JP4969760B2 - ポリマー - Google Patents
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Description
【0001】
本発明は刺激応答性のポリマー、微生物の分離方法または濃縮方法、核酸の精製方法、検出方法、または濃縮方法、分離剤、生体物質の分離方法、および物質の変換方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、刺激応答性ポリマーはドッラグデリバリーシステム(DDS)、各種分離剤、カテーテル、人工筋肉、ケモバルブなどに広く応用され、その重要性は急激に増大している。例えば特開平8−103653号公報には、熱、pH、電位、または光などの刺激により高次構造が変化して水溶液中で膨潤したり収縮する刺激応答性高分子として、ポリ−N−イソプロピルアクリルアミド、およびN,N−ジエチルアクリルアミドなどのアクリルアミド誘導体類、ポリメチルビニルエーテルなどのビニルエーテル類が記載されている。
【0003】
しかしながら、温度変化に応答して膨潤−収縮するとして公知のポリマーは、上限臨界溶液温度(以下「UCST」と記述する。)又は下限臨界溶液温度(以下「LCST」と記述する。)を有すると記載されるものの、実際は全てLCSTを有する高分子である。すなわち、或る温度以上において可逆的に高分子間同士での凝集を起こすことにより水に不溶化し、それ未満では水に溶解するという性質を有する物であった。
【0004】
LCSTを有するポリマーは、ある一定温度以上においてポリマーが収縮し水に対して不溶化する物であるから、分離剤等の用途に使用する際、収縮を低温下、降温操作で行いたいという要請に対して、その調整が難しいという課題があった。例えば、熱に不安定なタンパク質等の分離剤として用いる場合、LCSTを有するポリマーは昇温操作により凝集するため、その操作によりタンパク質の変性を伴う危険性を考慮しなければならなかった。
【0005】
一方、水溶液中でUCSTを示す高分子であるポリアクリル酸を用いたポリマー間イオンコンプレックスやポリソープなどは、緩衝液中において例えば分離剤などの用途に使用すると、ポリマーのイオン解離が起こりUCSTを示さない場合があった。
【発明の開示】
【0006】
本発明者らは前述の従来技術の課題に鑑み鋭意努力した、その結果、少なくとも下記一般式(1)で表されるモノマーと一般式(2)で表されるモノマーとを重合させて得られたポリマーは、緩衝液中においてもUCSTを有すること、さらに、本発明のポリマーを用いれば、微生物の分離、濃縮、核酸の精製、検出、または濃縮、生体物質の分離、および物質の変換が効率よく行えることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【0007】
本発明は以下の構成を有する。
(1)少なくとも一般式(1)で表されるモノマーと一般式(2)で表されるモノマーとを重合させて得られたポリマー。
【0008】
【化1】
【0009】
(式中、R11は水素原子又はメチル基を示し、R12は単結合または炭素数1〜5の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を示す。)
【0010】
【化2】
【0011】
(式中、R13は水素原子又はメチル基を示し、R14は水素原子、炭素数1〜10の直鎖状、分岐状もしくは環状の、アルキル基、アルコキシル基もしくはアルキルアミノ基、アリール基、又は複素環基を示す。)
【0012】
(2)上記一般式(1)で表されるモノマーと、ビオチン部位を有するモノマーとを重合させて得られたポリマー。
(3)さらに親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた1種以上を用いた前記第1項または第2項記載のポリマー。
【0013】
(4)相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が固定化された前記第1項〜第3項の何れか1項記載のポリマー。
(5)相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、cDNAとmRNA、酵素(活性部位)と基質、酵素(活性部位)と生産物、酵素(活性部位)と競争阻害剤、酵素(補酵素結合部位)と補酵素、酵素(補酵素結合部位)とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Fc部位とプロテインA、Fc部位とプロテインG、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、DNAとDNA結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、およびヘパリンとラミニンとの組合せから選ばれた1種以上である前記第4項記載のポリマー。
(6)相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビオチンとアビジンである前記第4項記載のポリマー。
【0014】
(7)高分子に固定化された該一対の物質の一方が、ビオチンである前記第4項記載のポリマー。
(8)ビオチンがアビジンと結合したビオチン(以下「アビジン結合ビオチン」と記載する。)である前記第7項記載のポリマー。
(9)アビジン化酵素をビオチンに結合させた前記第7項記載のポリマー。
(10)ビオチン化酵素をアビジン結合ビオチンに結合させた前記第8項記載のポリマー。
