머의 서열 말단에 상기 필터 또는 고형체에 결합가능한 잔기를 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 고형체는 원통 또는 구슬의 모양을 가지며, 자성체인 것을 특징으로 하고, 상기 펩티드핵산 압타머는 잔기로 바이오틴(biotin)을 가지며, 상기 바이오틴은 상기 고형체에 부착된 스트렙트아비딘(streptavidin)과 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 펩티드핵산 압타머는 오염물질과 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 오염물질은 미세입자 또는 미생물인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 미세입자는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 항생제로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 미생물은 조류(algae), 세균, 효모, 곰팡이, 원생동물류(protozoa) 및 바이러스로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 용기는 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리노보낸(polynorbonene), COC(Cyclic olefin Copolymer), 불소화 폴리이미드, 폴리스틸렌(PS), SBC(styrene-butadiene copolymer), ABS(acrylonitrile butadiene styrene), SAN((styrene acrylonitrile) 및 폴리 술폰으로 구성된 군에서 선택된 재질로 만들어진 용기인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 오염물질은 표적 용액에 함유되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 '미세입자(microparticle)'란 0.1∼700μm의 크기를 가지며, 부피대 표면적의 비율이 큰 입자를 의미하며, 핵산, 탄수화물, 단백질, 지질, 항생제 등과 같은 고분자화합물을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 '미생물(microorganism)'이란 보통 0.1mm 이하의 미세한 생물을 의미하며, 조류(algae), 세균, 효모, 곰팡이, 원생동물류(protozoa)와 생체 내에서만 생화학적, 생리적 현상을 나타내는 한계적 생물인 바이러스를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 용기에 표적 용액을 넣고, 마개를 닫은 다음, 상기 용기를 뒤집고, 교반하여 오염물질과 펩티드핵산 압타머를 결합시키는 단계; (b) 용기의 마개를 열고, 상기 펩티드핵산 압타머와 결합된 오염물질을 분리한 다음, 정화된 표적 용액을 회수하는 단계; (c) 상기 회수된 표적 용액의 오염도를 확인하는 단계; 및 (d) 상기 확인 결과, 오염도가 높으면 (a)∼(c)를 반복하는 단계를 포함하는 펩티드핵산 압타머를 함유하는 용기가 구비된 여과 장치를 이용한 오염물질 여과 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 오염도를 확인하는 단계는 흡광도 측정법, 균수측정법, 항생제 감수성분석 또는 실시간 중합효소연쇄반응에서 선택되는 방법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 표적 용액은 오염물질을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 PNA의 염기서열의 길이는 제한되지 않으나, 바람직하게는 25∼30 mer 길이를 가지며, 펩티드핵산은 필터 또는 고형체에 고정시키기 위해서 잔기인 바이오틴(biotin)이 핵산 말단에 결합되어 있고, 압타머의 유연성을 확보하기 위하여 상기 핵산과 바이오틴 사이에 링커(linker)가 삽입되어 있는 것을 특징으로 한다.

일반적으로 압타머는 DNA 혹은 RNA의 2차 구조를 사용한 표면 결합물질로, RNA 압타머의 경우 2차 구조가 다양하고 결합효율이 좋으나, 화학적으로 불안정하여 쉽게 분해될 수 있다. 반면, DNA 압타머의 경우 2차 구조가 제한적으로 표적 물질과의 결합 효율이 낮아 압타머의 역할을 기대하기 힘든 것으로 알려져 있어, 안정성 및 결합력이 높은 압타머 재료의 필요성이 요구된다.

인공합성 핵산인 펩티드핵산은 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. PNA(Peptide Nucleic Acid)는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 화학적으로 안정할 뿐만 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. 또한, PNA는 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로서, 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하고, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 특성이 있다.

