JPH09154573A - 核酸吸着剤 - Google Patents
核酸吸着剤Info
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- JPH09154573A JPH09154573A JP7315464A JP31546495A JPH09154573A JP H09154573 A JPH09154573 A JP H09154573A JP 7315464 A JP7315464 A JP 7315464A JP 31546495 A JP31546495 A JP 31546495A JP H09154573 A JPH09154573 A JP H09154573A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸を酵素が共存する系から選択的に、且つ
容易に吸着分離可能な核酸吸着剤を提供する。 【解決手段】 窒素含有塩基性モノマーを２〜６０重量
％およびＮ−イソプロピルアクリルアミドを４０〜９８
重量％含有するモノマーを重合して得られた共重合ポリ
マーよりなることを特徴とする核酸吸着剤。
容易に吸着分離可能な核酸吸着剤を提供する。 【解決手段】 窒素含有塩基性モノマーを２〜６０重量
％およびＮ−イソプロピルアクリルアミドを４０〜９８
重量％含有するモノマーを重合して得られた共重合ポリ
マーよりなることを特徴とする核酸吸着剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、温度応答性の核酸
吸着剤に関する。さらに詳しくは、酵素製造時の酵素の
精製工程における核酸の除去や核酸の抽出などに使用す
ることができる核酸を吸着分離可能な温度応答性核酸吸
着剤に関する。
吸着剤に関する。さらに詳しくは、酵素製造時の酵素の
精製工程における核酸の除去や核酸の抽出などに使用す
ることができる核酸を吸着分離可能な温度応答性核酸吸
着剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、酵素反応が洗浄剤、繊維、食品、
種々の産業分野および診断薬のような医療分野にて利用
されるようになっており、酵素を低コストで高活性を維
持したまま回収する精製方法の開発が望まれている。目
的とする酵素の抽出・精製は、まず酵素を生産させた細
菌を破壊して無細胞化した後、酵素タンパクとしての変
性を防ぐため、温度、ｐＨ、イオン強度、基質や補助因
子の共存などに留意しつつ、また微生物の汚染も避けな
がら実施する必要がある。酵素の精製は存在する他の物
質から酵素タンパクを分離する一連の分画法であるが、
一般には除核酸、安定性による分画、溶解度による分
画、分別吸着、カラムクロマトグラフィーによる分画、
電気泳動による分画、密度勾配超遠心法による分画、二
相分離法などによる分画法がある。
種々の産業分野および診断薬のような医療分野にて利用
されるようになっており、酵素を低コストで高活性を維
持したまま回収する精製方法の開発が望まれている。目
的とする酵素の抽出・精製は、まず酵素を生産させた細
菌を破壊して無細胞化した後、酵素タンパクとしての変
性を防ぐため、温度、ｐＨ、イオン強度、基質や補助因
子の共存などに留意しつつ、また微生物の汚染も避けな
がら実施する必要がある。酵素の精製は存在する他の物
質から酵素タンパクを分離する一連の分画法であるが、
一般には除核酸、安定性による分画、溶解度による分
画、分別吸着、カラムクロマトグラフィーによる分画、
電気泳動による分画、密度勾配超遠心法による分画、二
相分離法などによる分画法がある。
【０００３】酵素の精製においては、通常核酸が酵素と
親和性を有し、複合体を形成しやすいため除核酸の工程
が不可欠である。この除核酸を効率的に行なうことは、
さらに他の精製方法を行う場合においても非常に重要で
ある。従来、除核酸の方法としては、主に塩基性水溶性
ポリマーなどからなる核酸吸着剤に核酸を吸着させる方
法が使用されてきた。
親和性を有し、複合体を形成しやすいため除核酸の工程
が不可欠である。この除核酸を効率的に行なうことは、
さらに他の精製方法を行う場合においても非常に重要で
ある。従来、除核酸の方法としては、主に塩基性水溶性
ポリマーなどからなる核酸吸着剤に核酸を吸着させる方
法が使用されてきた。
【０００４】この塩基性水溶性ポリマーとしては、具体
的にはポリエチレンイミンやポリアミノアルキルメタク
リレート類、アミノアクリルメタクリレートとアクリル
アミドの共重合体、ポリビニルイミダゾリンのようなカ
チオン性ポリマーが知られているが、核酸の吸着後の状
態がハイドロゲルのような状態であるため酵素と核酸の
分離が困難であり、遠心分離を十分おこなっても酵素の
回収率は低かった。また、核酸吸着剤の分子量が高いた
め、酵素が核酸吸着剤のハイドロゲル状ポリマーに物理
的に沈澱物として取り込まれる割合が高いことも収率の
低い原因となっている。
的にはポリエチレンイミンやポリアミノアルキルメタク
リレート類、アミノアクリルメタクリレートとアクリル
アミドの共重合体、ポリビニルイミダゾリンのようなカ
チオン性ポリマーが知られているが、核酸の吸着後の状
態がハイドロゲルのような状態であるため酵素と核酸の
分離が困難であり、遠心分離を十分おこなっても酵素の
回収率は低かった。また、核酸吸着剤の分子量が高いた
め、酵素が核酸吸着剤のハイドロゲル状ポリマーに物理
的に沈澱物として取り込まれる割合が高いことも収率の