(11)前記第9項または第10項記載のポリマーを用いることを特徴とする物質の変換方法。
(12)アビジン化抗体をビオチンに結合させた前記第7項記載のポリマー。
(13)ビオチン化抗体をアビジン結合ビオチンに結合させた前記第8項記載のポリマー。
(14)前記第12項または第13項記載のポリマーを用いることを特徴とする微生物の分離方法または濃縮方法。
【0015】
(15)アビジン化分子シャペロンをビオチンに結合させた前記第7項記載のポリマー。
(16)ビオチン化分子シャペロンをアビジン結合ビオチンに結合させた前記第8項記載のポリマー。
(17)前記第15項または第16項記載のポリマーを用いることを特徴とする変性蛋白質の改質方法。
【0016】
(18)アビジン化ヒートショックプロテインをビオチンに結合させた前記第7項記載のポリマー。
(19)ビオチン化ヒートショックプロテインをアビジン結合ビオチンに結合させた前記第8項記載のポリマー。
(20)前記第18項または第19項記載のポリマーを用いることを特徴とする変性蛋白の改質方法。
【0017】
(21)アビジン化核酸をビオチンに結合させた前記第7項記載のポリマー。
(22)ビオチン化核酸をアビジン結合ビオチンに結合させた前記第8項記載のポリマー。
(23)前記第21項または第22項記載のポリマーを用いることを特徴とする核酸の精製、検出、または濃縮方法。
(24)前記第23項記載の核酸の精製、または濃縮方法により得られた核酸を増幅することを特徴とする核酸の検出方法。
(25)増幅方法がPCR法またはRT−PCR法である前記第24項記載の核酸の検出方法。
【0018】
(26)前記第1項〜第8項の何れか1項記載のポリマーを含有する分離剤。
(27)前記第26項記載の分離剤を用いることを特徴とする生体物質の分離方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【0019】
以下、本発明について更に詳しく説明する。
上限臨界温度(以下「UCST」と記述する。)を有するポリマー(以下「UCSTポリマー」と記述する。)とは、ポリマー含有溶媒において、該ポリマー含有溶媒の温度が特定温度を越えた場合には、該ポリマーが溶媒に溶解した状態となり、該特定温度以下となった場合には、該ポリマーが溶媒中に析出、凝集する性質を有するポリマーのことである。UCSTとは該特定温度のことである。また、UCSTを境にポリマーの溶解、析出が起こる現象をUCST特性と言う。
【0020】
前述の溶媒は特に限定されるものではないが、具体的には水、および水を50重量%以上含有する液体を挙げることができる。さらに水を50重量%以上含有する液として具体的には、生理食塩水、緩衝液などを挙げることができる。また、ポリマーを含有した状態でUCST特性を示すのであれば、該溶媒は、アセトンなどの有機溶媒と水との混合液であっても良い。
本発明の第一のポリマーは、少なくとも一般式(1)で表されるモノマー(以下「モノマー(1)」と記述する。)と一般式(2)で表されるモノマー(以下「モノマー(2)」と記述する。)とを重合させて得られたUCSTポリマーである。
【0021】
【化3】
【0022】
一般式(1)中、R11は水素原子又はメチル基を示し、本発明においてR11は水素原子であることが好ましい。R12は単結合または炭素数1〜5の直鎖状もしくは分岐状のアルキレン基を示し、本発明においてR12はメチレン基であることが好ましい。
【0023】
【化4】
【0024】
一般式(2)中、R13は水素原子又はメチル基を示し、本発明においてR13は水素原子であることが好ましい。R14は水素原子、炭素数1〜10の直鎖状、分岐状もしくは環状のアルキル基、アルコキシル基、アルキルアミノ基、アリール基、又は複素環基を示す。アルキル基としては炭素数1〜5の直鎖のアルキル基が好ましく、アルコキシル基およびアルキルアミノ基のアルキル基部分としては、炭素数1〜5の直鎖のアルキル基が好ましい。アリール基としては、フェニル基、およびナフチル基等が挙げられ、複素環基となるものとしてはピリミジン等が挙げられる。
【0025】
本発明UCSTポリマーの重合において、モノマー(1)とモノマー(2)の他に、その他の成分として、親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた1種以上を用いた場合には、その種類および使用割合を変えることによってUCSTを制御することが可能である。
その他の成分として使用するモノマーが親水性であるのか、もしくは疎水性であるのかの分類は、モノマー(1)の親水性を基準として行う。つまり、重合に用いるモノマー(1)よりも親水性であるものは親水性モノマーであり、疎水性であるものは疎水性モノマーである。また、重合に用いるモノマー(1)が複数である場合には、その中で最も親水性であるモノマーを基準に分類を行えばよい。
【0026】
重合に用いるモノマー(1)の種類により異なり、一概に特定することはできないが、具体的にその例を挙げれば、本発明において使用する親水性モノマーとしては、(メタ)アクリルアミド、(メタ)アクリル酸、アリルアルコール、およびアリルアミンなどを挙げることができ、疎水性モノマーとしては、アルキル(メタ)アクリレート、スチレン、エチレン、プロピレン、アセチレン等の不飽和炭化水素、アルキルビニルエーテル、およびアルキル(メタ)アクリルアミドなどを挙げることができる。
【0027】
本発明のUCSTポリマーの重合に親水性モノマーを用いた場合、UCSTは低下する傾向にあり、反対に疎水性モノマーを用いた場合、UCSTは上昇する傾向にある。