상기 특성(안정성)을 바탕으로 PNA를 사용한 압타머 연구가 보편적으로 진행되고 있으며, PNA는 표적 물질에 대한 강한 결합력과 높은 안정성으로 보관 및 제품 개발이 용이한 장점을 보유하고 있으나, 염기서열 분석이 불가능하여 특이적인 압타머의 선별이 어려운 단점을 가진다. 최근 연구에 의하면 특이적인 압타머를 선별하여 임의로 제작된 DNA 풀(pool)과 혼성화시킨 다음, 상기 혼성화된 특이 DNA를 사용하여 상보적인 염기서열을 확보하는 기술이 개발되는 등 펩티드핵산을 사용한 압타머 연구는 활발하게 진행되고 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 펩티드핵산 압타머 정수장치를 이용한 단백질 오염 물질의 분리

도 2는 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid: PNA) 압타머를 이용한 여과 장치의 특징을 설명하기 위한 개념도를 나타낸 것으로, 본 발명에 따른 임의 서열 펩티드핵산은 2차 구조를 이루어 수중 오염물의 표면에 결합이 가능하며, 상기 펩티드핵산 말단의 바이오틴(biotin)을 사용하여 스트렙트아비딘(streptavidin)이 결합된 자성 고형체에 고정시켜 수중 오염물의 침전 및 분리가 가능하도록 제작하였다.

도 3은 펩티드핵산 압타머를 이용한 정수장치를 나타낸 것으로, 상기 여과 마개에 자성 고형체를 결합시켜 전술한 펩티드핵산 압타머가 결합할 수 있도록 하였다.

상기 펩티드핵산 압타머는 하기 표 1에 나와있는 서열번호 1과 2의 구조로 제작하여 스트렙트아비딘(streptavidin)이 결합된 자성 비드에 결합시켰으며, 마개 부분의 자석에 결합시킨 후 정제에 사용하였다. 상기 PNA 압타머의 염기서열은 하기 표 1에 나타내었다(표 1: N은 아데닌(adenine: A), 구아닌(guanine: G), 티민(thymine: T) 또는 시토신(cytosine: C)에서 무작위로 선택되는 핵산뉴클레오티드(nucleotide)를, O는 링커를 나타낸 것이다).

단백질 오염 물질으로 사용된 탈지분유를 20μg/ml의 단백질 농도로 상기 제작된 펩티드핵산이 결합된 정수 튜브에 넣은 후 10분간 정수 튜브를 뒤집어 반응을 시켜주었고, 2분마다 한 번씩 교반하여 주었다.

펩티드핵산의 오염 물질 제거 효율을 확인하기 위하여, 대조군으로는 펩티드핵산이 결합되지 않은 스트렙트아비딘(streptavidin)이 결합된 자성 비드가 결합된 정수튜브를 사용하였으며, 이는 모든 실시예의 대조군으로 동일하게 사용하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 여과 장치의 펩티드핵산을 사용한 경우 3μg/ml의 단백질 농도를 가지는 물로 정수가 된 것을 확인하였고, 대조군의 경우 19.9μg/ml의 단백질 농도를 유지하는 것으로 나타나 여과 장치의 펩티드핵산에 의한 정수효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다.

실시예 2: 펩티드핵산 압타머 정수장치를 이용한 항생제 요염원의 분리

실시예 1의 방법으로 제작된 펩티드핵산 압타머 정수장치가 포함된 정수튜브를 이용하여 항생제를 표적 용액(오염수)으로부터 제거하고자 하였다.

전술한 펩티드핵산압타머가 결합된 정수튜브에 50mg/ml 암피실린(ampicillin)을 함유하는 오염수를 넣고 10분간 정수 튜브를 뒤집어 반응을 시켜주었고, 2분마다 한번씩 교반하여 주었다. 그다음, 대장균을 도말한 배지 위에 대조군를 포함한 5종의 여과 방법을 진행한 항생제 오염수를 포함하는 필터를 올려 대장균의 배양 범위를 측정하여 항생제의 제거 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 펩티드핵산 압타머 정수장치가 항생제를 물에서부터 분리할 수 있는지를 항생제 제거과정을 거친 다음, 세균배양에 따른 항생효과를 간접적으로 확인한 결과, 팹티드핵산을 포함하지 않은 스트렙트아비딘(streptavidin)-자성 비드 결합체만을 사용한 정수 튜브를 사용한 대조군은 3cm의 항생제 확산을 보여주었으며, 펩티드핵산 압타머 2종을 농도별로 자성 비드에 결합하여 정수를 진행한 물의 경우 2.4~2.6cm의 항생제 확산을 보이며 대조군 대비 항생제의 제거가 가능하였음을 확인하였다.