低い原因となっている。
【０００５】さらに、除核酸の方法としては、硫酸プロ
タミンまたは硫酸ストレプトマイシンなどの除核酸剤と
核酸を結合させた後、沈澱させて分離する結合沈澱法が
知られているが、いずれも沈澱が不十分なため、多量の
除核酸剤を必要とし、コストが高くなるという問題があ
った。また、その他の除核酸の方法として、水性２相分
配法、硫酸アンモニウム分画、ｐＨ処理、熱処理などに
より粗分画抽出液にすることもできるが、いずれも精製
度合いの低いものしか得ることができず、さらに各種ク
ロマトグラフィー処理工程が必須で、各工程での酵素濃
縮、脱塩なども必要となり、最終的にコストが高くなる
問題があった。
タミンまたは硫酸ストレプトマイシンなどの除核酸剤と
核酸を結合させた後、沈澱させて分離する結合沈澱法が
知られているが、いずれも沈澱が不十分なため、多量の
除核酸剤を必要とし、コストが高くなるという問題があ
った。また、その他の除核酸の方法として、水性２相分
配法、硫酸アンモニウム分画、ｐＨ処理、熱処理などに
より粗分画抽出液にすることもできるが、いずれも精製
度合いの低いものしか得ることができず、さらに各種ク
ロマトグラフィー処理工程が必須で、各工程での酵素濃
縮、脱塩なども必要となり、最終的にコストが高くなる
問題があった。
【０００６】一方、近年生体試料から核酸の抽出操作が
工業的に広くに行われている。例えば遺伝子工学やＤＮ
Ａプローブの作製においては、目的とするタンパク質を
生産する細胞からｍＲＮＡやＤＮＡを抽出する操作が、
またＤＮＡプローブを用いて例えばウィルスＤＮＡ（Ｒ
ＮＡ）を検出する臨床診断においては、生体試料から検
出されるべきＤＮＡ（ＲＮＡ）を抽出する操作が行われ
る。従来、核酸の抽出は、苛性試薬添加後、フェノール
などで抽出操作を数回繰り返し、実施後エタノール沈澱
を行なう方法が知られているが、危険な溶剤を使用し、
また操作も繁雑で時間がかかり、また、得られる核酸の
収率も低いという問題があった。
工業的に広くに行われている。例えば遺伝子工学やＤＮ
Ａプローブの作製においては、目的とするタンパク質を
生産する細胞からｍＲＮＡやＤＮＡを抽出する操作が、
またＤＮＡプローブを用いて例えばウィルスＤＮＡ（Ｒ
ＮＡ）を検出する臨床診断においては、生体試料から検
出されるべきＤＮＡ（ＲＮＡ）を抽出する操作が行われ
る。従来、核酸の抽出は、苛性試薬添加後、フェノール
などで抽出操作を数回繰り返し、実施後エタノール沈澱
を行なう方法が知られているが、危険な溶剤を使用し、
また操作も繁雑で時間がかかり、また、得られる核酸の
収率も低いという問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来の
技術的課題を背景になされたもので、酵素活性を維持し
つつ、効率的に核酸を選択的に吸着でき、危険な溶剤を
使用することなく、しかも簡便なプロセスで目的とする
核酸を抽出することができる吸着剤を提供することを目
的とするものである。
技術的課題を背景になされたもので、酵素活性を維持し
つつ、効率的に核酸を選択的に吸着でき、危険な溶剤を
使用することなく、しかも簡便なプロセスで目的とする
核酸を抽出することができる吸着剤を提供することを目
的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記の目的は、窒素含有
塩基性モノマーを２〜６０重量％およびＮ−イソプロピ
ルアクリルアミドを４０〜９８重量％含有するモノマー
を重合して得られた共重合ポリマーよりなることを特徴
とする核酸吸着剤によって達成される。
塩基性モノマーを２〜６０重量％およびＮ−イソプロピ
ルアクリルアミドを４０〜９８重量％含有するモノマー
を重合して得られた共重合ポリマーよりなることを特徴
とする核酸吸着剤によって達成される。
【０００９】本発明の核酸吸着剤は、酵素を吸着せず、
核酸のリン酸基部分に選択的に吸着し、且つ温度の変化
により溶解状態から不溶化し析出するという特性を有し
ている。この析出する状態としては、凝集融着状態であ
り、核酸が大きな塊状となるため酵素と核酸の分離操作
も容易であり、しかも分離効率も高い。本発明における
吸着とは、物理的結合および化学的結合の両方を含むも
のである。
核酸のリン酸基部分に選択的に吸着し、且つ温度の変化
により溶解状態から不溶化し析出するという特性を有し
ている。この析出する状態としては、凝集融着状態であ
り、核酸が大きな塊状となるため酵素と核酸の分離操作
も容易であり、しかも分離効率も高い。本発明における
吸着とは、物理的結合および化学的結合の両方を含むも
のである。
【００１０】以下本発明の核酸吸着剤（以下、単に「吸
着剤」と略すことがある）について詳細に説明する。本
発明において吸着剤を形成する共重合ポリマーの製造に
使用することのできる、窒素含有塩基性ビニルモノマー
としては、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレー
ト、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ,
Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、４−ビニ
ルピリジン、２−ビニルピリジンなどが挙げられこれら
は１種または２種以上で用いられる。
着剤」と略すことがある）について詳細に説明する。本
発明において吸着剤を形成する共重合ポリマーの製造に