本発明のUCSTポリマー重合の際の、各モノマーの組成は特に限定されるものではないが、モル比で通常、モノマー(1):モノマー(2):その他のモノマー=95〜20:1〜60:0〜40の割合であり、好ましくは95〜50:1〜50:0〜20の割合である。
【0028】
本発明のUCSTポリマーを含有する重合直後の反応液には、未反応のモノマーや塩などの夾雑物が反応液に共存している。該夾雑物の除去は、透析によって行ってもよく、または溶液の温度をUCST以下とし、凝集させ凝集物を回収後上清を取り除くことによって行っても良い。
【0029】
本発明の第二のポリマーは、前述のモノマー(1)とビオチン部位を有するモノマーとを重合させて得られたUCSTポリマーである。本発明第二のUCSTポリマーは、該UCSTポリマー内に導入されたビオチン部位により、アビジンを特異的に吸着することが可能となることから、該UCSTポリマーを用いれば、各種目的物質をアビジン化することによって、該目的物質の分離、精製、濃縮を効率よく行うことが可能となる。
【0030】
モノマー(1)のうち、下記一般式(3)で表されるアクリロイルグリシンアミドは、本発明の第二のUCSTポリマーに好ましく使用することができる。
【0031】
【化5】
【0032】
本発明において、本発明に使用するビオチン部位を有するモノマーは特に限定されるものではないが、ビオチンをその構造の一部とするモノマーとしては、ビオチンの末端カルボキシル基を用いた(メタ)アクリルアミド、(メタ)アクリレート誘導体などを挙げることが出来るが、本発明においてこれらに限定されるものではない。その中でも好ましい該モノマーとして、下記一般式(4)で表される重合性ビオチン誘導体を挙げることができる。
【0033】
【化6】
【0034】
一般式(4)中、R2は水素原子又はアルキル基を示す。R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基を示す。Tは酸素原子又は=NH基を示す。Wは単結合又はカルボニル基、チオカルボニル基もしくは炭素数1〜5のアルキレン基を示す。Uは単結合又は−NH−基を示す。Xは単結合又は炭素数1〜8の炭化水素結合、酸素原子もしくは−NH−基を示す。Yは単結合又はカルボニル基、チオカルボニル基、−NH基−、1,2−ジオキシエチレン基もしくは1,2−ジアミノエチレン基を示す。Zは単結合又はカルボニル基、チオカルボニル基、炭素数1〜5のアルキレン基、酸素原子もしくは−NH−基を示す。Vは単結合又は炭素数1〜5のアルキレン基を示す。
【0035】
一般式(4)で表される重合性ビオチン誘導体の中でも、下記一般式(5)〜(7)で表される重合性ビオチン誘導体は、本発明のUCSTポリマーに好ましく使用することができる。
【0036】
【化7】
【0037】
一般式(5)〜(7)中、R1は単結合又は炭素数1〜4のアルキレン基を示し、R5は炭素数2又は3のアルキレン基を示す。X1は酸素原子又は硫黄原子を示し、X2〜X5はそれぞれ独立に、酸素原子又は−NH−基を示す。T、R2、R3及びR4はそれぞれ上記一般式(4)における定義と同じである。
【0038】
上記一般式(5)で示される重合性ビオチン誘導体は、一般に下記一般式(8)で示されるビオチン誘導体の側鎖カルボキシル水酸基を適当な脱離基に変換後、下記一般式(9)で示されるアクリル誘導体と縮合反応させることにより得ることができる。
【0039】
【化8】
【0040】
上記一般式(6)で示される重合性ビオチン誘導体は、一般に下記一般式(10)で示されるビオチン誘導体を、適当なアクリル化剤(メタクリル化剤等も含む。例えばアクリル酸、アクリル酸クロリド、無水アクリル酸、アクリロキシスクシンイミド等のアクリル化剤、メタクリル酸、メタクリル酸クロリド、無水メタクリル酸、メタクリロキシスクシンイミド等のメタクリル化剤などが挙げられる。)と反応させることにより得ることができる。
【0041】
【化9】
【0042】
ここで、一般式(10)で表されるビオチン誘導体は、一般式(8)で表されるビオチン誘導体を適当な還元剤で還元して得られるアルコール体(X4=酸素原子)の水酸基を、脱離基機能を有する官能基に変換し、変換後の該アルコール体とアミン誘導体(X4=−NH−)とを置換反応させることにより得ることができる。
【0043】
上記一般式(7)で示される重合性ビオチン誘導体は、一般に下記一般式(11)で示されるビオチン誘導体を、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エーテル、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、脂肪族炭化水素、ベンゼン、トルエン等の非プロトン性溶媒中で、一般式(12)で示されるイソシアネート物質と反応させることにより得ることができる。
【0044】
【化10】
【0045】
さらに、下記一般式(13)で表される重合性ビオチン誘導体は、本発明のUCSTポリマーに特に好ましく使用することができる。
【0046】
【化11】
【0047】
さらに、本発明のUCSTポリマーに好ましく使用することができるモノマーとして、一般式(14)で表されるビオチンメタクリアミド誘導体、および一般式(15)で表されるビオチン誘導体が挙げられる。
【0048】
【化12】
【0049】
さらに、本発明の第二のUCSTポリマーには、本発明第一のUCSTポリマーと同様に、UCSTを制御する目的で、その他のモノマーとして前述の親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた1種以上を用いることができる。