실시예 3: 펩티드핵산 압타머 여과 장치를 이용한 세균 요염원의 분리

실시예 1의 방법으로 제작된 펩티드핵산 압타머가 포함된 여과 장치(정수 튜브)를 이용하여 세균을 표적 용액(오염수)으로부터 제거하고자 하였다.

우선 대장균(E. coli) 오염수를 정수하기 위하여, 대장균을 포함하는 물을 펩티드핵산 압타머가 포함되지 않은 여과 장치, 25mer의 길이를 가지는 펩티드핵산 압타머를 이용한 여과 장치 또는 30mer 펩티드핵산 압타머를 이용한 여과 장치로 여과 과정을 수행하였다. 그다음, 펩티드핵산 압타머가 결합된 여과 장치를 사용하여 정수한 물을 배지에 도말하여 전배양한 후 집락(colony)의 수를 확인하여 상기 펩티드핵산 압타머의 유무와 종류에 따른 정수 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 펩티드핵산 압타머가 결합되지 않은 정수장치에서 2675, 567 및 56개의 대장균 집락을 보였으나, 펩티드핵산이 결합된 정수장치에서의 25mer 펩티드핵산을 사용한 경우 4, 0 및 0개의 집락을 보였으며, 30mer 펩티드핵산을 사용한 경우 12, 4 및 1개의 집락을 보이는 것으로 확인되어 펩티드핵산 압타머 여과 장치가 세균을 물에서부터 매우 효과적으로 분리할 수 있음을 확인할 수 있었다.

한편, 펩티드핵산 압타머 여과 장치가 식중독균을 물에서부터 분리할 수 있는지 확인하고자 하였다. 상기 식중독균으로 2종(Listeria monocytogenes , Yersinia enterocolitica)을 포함하는 물을 펩티드핵산 압타머가 포함되지 않은 여과 장치와 25mer의 길이를 가지는 펩티드핵산 압타머를 사용한 여과 장치로 정수과정을 수행하였고, 펩티드핵산 압타머가 결합된 여과 장치를 사용하여 정수된 물의 흡광도(optical density)를 측정하여 정수 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 펩티드핵산 압타머가 결합되지 않은 여과 장치에 비하여, 펩티드핵산이 결합된 여과 장치를 사용한 경우 2종의 식중독 균주(Listeria monocytogenes , Yersinia enterocolitica) 모두에서 낮은 흡광도를 보이며 정수가 되는 것을 확인하였고, 이는 펩티드핵산 여과 장치를 사용하여 세균을 분리하는 것이 가능하다는 것을 의미한다.

실시예 4: 펩티드핵산 압타머 정수장치를 이용한 바이러스 오염 물질의 분리

실시예 1의 방법으로 제작된 펩티드핵산 압타머가 포함된 여과 장치를 이용하여 바이러스를 표적 용액(오염수)로부터 제거하고자 하였다.

전술한 펩티드핵산 압타머가 결합된 여과 장치(정수 튜브)에 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus: CMV)가 포한된 마쇄 잎을 넣고 10분간 정수튜브를 뒤집어 반응을 시켜주었고, 2분마다 한번씩 교반하여 주었다.