使用することのできる、窒素含有塩基性ビニルモノマー
としては、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレー
ト、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ,
Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、４−ビニ
ルピリジン、２−ビニルピリジンなどが挙げられこれら
は１種または２種以上で用いられる。
【００１１】窒素含有塩基性ビニルモノマーの使用量と
しては、全モノマーの２〜６０重量％、好ましくは５〜
４０重量％である。窒素含有塩基性ビニルモノマーが２
重量％より少ない場合、核酸を吸着する能力が不足する
問題があり、また６０重量％を越える場合では、いかな
る温度でも共重合ポリマーが水に不溶化しなくなるた
め、核酸を試料から分離することができなくなる。
しては、全モノマーの２〜６０重量％、好ましくは５〜
４０重量％である。窒素含有塩基性ビニルモノマーが２
重量％より少ない場合、核酸を吸着する能力が不足する
問題があり、また６０重量％を越える場合では、いかな
る温度でも共重合ポリマーが水に不溶化しなくなるた
め、核酸を試料から分離することができなくなる。
【００１２】また、本発明の吸着剤を形成する共重合ポ
リマーは、温度に対する応答性を付与するためには、Ｎ
−イソプロピルアクリルアミドを４０〜９８重量％共重
合する必要がある。Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが
４０重量％より少ないと、温度応答性がなくなり、核酸
を分離することができなくなり、さらに、９８重量％を
越えると、核酸を吸着する能力が不足するようになる。
また、その他温度応答性を低下させない範囲で、親水
性、疎水性などの他のビニルモノマーを使用することが
できる。その他のビニルモノマーとしては、例えばアク
リル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸などの
モノまたはジカルボン酸化合物；２−ヒドロキエチルメ
タクリレート、Ｎ−メチロールアクリルアミド、スチレ
ンスルホン酸ナトリウム、イソプレンスルホン酸ナトリ
ウム、無水マレイン酸、アクリルアミド、メタクリルア
ミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアクリルアミドなどのアミド化
合物が挙げられる。これらその他のビニルモノマーの使
用量は全モノマーの２０重量％以下、好ましくは１０重
量％以下である。
リマーは、温度に対する応答性を付与するためには、Ｎ
−イソプロピルアクリルアミドを４０〜９８重量％共重
合する必要がある。Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが
４０重量％より少ないと、温度応答性がなくなり、核酸
を分離することができなくなり、さらに、９８重量％を
越えると、核酸を吸着する能力が不足するようになる。
また、その他温度応答性を低下させない範囲で、親水
性、疎水性などの他のビニルモノマーを使用することが
できる。その他のビニルモノマーとしては、例えばアク
リル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸などの
モノまたはジカルボン酸化合物；２−ヒドロキエチルメ
タクリレート、Ｎ−メチロールアクリルアミド、スチレ
ンスルホン酸ナトリウム、イソプレンスルホン酸ナトリ
ウム、無水マレイン酸、アクリルアミド、メタクリルア
ミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアクリルアミドなどのアミド化
合物が挙げられる。これらその他のビニルモノマーの使
用量は全モノマーの２０重量％以下、好ましくは１０重
量％以下である。
【００１３】本発明において共重合ポリマーを得るため
の重合方法は、好ましくはラジカル重合であり、その形
式は溶液重合、乳化重合または懸濁重合いずれでも良い
が、最も好ましい方法は溶液重合である。溶液重合にお
いて重合溶媒の具体例としては、メチルアルコール、エ
チルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、
テトラヒドフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、酢
酸エチル、トルエンなどが挙げられる。また、重合溶媒
には、重合中ポリマーが析出しない範囲で水を組み合わ
せることもできる。
の重合方法は、好ましくはラジカル重合であり、その形
式は溶液重合、乳化重合または懸濁重合いずれでも良い
が、最も好ましい方法は溶液重合である。溶液重合にお
いて重合溶媒の具体例としては、メチルアルコール、エ
チルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、
テトラヒドフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、酢
酸エチル、トルエンなどが挙げられる。また、重合溶媒
には、重合中ポリマーが析出しない範囲で水を組み合わ
せることもできる。
【００１４】重合開始剤としては、通常のラジカル開始
剤が使用でき、アゾイソブチロニトリルのようなアゾ系
開始剤、ベンゾイルパーオキサイドなどの有機過酸化物