【0050】
本発明第二のUCSTポリマー重合の際の、各モノマーの組成は特に限定されるものではないが、モル比で通常、モノマー(1):ビオチン部位あるいはイミノビオチン部位を有するモノマー:その他のモノマー=500〜1:500〜0.1:0〜50の割合であり、好ましくは100〜5:10〜0.5:0〜5の割合である。
【0051】
本発明UCSTポリマーを含有する重合直後の反応液には、未反応のモノマーや塩などの夾雑物が反応液に共存している。該夾雑物の除去は、透析によって行ってもよく、または溶液の温度をUCST以下とし、凝集させ凝集物を回収後上清を取り除くことによって行っても良い。
【0052】
本発明の第一、第二の何れのUCSTポリマーにおいても、その分子量は特定されるものではないが、質量平均分子量が500〜1000000の範囲であることが好ましく、さらに好ましくは1000〜100000の範囲である。また、そのUCSTは該分子量に依存しないことが好ましい。
【0053】
本発明におけるUCSTとは、具体的には、本発明のUCSTポリマーを水に対して1重量%の割合で水に添加したUCSTポリマー含有水を加熱して清澄状態とし、次いでUCSTポリマー含有水の温度を1分あたり1℃の割合で降下させて行き、該UCSTポリマー含有水の可視光透過率が、清澄状態時の1/2の値になった時点の温度である。
【0054】
該UCSTポリマー含有水の可視光透過率が、清澄状態時の1/2の値になって、さらに昇温乃至降温してもある温度範囲で1/2の値が保持される場合がある。この温度範囲の上限を昇温時のUCSTと言い、同下限を降温時のUCSTと言う。この両者の差(温度範囲)をスイッチング範囲と言う。このスイッチング範囲は狭ければ狭いほど良く、本発明においては10℃以下であることが好ましく、より好ましくは0℃である。
【0055】
本発明UCSTポリマーのUCSTは特に限定されるものではないが、本発明のUCSTポリマーを分離剤とする場合には、0〜50℃の範囲であることが好ましく、特に好ましくは0〜40℃の範囲である。
【0056】
相互に特異的作用を有する一対の物質とは、イオン間の相互作用、水素結合、疎水的相互作用、および金属原子に対する配位などの相互作用によって特異的に相互に吸着する物質であり、具体的には、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、cDNAとmRNA、酵素(活性部位)と基質、酵素(活性部位)と生産物、酵素(活性部位)と競争阻害剤、酵素(補酵素結合部位)と補酵素、酵素(補酵素結合部位)とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Fc部位とプロテインA、Fc部位とプロテインG、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、DNAとDNA結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、ヘパリンとラミニン、ポリチミンとmRNA、大腸菌抗体と大腸菌、および抗体(IgG)と抗IgGとの組合せを挙げることができる。
【0057】
その中でも、ビオチンとアビジンとの組合せは本発明に最も好ましく使用することができる。本発明第一のUCSTポリマーにビオチンを固定化した場合には、アビジンを固定化した目的物質のみを選択的に分離、回収することが可能となり、本発明第一または第二のUCSTポリマーにアビジンを固定化した場合には、ビオチンを固定化した目的物質のみを選択的に分離、回収することが可能となる。
なお、本発明においてビオチンは、イミノビオチンであってもよく、アビジンはストレプトアビジンであっても良い。何れの場合も本発明の効果を得ることができる。
その際の目的物質は特に限定されるものではないが、例えば酵素、抗体、核酸、分子シャペロン、およびヒートショックプロテインなどを挙げることができる。
【0058】
本発明のUCSTポリマーにアビジンが固定化された場合には、アビジンのビオチン結合4サイトのうち最大3サイトを開いた状態に保つことが可能であることから、ビオチン化された目的物質をさらに効率よく分離、回収することが可能となる。
しかしながら、現実的にはアビジンを直接UCSTポリマーに固定化することは困難であることから、本発明第二のUCSTポリマーに固定されているビオチンにアビジンを結合させることによって、アビジンを本発明のUCSTポリマーに固定化することが好ましい。
【0059】
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が固定化された、本発明のUCSTポリマーを用いれば、そのもう一方の物質、該物質が固定化された物質を容易に分離、回収することが可能となる。
例えば、酵素が固定化された本発明のUCSTポリマーを酵素反応に用いれば、従来の固定化酵素を用いた酵素反応に比べ、より速い速度で基質を変換することが可能である。その際使用される酵素は特に限定されるものではないが、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、分解酵素、異性化酵素、および合成酵素などを挙げることができる。
基質の変換により生成した物質は、本発明のUCSTポリマーと該生成物質とを含有する溶液の温度を下げることにより、該UCSTポリマーのみを析出させ、析出した該UCSTポリマーのみを取り除くことにより、酵素と該生成物質とを容易に分離することができる。
【0060】