도 8은 본 발명에 따른 바이러스 오염 물질 정수의 일례를 나타내는 바이러스농도를 확인한 결과를 나타내는 그림으로, 실시간 중합효소 연쇄반응기를 사용하여 하기 표 2의 DNA 프라이머 서열번호 3 및 4를 사용하여 CMV의 제거 여부를 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)으로 상기 바이러스 유전자의 증폭을 통해서 확인하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 펩티드핵산 압타머 여과 장치가 바이러스를 물에서부터 분리할 수 있는지를 확인한 결과, 팹티드핵산을 포함하지 않은 스트렙트아비딘(streptavidin)-자성 비드 결합체만을 사용한 여과 장치(정수 튜브)를 이용한 대조군의 증폭곡선과 펩티드핵산 압타머를 자성 비드에 결합하여 정수를 진행한 실험군의 증폭곡선을 비교한 결과 4.93의 증폭 사이클(cycle) 차이(ΔCt)를 보이며 대조군 대비 바이러스의 제거가 가능하였음을 확인하였다.

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Seasunbiomaterials <120> Apparatus for Filtering Microorganism and Microparticle Containing Artificial Nucleic Acid Analog Aptamer, And Method for Filtering Using the Same <130> P14-B384 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA-1 <400> 1 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 25 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA-2 <400> 2 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 30 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV_F <400> 3 cgtatggtgg aggcgaagaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV_R <400> 4 gctctctcgc tgggactttt 20

Claims (13)

1. 마개와 몸체로 구성된 용기; 및 상기 마개에 부착된 펩티드핵산 압타머를 함유하는 필터 또는 펩티드핵산 압타머와 결합된 고형체를 구비하는 오염물질 여과 장치.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드핵산 압타머는 25∼30mer의 길이를 가지는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 무작위(random) 서열을 가지고, 상기 압타머의 서열 말단에 상기 필터 또는 고형체에 결합가능한 잔기를 가지는 것을 특징으로 하는 오염물질 여과 장치.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 고형체는 원통 또는 구슬의 모양을 가지며, 자성체인 것을 특징으로 하는 오염물질 여과 장치.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 펩티드핵산 압타머는 잔기로 바이오틴(biotin)을 가지며, 상기 바이오틴은 상기 고형체에 부착된 스트렙트아비딘(streptavidin)과 결합하는 것을 특징으로 하는 오염물질 여과 장치.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 펩티드핵산 압타머는 오염물질과 결합하는 것을 특징으로 하는 오염물질 여과 장치.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 오염물질은 미세입자 또는 미생물인 것을 특징으로 하는 오염물질 여과 장치.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 미세입자는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 항생제로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 오염물질 여과 장치.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 조류(algae), 세균, 효모, 곰팡이, 원생동물류(protozoa) 및 바이러스로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 오염물질 여과 장치.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 용기는 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리노보낸(polynorbonene), COC(Cyclic olefin Copolymer), 불소화 폴리이미드, 폴리스틸렌(PS), SBC(styrene-butadiene copolymer), ABS(acrylonitrile butadiene styrene), SAN((styrene acrylonitrile) 및 폴리 술폰으로 구성된 군에서 선택된 재질로 만들어진 용기인 것을 특징으로 하는 오염물질 여과 장치.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 오염물질은 표적 용액에 함유되는 것을 특징으로 하는 오염물질 여과 장치.
    
11. 다음 단계를 포함하는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 펩티드핵산 압타머를 함유하는 용기가 구비된 여과 장치를 이용한 오염물질 여과 방법:
    (a) 용기에 표적 용액을 넣고, 마개를 닫은 다음, 상기 용기를 뒤집고, 교반하여 오염물질과 펩티드핵산 압타머를 결합시키는 단계;
    (b) 용기의 마개를 열고, 상기 펩티드핵산 압타머와 결합된 오염물질을 분리한 다음, 정화된 표적 용액을 회수하는 단계;
    (c) 상기 회수된 표적 용액의 오염도를 확인하는 단계; 및
    (d) 상기 확인 결과, 오염도가 높으면 (a)∼(c)를 반복하는 단계.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 오염도를 확인하는 단계는 흡광도 측정법, 균수측정법, 항생제 감수성분석 또는 실시간 중합효소연쇄반응에서 선택되는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 오염물질 여과 방법.
    
13. 제11항에 있어서, 상기 표적 용액은 오염물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 오염물질 여과 장치.

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