を使用することができる。 重合後、硫酸や塩酸を滴下
してｐＨを７以下にコントロールした後、減圧蒸留など
の方法により脱溶剤することにより共重合ポリマー水溶
液を得ることができる。本発明で使用する共重合ポリマ
ーの分子量は、通常１０００〜５０万、好ましくは２０
００〜２０万である。分子量が１０００未満では沈澱し
にくくなり、一方５０万を超えると粘度が高くなりすぎ
る。
剤が使用でき、アゾイソブチロニトリルのようなアゾ系
開始剤、ベンゾイルパーオキサイドなどの有機過酸化物
を使用することができる。 重合後、硫酸や塩酸を滴下
してｐＨを７以下にコントロールした後、減圧蒸留など
の方法により脱溶剤することにより共重合ポリマー水溶
液を得ることができる。本発明で使用する共重合ポリマ
ーの分子量は、通常１０００〜５０万、好ましくは２０
００〜２０万である。分子量が１０００未満では沈澱し
にくくなり、一方５０万を超えると粘度が高くなりすぎ
る。
【００１５】本発明の吸着剤は、水系媒体中において温
度の変化により水溶性と不溶性の可逆形態を有する温度
応答性のあるポリマーである。本発明の吸着剤の温度応
答性は、低温側では溶解しており、高温領域では不溶性
となり沈澱するものである。変化する温度は、重合時使
用する窒素含有塩基性ビニルモノマーの種類と量、Ｎ−
イソプロピルアクリルアミドの量、その他のビニルモノ
マーの種類と量によってコントロールすることができ
る。温度の調整により形成された沈澱は、遠心分離操作
により沈降させることができ上清と沈降ポリマーと分離
することができる。具体的には２０℃以下では吸着剤の
８０重量％以上が水系媒体に溶解しており、５０℃以上
では吸着剤の８０重量％以上が水系媒体に不溶化する温
度応答性ポリマーが好ましい。２０℃以下でポリマーが
溶解しない場合は、ポリマーが溶解した状態で核酸を吸
着することができず、一方５０℃以上で析出しない場合
は、核酸を吸着して後分離することができなくなるとい
う問題がある。
度の変化により水溶性と不溶性の可逆形態を有する温度
応答性のあるポリマーである。本発明の吸着剤の温度応
答性は、低温側では溶解しており、高温領域では不溶性
となり沈澱するものである。変化する温度は、重合時使
用する窒素含有塩基性ビニルモノマーの種類と量、Ｎ−
イソプロピルアクリルアミドの量、その他のビニルモノ
マーの種類と量によってコントロールすることができ
る。温度の調整により形成された沈澱は、遠心分離操作
により沈降させることができ上清と沈降ポリマーと分離
することができる。具体的には２０℃以下では吸着剤の
８０重量％以上が水系媒体に溶解しており、５０℃以上
では吸着剤の８０重量％以上が水系媒体に不溶化する温
度応答性ポリマーが好ましい。２０℃以下でポリマーが
溶解しない場合は、ポリマーが溶解した状態で核酸を吸
着することができず、一方５０℃以上で析出しない場合
は、核酸を吸着して後分離することができなくなるとい
う問題がある。
【００１６】本発明の吸着剤を用いて除核酸することに
より酵素を精製するための試料、および核酸抽出するた
めの試料としては、微生物や組織、細胞、血液などの生
体組織が例示できる。これらの試料について、含有され
るタンパク質や核酸が吸着剤と接触できない状態、すな
わち、試料が細胞壁や細胞膜を有しているか塊状になっ
ている場合などには、必要に応じて例えばホモジナイズ
処理あるいは超音波処理を実施すると良い。
より酵素を精製するための試料、および核酸抽出するた
めの試料としては、微生物や組織、細胞、血液などの生
体組織が例示できる。これらの試料について、含有され
るタンパク質や核酸が吸着剤と接触できない状態、すな
わち、試料が細胞壁や細胞膜を有しているか塊状になっ
ている場合などには、必要に応じて例えばホモジナイズ
処理あるいは超音波処理を実施すると良い。
【００１７】
【実施例】以下、本発明の実施例を説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。
はこれらに限定されるものではない。
【００１８】実施例１ （１）５００ｍｌガラス製耐圧瓶中で、ジメチルアミノ
エチルアクリレート２０ｇと、Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミド８０ｇを、メタノール２００ｇに溶解し重合開
始剤としてアゾビスイソブチロニトリル０.２ｇを加え
７０℃で５時間重合した。重合転化率は９８％であっ
た。０.５重量％硫酸水溶液４００ｇ添加した後減圧蒸
留によりメタノールおよび残留モノマーを除去して水溶
液とした。調整水およびｐＨ調整剤を添加することによ
り固形分濃度１０重量％、ｐＨ６.３のポリマー水溶液
［ポリマー（１）］とした。得られたポリマー（１）の
温度応答性を測定したところ３０℃以下では透明で溶解
し、３５℃以上では不溶化により析出した。この変化は
可逆的であった。 （２）超音波破砕および遠心分離により得られたＰｓｅ
ｕｄｍｏｎａｓ ｓｐ. Ｆ−１２６の無細胞抽出液
（０.０１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６.２）にタン
パク質１０ｇあたり前記温度応答性ポリマー［ポリマー
（１）］１０重量％水溶液１００ｇを２０℃で攪拌しな
がら滴下しポリマーに核酸を吸着させた。３０分後液温
を４０℃に昇温し、温度応答性共重合ポリマーを析出さ
せ、遠心分離により上清を得た。この操作で上清に得ら
れたγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼの比活性は変化
せず、酵素活性の回収率は８７％であった。
エチルアクリレート２０ｇと、Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミド８０ｇを、メタノール２００ｇに溶解し重合開
始剤としてアゾビスイソブチロニトリル０.２ｇを加え
７０℃で５時間重合した。重合転化率は９８％であっ
た。０.５重量％硫酸水溶液４００ｇ添加した後減圧蒸
留によりメタノールおよび残留モノマーを除去して水溶
液とした。調整水およびｐＨ調整剤を添加することによ
り固形分濃度１０重量％、ｐＨ６.３のポリマー水溶液
［ポリマー（１）］とした。得られたポリマー（１）の
温度応答性を測定したところ３０℃以下では透明で溶解
し、３５℃以上では不溶化により析出した。この変化は
可逆的であった。 （２）超音波破砕および遠心分離により得られたＰｓｅ
ｕｄｍｏｎａｓ ｓｐ. Ｆ−１２６の無細胞抽出液
（０.０１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６.２）にタン
パク質１０ｇあたり前記温度応答性ポリマー［ポリマー
（１）］１０重量％水溶液１００ｇを２０℃で攪拌しな
がら滴下しポリマーに核酸を吸着させた。３０分後液温
を４０℃に昇温し、温度応答性共重合ポリマーを析出さ
せ、遠心分離により上清を得た。この操作で上清に得ら
れたγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼの比活性は変化
せず、酵素活性の回収率は８７％であった。
【００１９】比較例１ 実施例１（１）において、モノマーとしてジメチルアミ
ノエチルアクリレート６５ｇおよびＮ−イソプロピルア
クリルアミド３５ｇを使用した他は実施例１（１）と同
様な操作でポリマー（２）を得た。ポリマー（２）の温
度応答性を測定したところ、１０℃から９０℃まで溶解
した状態であり温度応答性はなかった。実施例１（２）
と同様にして核酸吸着剤としての使用を検討したが、す
べての温度で析出しないため、核酸と酵素を分離するこ
とはできなかった。
ノエチルアクリレート６５ｇおよびＮ−イソプロピルア
クリルアミド３５ｇを使用した他は実施例１（１）と同
様な操作でポリマー（２）を得た。ポリマー（２）の温
度応答性を測定したところ、１０℃から９０℃まで溶解
した状態であり温度応答性はなかった。実施例１（２）
と同様にして核酸吸着剤としての使用を検討したが、す
べての温度で析出しないため、核酸と酵素を分離するこ
とはできなかった。
【００２０】比較例２ 実施例１（１）において、モノマーとしてジメチルアミ
ノエチルアクリレート１ｇおよびＮ−イソプロピルアク
リルアミドを９９ｇを使用した他は実施例１（１）と同
様な操作でポリマー（３）を得た。ポリマー（３）の温
度応答性を測定したところ、３１℃以下では透明で３３
℃以上では析出するという非常に優れた温度応答性を有
していた。しかし、実施例１（２）と同様にして核酸吸
着剤として使用したところ、ポリマーの核酸を吸着する
能力が不十分なため、核酸と酵素を分離することはでき
なかった。
ノエチルアクリレート１ｇおよびＮ−イソプロピルアク
リルアミドを９９ｇを使用した他は実施例１（１）と同
様な操作でポリマー（３）を得た。ポリマー（３）の温
度応答性を測定したところ、３１℃以下では透明で３３
℃以上では析出するという非常に優れた温度応答性を有
していた。しかし、実施例１（２）と同様にして核酸吸
着剤として使用したところ、ポリマーの核酸を吸着する
能力が不十分なため、核酸と酵素を分離することはでき
なかった。
【００２１】実施例２ （１）１Ｌオートクレーブ中で、４−ビニルピリジン４
０ｇとＮ−イソプロピルアクリルアミド１６０ｇをエチ
ルアルコール４００ｇに溶解し重合開始剤としてベンゾ
イルパーオキサイド０.５ｇを加え８０℃で４時間重合
した。重合転化率は９５％であった。１重量％硫酸水溶
液８００ｇを添加しロータリーエバポレーターでエチル
アルコールおよび残留モノマーを除去した後、調製水お
よびｐＨ調整剤を添加することによりｐＨ５.０、固形
分濃度１０重量％のポリマー水溶液［ポリマー（４）］
を得た。得られたポリマー（４）の温度応答性を測定し
たところ２８℃以下で完全に溶解し透明となり、３５℃
以上で完全に不溶化し塊状に析出した。 （２）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｕ ｇｒａｖｅｏｌｅｎ
ｓ ＩＦＯ ３４６０（２Ｋｇ）から超音波破砕により
調製した無細胞抽出液（５００ｍＬ）に前記ポリマー
（４）の１０重量％水溶液（ｐＨ５.０）を１００ｇ添
加して２０℃でポリマーに核酸を吸着した。その後４０
℃に昇温してポリマー（４）を析出させ、４０℃に維持
したまま遠心分離したところ、糖、脂質などの夾雑物と
同時にポリマーが核酸に吸着した状態の沈澱物として核
酸を除去できた。この操作で上清に得られたアルギニン
ラセマーゼの比活性はほとんど変化なく、酵素活性の回
収率は８２％で良好であった。
０ｇとＮ−イソプロピルアクリルアミド１６０ｇをエチ
ルアルコール４００ｇに溶解し重合開始剤としてベンゾ
イルパーオキサイド０.５ｇを加え８０℃で４時間重合
した。重合転化率は９５％であった。１重量％硫酸水溶
液８００ｇを添加しロータリーエバポレーターでエチル
アルコールおよび残留モノマーを除去した後、調製水お