抗体を固定化した本発明のUCSTポリマーを用いれば、溶液中の微生物の分離、濃縮を効率よく行うことができる。その際に使用する抗体はモノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であっても良い。
溶液中の微生物の分離方法、濃縮方法は特に限定されるものではないが、具体的には、微生物を含有する溶液に該UCSTポリマーを添加し、微生物と該UCSTポリマーとを充分に接触させた後、該溶液の温度を下げることにより、微生物を吸着したUCSTポリマーのみを析出させ、析出したUCSTポリマーのみを取り除く方法を挙げることができる。この方法であれば、溶液中の微生物を容易に分離、濃縮することが可能である。
例えば、使用する抗体がサルモネラ抗体であれば、食品懸濁液中のサルモネラ菌だけを容易に分離、濃縮することが可能であることから、任意の抗体が固定化された本発明のUCSTポリマーと適当な検出試薬とを組み合わせることによって、感度の高い微生物検査キットもしくは診断薬を作ることも可能である。
【0061】
分子シャペロンやヒートショックプロテインをUCSTポリマーに固定化した磁性微粒子は、溶液中における、酵素や抗体の安定性を高めることから、その繰り返し離床が可能となり、工業レベルでの蛋白質生産、物質生産を補助することが出来る。通常、分子シャペロンのような蛋白質は高価なため、工業レベルでの使用は困難である。
【0062】
核酸を固定化した本発明のUCSTポリマーを、核酸を含有する溶液に添加し、該UCSTポリマーと核酸とを充分に接触させた後、該溶液の温度を下げることにより、核酸を吸着したUCSTポリマーのみを析出させ、析出したUCSTポリマーのみを取り除く方法を挙げることができる。この方法であれば、溶液中の核酸を容易に分離、濃縮することが可能である。また、該核酸の分離、濃縮方法は、特定遺伝子の精製、濃縮、検出等に応用することも可能である。
【0063】
また、複数種類の核酸と該UCSTポリマーとを含有する混合液中で、ハイブリダイゼーションを充分に行った後、該混合液の温度を下げることにより核酸ごと凝集、回収を行った後、再度温度を上げることで容易に任意の核酸の精製、検出、濃縮を行うことが出来る。
例えば目的とするDNAと相補的な配列を有するビオチン化DNAやビオチン化ポリチミンを用いることで、目的DNAやmRNAを濃縮、精製することが出来る。得られた核酸を各種遺伝子増幅法により増幅させることで、感度良く核酸を検出することが出来る。核酸の増幅方法は特に限定されないが、PCR法やRT−PCR法が本発明に好ましく用いることができる。
【0064】
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方を、本発明第一のUCSTポリマーに固定化する方法は特に限定されるものではなく、既に合成された該UCSTポリマーに該一対の物質の一方を固定化する方法(以下「固定化法」と記載する。)や、アビジンが固定化された該一対の物質の一方を、アビジンとビオチンとの特異的作用を利用して、本発明第二のUCSTポリマーに結合させる方法(以下「結合法」と記載する。)などを挙げることができる。
【0065】
前述の固定化法としては共有結合であることが好ましいが、イオンコンプレックスや電荷移動錯体を利用した結合、生化学的親和性等を利用した結合であってもよい。
抗体や酵素などの蛋白質を、本発明のUCSTポリマーに結合させる場合であれば、該蛋白質が有するアミノ基やカルボキシル基等の官能基の反応性を利用して、該UCSTポリマーと該蛋白質とを結合させればよい。
例えば、蛋白質のアミノ基を利用する場合は、該UCSTポリマーにカルボキシル基を導入して、下記に示すような反応式でアミド結合を作ることができる。
【0066】
【化13】
【0067】
また、下記に示すようなアルデヒド基を利用する方法、エポキシ基を利用して、本発明のUCSTポリマーと蛋白質とを結合させても良い。
【0068】
【化14】
【0069】
また、該蛋白質のカルボキシル基を利用する場合であれば、本発明のUCSTポリマーにアミノ基を導入して、下記に示すような反応式でアミド結合を作ることができる。
【0070】
【化15】
【0071】
また、例えば、メタクリル酸のカルボキシル基などを、上記モノマーや他のモノマーに共重合させて、カルボキシル基など適当な官能基を持つように本発明のUCSTポリマーを設計することにより、カルボジイミド等を用いる既知の蛋白質固定化方法により酵素や抗体などの蛋白質を、該UCSTポリマーに固定化することも出来る。
【0072】
本発明のUCSTポリマーに抗体を導入して蛋白質と結合させる場合、該結合は、pHが中性付近の燐酸、トリスバッファーの中で行われることが好ましい。また、塩濃度は目的に応じて適宜設定できる。
【0073】
相互に特異的作用を有する一対の物質の一方の、本発明UCSTポリマーへの固定化は、前述のように相互に特異的作用を有する一対の物質の一方を、該UCSTポリマーに直接固定化しても良いが、固定化の作業が簡便であることから、ビオチンとアビジンとの結合を介して該UCSTポリマーに固定化されていることが好ましい。例えば、アビジンが固定化された酵素を、アビジンとビオチンとの間の特異的作用を利用して、ビオチンが固定化された本発明第二のUCSTポリマーに固定化すればよい。
【0074】
さらに好ましくは、例えば、ビオチンが固定化された酵素を、アビジン結合ビオチンが固定化されたUCSTポリマーに固定化することである。前述のように該アビジン結合ビオチンは、最大3つのビオチン化酵素を固定化することが可能であることから、より高い効率で基質の変換、分離、回収が可能となる。