よびｐＨ調整剤を添加することによりｐＨ５.０、固形
分濃度１０重量％のポリマー水溶液［ポリマー（４）］
を得た。得られたポリマー（４）の温度応答性を測定し
たところ２８℃以下で完全に溶解し透明となり、３５℃
以上で完全に不溶化し塊状に析出した。 （２）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｕ ｇｒａｖｅｏｌｅｎ
ｓ ＩＦＯ ３４６０（２Ｋｇ）から超音波破砕により
調製した無細胞抽出液（５００ｍＬ）に前記ポリマー
（４）の１０重量％水溶液（ｐＨ５.０）を１００ｇ添
加して２０℃でポリマーに核酸を吸着した。その後４０
℃に昇温してポリマー（４）を析出させ、４０℃に維持
したまま遠心分離したところ、糖、脂質などの夾雑物と
同時にポリマーが核酸に吸着した状態の沈澱物として核
酸を除去できた。この操作で上清に得られたアルギニン
ラセマーゼの比活性はほとんど変化なく、酵素活性の回
収率は８２％で良好であった。
【００２２】実施例３ （１）５００ｍｌガラス製耐圧瓶中で、ジメチルアミノ
エチルアクリレート３０ｇと、Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミドを、メタノール１５０ｇに溶解し重合開始剤と
してアゾビスイソブチロニトリル０.５ｇを加え７０℃
で１２時間重合した。重合転化率は９５％であった。１
重量％硫酸水溶液４００ｇ添加した後減圧蒸留によりメ
タノールおよび残留モノマーを除去して水溶液とした。
調整水およびｐＨ調整剤を添加することにより固形分濃
度１０重量％、ｐＨ７.１のポリマー水溶液［ポリマー
（５）］とした。得られたポリマー（５）の温度応答性
を測定したところ、４０℃以下では透明で溶解して、４
８℃以上では不溶化により析出した。この変化は可逆的
であった。 （２）ヒト白血球の癌細胞であるＫ５６２細胞を１％牛
胎児血清を含むＰＲＭ１−１６４０培地で培養した。培
養懸濁液１ｍＬあたり５０万の細胞となった時点で１ｍ
Ｌの懸濁液をサンプリングチューブにとり、５００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離し、沈澱に細胞を回収した。細胞に
対し１ｍＬのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７.２を添加し
た後、超音波処理により、無細胞化した後、３０００ｒ
ｐｍで３０分間遠心分離を行い上清を得た。この上清に
ポリマー（５）の１０％水溶液を、１００μＬ添加し３
０分間攪拌後ｐＨ８の緩衝液を１０ｍＬ添加し、５０℃
に昇温することにより核酸を吸着した状態で沈澱させ、
５０℃に維持したまま遠心分離により上清と分離した。
沈澱に５℃のｐＨ７.２の緩衝液１ｍｌを添加すること
により核酸溶液を得た。以上のように抽出された核酸に
ついて制限酵素を作用させた結果、これらの酵素による
反応は阻害されることはなかった。
エチルアクリレート３０ｇと、Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミドを、メタノール１５０ｇに溶解し重合開始剤と
してアゾビスイソブチロニトリル０.５ｇを加え７０℃
で１２時間重合した。重合転化率は９５％であった。１
重量％硫酸水溶液４００ｇ添加した後減圧蒸留によりメ
タノールおよび残留モノマーを除去して水溶液とした。
調整水およびｐＨ調整剤を添加することにより固形分濃
度１０重量％、ｐＨ７.１のポリマー水溶液［ポリマー
（５）］とした。得られたポリマー（５）の温度応答性
を測定したところ、４０℃以下では透明で溶解して、４
８℃以上では不溶化により析出した。この変化は可逆的
であった。 （２）ヒト白血球の癌細胞であるＫ５６２細胞を１％牛
胎児血清を含むＰＲＭ１−１６４０培地で培養した。培
養懸濁液１ｍＬあたり５０万の細胞となった時点で１ｍ
Ｌの懸濁液をサンプリングチューブにとり、５００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離し、沈澱に細胞を回収した。細胞に
対し１ｍＬのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７.２を添加し
た後、超音波処理により、無細胞化した後、３０００ｒ
ｐｍで３０分間遠心分離を行い上清を得た。この上清に
ポリマー（５）の１０％水溶液を、１００μＬ添加し３
０分間攪拌後ｐＨ８の緩衝液を１０ｍＬ添加し、５０℃
に昇温することにより核酸を吸着した状態で沈澱させ、
５０℃に維持したまま遠心分離により上清と分離した。
沈澱に５℃のｐＨ７.２の緩衝液１ｍｌを添加すること
により核酸溶液を得た。以上のように抽出された核酸に
ついて制限酵素を作用させた結果、これらの酵素による
反応は阻害されることはなかった。
【００２３】実施例４ 実施例３で得たＫ５６２細胞溶解液を、それぞれ０.５
ｍＬ、３本の２ｍＬ遠心チューブに取り、ｐＨ５の１０
ｍＭリン酸緩衝液で２ｍＬまで希釈した。この希釈液の
中に、エイズウイルスＤＮＡを組み込んで培養したヒト
白血球（ＮＹ１０株）から取ったＨＩＶ−１ＤＮＡを、
チューブ１、２、３に、０分子、１０分子、５０分子を
それぞれ加えた。ボルテックス後、各チューブに実施例
３で使用したポリマー（５）の固形分濃度１０重量％ポ
リマー水溶液を２μＬ添加し、室温で５分間回転攪拌し
た（１０ｒｐｍ）。次いで、５０℃に昇温してポリマー
を析出させた後、５０℃に維持したまま、３０００ｒｐ