当然のことながら、これは酵素に限定されるものではなく、前述の相互に特異的作用を有する一対の物質であれば、同様の効果が得られる。
【0075】
本発明の分離剤は、本発明のUCSTポリマーを含有するものであれば特に限定されるものではないが、該UCSTポリマーの分離剤に対する含有割合が1〜100重量%の範囲であることが好ましく、特に好ましくは2〜30重量%の範囲である。
その他の成分としてはフェライト粒子、マグネタイト粒子、およびヘマタイト粒子などを挙げることができる。
本発明の分離剤を用いれば、微生物、核酸、タンパク、ペプチド、抗原、環境ホルモンなどの分離を容易に行うことが出来る。
【0076】
本発明のUCSTポリマーは、相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が固定化された場合であっても、そのUCSTは不変であることが好ましく、さらに、溶解、不溶化の操作を繰り返し行った場合であっても、そのUCSTは不変であることが好ましい。
また、本発明のUCSTポリマーは、細菌、残留農薬の検出等の如き検査薬、診断薬への応用、微生物や細胞培養の生体物等のバイオプロダクトの分離、酵素や分子シャペロン等の固定化による生体反応機能の活性化・維持などに特に有効に利用できる。
【実施例】
【0077】
以下の実施例において、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【0078】
実施例1[N−アクリロイルグリシンアミドの合成]
アクリル酸クロリド9質量部とグリシンアミド塩酸塩11質量部とをエーテル200ml中に懸濁させ、10℃で3時間撹拌した。その後飽和重曹水を100ml加え、更に1時間室温で撹拌を行った。次いで、酢酸エチル200mlを加え有機相の抽出を行った。減圧下、該有機相を濃縮して得られた在留物を、酢酸エチルを移動相に用いて、シリカゲルでカラムクロマトを行い白色結晶の化合物10質量部を得た。得られた化合物についてNMR及び質量分析を行い、該化合物がN−アクリロイルグリシンアミドであることを確認した。
【0079】
実施例2[UCSTポリマーの合成:(N−アクリロイルグリシンアミドとN−アセチルアクリルアミドとの共重合体(モル比10:1))
N−アクリロイルグリシンアミド13質量部と、N−アセチルアクリルアミド1.1質量部とを、100mlのジメチルスルフォキシドに溶解し、0.1質量部のアゾビスイソブチロニトリル(AIBN)を開始剤に用いて、窒素雰囲気下、3時間重合を行った。反応終了後エタノールを用いて再沈を行い、白色の重合物を得た。得られた重合物についてNMR分析を行い、該重合物がN−アクリロイルグリシンアミドとN−アセチルアクリルアミドとの共重合体であることを確認した。またGPCを用いて分子量を測定したところ、該共重合体の質量平均分子量は約6000であった。
得られたポリマーをpH=7.6、PBSサリンバッファー中に溶解し(2質量%)、石英セル中で500nmの可視光を用いてUCSTを測定したところ、昇温時約13℃、降温時約5℃であった。
【0080】
実施例3[UCSTポリマーの合成:N−アクリロイルグリシンアミドとモノマー式(14)との共重合体(モル比10:1)]
N−アクリロイルグリシンアミド13質量部と、モノマー式(14)3.7質量部とを100mlのジメチルスルフォキシドに溶解し、0.1質量部のAIBNを開始剤に用いて、窒素雰囲気下、3時間重合を行った。反応終了後エタノールを用いて再沈を行い、白色の重合物を得た。得られた重合物についてNMR分析を行い、該重合物がN−アクリロイルグリシンアミドとモノマー式(14)との共重合体であることを確認した。またGPCを用いて分子量を測定したところ、該共重合体の質量平均分子量は約8000であった。
得られたポリマーをpH=7.6、PBSサリンバッファー中に溶解し(2質量%)、石英セル中で500nmの可視光を用いてUCSTを測定したところ、昇温時約33℃、降温時約21℃であった。
【0081】
実施例4[卵白中からのアビジンの特異的分離]
実施例3で得られたUCSTポリマー5mg、1.0%アビジン溶液50μl、1.0Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)100μl、蒸留水450μl、および2.5%の卵白溶液400μlを試験管中で良く混合した後、該試験管を氷水中に置き、溶液の温度をUCST以下にし高分子を凝集させた。上清部分100μlを取り出し、SDSによる変性処理後、SDS−PAGE(SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)により上清からアビジンに対応するバンドのみが無くなっていることを確認した。
【0082】
実施例5[UCSTポリマーの合成:N−アクリロイルグリシンアミドとモノマー式(14)との共重合体(モル比200:1)]
N−アクリロイルグリシンアミド13質量部とモノマー式(14)0.19質量部とを、100mlのジメチルスルフォキシドに溶解し、0.1質量部のAIBNを開始剤に用いて、窒素雰囲気下、3時間重合を行った。反応終了後エタノールを用いて再沈を行い、白色の重合物を得た。得られた重合物についてNMR分析を行い、該重合物がN−アクリロイルグリシンアミドとモノマー式(14)との共重合体であることを確認した。またGPCを用いて分子量を測定したところ、該共重合体の質量平均分子量は約8000であった。
得られた共重合体をpH=7.6、PBSサリンバッファー中に溶解し(2質量%)、石英セル中で500nmの可視光を用いてUCSTを測定したところ、昇温時約18℃、降温時約7℃であった。
【0083】
実施例6[UCSTポリマーへのアビジン固定化酵素の固定化]
実施例5で得られたUCSTポリマー3mg、市販のアビジン固定化ペルオキシダーゼ溶液(1mg/ml)1000μl、および1.0Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH=7.0)100μlを、蒸留水700μlに添加し良く混合した。得られた溶液を、その温度がUCST以下になるまで冷却し、生成した凝集物を回収し、上清1900μlを取り除いた後、新たに0.1Mリン酸緩衝液(pH=7.0)1900μlを添加することによって、アビジン固定化ペルオキシダーゼを固定化したUCSTポリマーを含有する溶液を調製した。
該UCSTポリマーは該溶液中において、該溶液の温度がUCSTを越えた場合には溶解し、UCST以下である場合には凝集した。該溶液の温度を恒温槽により変化させ、溶解、凝集および遠心分離後の操作を行い、それぞれ段階における上清のペルオキシダーゼ活性を、下記に示すペルオキシダーゼの活性測定法により測定した。なお、遠心分離後、凝集物を回収した後は、毎回上清1900μlを取り除き、新たに0.1Mリン酸緩衝液(pH=7.0)1900μlを添加した。
上記方法により繰り返し凝集、溶解を行った場合の上清のペルオキシダーゼ活性を測定した結果を表1に示す。なお、ペルオキシダーゼ活性は最初の溶解時の活性を100とした場合の比活性で示した。
【0084】
(ペルオキシダーゼ活性測定法)
100mM過酸化水素100μl、50mMフェノール100μl、50mM4−アミノアンチピリン100μl、1.0Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH=7.0)100μl、および蒸留水580μlを、吸光度計のセル内で予め混合し、次いで、該セルにサンプルを20μl添加し、再び良く混合した後、生成物を500nmの可視光吸収を測定することにより、該サンプルのペルオキシダーゼ活性を求めた。なお、以上の操作は30℃で行った。
【0085】
【表1】
【0086】
この結果よりアビジン固定化ペルオキシダーゼの活性は、該UCSTポリマーの溶解と凝集とを繰り返し行った場合であっても、低下しにくいことが明らかである。
【0087】
実施例7[アビジン固定化UCSTポリマーへのビオチン固定化酵素の固定]
まず、アビジンのビオチン結合サイト3カ所が空いている状態のアビジン固定化UCSTポリマーを得るため、実施例5で得られたUCSTポリマー5mgに1.0%アビジン溶液500μl、1.0Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH=7.0)100μl、および蒸留水350μlを試験管中で良く混合した後、氷水中に置き該混合液の温度をUCST以下にし、該UCSTポリマーを凝集させた。該凝集物を遠心分離後、吸引濾過し、UCSTポリマーとの結合部位以外のビオチン結合サイトが空いているアビジン固定化UCSTポリマー含有液を得た。
このアビジン固定化UCSTポリマー含有液に、市販のビオチン固定化ペルオキシダーゼ溶液(1mg/ml)1000μl、1.0Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH=7.0)100μl、および蒸留水700μlを添加し、良く混合した。得られた混合液を冷却し、生成した凝集物を回収し、回収後の該混合液から上清1900μlを取り除いた後、該混合液に新たに0.1Mリン酸緩衝液(pH=7.0)1900μlを添加し、ビオチン固定化ペルオキシダーゼを固定化したアビジン固定化UCSTポリマーを調製した。このUCSTポリマーを使って、実施例6と同様に溶解、凝集回収を繰り返し、上清のペルオキシダーゼ活性を測定した結果を表2に示す。なお、ペルオキシダーゼ活性についても同様に最初の溶解時の活性を100とした場合の比活性で示した。
【0088】
【表2】
【0089】
アビジン固定化UCSTポリマーに固定化されたビオチン固定化ペルオキシダーゼの活性は、該UCSTポリマーの溶解と凝集とを繰り返し行った場合であっても、低下しにくいことが明らかである。
【0090】
実施例8[UCSTポリマーへのヒートショックプロテインの固定化]
市販のビオチンが固定化されたヒートショックプロテインHSP70、0.5mgを100mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH=7.0)1mlによく混合した後、この混合液から5μl取り出して変性処理した後SDS−PAGEによりHSP70のバンドを確認した。
続いて上記ビオチン化HSP70のリン酸ナトリウム緩衝溶液500μlを、実施例7で調製したアビジン固定化UCSTポリマー5mgに加え、良く混合したのち、その混合液を冷却し、冷却によって生成した凝集物を回収し、上清のHSP70をSDS−PAGEにより確認したところ上清にはHSP70は無く、HSP70はUCSTポリマーに固定化されたアビジンと結合していることが確認された。
【0091】
実施例9[微生物の分離濃縮方法]