ｍで３分間遠心した。上澄みをアスピレーターで吸引し
て除去し、得られた沈澱をｐＨ７の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液でリンスした後、２５μＬのポリメラー
ゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応溶液を加えて、
ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の組成は下記のとお
りであった。 １０ｘリアクションバッファ（タカラ製） ２.５μＬ ｄＮＴＰ ｍｉｘ（１ｍＭ）（タカラ製） ５.０μＬ プライマー ＳＫ１４５Ａ（２０ｍＭ） ０.５μＬ プライマー ＳＫ４５１Ａ（２０ｍＭ） ０.５μＬ Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ（０.５ＵＮＩＴ／ｍＬ）（タカラ製） １.２５μＬ 減菌蒸留水 ５.２５μＬ ミネラルオイル（シグマ社製） １ ＤＲＯＰ プライマー ＳＫ１４５Ａの配列は、
ｍＬ、３本の２ｍＬ遠心チューブに取り、ｐＨ５の１０
ｍＭリン酸緩衝液で２ｍＬまで希釈した。この希釈液の
中に、エイズウイルスＤＮＡを組み込んで培養したヒト
白血球（ＮＹ１０株）から取ったＨＩＶ−１ＤＮＡを、
チューブ１、２、３に、０分子、１０分子、５０分子を
それぞれ加えた。ボルテックス後、各チューブに実施例
３で使用したポリマー（５）の固形分濃度１０重量％ポ
リマー水溶液を２μＬ添加し、室温で５分間回転攪拌し
た（１０ｒｐｍ）。次いで、５０℃に昇温してポリマー
を析出させた後、５０℃に維持したまま、３０００ｒｐ
ｍで３分間遠心した。上澄みをアスピレーターで吸引し
て除去し、得られた沈澱をｐＨ７の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液でリンスした後、２５μＬのポリメラー
ゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応溶液を加えて、
ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の組成は下記のとお
りであった。 １０ｘリアクションバッファ（タカラ製） ２.５μＬ ｄＮＴＰ ｍｉｘ（１ｍＭ）（タカラ製） ５.０μＬ プライマー ＳＫ１４５Ａ（２０ｍＭ） ０.５μＬ プライマー ＳＫ４５１Ａ（２０ｍＭ） ０.５μＬ Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ（０.５ＵＮＩＴ／ｍＬ）（タカラ製） １.２５μＬ 減菌蒸留水 ５.２５μＬ ミネラルオイル（シグマ社製） １ ＤＲＯＰ プライマー ＳＫ１４５Ａの配列は、
【００２４】 ５’ＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡ ３’
【００２５】プライマー ＳＫ４５１Ａの配列は、
【００２６】 ５’ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣ ３’
【００２７】であって、これらのアプライドバイオシス
テム社製ＤＮＡ合成器３８１Ａ型を用いて、メーカーマ
ニュアルに従って合成し、ＨＰＬＣにより精製品を得
た。なお、ＰＣＲ反応はＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ Ｃ
ＥＴＵＳ社製のサーマルサイクラー モデルＪＰ２００
０を用いて、次のプログラムで増幅反応を行った。 ９４℃ ０.５分 ５５℃ １.０分 ７２℃ １.５分 ３０サイクル ７２℃ ７分
テム社製ＤＮＡ合成器３８１Ａ型を用いて、メーカーマ
ニュアルに従って合成し、ＨＰＬＣにより精製品を得
た。なお、ＰＣＲ反応はＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ Ｃ
ＥＴＵＳ社製のサーマルサイクラー モデルＪＰ２００
０を用いて、次のプログラムで増幅反応を行った。 ９４℃ ０.５分 ５５℃ １.０分 ７２℃ １.５分 ３０サイクル ７２℃ ７分
【００２８】上記１回目のＰＣＲ法による増幅反応の生
成物を５μＬ取り、同様なプログラムでＮｅｓｔｅｄ
ＰＣＲ法の反応を行った。その時のＰＣＲ法の反応液の
組成はプライマーＳＫ１４５の代わりにＳＫ１４５（タ
カラ製）、ＳＫ４５１Ａの代わりにＳＫ４５１を使用し
た以外は同様に行った。ＰＣＲ法およびＮｅｓｔｅｄ
ＰＣＲ法の反応増幅産物を２重量％のアガロースゲル
（Ａｇａｒｏｓｅ １６００、和光純薬製）を用いてＴ
ＢＥ緩衝液（５０ｍＭホウ酸からなる緩衝液、ｐＨ８.
２）中でＭｕｐｉｄ型電気泳動装置で泳動し、エチジウ
ムブロマイド染色後に紫外線（２５４ｎｍ）照射下で検
出した。その結果を下記表１にまとめて示す。この結果
より、本発明の吸着剤を用いることによりＤＮＡのみ回
収することができるため、ＰＣＲ法に利用できることが
わかった。
成物を５μＬ取り、同様なプログラムでＮｅｓｔｅｄ
ＰＣＲ法の反応を行った。その時のＰＣＲ法の反応液の
組成はプライマーＳＫ１４５の代わりにＳＫ１４５（タ
カラ製）、ＳＫ４５１Ａの代わりにＳＫ４５１を使用し
た以外は同様に行った。ＰＣＲ法およびＮｅｓｔｅｄ
ＰＣＲ法の反応増幅産物を２重量％のアガロースゲル
（Ａｇａｒｏｓｅ １６００、和光純薬製）を用いてＴ
ＢＥ緩衝液（５０ｍＭホウ酸からなる緩衝液、ｐＨ８.