市販のビオチン固定化サルモネラ抗体を、実施例7に記載の方法に準じてUCSTポリマーに固定化した。固定化したことはSDS−PAGEを用い確認を行った。続いて該ビオチン固定化サルモネラ菌の濃度が1個/mlになるように調整した菌けん濁液20mlに該UCSTポリマー5mgを添加してよく撹拌後、得られた混合液を冷却して該UCSTポリマーを凝集させ、該凝集物を遠心分離により沈殿させ、上清を取り除き、次いで、残さである凝集物に水を加えて容積を1mlとした。この凝集体含有液を予め滅菌し、50℃にインキュベートしていたブレインハートインフュージョン寒天培地20mlに添加し、すばやく混合後シャーレに広げ、寒天が固まるまで放冷し、37℃で48時間インキュベートした。48時間後のコロニー数を計測した結果を表3に示した。また、これら総ての操作はクリーンベンチ内にて行った。
また、対照として、該UCSTポリマーを添加せず、最初に調整した菌けん濁液1ml中の菌数を同様に測定した。
【0092】
【表3】
【0093】
この結果より、サルモネラ菌は該UCSTポリマーにより濃縮されていることが明らかである。
【0094】
実施例10[UCSTポリマーへの核酸の固定化]
市販のビオチン固定化DNA断片500μl(50〜1000bp)に、蒸留水450μl、および実施例7で調製したアビジン固定化UCSTポリマー5mgを加え良く混合したのち、該混合液を冷却して該UCSTポリマーを凝集させ、該凝集を遠心分離により回収し、上清のDNA断片をアガロースゲル電気泳動により確認したところ、いずれのDNA断片も該UCSTポリマーに結合していることが示唆された。RNAについても同様の実験を行い、該UCSTポリマーへの結合を確認した。
【0095】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、2000年8月21日出願の日本特許出願No.2000−249818に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【0096】
本発明のUCSTポリマーは、緩衝液中においてもUCSTを有し、さらに、本発明のポリマーを用いれば、微生物の分離、濃縮、核酸の精製、検出、または濃縮、生体物質の分離、および物質の変換が効率よく行える。特に温度設定が難しい物質、高温環境が好ましくない物質(例えばバイオプロダクト、酵素、抗体などの蛋白質)の分離、精製、固定化酵素、検量、制御、或いはケモバルブ、ドラッグデリバリーシステム(DDS)等に有効に利用出来る。
Claims (27)
- 請求項1記載の一般式(1)で表されるモノマーと、ビオチン部位或いはイミノビオチン部位を有するモノマーとを重合させて得られたポリマー。
- さらに親水性モノマーおよび疎水性モノマーから選ばれた1種以上を用いた請求項1または2記載のポリマー。
- 相互に特異的作用を有する一対の物質の一方が固定化された請求項1〜3の何れか1項記載のポリマー。
- 相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビオチンとアビジン、抗原と抗体、ポリヌクレオチドと相補的塩基配列をもつポリヌクレオチド、cDNAとmRNA、酵素(活性部位)と基質、酵素(活性部位)と生産物、酵素(活性部位)と競争阻害剤、酵素(補酵素結合部位)と補酵素、酵素(補酵素結合部位)とトリアジン色素、プロテアーゼとプロテアーゼインヒビター、Fc部位とプロテインA、Fc部位とプロテインG、レクチンと糖、ホルモンレセプターとホルモン、DNAとDNA結合タンパク質、ヘパリンとフィブロネクチン、およびヘパリンとラミニンとの組合せから選ばれた1種以上である請求項4記載のポリマー。
- 相互に特異的作用を有する一対の物質が、ビオチンとアビジンである請求項4記載のポリマー。
- 高分子に固定化された該一対の物質の一方が、ビオチンである請求項4記載のポリマー。
- ビオチンがアビジンと結合したビオチン(以下「アビジン結合ビオチン」と記載する。)である請求項7記載のポリマー。
- アビジン化酵素をビオチンに結合させた請求項7記載のポリマー。
- ビオチン化酵素をアビジン結合ビオチンに結合させた請求項8記載のポリマー。
- 請求項9または10記載のポリマーを用いることを特徴とする物質の変換方法。
- アビジン化抗体をビオチンに結合させた請求項7記載のポリマー。
- ビオチン化抗体をアビジン結合ビオチンに結合させた請求項8記載のポリマー。
- 請求項12または13記載のポリマーを用いることを特徴とする微生物の分離方法または濃縮方法。
- アビジン化分子シャペロンをビオチンに結合させた請求項7記載のポリマー。
- ビオチン化分子シャペロンをアビジン結合ビオチンに結合させた請求項8記載のポリマー。
- 請求項15または16記載のポリマーを用いることを特徴とする変性蛋白質の改質方法。
- アビジン化ヒートショックプロテインをビオチンに結合させた請求項7記載のポリマー。
- ビオチン化ヒートショックプロテインをアビジン結合ビオチンに結合させた請求項8記載のポリマー。
- 請求項18または19記載のポリマーを用いることを特徴とする変性蛋白の改質方法。
- アビジン化核酸をビオチンに結合させた請求項7記載のポリマー。
- ビオチン化核酸をアビジン結合ビオチンに結合させた請求項8記載のポリマー。
- 請求項21または22記載のポリマーを用いることを特徴とする核酸の精製、検出、または濃縮方法。
- 請求項23記載の核酸の精製、または濃縮方法により得られた核酸を増幅することを特徴とする核酸の検出方法。
- 増幅方法がPCR法またはRT−PCR法である請求項24記載の核酸の検出方法。
- 請求項1〜8の何れか1項記載のポリマーを含有する分離剤。
- 請求項26記載の分離剤を用いることを特徴とする生体物質の分離方法。
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