２）中でＭｕｐｉｄ型電気泳動装置で泳動し、エチジウ
ムブロマイド染色後に紫外線（２５４ｎｍ）照射下で検
出した。その結果を下記表１にまとめて示す。この結果
より、本発明の吸着剤を用いることによりＤＮＡのみ回
収することができるため、ＰＣＲ法に利用できることが
わかった。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【発明の効果】本発明の核酸吸着剤を使用すると、酵素
反応液の温度を変化させるという簡単な操作で核酸を容
易に回収できるので、酵素の精製が容易に可能となり、
目的とする酵素を効率良く回収できるとともに、酵素の
活性が高いため酵素精製方法が著しく簡略化される効果
がある。また本発明の核酸吸着剤の使用により、核酸を
抽出するにあたり危険な溶剤を使用することなく、簡便
なプロセスで短時間に目的とする核酸を抽出できる効果
がある。
反応液の温度を変化させるという簡単な操作で核酸を容
易に回収できるので、酵素の精製が容易に可能となり、
目的とする酵素を効率良く回収できるとともに、酵素の
活性が高いため酵素精製方法が著しく簡略化される効果
がある。また本発明の核酸吸着剤の使用により、核酸を
抽出するにあたり危険な溶剤を使用することなく、簡便
なプロセスで短時間に目的とする核酸を抽出できる効果
がある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０８Ｆ 226/00 ＭＮＬ Ｃ０８Ｆ 226/00 ＭＮＬ
Claims (1)
- 【請求項１】 窒素含有塩基性モノマーを２〜６０重量
％およびＮ−イソプロピルアクリルアミドを４０〜９８
重量％含有するモノマーを重合して得られた共重合ポリ
マーよりなることを特徴とする核酸吸着剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31546495A JP3689897B2 (ja) | 1995-12-04 | 1995-12-04 | 核酸吸着剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31546495A JP3689897B2 (ja) | 1995-12-04 | 1995-12-04 | 核酸吸着剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09154573A true JPH09154573A (ja) | 1997-06-17 |
| JP3689897B2 JP3689897B2 (ja) | 2005-08-31 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31546495A Expired - Fee Related JP3689897B2 (ja) | 1995-12-04 | 1995-12-04 | 核酸吸着剤 |
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| Country | Link |
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| JP (1) | JP3689897B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002000193A3 (en) * | 2000-06-23 | 2003-01-03 | Battelle Memorial Institute | Multiple stimulus reversible hydrogels |
| JP2004508002A (ja) * | 1999-05-04 | 2004-03-18 | オルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティド | 細胞溶解剤を使用せずに試料からｄｎａを迅速に効率よく捕捉する方法 |
| JP2006176521A (ja) * | 2004-12-23 | 2006-07-06 | Samsung Electronics Co Ltd | 核酸の分離方法 |
| JP2011074184A (ja) * | 2009-09-30 | 2011-04-14 | Daicen Membrane Systems Ltd | アクリル系ポリマー |
| WO2017104676A1 (ja) * | 2015-12-14 | 2017-06-22 | Jsr株式会社 | 重合体、抗菌剤、殺菌剤、抗菌材料、殺菌材料、抗菌方法及び殺菌方法 |
| JP2018046001A (ja) * | 2011-08-19 | 2018-03-22 | 国立大学法人九州大学 | イオン濃度勾配発生システム、装置、方法、及び、温度応答性電解質材料 |
| CN111892689A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-06 | 东南大学成贤学院 | 一种核酸水凝胶及其制备方法 |
-
1995
- 1995-12-04 JP JP31546495A patent/JP3689897B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004508002A (ja) * | 1999-05-04 | 2004-03-18 | オルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティド | 細胞溶解剤を使用せずに試料からｄｎａを迅速に効率よく捕捉する方法 |
| WO2002000193A3 (en) * | 2000-06-23 | 2003-01-03 | Battelle Memorial Institute | Multiple stimulus reversible hydrogels |
| US6660247B1 (en) | 2000-06-23 | 2003-12-09 | Battelle Memorial Institute | Multiple stimulus reversible hydrogels |
| US7033571B2 (en) | 2000-06-23 | 2006-04-25 | Battelle Memorial Institute | Multiple stimulus reversible hydrogels |
| JP2006176521A (ja) * | 2004-12-23 | 2006-07-06 | Samsung Electronics Co Ltd | 核酸の分離方法 |
| JP4527054B2 (ja) * | 2004-12-23 | 2010-08-18 | 三星電子株式会社 | 核酸の分離方法 |
| JP2011074184A (ja) * | 2009-09-30 | 2011-04-14 | Daicen Membrane Systems Ltd | アクリル系ポリマー |
| JP2018046001A (ja) * | 2011-08-19 | 2018-03-22 | 国立大学法人九州大学 | イオン濃度勾配発生システム、装置、方法、及び、温度応答性電解質材料 |
| US10137409B2 (en) | 2011-08-19 | 2018-11-27 | Kyushu University, National University Corporation | System, device and method for generating ion concentration gradient, and temperature-responsive electrolyte material |
| US10300432B2 (en) | 2011-08-19 | 2019-05-28 | Kyushu University, National University Corporation | System, device, and method for producing ion concentration gradient, and temperature-responsive electrolyte material |
| US10695714B2 (en) | 2011-08-19 | 2020-06-30 | Kyushu University, National University Corporation | System, device, and method for producing ion concentration gradient, and temperature-responsive electrolyte material |
| WO2017104676A1 (ja) * | 2015-12-14 | 2017-06-22 | Jsr株式会社 | 重合体、抗菌剤、殺菌剤、抗菌材料、殺菌材料、抗菌方法及び殺菌方法 |
| CN108368201A (zh) * | 2015-12-14 | 2018-08-03 | Jsr株式会社 | 聚合物、抗菌剂、杀菌剂、抗菌材料、杀菌材料、抗菌方法和杀菌方法 |
| US11384172B2 (en) | 2015-12-14 | 2022-07-12 | Jsr Corporation | Polymer, antimicrobial agent, disinfectant, antimicrobial material, disinfectant material, antimicrobial method, and disinfecting method |
| CN111892689A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-06 | 东南大学成贤学院 | 一种核酸水凝胶及其制备方法 |
| CN111892689B (zh) * | 2020-08-14 | 2023-04-25 | 东南大学成贤学院 | 一种核酸水凝胶及其制备方法 |
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